CN113025622B

CN113025622B - 植物花器官优势表达基因jaz-10、其表达产物、表达载体及应用

Info

Publication number: CN113025622B
Application number: CN202110212632.4A
Authority: CN
Inventors: 张洪映; 崔红; 王召军; 闫筱筱
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2021-02-25
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-02-25
Also published as: CN113025622A

Abstract

本发明公开了一种植物花器官优势表达基因JAZ‑10、其表达产物、表达载体及应用，旨在促进当前雄性不育、种子败育植物品种的构建或筛选等技术的深入发展。本发明鉴定出一个可调控植物生殖器官发育的基因JAZ‑10，构建了其过表达载体和CRISPR/Cas9载体，并分别转化获得对应过表达株系和基因敲除植株；经花器官的显微观察表明，JAZ‑10能够调控植物子房心皮、雄蕊和柱头毛的发育，其在分子育种、杂交育种、杂种优势、种子败育植物品种的构建或筛选等方面具有重要的应用价值。

Description

植物花器官优势表达基因JAZ-10、其表达产物、表达载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及植物花器官优势表达基因JAZ-10、其表达产物、表达载体及应用。

背景技术

茉莉酸(JA)能够调控植物的各种发育过程，如花粉成熟、花药开裂、胚成熟、卷须盘绕、块茎和毛状体发育等。茉莉酸途径的抑制因子JAZ蛋白（Jasmonate ZIM domain，JAZ）是调节茉莉酸激素应答的关键因子。JAZ是植物特有的基因家族，JAZs家族成员都含有NT、 ZIM和Jas三个保守结构域。蛋白的N末端包含一个弱保守的NT结构域，此结构域可与DELLA蛋白互作。ZIM 结构域由36个氨基酸组成，其中包含保守的TIFY基序（TIF［F/Y］XG），JAZs形成同源或异源二聚物依赖TIFY基序。JAZ家族C端的Jas结构域十分保守，由12-29个氨基酸组成，在拟南芥的12个JAZ成员中Jas结构域基本一致，Jas结构域可以同很多蛋白互作，在有JA-Ile情况下负责JAZs的降解。

MYC2为JA应答基因的起始转录因子，而植物体的JA感应由COI1控制，JAZ作为它们之间的联系物于2007年被鉴定出(Chini et al, 2007; Yan et al, 2007)，自此JA信号传导模型被揭示：植物在正常生长条件下，体内JA-Ile水平很低，JAZs结合MYC2等转录因子，抑制JA应答基因转录，从而阻止植物体进行JA应答反应；当植物体处于某发育过程或受到外界胁迫时，体内JA-Ile的水平增高，JAZ阻遏蛋白与COI1通过Jas结构域发生互作，并通过SCF^COI1 /26S蛋白酶通路降解，MYC2等转录因子被释放，从而启动相应JA应答基因的转录；当发生JA应答时JAZs也被诱导，诱导表达的JAZs再次抑制MYC2转录因子活性，从而封闭JA响应，这种调节过程类似于反馈调节，使植物体不会产生过于猛烈的JA应答反应，以避免植物体能量的过度消耗(Chico et al, 2008; Browse et al, 2009)。

据报道，拟南芥R2R3-MYB转录因子myb21、myb24双突变体在花粉成熟，花药开裂和花丝伸长方面表现出缺陷，导致雄性不育。在coi1-1突变体中的过表达myb21能够部分挽救雄性育性，但无法恢复JA调节的根系生长抑制，花色苷积累和植物防御作用。这些结果表明，R2R3-MYB转录因子myb21和myb24充当JAZ的直接靶标，调控雄性育性(Song et al, 2011; Huang et al, 2017)。近期研究发现IIIe bHLH转录因子MYC5可能与JAZ蛋白互作调节雄蕊发育，其它IIIe bHLH因子MYC2，MYC3和MYC4可能也具有相似功能。此外，这些IIIe bHLH因子可以与myb21、myb24相互作用，形成bHLH-MYB转录复合物进而协同调节雄蕊的发育(Qi et al, 2015)。

