CN113004398A - 人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法，该方法包括如下步骤：针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；对筛选得到的异源抗体进行人源化改造获得人源化IgG单克隆抗体；对筛选得到的人源抗体进行框架优化；需要时后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟；表达、纯化以获得人源化IgG单克隆抗体标准物质原料；对人源化IgG单克隆抗体标准物质原料进行纯度表征，蛋白质活性表征和结构表征；在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对单克隆抗体标准物质进行定值。

Description

人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法
技术领域
本发明涉及IgG抗体检测标准物质技术领域，特别是涉及一种人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法。
背景技术
免疫学检测是临床检测的重要方法之一，它是一种特异性的诊断方法，广泛用于临床检测、确诊和流行病学调查，可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原(如：血清学检测)。免疫学检测方法是利用抗原抗体之间的特异性和可逆空间结合来检测目标物。按检测目标物不同，免疫检测方法主要可分为病毒抗原检测和血清IgM/IgG抗体检测；按检测原理不同，可以分为胶体金法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光法等。免疫学检测作为医院诊疗工作的重要组成部分，为临床诊断和治疗用药等提供依据，免疫学检测的质量对临床诊断结果和治疗效果有最直接的影响。
标准物质(ReferenceMaterial，RM)是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。标准物质是实现检测结果准确、一致、可比的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检测技术要求的不断提高，对标准物质的需求和依赖也越来越强烈。血清IgG抗体检测也需要标准物质对检测方法和试剂盒进行质量控制和评价。
然而对于人源的临床标准物质，很多标准物质原料需要从病人血液中提取，这极大限制了临床类标准物质的研制。如果病人难找到、或者血液中含量很低，就需要考虑采用重组蛋白技术体外表达和纯化。针对于难获取原料的血清抗体标准物质的研发，如果不应用重组蛋白技术设计、制备，很难想象有足量一致的、人源提取的血清来源抗体标准物质及时分配、应用于全世界，尤其是应用于像新冠这种突发流行病危机。这也是现有的临床诊断抗体标准物质数目只寥寥数种的原因，一是需要从病人血液提取，原料来源受限；二是针对提取的多克隆抗体的表征、定值难度太大，需要建立可应用于它们的基准定值方法。
具体来说，以急性传染病为例，检测试剂研发周期一般比较短，短时间难以开发研发和生产的标准化流程，难免出现性能高低不一、品质良莠不齐的问题。试剂盒性能评价和质量控制也非常急迫。标准物质作为准确量值的载体，是评价试剂质量的“砝码”，并可以用于检测方法开发与验证，对试剂盒研发和评价进行质量控制和评价等。
现阶段，试剂公司多直接采用阳性血清作为研发的质控品。阳性血清是混合的病人灭活血清，未经过提取纯化，纯度非常低且多克隆来源(因为除了血清基质和抗(病毒)抗原的抗体，还含有极高丰度的不抗(病毒)抗原的本底抗体存在)。它作为质控品的缺陷是具有生物安全风险和批次来源差异，无法精确复制，也无法精确表征，更不用说在其基础上研制纯度、稳定性、均匀性和定值精确性要求极高的标准物质。很多厂家、研发机构无法及时获得阳性血清，在研发过程中只能依靠企业自行研制的物质部分替代质控品的功能，因此研制无生物安全风险、可精确复制、可准确表征与定量的病毒抗体标准物质十分必要。
