CN113005194A - 检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法,所述引物组合物包括特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域及特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物,本发明可用于分析亲本来源的染色体小片段异常,根据男方、女方及子代或男方、女方、携带异常片段一方的父母,根据家系关系及单体型分析原理确定染色体异常片段的风险染色体,进而通过分析胚胎单体型判读胚胎的染色体小片段异常的遗传情况,本发明扩大了胚胎植入前单基因遗传学检测可应用的范围,经过实验证明效果可靠。
Description
【技术领域】
本发明涉及胚胎移植检测技术领域,尤其涉及一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法。
【背景技术】
人类已知的染色体疾病有200多种。大多数染色体疾病由染色体数目异常引起,以唐氏综合征最为普遍。另有一部分染色体疾病因缺失或重复一段染色体片段(染色体拷贝数变异,copy number variations,CNVs)而引起,统称为染色体微缺失/微重复综合征。染色体微缺失/微重复主要指小于5Mb大小的染色体片段异常,染色体拷贝数变异在临床症状诊断不明和识别胎儿染色体疾病方面具有重要作用。染色体疾病临床表型多样,表现为多发性先天畸形、肢体残疾、发育迟缓、智力障碍、癫痫症、自闭症和学习障碍等(J Mol Diagn2014,16:519e526;http://dx.doi.org/10.1016/j.jmoldx.2014.05.002)。
染色体微缺失/微重复部分起因于上代生殖细胞和受精卵的遗传物质突变。杜绝遗传病患儿的出生仍是目前最有效的手段,以往通过产前诊断在妊娠16-20周进行选择性流产,阻止患儿的出生。植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是辅助生殖技术和分子生物学技术相结合而发展起来的一门新的诊断技术,通过胚胎活检技术获得5-10个囊胚期细胞进行遗传学诊断分析(《胚胎植入前遗传学诊断/筛查专家共识》,中华医学遗传学杂志2018,35(2):151-155),选择正常、无缺陷的健康胚胎植入子宫继续妊娠,达到优生的目的,可以避免传统的产前诊断技术引起的出血、感染等并发症以及流产和引产给孕妇造成的身心痛苦,并避免由此引起的伦理上的争议。
目前检测胚胎植入前检测染色体拷贝数的方法主要有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、微阵列比较基因组杂交(arraycomparative genomic hybridization,aCGH)、单核苷酸多态性微阵列技术(SNP array)和高通量测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)。采用FISH进行染色体拷贝数分析,需提前验证患者夫妇外周血中期染色体的核型,同时在间期核上检测分析探针的荧光强度及特异性。微阵列技术技术难度高、缺少专业知识和高成本。目前PGT-A和PGT-SR技术检测胚胎染色体拷贝数异常的分辨率约为4-10Mb,不能满足检测胚胎染色体微缺失/微重复的需要。
因此,有必要研究一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法来应对现有技术的不足,以解决或减轻上述一个或多个问题。
【发明内容】
有鉴于此,本发明提供了一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法,可用于分析亲本来源的染色体小片段异常,根据男方、女方及子代或男方、女方、携带异常片段一方的父母,根据家系关系及单体型分析原理确定染色体异常片段的风险染色体,进而通过分析胚胎单体型判读胚胎的染色体小片段异常的遗传情况,本发明扩大了胚胎植入前单基因遗传学检测可应用的范围,经过实验证明效果可靠。
一方面,本发明提供一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物,所述引物组合物包括特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域及特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述特异扩增Xq22.2染色体小片段为人类特异扩增Xq22.2染色体小片段异常。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域的序列为SEQID NO:151-181引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物序列为SEQID NO:1-150和182-289引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述引物组合物包括SEQID NO:1-289的全部引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种胚胎植入前的检测产品,所述检测产品由所述的引物组合物制备而成。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述检测产品为检测试剂盒。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述检测试剂盒包括:
用于文库构建的反应试剂,包括:特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液;
用于纯化PCR的反应产物的试剂,包括产物纯化磁珠及缓冲液。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种实现方式,所述检测试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
如上所述的方面和任一可能的实现方式,进一步提供一种胚胎植入前的检测方法,通过所述的检测产品实现,所述检测方法包括以下步骤:
S1:分离样本基因组DNA;
S2:利用引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA;
S3:纯化PCR产物,测序;
S4:比对与统计;
S5:数据分析。