而当前仍需进一步挖掘研究植物花器官优势表达相关基因，了解掌握调控植物雄性不育等种子败育基因及其作用机制，以促进当前作物分子育种、杂交育种、杂种优势利用等制种技术的发展。

发明内容

本发明目的在于提供一种能调控植物生殖器官发育的基因JAZ-10，并利用其表达载体转化植物，以期促进当前植株分子育种、杂交育种及杂种优势利用等制种技术的发展，为种子败育植物品种的构建或筛选提供技术手段，同时为探索植物雄性不育、生殖器官发育机理奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明基于对烟草JAZ家族成员的长期分析研究，鉴定出一个可以调控植物雄性不育的花器官优势表达基因JAZ-10 (Jasmonate ZIM domain-10)，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。JAZ-10 CDS全长为534 bp，编码177个氨基酸和1个终止密码子，具有典型的ZIM和Jas保守结构域。

在强启动子35S后***植物花器官优势表达基因JAZ-10，得过表达载体，转化受体植物可得过表达植株。

利用保守序列设计sgRNA引物，构建JAZ-10基因的CRISPR/Cas9载体，转化受体植物后可获得JAZ-10敲除植株。

在具体研究过程中，利用上述载体通过农杆菌介导法分别转化烟草栽培品种K326，还分别获得了JAZ-10过表达株系（K326-T）和基因敲除植株（K326-M）。

对上述所得不同转基因株系进行显微形态观察发现，JAZ-10过表达株系无雄蕊，且子房由2个心皮变为3个心皮；而JAZ-10基因敲除植株表型为雄蕊和子房基本正常，但柱头毛缺失；JAZ-10过表达和敲除植株均出现种子败育现象。

以上研究结果证明，JAZ-10对植物生殖器官的发育具有关键调控作用，其在植株杂交育种、杂种优势利用、种子败育植物品种的构建或筛选中具有重要的应用价值。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1. 本发明筛选鉴定出了JAZ-10基因，基于其过表达和敲除植株的表型和生理特征鉴定、检测研究表明，其能够调控植物生殖器官的发育，具体而言，其在调控植物雄蕊发育、子房心皮发育和柱头毛形成等方面具有关键作用，因而其在植株分子育种、杂交育种、杂种优势利用、种子败育植物品种的构建或筛选等方面具有重要的应用价值。

2. 本发明研究应用为进一步研究揭示植物雄蕊发育、子房心皮发育和柱头毛形成的分子机制奠定了坚实的技术基础。

附图说明

图1为植物花器官优势表达基因JAZ-10和拟南芥JAZ家族成员的聚类图。

图2为植物花器官优势表达基因JAZ-10的组织表达特性分析图。

图3为植物花器官优势表达基因JAZ-10过表达株系的Sourthern杂交分析图。

图4为植物花器官优势表达基因JAZ-10基因突变体测序的分析图。

图5为对照烟草株、JAZ-10基因过表达株系和JAZ-10基因敲除植株的花器官观察对比照片。

图6为对照烟草株、JAZ-10基因过表达株系和JAZ-10基因敲除植株的花器官中子房内的心皮观察对比照片。

图7为对照烟草株、JAZ-10基因过表达株系和JAZ-10基因敲除植株的花器官中子房内的柱头观察对比照片。

以上图4至图7中，K326为对照烟草株，K326-T为过表达株系；K326-M为JAZ-10基因突变体植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的质粒载体如无特别说明，均为常规商业载体；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

茉莉酸途径的抑制因子JAZ蛋白是调节茉莉酸激素应答的关键因子。本发明人对普通烟草(Nicotiana tobacum) 中JAZ基因进行组织表达特性分析，研究发现JAZ-10基因在花器官中优势表达。

实施例一：花器官优势表达基因JAZ-10的克隆和组织表达分析

1. 烟草JAZ-10的克隆

（1）用TRIZOL提取普通烟草的总RNA，使用PrimerScript RT reagent Kit（TaKaRa，Japan）将RNA反转录为cDNA。

（2）基因的克隆：PCR反应条件为95 ℃下5 min；95 ℃下40 s，57℃下50 s，72 ℃下1 min，35个循环；72℃下10 min。扩增引物为（见SEQ ID NO.3～4）：

