CN113008820B - 一种测定巯基含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定巯基含量的方法，涉及一种利用Ellman试剂快速测定巯基的方法。本发明是要解决现有的检测巯基含量的方法中滴定法易被共存物质干扰，影响滴定结果；电化学法检测环境要求十分苛刻；色谱法仪器成本高昂的技术问题。本发明的测定巯基含量的方法是按以下步骤进行的：一、绘制标准曲线；二、测定样品巯基含量。本发明提供一种成本低、操作便捷、灵敏度良好且运用广泛的测定巯基含量的新方法。本发明中的Ellman试剂选择PBS缓冲溶液，能够促进NTB‑离子化完全，生成NTB2‑二价阴离子，从而可以通过紫外分光光度法测试浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用Ellman试剂快速测定巯基的方法。
背景技术
巯基是一类重要的含硫官能团，巯基相关化合物已经广泛应用于生物学、医学、环境学、材料学等各个领域，故对于巯基的检测无论是在医学领域、实验室科学研究或是在实际工程中都有着十分重要的意义。检测巯基含量是研发新型材料中举足轻重的一步，其可作为判断材料性能好坏的重要依据之一；同时巯基类化合物被视为生物活性物质，对相关疾病的检测及诊断等医学领域的研究也十分重要。目前巯基的检测技术主要基于两方面，一是自身的物化性质，二是相关衍生物的物化性质。其中，滴定法易被共存物质干扰，影响滴定结果；电化学法检测环境要求十分苛刻；色谱法仪器成本高昂。
因此，发明一种成本低、操作便捷、灵敏度良好且运用广泛的测定巯基含量的新方法已是急需解决的问题。
发明内容
本发明是要解决现有的检测巯基含量的方法中滴定法易被共存物质干扰，影响滴定结果；电化学法检测环境要求十分苛刻；色谱法仪器成本高昂的技术问题，而提供一种测定巯基含量的方法。
本发明的测定巯基含量的方法是按以下步骤进行的：
一、绘制标准曲线：用无水乙醇作为溶剂配置5mmol/L的巯基乙酸标准溶液，然后取不同体积的巯基乙酸标准溶液分别加至多个10mL的比色管中，在每个比色管中分别加入200μL的Ellman试剂，再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min～20min充分混合均匀，得到不同浓度的巯基乙酸溶液，巯基乙酸溶液的浓度记为x；
在紫外分光光度计中以PBS缓冲溶液为参比溶液将吸光度清零，然后用紫外分光光度计测定不同浓度的巯基乙酸溶液在412nm的吸光度，吸光度记为y；绘制标准线性曲线y＝ax+b，所述的y的单位为abs，x的单位为mmol/L，a和b均为常数；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2；
二、测定样品巯基含量：将注射器的注射头上安装PES过滤头；称取质量为m的待测含巯基样品，然后加入5mL的离心管中，依次加入1mL的PBS缓冲溶液、0.5mL的无水乙醇和200μL的Ellman试剂，超声10min～15min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中，推动注射器将其中的液体推入10mL比色管内，使用PBS缓冲溶液将10mL比色管定容至刻度线，混合均匀并静止15min后，使用紫外分光光度计测量其在412nm波长的吸光度y，将y值带入步骤一的标准线性曲线y＝ax+b中，算出待测含巯基样品的巯基浓度x，再通过公式C＝10x/m计算得到其巯基含量C；所述的m的单位为mg，y的单位为abs，x的单位为mmol/L，C的单位为mmol/g；
所述的PES过滤头的孔径为0.22μm；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2。
本发明提供一种成本低、操作便捷、灵敏度良好且运用广泛的测定巯基含量的新方法。
本发明中的Ellman试剂选择PBS缓冲溶液，能够促进NTB-离子化完全，生成NTB2-二价阴离子，从而可以通过紫外分光光度法测试浓度。
附图说明
图1为试验一中的标准线性曲线图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式为一种测定巯基含量的方法，具体是按以下步骤进行的：
一、绘制标准曲线：用无水乙醇作为溶剂配置5mmol/L的巯基乙酸标准溶液，然后取不同体积的巯基乙酸标准溶液分别加至多个10mL的比色管中，在每个比色管中分别加入200μL的Ellman试剂，再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min～20min充分混合均匀，得到不同浓度的巯基乙酸溶液，巯基乙酸溶液的浓度记为x；
在紫外分光光度计中以PBS缓冲溶液为参比溶液将吸光度清零，然后用紫外分光光度计测定不同浓度的巯基乙酸溶液在412nm的吸光度，吸光度记为y；绘制标准线性曲线y＝ax+b，所述的y的单位为abs，x的单位为mmol/L，a和b均为常数；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2；
二、测定样品巯基含量：将注射器的注射头上安装PES过滤头；称取质量为m的待测含巯基样品，然后加入5mL的离心管中，依次加入1mL的PBS缓冲溶液、0.5mL的无水乙醇和200μL的Ellman试剂，超声10min～15min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中，推动注射器将其中的液体推入10mL比色管内，使用PBS缓冲溶液将10mL比色管定容至刻度线，混合均匀并静止15min后，使用紫外分光光度计测量其在412nm波长的吸光度y，将y值带入步骤一的标准线性曲线y＝ax+b中，算出待测含巯基样品的巯基浓度x，再通过公式C＝10x/m计算得到其巯基含量C；所述的m的单位为mg，y的单位为abs，x的单位为mmol/L，C的单位为mmol/g；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的PES过滤头的孔径为0.22μm。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中取7个不同体积的巯基乙酸标准溶液分别加至7个10mL的比色管中。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min充分混合均匀。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二中超声10min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中。其他与具体实施方式四相同。
