CN103149179A - 利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针定量检测蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用[Co(NH3)6]3+-DNA(脱氧核糖核酸)共振光散射(RLS)探针定量检测蛋白质的方法。本发明利用[Co(NH3)6]3+-DNA复合物与蛋白质之间强的静电作用，引起蛋白质的共振光散射信号的强烈增强，来检测标准牛血清白蛋白(BSA)。在波长346.0nm处增强的共振光散射强度与BSA的浓度在0.05～1.2μg/mL范围内有良好的线性关系。本发明应用于人血清白蛋白等多种蛋白质的共振光散射响应值差别的比较，以及实际人血清样品中总蛋白含量的测定，均取得好的效果。方法灵敏度较高，准确可靠，检测体系简单，为定量检测痕量蛋白质建立了一种实用的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种共振光散射技术检测分析蛋白质含量的方法，属于蛋白质检测技术领域。
背景技术
蛋白质是生物体内最重要的物质之一，是生命的物质基础。蛋白质种类及其含量的测定对于生化分析和疾病诊断具有十分重要的意义。目前，传统的蛋白质测定方法有吸光光度法(包括凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝法)和荧光光度法。其中吸光光度法主要缺点是灵敏度较低，不能用于分析蛋白质浓度较低的生物样品；荧光光度法仅限于具有荧光的体系，使其适用范围受到限制。还有出现的一些发明方法，如欧洲专利G01N33/68A12、美国专利US2010047913等，将液相层析和质谱联用，虽然提高了检测的灵敏度及准确性，但是由于设备昂贵、耗时较长、操作较复杂，限制了其使用。因此寻找新的蛋白质检测方法具有重要的意义。
共振光散射(Resonance Light Scattering，RLS)分析方法是一种能在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射分析技术，在研究生物大分子识别、组装和聚集时出现灵敏而丰富的信号，可取得与常用的荧光法同样高的灵敏度。1993年，Pasternack等首次用共振光散射技术研究实现了卟啉类化合物在核酸上的聚集。目前这种技术被广泛应用于核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的定量检测，以及用于生物大分子间、生物大分子与其他物质之间相互作用机理的研究。
现有文献的报道中，大多采用有机染料探针或金属离子指示剂对生物大分子蛋白质和核酸展开共振光散射光谱分析，还有利用量子点共振光散射来定量检测蛋白质等生物大分子等。但对于简单金属络合物[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白质体系的共振光散射研究及其在蛋白质分析中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测蛋白质的方法，能够快速、灵敏、准确地检测出实际样品中的痕量蛋白质含量。
根据共振光散射理论，粒子体积的增大和强静电结合及大结合数所导致的高度的电子离域共轭，都会产生强烈的共振光散射现象。本发明中，六氨合钴离子与DNA分子发生静电结合，同时由于DNA与蛋白质分子相互交联在一起，形成生物复合体。最终形成[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白质体系，导致蛋白质体积急剧增大，相应的共振光散射信号较之蛋白质、[Co(NH3)6]3+-蛋白质、DNA-蛋白质体系都得以强烈的增强。本发明利用上述特性和原理，在一定的蛋白质浓度范围内，共振光散射的信号增强与蛋白质的浓度具有线性关系，从而能够检测出含很低浓度的蛋白质的复杂样品。
技术方案包括如下步骤：
1.依次加入0.7mL10μg/mL的小牛胸腺DNA(ctDNA)溶液，1.5mL的Britton-Robinson(BR)缓冲溶液(pH3.78)，0.1mL的1mmol/L[Co(NH3)6]Cl3溶液，每加一种试剂都将体系用旋涡混合器混合。最后在上述混合溶液中，分别加入1组蛋白质含量为0～2.0μg/mL已知浓度且浓度不同的标准组蛋白质溶液，以及待测的未知浓度的实验组蛋白质溶液。最后分别将各个混合溶液摇匀，再用二次蒸馏水稀释至10mL。
