CN113024683B - 黑老虎茎叶多糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑老虎茎叶多糖，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15‑20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。本发明公开了黑老虎茎叶多糖在制备抗氧化作用的药物、化妆品和保健品中的应用。本发明公开了黑老虎茎叶多糖在制备降血脂的药物和保健品中的应用。本发明的黑老虎茎叶多糖从黑老虎的茎叶中提取，由于黑老虎茎叶在植株生长过程中需要进行打顶修剪丢弃，本发明变废为宝，提高了黑老虎植株的综合利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域。更具体地说，本发明涉及一种黑老虎茎叶多糖及其应用。
背景技术
黑老虎[Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith]为木兰科南五味子属多年生常绿攀援藤本植物，其根茎是一种药用价值较高的民间中草药。少数研究发现黑老虎果实富含的氨基酸、蛋白质、多糖、挥发油、总黄酮等多种活性成分在黑老虎茎叶中同样存在，而且茎叶中的总糖含量甚至高于果肉中的总糖含量。目前，国内外主要对黑老虎根茎和果实进行开发利用研究，而对茎叶的研究鲜有报道。黑老虎作为藤蔓植物，其藤蔓长达数米，在植株生长过程中，常需要进行打顶修剪，被丢弃的茎叶造成了资源的浪费。
多糖是药用植物最重要的活性成分之一，许多药用植物中提取的多糖具有良好的抗氧化、降血脂、降血糖、抗衰老等生物活性，不同的多糖其结构不同，具有的生物活性也可能不同，自然也不是所有的植物多糖都具有上述生物活性。目前，关于黑老虎茎叶抗氧化活性的报道主要有黑老虎茎叶的挥发油成分和总黄酮提取物，而黑老虎茎叶中多糖成分的生物活性研究未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种黑老虎茎叶多糖，由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15-20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。
本发明还有一个目的是提供黑老虎茎叶多糖在制备抗氧化作用的药物、化妆品和保健品中的应用。
本发明还有一个目的是提供黑老虎茎叶多糖在制备降血脂的药物和保健品中的应用。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种黑老虎茎叶多糖，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15-20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。
优选的是，所述的黑老虎茎叶多糖，其提取方法包括以下步骤：
1)将待提取材料经洗净、干燥、粉碎过筛得茎叶粉末；
2)按质量比1:4～5取茎叶粉末和体积分数为95％的乙醇水溶液，回流搅拌1～2h，转速为300～600r/min，抽滤得滤渣，滤渣重复上述步骤三次并晾干，去除色素和脂类；
3)将步骤2)得到的滤渣取1质量份与20～30质量份蒸馏水混合得到混合水溶液，回流搅拌3～4h，抽滤得滤液，将滤液采用截留分子量为12000Da的超滤膜进行超滤浓缩至5～6质量份，加入20～30质量份无水乙醇，4℃冷藏保存12～16h，离心，取下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，晾干，得粗多糖；
4)将步骤3)中的粗多糖采用Sevag试剂法除去蛋白得到上层溶液；
5)将步骤4)中的上层溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，以流动蒸馏水透析48h，将透析后的上层溶液真空冷冻干燥，得黑老虎茎叶多糖。
优选的是，所述的黑老虎茎叶多糖，步骤4)中采用Sevag试剂法除去蛋白的方法为：按质量比为1:20:9.5～10.5取粗多糖、蒸馏水、Sevag试剂混合振荡，静置，于离心转速为4000r/min下离心10min，去除下层沉淀，再重复离心一次得到上层溶液；Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为4:1配制得到。
优选的是，所述的黑老虎茎叶多糖，步骤1)中干燥为40℃热风干燥，过筛的目数为40目。
本发明还提供了所述的黑老虎茎叶多糖在制备抗氧化作用的药物、化妆品和保健品中的应用。
本发明还提供了所述的黑老虎茎叶多糖在制备降血脂的药物和保健品中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：本发明通过特定的提取方法从黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15-20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取黑老虎茎叶多糖，具有优越的抗氧化活性和胆酸盐结合能力，可用于制备抗氧化和降血脂的药物或保健品，具有优越的应用价值，同时黑老虎茎叶多糖从黑老虎的茎叶中提取，由于黑老虎茎叶在生长过程中需要进行打顶修剪丢弃，本发明变废为宝，提高了黑老虎植株的综合利用价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是本发明试验3中黑老虎茎叶多糖的热性质分析TG曲线和DTG曲线；
图2是本发明试验3中黑老虎果实多糖的热性质分析TG曲线和DTG曲线；
图3是本发明试验3中黑老虎茎叶多糖的红外光谱分析图；
图4是本发明试验3中黑老虎果实多糖的红外光谱分析图；
图5是本发明试验3中扫描电镜图，其中A、B分别为黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的扫描电子显微镜图；
