CN113009144B - 一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括双层微流控芯片；单克隆检测抗体；荧光标记的IgG浓缩液；工作液和抗体稀释液；所述双层微流控芯片从下到上依次包括反应层衬底、微腔加样层和封盖层，所述反应层衬底包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的戊二醛，所述戊二醛上印刷有纯化的抗原条形码。本发明所公开的试剂盒和方法操作简单，性能稳定，成本低，检测灵敏度高，具有很好的应用价值。

Description

一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，特别涉及一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
随着肿瘤、血液***疾病患者的显著增加及临床输血医学的快速发展，输血用量逐年攀升。输血作为提升血小板计数，防止出血，保障患者生命安全的有效措施，其安全、科学、有效的输注已成为临床输血技术发展的必然要求。然而，目前大多数输血仍然采用随机输注，不相合的血液输入患者体内后迅速被机体免疫***破坏清除，导致血液输注无效症频繁发生，不仅浪费了宝贵的血液资源，而且延误了患者的最佳治疗时机，还增加了患者痛苦和经济负担。为改善这一现状，提高患者输血效果，部分临床医院新增开展了血液抗体检测项目。目前已存在的血型检测技术有：免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验；混合被动血凝技术、混合细胞粘附试验(固相技术)、特异的单克隆抗体对抗原固定试验等，但这些试验的操作程序都比较复杂，需要时间长，有的所需设备仪器昂贵，所以血型配型到目前还没有成为临床输血的常规检测项目，部分项目在临床开展过程中因准确性和灵敏度达不到安全输血要求，操作过于繁琐，逐渐被临床淘汰。目前临床常用的固相红细胞吸附试验技术(solid-phase red cell adherence,SPRCA)和单克隆特异的抗原固定试验(monoclonalantibody-specific immobilization of platelet antigens assay,MAIPA)，SPRCA技术原理为在反应板中包被抗血液单克隆抗体，血液悬液经离心洗涤后可在反应孔底部形成血液单层。加入血清或血浆，在孔中经过孵育后，若该血清或血浆中含有抗体，则该抗体与反应孔中的血液单层结合，未结合的成分通过洗涤被去除。加入抗人IgG及人IgG致敏红细胞(指示红细胞)，经离心后指示红细胞通过抗人IgG的桥连与血液单层上的抗体结合，因此阳性反应为指示红细胞平铺在反应孔底部表面。而阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央；MAIPA技术原理为血液先结合人的同种抗体，然后与不同的抗血液膜糖蛋白的(抗GPIb/CD42b、GPIIb/CD41a、GPIIIa、GPIX、HLA等)鼠抗人单克隆抗体孵育。经洗涤后裂解血液，将产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，经酶底物显色可以检测膜糖蛋白特异的同种抗体。
以上方法进行抗体定性检测时，其灵敏度和特异性仅有30％-40％，结果判读存在人为误差，约几个小时才能完成检测，不能满足临床医生的快速需求，同时该技术也没有相应的质控技术。为了克服临床上抗体检测方法灵敏度低，特异性差，临床操作复杂，检测时间过长，结果判读困难、缺乏相应的试剂质控等实际问题；现有微柱凝胶法进行的抗体检测指示红细胞一般会采用化学试剂(如戊二醛)将红细胞醛化处理，然后包被抗人IgG来指示反应结果，该方法不仅技术要求高，操作时间长(需静置过夜)，且醛化红细胞破坏抗原结构，容易造成漏检，因此限制了使用，难以达到临床快速安全配血要求。因此，需要建立灵敏，快速，低成本且易于操作的抗体检测***。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法，以达到对抗体检测具有快速、低成本、操作简便、检测精确的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒，包括双层微流控芯片、单克隆检测抗体；荧光标记的IgG浓缩液；工作液和抗体稀释液；所述双层微流控芯片从下到上依次包括反应层衬底、微腔加样层和封盖层，所述反应层衬底包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的戊二醛，所述戊二醛上印刷有纯化的特异性抗原条形码。