与现有技术相比,本发明可以获得包括以下技术效果:
1)通用性:本发明的方法对dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常区域在内的289个SNP进行分析,可用于基因诊断和不同配偶的胚胎移植前诊断;
2)dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常区域和多位点SNP测序:基于第二代测序技术,本发明可以对dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常区域和dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常区域附近的多个SNP进行分析,不需依赖已知的探针和设计探针;
3)高通量:基于高通量测序技术,本发明可以高通量地进行dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常的检测,通过在每个样品上加上不同的标签序列,可以一次地对大量样品进行分析;
4)成本低:随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低,本发明对dupXq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常分析的成本也在不断下降;
5)高灵敏度:可用于3~5个细胞的分析。因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测;
6)特异性:本发明选取千人基因组计划数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)中dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段上下游2Mb范围内CHB(北方汉人)和CHS(南方汉人)最小等位基因频率均大于0.2的高频多态性位点,去除多聚核苷酸(polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70%的多态性位点,并选择unique比对到人类基因组hg19的258个SNP位点和dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段区域作为目标区域设计了共289对引物,这些引物具有很高的特异性。
当然,实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案,下面对本发明实施例进行详细描述。
应当明确,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。
本发明提供了一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法,可用于分析亲本来源的染色体小片段异常,根据男方、女方及子代或男方、女方、携带异常片段一方的父母,根据家系关系及单体型分析原理确定染色体异常片段的风险染色体,进而通过分析胚胎单体型判读胚胎的染色体小片段异常的遗传情况,本发明扩大了胚胎植入前单基因遗传学检测可应用的范围,经过实验证明效果可靠。
所述引物组合物包括特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域及特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物。所述特异扩增Xq22.2染色体小片段为人类特异扩增Xq22.2染色体小片段异常。所述特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域的序列为SEQID NO:151-181引物对。所述特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物序列为SEQID NO:1-150和182-289引物对。所述引物组合物包括SEQID NO:1-289的全部引物对。
本发明还提供了一种胚胎植入前的检测产品,所述检测产品由所述的引物组合物制备而成。所述检测产品为检测试剂盒。所述检测试剂盒包括:
用于文库构建的反应试剂,包括:特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液;
用于纯化PCR的反应产物的试剂,包括产物纯化磁珠及缓冲液;
阴性质控品和阳性质控品。
本发明还提供了一种胚胎植入前的检测方法,通过所述的检测产品实现,所述检测方法包括以下步骤:
S1:分离样本基因组DNA;
S2:利用引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA;
S3:纯化PCR产物,测序;
S4:比对与统计;
S5:数据分析。
本发明包含一种利用单核苷酸多态性位点分析染色体小片段异常的分析方法,可以对所有染色体小片段异常进行连锁分析,检测方法更加快速,检测结果也更为准确。
⑴定义
“读段(reads)”是指测序获得的序列片段。
“单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
“单体型(Haplotype)”是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联,并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态性的组合,又称单倍体型或单元型。
“有效位点(informative SNPs)”可提供遗传信息的多态位点,同时避免选择同源性高、相邻序列中GC含量高或有多聚核苷酸序列的SNP位点。
(2)引物组合物
本发明提供了一种用于检测染色体小片段异常的引物组设计方法,其由特异扩增Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常区域及其上下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点组成。
在本发明中,以Xq22.2(102740001_103300000)为例,针对人类Xq22.2设计了289对序列特异性引物(如表1所示)。其中特异性扩增Xq22.2的引物包括编号151-181的引物对;特异扩增Xq22.2上下游2Mb范围内紧密连锁的SNP位点的引物包括编号1-150和182-289的引物对。