2.将上述步骤1所得的各种混合溶液，于混合摇匀后放置1小时，在荧光分光光度计上进行同步扫描(λex＝λem)，获得200.0nm～700.0nm之间的RLS光谱，并在346.0nm处测定RLS强度。设定扫描的激发和发射狭缝宽度均为5nm，负高压为400V。
3.结合标准组蛋白质溶液的已知蛋白质浓度(C)与其增强的共振光散射强度(ΔI)绘制标准曲线，得到测量蛋白质的线性范围、线性回归方程ΔI＝aC+b，以及线性相关系数。
4.根据标准曲线的回归方程和实验组蛋白质溶液增强的共振光散射强度，计算实验组蛋白质溶液浓度。
本发明的有益效果是：利用[Co(NH3)6]3+-DNA-蛋白质体系产生共振光散射信号的强烈增强现象，用于定量检测不同样品中痕量蛋白质的含量，具有灵敏度高、准确可靠、经济实用等特点，能够广泛应用于蛋白质痕量定量检测领域，在农业质量检测、食品营养标准检测、临床医学、疾病诊断等领域具有应用价值。
附图说明
图1为不同蛋白质体系的共振光散射光谱图
图2为检测牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线
具体实施方式
实施例1：绘制标准曲线
1.DNA贮备液：准确称量小牛胸腺DNA(ctDNA，Sigma D-1501)，直接溶于二次蒸馏水中配制成10μg/mL的溶液，于0～4℃冰箱中保存；BSA贮备液：准确称取牛血清白蛋白(BSA)，直接溶于二次蒸馏水中配成100μg/mL的溶液，于0～4℃冰箱中保存；配制pH1.8～11.9的一系列Britton-Robinson(BR)缓冲溶液；以CoCl2·6H2O为原料，制得[Co(NH3)6]Cl3晶体，直接溶解于二次蒸馏水中，配制成10-3mol/L的储备液。
2.分别在10mL比色管中，依次加入0.7mL10μg/mL的ctDNA贮备液，1.5mL的BR缓冲溶液(pH3.78)，0.1mL1mmol/L的[Co(NH3)6]Cl3溶液，以及分别加入0.005mL、0.008mL、0.01mL、0.03mL、0.05mL、0.08mL、0.10mL、0.12mL、0.15mL、0.20mL的100μg/mL BSA贮备液作为标准组溶液。每加一种试剂都将体系用旋涡混合器混合，最后将试液用二次蒸馏水稀释至刻度。
3.将上述步骤2所得的BSA标准组溶液，于混合摇匀后放置1小时，在荧光分光光度计上进行同步扫描(λex＝λem)，获得200.0nm～700.0nm之间的RLS光谱，并在346.0nm处测定RLS强度。设定扫描的激发和发射狭缝宽度均为5nm，负高压为400V。
4.结合标准组蛋白质溶液的已知蛋白质浓度(C)与其增强的共振光散射强度(ΔI)绘制标准曲线，如图2所示。BSA的浓度在0.05μg/mL～1.20μg/mL的范围内，与增强的RLS信号之间有良好的线性关系。线性回归方程为Δt＝88.80C-1.30，线性相关系数为0.991，表明该方法具有很高的灵敏度。
实施例2：多种蛋白质的响应差别
1.分别在10mL比色管中，依次加入0.7mL10μg/mL的ctDNA溶液，1.5mL的BR缓冲溶液(pH3.78)，0.1mL1mmol/L的[Co(NH3)6]Cl3溶液，以及分别加入0.1mL的100μg/mL的牛血清白蛋白溶液、人血清白蛋白溶液、胰岛素溶液、明胶溶液、鸡蛋白溶液、γ-球蛋白溶液。每加一种试剂都将体系用旋涡混合器混合，最后将试液用二次蒸馏水稀释至刻度。
2.将上述步骤1所得浓度为1.0μg/mL的不同种类的蛋白质溶液，混合摇匀后各放置1小时，并在荧光分光光度计上分别进行同步扫描(λex＝λem)，获得200.0nm～700.0nm之间的RLS光谱，并在346.0nm处测定RLS强度，如表1所示。设定扫描的激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，负高压为400V。
3.由表1可知，各蛋白质响应信号的大小基本符合它们分子量大小的顺序，也就是说该分析方法的响应信号主要取决于蛋白质体积的大小，这与共振光散射理论是相符合的。