用以下试验对本发明进行验证：
试验一：本试验为为一种测定巯基含量的方法，具体是按以下步骤进行的：
一、绘制标准曲线：用无水乙醇作为溶剂配置5mmol/L的巯基乙酸标准溶液，然后分别取0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.2mL、0.24mL和0.28mL的巯基乙酸标准溶液分别加至7个10mL的比色管中，在每个比色管中分别加入200μL的Ellman试剂，再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min充分混合均匀，得到不同浓度的巯基乙酸溶液，巯基乙酸溶液的浓度记为x；
在紫外分光光度计中以PBS缓冲溶液为参比溶液将吸光度清零，然后用紫外分光光度计测定不同浓度的巯基乙酸溶液在412nm的吸光度，吸光度记为y；绘制标准线性曲线y＝ax+b(见图1)，所述的y的单位为abs，x的单位为mmol/L，a和b均为常数，a为6.967，b为0.14；测试结果见表1；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2；
表1
二、测定样品巯基含量：将注射器的注射头上安装PES过滤头；称取质量为m(3mg)的待测含巯基样品，然后加入5mL的离心管中，依次加入1mL的PBS缓冲溶液、0.5mL的无水乙醇和200μL的Ellman试剂，超声10min～15min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中，推动注射器将其中的液体推入10mL比色管内，使用PBS缓冲溶液将10mL比色管定容至刻度线，混合均匀并静止15min后，使用紫外分光光度计测量其在412nm波长的吸光度y，重复三次测试，数据如表2，将y值带入步骤一的标准线性曲线y＝ax+b中，算出待测含巯基样品的巯基浓度x，见表3，再通过公式C＝10x/m计算得到其巯基含量C，见表3，巯基含量C的平均值为0.701040167mmol/g；所述的m的单位为mg，y的单位为abs，x的单位为mmol/L，C的单位为mmol/g；
步骤二中所述的PES过滤头的孔径为0.22μm；
所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2。
表2
| 实验次数 | 吸光度Y(abs) |
| 1 | 1.579 |
| 2 | 1.642 |
| 3 | 1.598 |
表3
本试验提供一种成本低、操作便捷、灵敏度良好且运用广泛的测定巯基含量的新方法。本试验中的Ellman试剂选择PBS缓冲溶液，能够促进NTB-离子化完全，生成NTB2-二价阴离子，从而可以通过紫外分光光度法测试浓度。
Claims (4)
1.一种测定巯基含量的方法，其特征在于测定巯基含量的方法是按以下步骤进行的：
一、绘制标准曲线：用无水乙醇作为溶剂配置5mmol/L的巯基乙酸标准溶液，然后取不同体积的巯基乙酸标准溶液分别加至多个10mL的比色管中，在每个比色管中分别加入200μL的Ellman试剂，再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min~20min充分混合均匀，得到不同浓度的巯基乙酸溶液，巯基乙酸溶液的浓度记为x；
在紫外分光光度计中以PBS缓冲溶液为参比溶液将吸光度清零，然后用紫外分光光度计测定不同浓度的巯基乙酸溶液在412nm的吸光度，吸光度记为y；绘制标准线性曲线y=ax+b，所述y的单位为abs，x的单位为mmol/L，a和b均为常数；
二、测定样品巯基含量：将注射器的注射头上安装PES过滤头；称取质量为m的待测含巯基样品，然后加入5mL的离心管中，依次加入1mL的PBS缓冲溶液、0.5mL的无水乙醇和200µL的Ellman试剂，超声10min~15min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中，推动注射器将其中的液体推入10mL比色管内，使用PBS缓冲溶液将10mL比色管定容至刻度线，混合均匀并静止15min后，使用紫外分光光度计测量其在412nm波长的吸光度y，将y值带入步骤一的标准线性曲线y=ax+b中，算出待测含巯基样品的巯基浓度x，再通过公式C=10x/m计算得到其巯基含量C；所述m的单位为mg，y的单位为abs，x的单位为mmol/L，C的单位为mmol/g；所述的PES过滤头的孔径为0.22μm；
步骤一和步骤二中所述的Ellman试剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和PBS缓冲溶液混合而成，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2mg:1mL；
步骤一和步骤二中所述的PBS缓冲溶液的pH为7.8，为磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液超声混合均匀制成，磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸氢二钾水溶液的浓度为0.06mol/L，磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钾水溶液的体积比为8:2。
2.根据权利要求1所述的一种测定巯基含量的方法，其特征在于步骤一中取7个不同体积的巯基乙酸标准溶液分别加至7个10mL的比色管中。
3.根据权利要求1所述的一种测定巯基含量的方法，其特征在于步骤一中再使用PBS缓冲溶液定容至刻度线，超声15min充分混合均匀。
4.根据权利要求1所述的一种测定巯基含量的方法，其特征在于步骤二中超声10min使其混合均匀充分反应，然后装入安装PES过滤头的注射器中。
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