综上所述，病人血清尤其是未知病毒引发的急性传染病血清中的IgG属于多克隆抗体，不易获取、应用于标准物质制备，难以准备表征、定值。利用单克隆抗体安全、易生产、可复制、能准确表征、可应用基准方法准确定值的特点，可设计、研制病毒单克隆抗体标准物质，用于如传染病中血清抗体的免疫检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，实验室质量控制，突破目前临床疾病中血清抗体标准物质研制和应用的瓶颈限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法。本发明制得的单克隆抗体标准物质可以模拟病人血清中抗病毒的多克隆抗体，与抗体检测试剂盒中的抗原和二抗反应，从而评价抗体检测试剂盒和方法的性能和可靠性，为突发的急性传染病血清抗体的检测提供质量控制。该方法具有良好的实用性、准确性、可靠性和溯源性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，包括如下步骤：
(1)针对(病毒)抗原进行(噬菌体)抗体库(包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体库，库容量最好在109以上)筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；
(2)获得人源化的IgG单克隆抗体：
A.如原型抗体来自于病人抗体库、正常人天然抗体库或合成的人源抗体库，则获得的目标抗体已经是人源的，符合制备要求；
B.如原型抗体来自于免疫动物得到的抗体库或非人源合成抗体库，则将原型抗体进行人源化改造获得人源化的IgG单克隆抗体：
1)先利用人天然库对抗体轻链进行链置换，将轻链置换成人源序列；
2)再用CDR移植技术将异源抗体CDR移植入人源IgG框架，对重链进行人源化；
(3)通过细胞培养表达、纯化得到单克隆抗体的标准物质原料；
(4)对单克隆抗体进行纯度表征；
(5)对单克隆抗体进行蛋白质活性表征；
(6)对单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括单克隆抗体完整分子量测定、切去糖链后完整分子量测定、还原后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、糖基化修饰表征、肽谱表征；
(7)在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法经两名操作者对对该单克隆抗体进行标准物质定值。
其中，所述步骤(1)中，需要针对病毒抗原筛选2种或2种以上具有一定亲和力活性的原型抗体，所述原型抗体需针对抗原的不同表位，从而可以模拟病人血清中的多克隆抗体。所述亲和力阈值Kd<10-7。
其中，所述步骤(2)A中，需要时可对筛选得到的人源抗体进行框架优化(把CDR移植到高表达的框架上)；后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟；以进一步提高亲和力；
所述步骤(2)B中，后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟。
其中，所述步骤(3)中，单克隆抗体的标准物质原料的纯度需≥95％；如果纯度<95％，则通过不影响抗体活性的方法对单克隆抗体进行纯化，将纯度提高到95％以上；所述不影响抗体活性的方法包括高效凝胶排阻色谱法、亲和色谱法。
其中，所述步骤(4)中，纯度表征方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱法。
其中，所述步骤(5)中，活性表征方法包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振效价测定法、生物膜层干涉法。亲和活性是抗体标准物质的重要参数，尽量选择亲和活性高的抗体作为标准物质原料。
其中，所述步骤(6)中，还需确定不同糖型的分布比例；根据单抗的完整分子量和单抗不同糖型修饰的分布比例，计算单抗蛋白的加权分子量；
进行单抗的肽谱分析，将单抗经酶切处理后经质谱仪进行检测，通过软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率；
通过胰蛋白酶、糜蛋白酶的多种酶切方式或者多次质谱分析提高肽谱的序列覆盖率；肽图的序列覆盖率需达到90％以上。
其中，所述步骤(7)中，对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行均匀性检验，采用同位素稀释质谱法进行测定，通过统计学方法分析确定标准物质是否均匀；对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行稳定性检验，稳定性检验包括短期稳定性和长期稳定性，短期稳定性为模拟运输条件下为期一周的稳定性考察，长期稳定性为-70℃储存条件下6个月及以上的稳定性；
以亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法经两名操作者对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行定值。
采用本发明上述制备方法制得的人源化IgG单克隆抗体标准物质。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明建立的用于传染病血清抗体检测的抗体标准物质研制方法是完全创新的方法，开创了血清抗体检测用抗体标准物质研制的新思路，主要包括抗体标准物质原料的设计、制备和抗体蛋白的表征、定值两个方面。
这是导致现有的临床诊断抗体标准物质数目只有寥寥数种的两大瓶颈：一是需要从病人血液提取，原料来源受限；二是针对提取的多克隆抗体的表征、定值难度太大，需要建立可应用于它们的基准定值方法。以往对于人源的临床标准物质，很多需要从病人血液中提取。如果病人难找到、或者血液中含量很低，就需要考虑采用重组蛋白技术体外表达和纯化。针对于难获取原料的血清抗体标准物质的研发，如果不应用重组蛋白技术设计、制备，很难想象有足量一致的、人源提取的血清来源抗体标准物质及时分配、应用于全世界，尤其是应用于像新冠这种突发流行病危机。
(2)本发明建立的方法所研制的抗体标准物质可以模拟人血清中抗病毒的IgG多克隆抗体，与现有阳性血清作为检测质控品相比，克服了传染病阳性血清的传染性风险缺点，以及阳性血清中IgG多克隆抗体无法精确表征、定量、复制的缺点。
现阶段，试剂公司多直接采用阳性血清作为研发的质控品。阳性血清是混合的病人灭活血清，只经过灭活处理，未经过提取纯化，纯度很低且多克隆来源(除了血清基质和抗(病毒)抗原的抗体，还含有极高丰度的不抗(病毒)抗原的本底抗体存在)。它作为质控品的缺陷是具有生物安全风险和批次来源差异，无法精确复制；同时，由于成分高度复杂，在人类现有技术水平无法准确表征和定量，阳性血清也不能适用于基准方法定值，无法实现量值溯源。标准物质要求纯度高、稳定性好，因此，阳性血清不宜作为标准物质原料，而研制无生物安全风险、可精确复制、可准确表征与定量的(病毒)抗原单克隆抗体标准物质能有效解决这个问题。
本发明建立的方法所研制的抗体标准物质可以精确表征、定量和复制，可用于传染病血清抗体检测试剂盒的质量控制与评价，检测方法的验证与开发。
(3)本发明建立的方法可以用于一系列抗体检测所需抗体标准物质的研制，并且可以针对不同的抗原表位研制多个单克隆抗体标准物质，形成多个表位的抗体标准物质库，更好的模拟血清中的多克隆抗体。
(4)本发明建立的抗体蛋白质定值方法，标准物质具有量值溯源性，含量测定结果可以直接溯源到SI单位。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法作进一步说明。
附图说明
图1为N蛋白人源IgG单抗活性评价结果；
图2为N蛋白人源IgG单抗完整分子量去卷积结果图；
图3为N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质定值结果的溯源性。
具体实施方式
实施例1
对于突然爆发的新型病毒引起的急性传染病，以2019-2020年的新冠病毒大流行为例，展示2019-nCoV新型冠状病毒N蛋白人源IgG单克隆抗体溶液标准物质的研制过程，具体设计、实验过程如下：
1、2019-nCoV新型冠状病毒N蛋白人源IgG单克隆抗体的筛选、蛋白的表达和纯化
根据NCBI GenBank中公布的2019-nCoV新型冠状病毒N基因(28274-29533位)序列为依据，表达N完整蛋白，利用合并的噬菌体抗体库(包括病人抗体库、正常人天然抗体库、合成抗体库及免疫动物得到的抗体库)蛋白免疫动物后构建的噬菌体展示库(库容约为1010)对2019-nCoV新型冠状病毒N抗原进行抗体筛选，获得达到亲和力阈值需求(Kd<10-8)的原型抗体。
将原型抗体进行人源化改造，利用人天然库将抗体轻链置换成人源序列，然后用CDR移植技术对重链进行人源化。所有抗体均采用双质粒转染HEK293F细胞，培养后收集细胞，过Protein A柱纯化后得到N蛋白人源IgG单抗的标准物质原料。
获得标准物质原料后，首先对获得N蛋白人源IgG单抗进行了SDS-PAGE电泳纯度表征，电泳条件如下：取20mg N蛋白原料与等体积的1X电泳上样缓冲液混合，在沸水浴中煮沸5min，每个泳道上样10mg N蛋白。采用伯乐公司Mini-PROTEAN预制胶进行分离，电泳电压120V，电泳时间45min。电泳完成后用考马斯亮蓝进行染色，染色完毕后用甲醇-乙酸溶液进行脱色并成像。