表1不同蛋白质的共振光散射响应值
实施例3：人血清试样中总蛋白含量的测定
1.分别取2份新鲜的人血清样品(由河北农业大学医院提供)0.2mL置于100mL容量瓶中，用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
2.在10mL比色管中，依次加入0.7mL10μg/mL的ctDNA溶液，1.5mL的BR缓冲溶液(pH3.78)，0.1mL1mmol/L的[Co(NH3)6]Cl3溶液，最后分别加入上述步骤1中贮备好的人血清样本0.1mL，每加一种试剂都将体系用旋涡混合器混合，最后将试液用二次蒸馏水稀释至刻度。
3.将上述步骤2所得的人血清样本溶液，混合摇匀后各放置1小时，并在荧光分光光度计上分别进行同步扫描(λex＝λem)，获得200.0nm～700.0nm之间的RLS光谱，并在346.0nm处测定RLS强度。设定扫描的激发和发射狭缝宽度均为5.0nm，负高压为400V。
4.根据测量样品中RLS强度的增强值(ΔI)，在实施例1中所获得的标准曲线上查出人血清总蛋白质的含量(C)。
5.用传统的考马斯亮蓝法(CBB G-250)进行上述2份人血清样本中总蛋白含量的测定，并将结果与本发明方法测量结果进行比较。采用本发明的RLS方法分别对两个样品重复三次测量，测量结果的平均回收率和相对标准偏差(RSD)均列于表2中。
6.从表2中的RLS方法分别对两个样品重复三次测量结果的平均回收率和相对标准偏差(RSD)的数值可以看出，本发明分析方法准确可靠，可用于实际样品的测定，具有广泛的应用价值。
表2人血清总蛋白含量的分析
Claims (5)
1.一种利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针定量检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)依次加入小牛胸腺ctDNA溶液、Britton-Robinson(BR)缓冲溶液、[Co(NH3)6]Cl3溶液，最后分别加入1组已知浓度的标准组蛋白质溶液，和待测的未知浓度的实验组蛋白质溶液，各个混合溶液摇匀稀释；
(2)步骤(1)所得的各混合溶液分别放置1小时后，在200.0nm～700.0nm下进行同步荧光扫描，获得其共振光散射光谱，并在346.0nm处测定共振光散射强度；
(3)结合标准组蛋白质溶液的浓度(C)与其增强的共振光散射强度(ΔI)绘制标准曲线，得到ΔI与C之间的线性回归方程，以及该方法测量蛋白质的线性范围；
(4)根据测量蛋白质标准曲线的回归方程和实验组蛋白质溶液增强的共振光散射强度，计算实验组蛋白质溶液的浓度。
2.权利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针检测蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，混合试剂的用量比为DNA∶BR缓冲液∶[Co(NH3)6]Cl3＝(7μg∶1.5mL∶10-4mmol)/10mL。
3.权利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针检测蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用pH为3.78的Britton-Robinson缓冲溶液控制待测溶液的酸度。
4.权利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针检测蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所加入几种试剂的次序，以及每加入一种试剂都将体系旋涡混合均匀。
5.权利要求1所述利用[Co(NH3)6]3+-DNA共振光散射探针检测蛋白质的方法，其特征在于，验证了该发明方法可以应用于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素、明胶、鸡蛋白、γ-球蛋白，以及人血清样本中总蛋白含量的检测。
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