5'- GAATATAATTTAGCAGTGTATAAACATGTC-3'；

5'- CCTGTACATATATAATCCAAGCTGAA-3'。

（3）PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测，结果显示约在550 bp的位置有一个明显条带。

（4）电泳结束后，切下凝胶中条带，用DNA回收试剂盒进行DNA片段回收。

（5）将回收后DNA和pMD19-T载体（Takara）进行连接。

（6）将连接产物热激转化入大肠杆菌DB3.1菌株，利用氨苄抗性的LB平板进行阳性克隆筛选，提取质粒进行测序分析。

2. 序列保守域的预测

将测序分析获得的烟草JAZ-10的氨基酸序列提交至NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行tblastn分析，查询与烟草JAZ-10和拟南芥JAZ成员的聚类关系。

结果如图1所示，克隆所得的烟草JAZ-10与拟南芥JAZ-1和JAZ-2序列相似最高。

3. 组织表达特性分析

采集长势优良的普通烟草品种K326的根部、茎部、叶片和花朵，提取样品总RNA，反转录合成cDNA。以 L25作为内参基因，采用实施定量PCR方法分析烟草JAZ-10基因的组织表达特性。扩增引物为（见SEQ ID NO.5～8）：

JAZ-10-F: 5'-GAGTCAGTATCTCAATGGAAAGGC-3'；

JAZ-10-R: 5'-TGCTGGCTTTATTTATTGACGC-3'；

L25-F: 5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'；

L25-R: TTCTAACTCCTGTTGTTGTGGGAA。

PCR反应条件：95 ℃下5 min；95 ℃下50 s，60 ℃下50 s，72 ℃下30 s，35个循环；72 ℃下10 min。

结果如图2所示：JAZ-10基因在花中的表达量最高，在根、茎和叶中仅有微量表达。该结果表明JAZ-10基因为花器官优势表达基因。

实施例二：JAZ-10基因的过表达株系的获得

1. 过表达载体的构建

烟草JAZ-10基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达载体采用pCAMBIA-NPT载体）。

（1）选用Spe I和Nru I两个酶切位点为连接酶位点，设计如下JAZ-10加酶切位点的克隆引物（见SEQ ID NO.9～10）进行PCR扩增：

F：5'- AGGACTAGTCAATATAATTTAGCAGTGTATAAACATGTC-3'，

R：5'- GAGATCGCGACCTGTACATATATAATCCAAGCTGAA-3'；

加粗标注的酶切位点分别是Spe I和Nru I。

PCR反应体系为：2 μl 基因组DNA（100 ng/μl）；1 μl Primer Star DNA 聚合酶；2μl 引物1（10 μM）；2 μl 引物2（10 μM）；10 μl 5× PCR反应 Buffer；4 μl dNTPs（2.5mM）；29 μl 水；总体积为50 μl。

反应程序为：95℃预变性 5 min ；95℃ 50 s，57℃ 50 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

（2）PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测，结果显示约在750 bp的位置有一个明显条带。

（3）切胶回收目的片段，进行DNA片段回收。

（4）用Spe I和Nru I分别酶切回收后的DNA片段和pCAMBIA-NPT载体。

酶切反应体系：10 ul DNA（100 ng/μl）；1 ul 限制性内切酶1（15 U/μl）；1 ul 限制性内切酶 2（15 U/μl）；5 ul 限制性内切酶反应10× Buffer；总体积为50 μl；37℃酶切5小时。

（5）进行凝胶电泳，分别切胶回收JAZ-10和质粒片段；

（6）将回收后JAZ-10和质粒片段进行连接反应；

连接反应体系：1 μl 载体骨架；3 μl JAZ-10；1 μl T4连接酶；1 μl 10×T4连接酶Buffer；4 μl 水；总体积为10 μl；16℃连接过夜；