这些引物的特点为:在目标染色体上序列唯一;位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度;289对引物混合到4个PCR反应管中,在四个PCR反应管中能进行289重反应。
表1染色体小片段异常Xq22.2(102740001_103300000)检测引物
在最优选的实施方案中,本发明的引物组合物包括表1中编号为1~289的全部引物对。
(3)检测产品
本发明提供了一种用于检测染色体小片段异常Xq22.2(102740001_103300000)的检测产品,其包括本发明的引物组合物。
在一个特定的实施方案中,所述检测产品为检测试剂盒,其包括:
①用于文库构建的反应试剂,包括:特异性结合引物,通用引物,多重PCR聚合酶,DNA连接酶,末端修复酶,dNTPs,反应缓冲液;
②用于纯化PCR反应产物的试剂。
所述特异性结合引物即为本发明的上述引物组合物。
优选地,用于PCR产物纯化的试剂包括产物纯化磁珠及缓冲液。上述试剂盒还可以包括阴性质控品和阳性质控品。
(4)检测方法
本发明提供了一种体外检测染色体小片段异常Xq22.2(102740001_103300000)的检测方法,其包括以下步骤:
①分离样本基因组DNA;
②利用本发明的引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA;
③纯化PCR产物,测序;
④比对与统计;
⑤数据分析。
优选地,样本来自胚胎或全血。
胚胎基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时,取出***滋养层细胞3~5个,运用全基因组扩增方法对细胞中的基因组DNA进行富集。任选地,使用磁珠纯化扩增产物。
目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和方法参见生厂商提供的说明书,将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个实施方案中,DNA片段大小在125~275bp之间。
优选地,步骤②中按照NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit标准建库流程进行建库。在这个过程中,通过目标区域多重PCR扩增为集中在125~275bp的DNA分子,两端加上了测序所用接头,每个样品被加上不同的标签序列(barcode),从而在一次测序得到的数据中可以使多个样品的数据区分开。
优选地,所采用的测序方法为高通量测序方法。在一个特定的实施方案中,测序平台为Illumina Miseq测序平台。更优选地,测序深度为300×~3000×,即每条特异PCR扩增产物被测序300~3000次,例如在本发明的实施方案中,测序深度为1000×,即该条特异PCR扩增产物被测序1000次。
优选地,当待测的DNA分子来自多个受试样品时,每个样品被加上不同的标签序列(barcode),以用于在测序过程中进行样品的区分(Micah Hamady,Jeffrey J Walker,JKirk Harris et al.Error-correcting barcoded primers forpyrosequencinghundreds of samples in multiplex.Nature Methods,2008,5(3)),从而实现同时对多个样品进行测序。
本发明中,基因组参考序列可以来自公共数据库。例如,人类基因组序列可以是NCBI或者UCSC数据库中的人类基因组参考序列。
本发明中,数据分析时,首先去除序列质量值小于30的碱基及之后的序列,选择长度大于30bp的序列,序列比对可以通过任何一种序列比对程序,例如本领域技术人员可获得的使用BWA(Burrows-Wheeler Alignment Tool,v0.7.15)软件,比对到人类基因组HG19(Genome Build 37.3),得到读段在参考基因组上的位置,然后过滤掉比对质量值为0或者比对长度小于总长度95%的序列。最后使用VarScan(v2.3.6)软件检测数据中相应染色体目标区域的SNP,检测SNP最低测序深度为30X,最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
本发明可用于对适用人群进行染色体小片段异常dup Xq22.2(102740001_103300000)胚胎移植前诊断,有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据。dup Xq22.2(102740001_103300000)基因诊断、胚胎移植前诊断、产前诊断可有效防止dup Xq22.2(102740001_103300000)患儿出生。本发明适用人群可以是dup Xq22.2(102740001_103300000)携带者和患者。
上述适用人群举例仅用于本发明,而不应为限定本说明的范围。
(5)胚胎植入前筛选
本发明还提供了dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常的胚胎植入前筛选方法。
在一个特定的实施方案中,所述胚胎植入前筛选方法包括(4)检测方法中的步骤。选择不携带dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段异常的胚胎用于子宫植入。
实施例1:
2例胚胎dup Xq22.2(102740001_103300000)染色体小片段胚胎植入前检测。
家系背景:患儿携带dup Xq22.2(102740001_103300000)小片段重复,女方携带dup Xq22.2(102740001_103300000)杂合重复。为避免妊娠遗传病患儿而流产或引产给男女双方带来痛苦,通过充分的知情同意后,男女双方选择以避免后代患该小片段重复为目的的单体型检测。
⑴.建库和测序
(1)获取夫妻双方及患儿3例全血样本,提取基因组DNA,用NonaQ微量分光光度计(博奥晶典)质控,纯度OD260/280大于1.2,并分离20ng进行后续实验。
(2)获取该家系2例胚胎样本细胞,进行全基因组扩增,磁珠纯化全基因组扩增产物,用Qubit(Invitrogen,1x dsDNA HS Assay Kit)定量,并分离20ng进行后续实验;
(3)使用本发明的优选引物组(表1中的全部引物对1~289)进行多重PCR扩增,按照NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit标准建库流程进行建库。
(4)纯化PCR产物,并测序;
