CN113005160B - 一种淀粉转化制备纤维二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种构建体外多酶分子机器，通过多酶级联催化来制备纤维二糖的方法，属于纤维二糖的酶催化制备领域。本发明所公开的纤维二糖的制备方法包括将淀粉中的支链通过异淀粉酶水解，脱支链淀粉中的葡萄糖单元分别通过淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶转化生成葡萄糖‑1‑磷酸和葡萄糖，然后葡萄糖1‑磷酸与葡萄糖通过纤维二糖磷酸化酶合成纤维二糖。通过进行过程优化，可以进一步提高淀粉的利用率以及纤维二糖的得率。该技术方法具有底物廉价易得，生产成本低，产品得率高，分离纯化简单等优势，可实现纤维二糖的规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制造领域，具体涉及一种以淀粉为原料，通过体外多酶催化制备纤维二糖的方法。
背景技术
纤维二糖是一种由β-1,4糖苷键连接的低聚糖，其甜度为蔗糖的30％，但卡路里几乎为零，主要作为功能性甜味剂用于食品领域，另外，它也是一种可溶性的膳食纤维，可作为益生元促进肠道有益菌群繁殖。
目前，纤维二糖的生产主要采用稀酸、酶或者微生物对高纯度纤维素进行水解。酸解纤维素的产物不单一，造成纤维二糖产率低，分离成本高，且易造成环境压力。酶解和微生物降解工艺的难度在于纤维素的溶解性差，需要借助一些预处理工艺，且产物混杂，产量低，且产物纤维二糖会抑制纤维素酶的活性。这些传统方式的缺陷导致纤维二糖的价格居高不下，限制了这种健康食品添加剂的应用前景。
随着工业酶生物技术的发展，有科学家开始尝试酶法合成纤维二糖。日本科学家尝试利用3个酶(葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖淀粉酶和纤维二糖磷酸化酶)，以淀粉为底物生产纤维二糖，然而纤维二糖的得率最高只有40％左右，导致后续产品分离的成本较高。
因此，亟待开发一种低成本，低污染，高得率的纤维二糖酶制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备纤维二糖的方法，其以廉价淀粉为底物，通过体外多酶反应体系催化生产纤维二糖，该方法具有产率高，生产成本低，环境友好等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一种利用酶催化反应制备纤维二糖的方法，其特征在于，以淀粉为底物，加入异淀粉酶(isoamylase,EC 3.2.1.68，IA)、淀粉磷酸化酶(α-glucanphosphorylase，EC 2.4.1.1，αGP)、葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20，αG)和纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP)构建多酶催化反应体系，进行酶催化反应。在本发明中，淀粉为底物，淀粉经异淀粉酶催化得到脱支链淀粉，脱支链淀粉经淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶催化分别转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖经纤维二糖磷酸化酶催化生成纤维二糖。
优选地，淀粉为可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖和麦芽糖中的任意一种或多种的任意比例的混合物。
优选地，酶催化反应体系中淀粉的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为10g/L。
在优选的实施方案中，当淀粉中含有α-1,6糖苷键(例如，可溶性淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖)时，在反应体系中加入异淀粉酶(isoamylase,EC3.2.1.68，IA)；更优选地，在反应体系中先加入异淀粉酶，反应一段时间后再加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶。
优选地，在反应体系中先加入异淀粉酶，在10-99℃反应0.5-72小时，进一步优选在30-95℃反应1-48小时，更优选在50-90℃反应1-12小时，最优选在85℃反应3小时。
优选地，用异淀粉酶处理淀粉时，淀粉的浓度为1-500g/L，进一步优选为10-300g/L，更优选为50-250g/L，最优选为200g/L；异淀粉酶的用量为0.1-20U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-8U/mL，最优选为5U/mL。
优选地，异淀粉酶在含有缓冲液、金属离子的体系中处理淀粉。
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如乙酸钠缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，优选地，缓冲液为乙酸钠缓冲液。优选地，缓冲液的pH为4.0-8.0，更优选为4.5-6.5，最优选为5.5。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为1-50mM，进一步优选为2-20mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。
本领域技术人员可以理解，各种金属离子均可用于本发明，例如锌离子、镁离子、锰离子等，优选地，金属离子为锌例子。优选地，反应体系中锌离子的浓度为0.01-10mM，进一步优选为0.1-5mM，更优选为0.2-1mM，最优选为0.5mM。
优选地，在反应体系中后加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶，继续在10-95℃反应0.5-150小时，进一步优选在20-80℃反应1-60小时，更优选在30-60℃反应6-48小时，最优选在50℃反应12小时
优选地，反应体系中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，优选地，缓冲液为HEPES缓冲液。优选地，缓冲液的pH为5.0-8.0，更优选为6.0-7.5，最优选为6.5。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为10-500mM，进一步优选为20-150mM，更优选为50-120mM，最优选为100mM。
本领域技术人员可以理解，各种磷酸盐均可用于本发明，例如磷酸钾、磷酸钠等，优选地，磷酸盐为磷酸钾。优选地，反应体系中磷酸盐的浓度为1-50mM，进一步优选为2-30mM，更优选为5-15mM，最优选为20mM。
本领域技术人员可以理解，各种金属离子均可用于本发明，例如锌离子、镁离子、锰离子等，优选地，金属离子为锌离子。优选地，反应体系中锌离子的浓度为1-20mM，进一步优选为2-15mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。
在本发明中，酶催化反应体系中加入的淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶可以为任意比例。
优选地，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶的比例为1.5～3:0.5:1～3。
进一步优选地，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶的比例为2.5:0.5:1.2。