上述方案中，所述微腔加样层上设有多个上下贯通的通孔，多个所述通孔与多个所述抗原条形码一一对应形成多个反应池；所述封盖层底部设有多个微流道凹槽，多个所述微流道凹槽与多个反应池一一对应，所述微流道凹槽的两端分别设有上下贯通所述封盖层的流入孔和流出孔。
上述方案中，所述工作液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5％的牛血清蛋白溶液。
上述方案中，所述抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为0.5-5％的牛血清蛋白溶液。
上述方案中，所述DPBS溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01-0.1mol/L。
上述方案中，所述单克隆抗体浓度大于100ug/ml。
上述方案中，所述IgG浓缩液浓度大于100ug/ml，IgG浓缩液的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500。
一种基于微流控技术的抗体检测方法，采用上述的基于微流控技术的抗体检测试剂盒，包括如下步骤：
(1)从流入孔分别注入不同的待测样本单克隆检测抗体，孵育10-40min,使待测样本中的抗体和单克隆检测抗体充分与反应层衬底上的特异性抗原结合，孵育完成之后，从流出孔将多余的液体抽干，并且用BSA冲洗，将没有吸附在反应层衬底上的待测抗体冲洗干净；
(2)从流入孔分别注入荧光标记的IgG浓缩液，孵育10-40min，使荧光标记的IgG浓缩液充分与反应层衬底上的待测样本中的抗体特异性结合，孵育完成之后，从流出孔将多余的液体抽干并且用BSA冲洗，将没有吸附在反应层衬底上的荧光标记的IgG浓缩液冲洗干净；
(3)将反应层衬底取下，通过检测光学信号的强度和对标单克隆检测抗体检测信号，从而实现对抗体的荧光检测。
通过上述技术方案，本发明提供的一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法具有如下有益效果：
本发明的试剂盒中使用双层微流控芯片，自组装戊二醛与微流控芯片集成，在戊二醛上印刷纯化的特异性抗原条形码，微腔加样层上的通孔，与多个特异性抗原条形码一一对应形成多个反应池，可对标本同时进行多个生化或化学指标的检测，极大程度的减少传统的抗体定量分析过程中工作液和检测样本的用量，简化步骤，灵敏度高。本发明结构简单，性能稳定，成本低，具有显著的进步性和良好的推广应用价值。该芯片在使用时仅有流出孔、流入孔与外界连通，大部分反应过程均在较封闭的微流道***中完成，有效降低外部环境对反应和检测过程的干扰；且上述芯片结构简单，易于集成和结合配套的自动化设备实现自动化检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的一种双层微流控芯片结构示意图；
图2为本发明实施例所公开的反应层衬底结构示意图；
图3为本发明实施例所公开的微腔加样层结构示意图；
图4为本发明实施例所公开的封盖层背面结构示意图；
图5为本发明实施例的标准曲线；
图6为5例血液***疾病患者和5例健康对照者血清CD41a检测结果柱状图。
图中，1、反应层衬底；2、微腔加样层；3、封盖层；4、抗原条形码；5、通孔；6、微流道凹槽；7、流入孔；8、流出孔。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例提供了一种基于微流控技术的血小板抗体检测试剂盒，包括双层微流控芯片、CD41a单克隆检测抗体、CD42b单克隆检测抗体、GPIIIa单克隆检测抗体、GPIX单克隆检测抗体和HLA单克隆检测抗体；荧光标记的羊抗小鼠IgG浓缩液；工作液和抗体稀释液。
如图1所示，双层微流控芯片从下到上依次包括反应层衬底1、微腔加样层2和封盖层3，如图2所示，反应层衬底1包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的戊二醛，戊二醛上印刷有纯化的鼠抗人重组蛋白CD41a、CD42b、GPIIIa、GPIX和HLA特异性抗原条形码4。
如图3所示，微腔加样层上设有多个上下贯通的通孔5，多个通孔5与多个抗原条形码4一一对应形成多个反应池；如图4所示，封盖层3底部设有多个微流道凹槽6，多个微流道凹槽6与多个反应池一一对应，微流道凹槽6的两端分别设有上下贯通封盖层的流入孔7和流出孔8。
本实施例中，工作液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为3％的牛血清蛋白溶液。
本实施例中，抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液。