简而言之,多重PCR扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头,在一定条件下使核酸分子成簇生长,然后在Illumina Miseq上测序,得到片段长度分布在125bp~275bp的目标区域DNA片段序列。
⑵.比对和统计
Illumina Miseq测序仪产生的原始数据去除序列质量值小于30的碱基及之后的序列,选择长度大于30bp的序列,用BWA(Burrows-Wheeler Alignment Tool,v0.7.15)软件比对到人类基因组HG19(Genome Build 37.3)。
⑶.数据分析
使用VarScan(v2.3.6)软件检测数据中相应染色体目标区域的SNP,检测SNP最低测序深度为30X,最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
⑷.结果
结果如表2所示
按照上述原理构建单体型,X染色体为性染色体,男方及儿子仅有一条X染色体,女方有两条染色体,遗传给儿子的染色体为携带dup Xq22.2小片段重复的风险染色体。
结果表明:胚胎1为Xq22.2(102740001_103300000)小片段重复携带者,胚胎2的Xq22.2(102740001_103300000)小片段未见异常。
表2根据家系关系及单体型分析原理家系及胚胎的分析结果如下。
表2为单体型检测结果。其中F1代表父本来源的DNA链,M1代表母本来源的正常DNA链,M0代表母本来源携带Xq22.2(102740001_103300000)小片段重复的DNA链;NO:1-41,43-62位置为单体型分析中女方Xq22.2(102740001_103300000)上下游2M内的有效位点,编号位置42为女方Xq22.2(102740001_103300000)重复区域的有效位点。
以上对本申请实施例所提供的一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物、产品及方法,进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本申请的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解,硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语,故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内,本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题,基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式,然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的,并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的商品或者***不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种商品或者***所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的商品或者***中还存在另外的相同要素。
应当理解,本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。另外,本文中字符“/”,一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例,但如前所述,应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述申请构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围,则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测染色体小片段异常单倍型的引物组合物,其特征在于,所述引物组合物包括特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域及其上下游2M内的SNP位点的引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述特异扩增Xq22.2染色体小片段为人类特异扩增Xq22.2染色体小片段异常。
3.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述特异扩增Xq22.2染色体小片段异常区域的上下游序列为SEQ ID NO:151~181引物对。
4.根据权利要求3所述的引物组合物,其特征在于,所述特异扩增Xq22.2上下游2M内的SNP位点的引物的上下游序列为SEQ ID NO:1~150和182~289引物对。
5.根据权利要求4所述的引物组合物,其特征在于,所述引物组合物包括SEQ ID NO:1-289的全部引物对。
6.一种胚胎植入前的检测产品,其特征在于,所述检测产品由上述权利要求1-5之一所述的引物组合物制备而成。
7.根据权利要求6所述的检测产品,其特征在于,所述检测产品为检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的检测产品,其特征在于,所述检测试剂盒包括:
用于文库构建的反应试剂,包括:特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液;
用于纯化PCR的反应产物的试剂,包括产物纯化磁珠及缓冲液。
9.根据权利要求8所述的检测产品,其特征在于,所述检测试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
10.一种胚胎植入前的检测方法,通过上述权利要求6-9之一所述的检测产品实现,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
S1:分离样本基因组DNA;
S2:利用引物组合物进行多重PCR扩增富集目标区域DNA;
S3:纯化PCR产物,测序;
S4:比对与统计;
S5:数据分析。
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2021
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