优选地，反应体系中淀粉磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为2.5U/mL。
优选地，反应体系中葡萄糖苷酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.2-10U/mL，更优选为0.3-5U/mL，最优选为0.5U/mL。
优选地，反应体系中纤维二糖磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为1.2U/mL。
在本发明中，可以使用各种来源的淀粉磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、异淀粉酶和葡萄糖苷酶。例如，淀粉磷酸化酶可以来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)等，优选地，淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌；纤维二糖磷酸化酶可以来源于热纤维梭菌(Paenibacillussp.)、小眼虫(Euglena Gracilis)、无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)等，优选地，纤维二糖磷酸化酶来源于热纤维梭菌；异淀粉酶可以来源于硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)等，优选地，异淀粉酶来源于硫化叶菌；葡萄糖苷酶可以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)、甜菜(Betavulgaris)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)等，优选地，葡萄糖苷酶来源于淡紫色拟青霉。本发明还可以使用氨基酸序列与上述来源的各种酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性的淀粉磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、异淀粉酶和葡萄糖苷酶。
本发明以淀粉为底物，加入异淀粉酶、淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶，配制四酶反应体系，酶催化途径包括：由异淀粉酶将淀粉中的支链水解，淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶分别将脱支链淀粉中的葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；由纤维二糖磷酸化酶将葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸转化为纤维二糖。
由于无机磷在反应过程中是循环的，所以只需要添加少量磷酸盐缓冲液就可以启动反应，并使反应持续发生，故而在实际生产中，磷酸盐的使用并不会造成环境压力。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明在一个多酶反应体系中，以淀粉为原料，通过体外多酶催化转化为纤维二糖，并通过过程优化，使转化效率显著提高，高得率又大大降低纤维二糖的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、纤维二糖得率高，分离成本低，环境友好等优点，可以实现纤维二糖的规模化生产。
附图说明
图1为淀粉转化生成纤维二糖的体外多酶催化途径的示意图；其中：IA为异淀粉酶，αGP为淀粉磷酸化酶，αG为葡萄糖苷酶，CBP为纤维二糖磷酸化酶。
图2为SDS-PAGE检测4个关键酶；其中：M为Marker，IA和αGP通过热处理纯化，αG和CBP通过Ni-NTA柱纯化。
图3为初始条件下体外多酶催化10g/L IA处理过的淀粉合成纤维二糖情况。
图4为最优条件下体外多酶催化10g/L IA处理过的淀粉合成纤维二糖的反应进程曲线。
图5为最优条件下体外多酶催化高浓度IA处理过的淀粉合成纤维二糖的反应进程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
本发明实施例中用到如下材料
可溶性淀粉，ACROS公司产品，产品编号：424490020；
pET20b载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；
本发明中的所有酶均能在Sigma公司购买得到，所有酶也都可以按照基因工程方法通过原核表达获得。
实施例1体外多酶催化将淀粉转化为纤维二糖
通过体外多酶催化体系将淀粉转化为纤维二糖的催化途径见图1。其中涉及的关键酶与关键步骤包括：(1)异淀粉酶(IA，EC 3.2.1.68)，用于水解淀粉的支链得到脱支链淀粉；(2)淀粉磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，用于从脱支链淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；(3)葡萄糖苷酶(αG，EC 3.2.1.20)，用于从脱支链淀粉上释放出葡萄糖；(4)纤维二糖磷酸化酶(CBP，EC 2.4.1.20)，用于催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖生成纤维二糖。
在本实施例中，异淀粉酶来源于硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)，其基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是从德国菌种保藏中心DSMZ上购买得到。淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，其基因在KEGG上的编号为TM1168；葡萄糖苷酶来源于淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，其基因在KEGG上的编号为QAQ81244；纤维二糖磷酸化酶来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)，其基因在KEGG上的编号为Cthe0275。这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这四个基因分别用F1/R1、F2/R2、F3/R3和F4/R4从相应的基因组DNA中通过PCR获取，其中，F1：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAGTGCTGGAGAAACTTCCCGAG，R1：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGAACCTTCTTCCAGAC，F2:CATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCTTGAAAAAAACATGGTGGAAAGAAG，R2:GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTTCCAGATGTATACGCGCGCC，F3：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGTCAGAAAGGCTGGAAATTTC，R3：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACTAATATTACGGCCCAGGGTCAC，F4：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGGTTTTTTCACACAAGGATAGACC，R4：GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTAATATTCAATCCTCCTATATACC，并通过Simple Cloning(You C,Zhang XZ,ZhangY-HP.2012.Simple cloning via direct transformation of PCR product(DNAMultimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-5.)的方法克隆至pET20b载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-StIA，pET20b-TmαGP，pET20b-PlαG和pET20b-PsCBP。然后，将这四个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。