对获得的N蛋白人源IgG单抗原料采用高效凝胶排阻色谱法进行了纯度表征，液相色谱条件如下：
由于抗体的分子量接近150kD，在溶液中可以单体、二聚体、多聚体及片段的形式存在。为采用Wyatt WTC-030S5高效液相尺寸排阻色谱柱(5mm，7.8mm×30cm)，柱温25℃，流动相为磷酸盐缓冲液(Corning康宁21-040-CV PBS缓冲液)，等度洗脱，流速为0.8ml/min，操作仪器为Agilent1200，检测器包括：UV紫外检测器(检测波长280nm)、RI示差折光检测器、MALS多角度光散射检测器，采集时间20min，样品稀释后浓度约为1mg/mL，进样量20mL，平行测定5次，以100mM枸橼酸缓冲液为空白对照。
对N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质的纯度进行了5次测定，根据面积归一法对单体和二聚体的比例进行统计(如表1所示)，N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质的平均纯度为98.95％，相对标准偏差0.2％，二聚体仅占1.05％。
表1 N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质SEC纯度表征结果
Figure BDA0002968936710000061
2、N蛋白人源IgG单抗的活性表征
N蛋白用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)稀释至5μg/mL，以100μL/孔加入酶标板4℃包被过夜，用0.05％PBST溶液洗涤1次并拍干，然后加入300μL/孔封闭液于37℃封闭反应1小时；N蛋白人源IgG单抗用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)分别从166倍和30倍以1.5倍系数倍比稀释15个浓度梯度，以100μL/孔的量加入封闭好的酶标板中，并于37℃反应1小时后(N抗体30min)，用0.05％PBST溶液洗涤3次并拍干，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人二抗用含0.5％BSA的PBS缓冲液稀释1500倍后，以100μL/孔的量加入酶标孔中，在37℃条件下孵育1小时后(N抗体30min)，用0.05％PBST溶液洗涤5次并拍干，加入显色液100μL/孔，37℃显色10分钟后加入100μl/孔的终止液，用酶标仪读取450nm处的紫外吸光度值，最后以N蛋白人源IgG单抗的浓度对数为横坐标，阳性和阴性对照孔的吸光度值差值为纵坐标绘制曲线，如图1所示。
3、N蛋白人源IgG单抗的表征
3.1单抗的分子量测定
为了确证N蛋白人源IgG单抗蛋白的结构和分子量信息，对单抗的完整分子量、切糖后分子量、以及还原后分子量分别进行了测定。将抗体蛋白分别经HPLC分离后由ThermoScientificTMExactiveTMPlus EMR质谱仪进行检测，通过Thermo Protein Deconvolution软件对MS图谱去卷积处理后得到相应分子量信息。
仪器所使用的色谱条件如下：
色谱柱：SHISEIDO C4色谱柱；5μm；ID 2.0mm；length 50mm。
流动相：A液，0.1％甲酸+2％乙腈(水溶液)；B液，0.1％甲酸+98％乙腈(水溶液)。
流速：0.2mL/min。
洗脱条件如表2所示：
表2
Figure BDA0002968936710000071
质谱条件为：数据采集时间为20分钟；MS Range：1000-9000；Mass Tolerance：30ppm。
数据分析采用Thermo Protein Deconvolution软件对MS图谱去卷积处理得到单抗蛋白的分子量信息，质量误差≤20ppm。
N蛋白人源IgG单抗的分子量测定结果如下：
(一)完整分子量测定
N蛋白人源IgG单抗经软件去卷积后得到样品完整分子量，对该单抗的分子量测定的质谱图进行了解析，结果如图2及表3所示。N蛋白人源IgG单抗有七种糖型分布：G0F/G0F-2HexNAc，G0F/G0F-HexNAc，G0F/G0F，G0F/G1F，G1F/G1F，G1F/G2F，G2F/G2F，七种糖型的分布比例如表中所示。另外C-端掉了2个赖氨酸(K)。分布最高的单抗分子量为147318.5，比例为49.5％。
表3 N蛋白人源IgG单抗完整分子量去卷积结果解析表
Figure BDA0002968936710000081