（7）热激转化大肠杆菌DB3.1菌株，并用Kan抗性进行筛选，选择阳性克隆提取重组载体，命名为35S-JAZ-10， -20℃下保存备用。

2. 重组载体35S-JAZ-10转化农杆菌

（1）将5 μl质粒（约 500 ng）加入农杆菌GV3101感受态细胞中混匀，放置冰上30min后，转入液氮中速冻8 min，再放入37℃水浴锅中热激5 min。

（2）热激后迅速将感受态细胞置于冰上5 min，放置28℃摇床中160 rmp/min活化2h。

（3）将菌液涂布在含有Kan抗性的平板上培养，获得阳性菌落。

3. 转基因植株的获得

采用叶盘转化法进行农杆菌侵染普通烟草栽培品种K326。在含有30 mg/L Kan的MS抗性培养基上进行转基因植株的筛选。获得T3纯系后利用Sourthern杂交检测目标基因在的转化植株中外源基因的拷贝数。

以35S启动子序列作为探针进行Sourthern杂交，结果如图3所示：获得的2个JAZ- 10过表达株系的基因组中各有一条杂交条带，说明T1和T2均为阳性株系，各***1个外源基因拷贝。

实施例三：JAZ-10基因敲除植株的获得

1. 敲除载体的构建

根据测序得到的烟草JAZ-10的基因组序列，设计并合成如下gRNA靶点序列（见SEQID NO.11）：

GCGCAGTTGTCTATATTCTATTG，下划线标注为PAM区，由杭州百格生物技术有限公司完成。

Oligo二聚体和CRISPR/Cas9载体连接反应：CRISPR/Cas9载体2.0 μL，Oligo二聚体1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，无菌水H₂O补充至10.0 μL。连接产物转化大肠杆菌，提取质粒进行测序，筛选JAZ-10-knock out基因编辑载体。

2. JAZ-10-knock out载体转化农杆菌

实施方法过程与实施例二基本相同。

3. 基因敲除植株的获得

采用叶盘转化法进行农杆菌侵染普通烟草栽培品种K326。在30 mg/L Kan的MS抗性平板上筛选转基因植株。

4. JAZ-10突变植株的筛选

为了检测靶标位点的突变情况，在靶标位点两侧设计如下检测引物（见SEQ IDNO.12～13），对阳性转化植株的基因组DNA分别进行PCR扩增：

F: AGACATAGATCAAAATGGCACAACA，

R: AGCAGAATTAGGTGGACCAGTTTTA。

将扩增条带进行纯化测序，筛选JAZ-10突变植株，获得K326-M。

结果如图4所示：K326-M突变体的SG序列中***一个T，使JAZ-10发生突变。

实施例四：各株系表型和生理特征的鉴定与检测

以普通栽培烟草品种K326为对照，以实施例一所构建重组的烟草转基因株系为试验组K326-T，以实施例二所构建重组的烟草JAZ-10突变植株为试验组K326-M，分别进行花器官的形态观察，结果如图5至图7所示。

综合各图中可以看出，JAZ-10过表达株系无雄蕊，且子房由2个心皮变为3个心皮；而JAZ-10基因敲除植株的雄蕊和子房基本正常，但柱头毛缺失；JAZ-10过表达和基因敲除植株均败育，无法受精、获得种子。

其中，图5为花器官图，从中可以看出，对照K326有5个雄蕊；JAZ-10突变植株K326-M和对照K326相似，无雄蕊突变，具有5个雄蕊；JAZ-10过表达的两个株系K326-T1和K326-T2无雄蕊。图6为子房内的心皮图，从中可以看出，对照K326的子房内有2个心皮；JAZ-10突变植株K326-M和对照K326相似，子房内具有2个心皮；JAZ-10过表达的两个株系K326-T1和K326-T2呈现子房心皮畸形，出现为3个心皮，其中K326-T1的3个心皮内均有胚珠，而其中K326-T2的1个心皮内有胚珠，其它2个心皮无胚珠。图7为柱头图，从中可以看出，对照K326有柱头毛；JAZ-10突变植株K326-M出现柱头毛突变，无柱头毛；JAZ-10过表达的两个株系K326-T1和K326-T2和对照K326相似，有柱头毛。