反应体系中含有5mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，0.5mM二价锌离子，5U/mL的异淀粉酶，200g/L的淀粉，在85℃进行催化反应，反应时间为3个小时，既得IA处理过的淀粉。
随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，1U/mL淀粉磷酸化酶，1U/mL葡萄糖苷酶，2U/mL纤维二糖磷酸化酶，10g/L IA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。
高效液相色谱检测纤维二糖的浓度。取反应样品94.5μL，加入5.5μL 10％的硫酸终止反应。离心取上清，采用HPLC检测纤维二糖出峰面积和峰高计算纤维二糖的浓度。
经标准曲线斜率计算，反应结束后，纤维二糖的终浓度(图3)是18mM，相对淀粉(10g/L，约55.5mM葡萄糖当量，2分子葡萄糖当量合成1分子纤维二糖)转化率为64.8％。
实施例2通过优化酶比例提高纤维二糖的得率
异淀粉酶、淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实施例1，IA处理过的淀粉的制备同实施例1。
经过逐步优化，确定最适磷酸钾浓度为20mM，最适加酶量为淀粉磷酸化酶2.5U/mL，葡萄糖苷酶0.5U/mL，纤维二糖磷酸化酶1.2U/mL。对于纤维二糖的生产，反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，2.5U/mL淀粉磷酸化酶，0.5U/mL葡萄糖苷酶，1.2U/mL纤维二糖磷酸化酶，10g/L IA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时，纤维二糖的检测同实施例1。
经检测，反应结束后，纤维二糖的终浓度(图4)是22.4mM，对淀粉(10g/L，约55.5mM葡萄糖当量)转化率为80.7％，相比初始条件，转化率有明显提高，葡萄糖浓度明显下降。
实施例3高浓度淀粉生产纤维二糖
异淀粉酶、淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶的制备同实施例1，IA处理过的淀粉的制备同实施例1。
对于纤维二糖的生产，反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，12.5U/mL淀粉磷酸化酶，2.5U/mL葡萄糖苷酶，6U/mL纤维二糖磷酸化酶，50g/L IA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为24个小时，纤维二糖的检测同实施例1。
反应结束后，纤维二糖的终浓度(图5)是101mM(34.5g/L)，相比10g/L淀粉来说，转化率并没有明显下降。
随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，10mM的磷酸钾(pH 6.5)，25U/mL淀粉磷酸化酶，5U/mL葡萄糖苷酶，12U/mL纤维二糖磷酸化酶，100g/LIA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为24个小时，纤维二糖的检测同实施例1。
经检测，反应结束后，纤维二糖的终浓度(图5)是219mM(69g/L)，同样相比10g/L淀粉来说，转化率并没有明显下降。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种酶催化制备纤维二糖的方法，其特征在于，以异淀粉酶处理后的淀粉为底物，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶建立多酶催化反应体系，进行酶催化反应, 所述多酶催化反应体系中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子，其中，淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌，葡萄糖苷酶来源于淡紫色拟青霉和纤维二糖磷酸化酶来源于热纤维梭菌，所述反应体系中淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶加入的比例为1.5-3:0.5:1-3，磷酸盐的浓度为1-50mM。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物在含有缓冲液、金属离子的体系中经异淀粉酶处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异淀粉酶来源于硫化叶菌。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述异淀粉酶处理的条件为在30-95℃反应1-48小时。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述异淀粉酶处理的条件为在50-90℃反应1-12小时。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述异淀粉酶处理的条件为在85℃反应3小时。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应温度为10-95℃。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应温度为20-80℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应温度为30-60℃。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应温度为50℃。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应时间为0.5-150小时。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应时间为1-60小时。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应时间为6-48小时。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系的反应时间为12小时。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多酶催化反应体系中淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和纤维二糖磷酸化酶加入的比例为2.5:0.5:1.2。
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