本实施例中，DPBS溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.05mol/L。
本实施例中，单克隆抗体浓度大于100ug/ml。
本实施例中，Alexa Fluor 488-羊抗小鼠IgG浓缩液浓度大于100ug/ml，AlexaFluor 488-羊抗小鼠IgG浓缩液的工作浓度稀释倍数为1:200。
本发明实施例还提供了一种基于微流控技术的血小板抗体检测方法，采用上述的基于微流控技术的血小板抗体检测试剂盒，包括如下步骤：
(1)从流入孔6分别注入不同的待测样本和单克隆检测抗体，孵育20min，使待测样本中的抗体和单克隆检测抗体充分与反应层衬底上的特异性抗原结合，孵育完成之后，从流出孔7将多余的液体抽干，并且用质量浓度为1％的BSA冲洗，将没有吸附在反应层衬底上的待测抗体冲洗干净；
(2)从流入孔6分别注入荧光标记的羊抗小鼠IgG浓缩液，孵育,20min，使荧光标记的羊抗小鼠IgG浓缩液充分与反应层衬底上的待测样本中的抗体特异性结合，孵育完成之后，从流出孔7将多余的液体抽干并且用质量浓度为1％的BSA冲洗，将没有吸附在反应层衬底上的荧光标记的羊抗小鼠IgG浓缩液冲洗干净；
(3)将反应层衬底1取下，通过微阵列扫描仪检测光学信号的强度和对标单克隆检测抗体检测信号，从而实现对血小板抗体的荧光检测。检测波长为488nm，并给出检测结果，总的检测时间为30min，每个标准品分别使用3个反应池测定3次取其结果的平均值，绘制标准曲线。
(4)结果判断
①配制浓度以10为底取对数作为横坐标，荧光值以10为底取对数为纵坐标作图，绘制标准曲线，以CD41a为例，拟合公式为lg[f(x)]＝1.07252+0.53353lgx，标准曲线见图5。
②选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量GenePix 4400微阵列扫描仪的随机软件得出样本阈值荧光值和校对样本荧光值，根据标准曲线得到的荧光值与浓度的关系式，将测量的荧光值带入，得到CD41a的含量。5例血液***疾病患者和5例健康对照者血清CD41a检测结果见图6。
以5例血液***疾病患者作为血液***疾病组，5例健康对照者作为非血液***疾病组，绘制柱状图，结果表明，采用本试剂盒进行血小板抗体浓度检测的最低检测限为5pg/mL，检测范围为5-50000pg/mL。通过将检测结果和现有的商业化检测方法(电化学方法)的检测结果进行对比，发现使用本发明试剂盒得出的检测结果和现有的商业化检测方法(电化学方法)的结果检测结果具有高度一致性，表明使用本发明试剂盒得出的检测结果具有准确性。同时，通过对同一血清样本进行多次(本实施例中采用10次)测定，获得的检测结果之间的变异系数均小于10％，表明本检测试剂盒具有良好的重复性，可以进一步作为血液***疾病医学诊断的参考。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种基于微流控技术的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，包括双层微流控芯片、CD41a单克隆检测抗体、CD42b单克隆检测抗体、GPIIIa单克隆检测抗体、GPIX单克隆检测抗体和HLA单克隆检测抗体；Alexa Fluor 488-羊抗小鼠IgG浓缩液；工作液和抗体稀释液；
双层微流控芯片从下到上依次包括反应层衬底(1)、微腔加样层(2)和封盖层(3)，反应层衬底1包括载玻片基板和组装于载玻片基板上的戊二醛，戊二醛上印刷有纯化的鼠抗人重组蛋白CD41a、CD42b、GPIIIa、GPIX和HLA特异性抗原条形码(4)；
微腔加样层上设有多个上下贯通的通孔(5)，多个通孔(5)与多个抗原条形码(4)一一对应形成多个反应池；
封盖层(3)底部设有多个微流道凹槽(6)，多个微流道凹槽(6)与多个反应池一一对应，微流道凹槽(6)的两端分别设有上下贯通封盖层的流入孔(7)和流出孔(8)；
所述工作液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为3％的牛血清蛋白溶液；
所述抗体稀释液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液；
所述DPBS溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.05mol/L；
单克隆抗体浓度大于100ug/ml；
所述Alexa Fluor 488-羊抗小鼠IgG浓缩液浓度大于100ug/ml，AlexaFluor 488-羊抗小鼠IgG浓缩液的工作浓度稀释倍数为1:200。
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