图6是本发明试验3中原子力显微镜图，其中A、B分别为黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的原子力显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
本发明提供一种黑老虎茎叶多糖，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。
所述的黑老虎茎叶多糖，其提取方法包括以下步骤：
1)将待提取材料经洗净、干燥、粉碎过筛得茎叶粉末；
2)按质量比1:4取茎叶粉末和体积分数为95％的乙醇水溶液，回流搅拌1h，转速为600r/min，抽滤得滤渣，滤渣重复上述步骤三次并晾干；
3)将步骤2)得到的滤渣取1质量份与20质量份蒸馏水混合得到混合水溶液，回流搅拌3h，抽滤得滤液，将滤液采用截留分子量为12000Da的超滤膜进行超滤浓缩至5质量份，加入20质量份无水乙醇，4℃冷藏保存12h，离心，取下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，晾干，得粗多糖；
4)将步骤3)中的粗多糖采用Sevag试剂法除去蛋白得到上层溶液；
5)将步骤4)中的上层溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，以流动蒸馏水透析48h，将透析后的上层溶液真空冷冻干燥(具体参数与设备有关，目的仅是采用真空冷冻干燥去除样品水分，为本领域现有技术，这里不对设备参数做具体限定)，得黑老虎茎叶多糖。
其中，步骤4)中采用Sevag试剂法除去蛋白的方法为：按质量比为1:20:9.5取粗多糖、蒸馏水、Sevag试剂混合振荡，静置，于离心转速为4000r/min下离心10min，去除下层沉淀，再重复离心一次得到上层溶液；Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为4:1配制得到。
其中，步骤1)中干燥为40℃热风干燥，干燥至水分低于15％便于样品储存和粉碎即可，过筛的目数为40目，过筛后有利于提取效率。
实施例2：
本发明提供一种黑老虎茎叶多糖，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。
所述的黑老虎茎叶多糖，其提取方法包括以下步骤：
1)将待提取材料经洗净、干燥、粉碎过筛得茎叶粉末；
2)按质量比1:5取茎叶粉末和体积分数为95％的乙醇水溶液，回流搅拌2h，转速为300r/min，抽滤得滤渣，滤渣重复上述步骤三次并晾干；
3)将步骤2)得到的滤渣取1质量份与30质量份蒸馏水混合得到混合水溶液，回流搅拌4h，抽滤得滤液，将滤液采用截留分子量为12000Da的超滤膜进行超滤浓缩至6质量份，加入30质量份无水乙醇，4℃冷藏保存16h，离心，取下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，晾干，得粗多糖；
4)将步骤3)中的粗多糖采用Sevag试剂法除去蛋白得到上层溶液；
5)将步骤4)中的上层溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，以流动蒸馏水透析48h，将透析后的上层溶液真空冷冻干燥，得黑老虎茎叶多糖。
其中，步骤4)中采用Sevag试剂法除去蛋白的方法为：按质量比为1:20:10.5取粗多糖、蒸馏水、Sevag试剂混合振荡，静置，于离心转速为4000r/min下离心10min，去除下层沉淀，再重复离心一次得到上层溶液；Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为4:1配制得到。
其中，步骤1)中干燥为40℃热风干燥，过筛的目数为40目。
实施例3：
本发明提供一种黑老虎茎叶多糖，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为18cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到。
所述的黑老虎茎叶多糖，其提取方法包括以下步骤：
1)将待提取材料经洗净、干燥、粉碎过筛得茎叶粉末；
2)按质量比1:4.5取茎叶粉末和体积分数为95％的乙醇水溶液，回流搅拌1.5h，转速为450r/min，抽滤得滤渣，滤渣重复上述步骤三次并晾干；
3)将步骤2)得到的滤渣取1质量份与25质量份蒸馏水混合得到混合水溶液，回流搅拌3.5h，抽滤得滤液，将滤液采用截留分子量为12000Da的超滤膜进行超滤浓缩至5.5质量份，加入25质量份无水乙醇，4℃冷藏保存14h，离心，取下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，晾干，得粗多糖；
4)将步骤3)中的粗多糖采用Sevag试剂法除去蛋白得到上层溶液；
5)将步骤4)中的上层溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，以流动蒸馏水透析48h，将透析后的上层溶液真空冷冻干燥，得黑老虎茎叶多糖。
其中，步骤4)中采用Sevag试剂法除去蛋白的方法为：按质量比为1:20:10取粗多糖、蒸馏水、Sevag试剂混合振荡，静置，于离心转速为4000r/min下离心10min，去除下层沉淀，再重复离心一次得到上层溶液；Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为4:1配制得到。
其中，步骤1)中干燥为40℃热风干燥，过筛的目数为40目。
为了说明本发明的方法提取得到的黑老虎茎叶多糖在抗氧化活性和降血脂上的应用效果，本发明进行了以下试验研究，并针对发明人的授权发明专利(公告号CN109021129B，发明名称为黑老虎果实多糖的提取方法)中具体实施例4的方法提取的黑老虎果实多糖与本发明实施例3的方法提取的黑老虎茎叶多糖进行了对比试验。
试验1、黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的理化性质分析