以上试验结果证明，JAZ-10对植物生殖器官的发育具有关键调控作用，其在种子败育植物品种的构建或筛选中具有重要的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明构思的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 植物花器官优势表达基因JAZ-10、其表达产物、表达载体及应用

<130> /

<160> 13

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 烟草

<400> 1

atggattttt tgacaaacat agaagagcaa tcaactaaga caatgggcca agacaagaaa 60

ttaatagatc atgttcctcg aaatgcaaca agaaattctt ttagagaaat ggaagtgtcc 120

ataaataaag ccagcaacag tagtaaagag acacaaaagg agttaaaggc agcgcagttg 180

tctatattct atggtggtaa agtaatagta tttgatgatt tcccagctga taaagccaga 240

gcaatgatgt tattagctag caaaggaagc cctcagaatt cttgtgctgt ttttcagacg 300

gctaacattg acaaaactgg tcctcttaag ctcggctcta attctgctgc taacaacttt 360

gatttaccta ttgcaagaag atcttcactt cataggttcc ttggcaggag gaaagataga 420

gacacggcta gagcgccata ccaagtgcag aatccattgc catcatcttc aaagaataag 480

gaatcaactt ccatgattcg tgatcagagc tttgatctca acttcacgtt atag 534

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 烟草

<400> 2

Met Asp Phe Leu Thr Asn Ile Glu Glu Gln Ser Thr Lys Thr Met Gly

1 5 10 15

Gln Asp Lys Lys Leu Ile Asp His Val Pro Arg Asn Ala Thr Arg Asn

20 25 30

Ser Phe Arg Glu Met Glu Val Ser Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Ser

35 40 45

Lys Glu Thr Gln Lys Glu Leu Lys Ala Ala Gln Leu Ser Ile Phe Tyr

50 55 60

Gly Gly Lys Val Ile Val Phe Asp Asp Phe Pro Ala Asp Lys Ala Arg

65 70 75 80

Ala Met Met Leu Leu Ala Ser Lys Gly Ser Pro Gln Asn Ser Cys Ala

85 90 95

Val Phe Gln Thr Ala Asn Ile Asp Lys Thr Gly Pro Leu Lys Leu Gly

100 105 110

Ser Asn Ser Ala Ala Asn Asn Phe Asp Leu Pro Ile Ala Arg Arg Ser

115 120 125

Ser Leu His Arg Phe Leu Gly Arg Arg Lys Asp Arg Asp Thr Ala Arg

130 135 140

Ala Pro Tyr Gln Val Gln Asn Pro Leu Pro Ser Ser Ser Lys Asn Lys

145 150 155 160

Glu Ser Thr Ser Met Ile Arg Asp Gln Ser Phe Asp Leu Asn Phe Thr

165 170 175

Leu

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

gaatataatt tagcagtgta taaacatgtc 30

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

cctgtacata tataatccaa gctgaa 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

gagtcagtat ctcaatggaa aggc 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

tgctggcttt atttattgac gc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

cccctcacca cagagtctgc 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

ttctaactcc tgttgttgtg ggaa 24

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

aggactagtc aatataattt agcagtgtat aaacatgtc 39

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

gagatcgcga cctgtacata tataatccaa gctgaa 36

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 11

gcgcagttgt ctatattcta ttg 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 12

agacatagat caaaatggca caaca 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 13

agcagaatta ggtggaccag tttta 25

Claims

1.一种获取雄性不育烟草材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的植物花器官优势表达基因JAZ-10，并向其***强启动子35S后，得过表达载体；

（2）将其转化受体烟草并培育，获得雄性不育的植物材料。

2.一种获取种子败育烟草材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）基于保守序列设计sgRNA引物，构建核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的植物花器官优势表达基因JAZ-10的CRISPR/Cas9载体；

（2）将其转化受体烟草并培育，获得无柱头毛、种子败育的植物材料。