参照硫酸-咔唑法、明胶比浊法、考马斯亮蓝法分别测定黑老虎茎叶多糖和果实多糖的糖醛酸含量、硫酸基含量和蛋白质含量，并按每100g样品粉末所提取出的多糖/100×100％公式计算多糖的提取得率。根据表1的结果显示，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖均含有大量的糖醛酸和少量的蛋白质，说明二者均为酸性糖蛋白复合物。黑老虎茎叶多糖提取得率和硫酸基含量均略高于黑老虎果实多糖。
表1黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的理化分析结果
试验2、黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的单糖组成分析
采用TFA水解-PMP衍生化-高效液相色谱法测定黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的单糖组成，将多糖样品完全酸水解后衍生产物的保留时间与单糖标准品的保留时间进行对比分析。可知黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的单糖种类相似，主要由2种酸性多糖(半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)和6种中性多糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、***糖)组成，但二者的单糖组成摩尔比存在显著差异。黑老虎茎叶多糖中半乳糖醛酸的占比最大(摩尔百分比为25.1％)，其次为半乳糖、***糖、葡萄糖醛酸。黑老虎果实多糖中半乳糖醛酸的占比最大(摩尔百分比为71.2％)，其次为***糖、木糖、葡萄糖醛酸。
表2黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的单糖组成分析
试验3、黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的结构分析
3.1利用同步热分析仪对黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的热性质进行表征，图1为黑老虎茎叶多糖热性质分析的TG曲线和DTG曲线，图2为黑老虎果实多糖热性质分析的TG曲线和DTG曲线。
图1、图2热性质分析的TG曲线显示，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖在25～800℃范围内出现三个阶段的质量变化模式。第一阶段的质量损失出现在大约60～190℃，黑老虎茎叶多糖质量剩余约86.1％，黑老虎果实多糖质量剩余约85.3％，损失部分可能是黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖样品中的游离水和结合水；第二阶段的质量损失发生在大约210～700℃，黑老虎茎叶多糖质量剩余约33.2％，黑老虎果实多糖质量剩余约28.6％，这是由于多糖结构在高温下发生解聚或本身出现降解；最后，随着温度的进一步升高，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的质量几乎保持不变。
DTG曲线显示在210～400℃范围内，黑老虎茎叶多糖出现一个峰(286.0℃)，黑老虎果实多糖出现两个峰(232.3℃，283.0℃)，说明黑老虎茎叶多糖由一个结构单元组成，黑老虎果实多糖可能由两个结构单元组成。黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖分别在286.0℃和232.3℃时失重速率最大，表明黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖分别在286.0℃和232.2℃温度下急剧分解，其应用温度应分别低于286.0℃和232.2℃。由此可见黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的热性质存在差异。
3.2利用红外光谱仪对黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的重要官能团进行表征。
图3为黑老虎茎叶多糖的红外光谱分析图，图4为黑老虎果实多糖的红外光谱分析图，结合图3与图4可以得出，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的吸收峰位置相似，但吸收峰的强度存在显著差异，例如在1740cm-1、1100cm-1附近的吸收峰存在很大的差异，说明黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的化学结构存在较大的差异。
3.3利用扫描电子显微镜及原子力显微镜对黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的微观结构进行表征。
通过扫描电子显微镜观察黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的形貌。图5中A、B分别为黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的扫描电子显微镜图(放大倍数为1000×)。黑老虎茎叶多糖主要呈现含有孔洞的光滑片状结构，其表面平整且具有结节状树枝，并存在致密的小凸起。黑老虎果实多糖主要呈现碎片结构，同时具有树枝状和不同尺寸的球形颗粒形貌，说明两者的差异较大。
通过原子力显微镜观察黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的形貌，图6中A、B分别为黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的原子力显微镜图，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖均呈现出不同的、分散的链状或网状结构，并具有一定分支，黑老虎茎叶多糖分支较少，黑老虎果实多糖呈现较多的分支，具有密集的分支结构和蜷曲缠绕的区域，说明从微观纳米层级来看，两种多糖存在一定的差异性。
试验4、黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的体外抗氧化活性测定
对黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖的DPPH自由基和ABTS自由基清除率进行测定，考察其体外抗氧化效果。由表3可知，黑老虎茎叶多糖和黑老虎果实多糖对DPPH自由基和ABTS自由基具有较好的清除效果，对DPPH、ABTS自由基的清除率随着多糖浓度的增加而显著提高。当多糖浓度为0.5mg/mL时，黑老虎茎叶多糖对DPPH自由基的清除率超过50％，略低于黑老虎果实多糖的DPPH清除率。黑老虎茎叶多糖对ABTS自由基的清除率与黑老虎果实多糖的相当，均达到98％以上。表明，黑老虎茎叶多糖对DPPH、ABTS自由基清除率具有较高的活性，具有良好的体外抗氧化作用。
表3黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖的体外抗氧化活性测定
试验5、黑老虎茎叶多糖体外胆酸盐结合能力评价
试验选择具有代表性的胆酸钠(SC)、甘氨胆酸钠(SGC)和牛磺胆酸钠(STC)作为吸附结合对象，研究黑老虎茎叶多糖的体外胆酸盐结合能力。结果显示黑老虎茎叶多糖对三种胆酸盐均具有一定的结合能力，每100mg黑老虎茎叶多糖可分别结合6.94mg SC，8.97mgSGC，10.58mg STC。而多糖降血脂的可能机制可以表述为：多糖结合胆酸盐，会促进肠道内胆汁酸的***，减少肠道内脂类包括胆固醇的吸收，由于肠道内的胆汁酸损失，肝脏内的胆固醇又转化为胆汁酸，这样一来肝脏中的胆固醇减少，使得肝细胞表面的(低密度脂蛋白)LDL受体活性增强数量增加，血液中的LDL-C经受体进入肝细胞，从而降低血液中的TC和LDL-C水平，达到降血脂目的。因此，黑老虎茎叶多糖在制备降血脂的药物或者保健品中具有潜在的应用价值。
结合试验1(两种多糖的理化性质分析)、试验2(两种多糖的单糖组成分析)、试验3(两种多糖的结构分析)可以得出，黑老虎茎叶多糖与黑老虎果实多糖为不同结构组成的多糖。试验4(多糖的体外抗氧化活性测定)与试验5(体外胆酸盐结合能力)表明，黑老虎茎叶多糖具有较强的抗氧化活性及胆酸盐结合能力，这可能与其高糖醛酸含量以及高度的分支结构特性有关。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (3)
1.黑老虎茎叶多糖，其特征在于，其由黑老虎植株蔓茎部位自茎叶末端截取长度为15-20cm包含嫩叶和藤蔓的部分为待提取材料提取得到；
其提取方法包括以下步骤：
1）将待提取材料经洗净、干燥、粉碎过筛得茎叶粉末；
2）按质量比1:4~5取茎叶粉末和体积分数为95%的乙醇水溶液，回流搅拌1~2h，转速为300~600 r/min，抽滤得滤渣，滤渣重复上述步骤三次并晾干；
3）将步骤2）得到的滤渣取1质量份与20~30质量份蒸馏水混合得到混合水溶液，回流搅拌3~4h，抽滤得滤液，将滤液采用截留分子量为12000Da的超滤膜进行超滤浓缩至5~6质量份，加入20~30质量份无水乙醇，4℃冷藏保存12~16h，离心，取下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，晾干，得粗多糖；
4）将步骤3）中的粗多糖采用Sevag试剂法除去蛋白得到上层溶液；
5）将步骤4）中的上层溶液进行透析，透析袋的截留分子量为3500Da，以流动蒸馏水透析48 h，将透析后的上层溶液真空冷冻干燥，得黑老虎茎叶多糖；
步骤1）中干燥为40℃热风干燥，过筛的目数为40目。
2.如权利要求1所述的黑老虎茎叶多糖，其特征在于，步骤4）中采用Sevag试剂法除去蛋白的方法为：按质量比为1:20:9.5~10.5取粗多糖、蒸馏水、Sevag试剂混合振荡，静置，于离心转速为4000 r/min下离心10 min，去除下层沉淀，再重复离心一次得到上层溶液；Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为4:1配制得到。
3.如权利要求1或2所述的黑老虎茎叶多糖在制备降血脂的药物中的应用。
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| Title |
|---|
| 黑老虎的研究进展;梁忠厚等;《湖南生态科学学报》;20170925(第03期);全文 * |
| 黑老虎籽功能成分分析及其应用前景展望;谢玮等;《食品研究与开发》;20160620(第12期);全文 * |
| 黑老虎茎叶营养成分检测及评价;廖苏奇等;《食品工业科技》;20210315;第42卷(第5期);第289-294页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113024683A (zh) | 2021-06-25 |
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Application publication date: 20210625 Assignee: Bobai Dayu agriculture and animal husbandry Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS Contract record no.: X2023980046199 Denomination of invention: Black Tiger Stem and Leaf Polysaccharides and Their Applications Granted publication date: 20220819 License type: Common License Record date: 20231107 |