(二)完整去糖分子量测定
切掉糖链后的分子量去卷积质谱图，结果显示该单抗切糖后的平均分子量为144426.5。
(三)还原后分子量测定
将N蛋白人源IgG单抗样品进行了还原后分子量测定，N蛋白人源IgG单抗的重链有两种糖型分布，平均分子量分别为50653.55，50815.5。轻链不含糖链，平均分子量为23014.3。
(四)去糖还原后分子量测定
N蛋白人源IgG单抗去糖还原后重链的分子量为49208.26。
从以上的分子量测定结果显示：N蛋白人源IgG单抗完整分子量分布为146863.0-147962.6Da；去糖后完整分子量为144426.5Da；完整蛋白还原后轻链分子量为23014.3Da，重链分子量分布为50653.55-50815.5Da；去糖后还原轻链分子量为23012.8Da，重链分子量为49208.26Da。
基于以上单抗蛋白分子量的精确表征，根据单抗的完整分子量和单抗不同糖型的分布比例，计算了单抗蛋白的加权分子量。N蛋白人源IgG单抗的加权分子量为147444.91kD。在后续的蛋白质量浓度计算时，使用了N蛋白人源IgG单抗的加权分子量。
3.2单抗的肽谱
为了进一步确证单抗的一级结构，进行了单抗的肽谱分析。将单抗经酶切处理后经纳升液相毛细管色谱柱分离后由Thermo ScientificTMQ Exactive Plus HybridQuadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer质谱仪进行检测，通过pFind软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率。
实验方法是将蛋白样品加入50mM碳酸氢铵溶液至总体积为100μL，震荡涡旋混匀。取上述待酶解溶液进行DTT还原和IAM烷基化。采用Chymotrypsin和Trypsin两种酶对蛋白样品进行双酶切。取上述酶解液2μL并加入0.1％的FA 8μL，15000g高速离心15min后取上清5μL进行LC-MS/MS分析。
仪器的液相参数如表4所示：
表4
Figure BDA0002968936710000091
仪器的质谱参数如下：
全扫描分辨率：70000；AGC Target：1e6；Maximum IT：20ms；扫描范围：200-2000m/z。dd-MS2分辨率：35000；AGC Target：1e5；Maximum IT：60ms；Loop count：20；(N)CE/stepped：30。
数据分析采用pFind软件对肽图图谱进行数据库检索，可变修饰：Carbamidomethyl(C)，Deamidation(NQ)，Oxidation(M)漏切：允许偏差：MS 20ppm，MS/MS50ppm。数据库匹配采用的是单抗的C-kappa区和C_H恒定区序列构建的本地数据库。
肽谱测定结果为：N蛋白人源IgG单抗C-kappa区的序列覆盖率为93％，C_H恒定区的序列覆盖率为92.1％，说明N蛋白人源IgG单抗样品与理论序列能够匹配。
4、均匀性检验
随机抽取一定数量的最小包装单元(可按随机数表所示方法抽样)，采用精密度高的试验方法，对抽出的各样品在控制同样的实验条件下进行测定，从而使各样品间的差异完全由样品的不均匀性反映出来。采用方差分析法用来进行统计检验均匀性。
根据分装的单元数，分别从标准物质分装的初期、中期、末期随机抽取一定数量单元进行均匀性分析。标准物质分装的单元数为320管，均匀性检验时抽取15管，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质进行均匀性检验。
N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质均匀性检验数据见表5，均匀性统计表明F值＜F0.05，说明标准物质均匀性良好。
表5 N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质均匀性检验数据
Figure BDA0002968936710000101
5、稳定性检验
采用氨基酸水解-同位素稀释质谱法，对制备的标准物质进行稳定性考察。短期稳定性实验关注的是在特定运输条件下标准物质的稳定性。根据目前我国的运输条件，使用快递运输，货物7天内可以运送到我国主要城市。抽取合适量的标准物质样品，做好标记，分别放入指定环境中，按指定周期进行检验。对N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质分别在4℃、室温两种不同温度下考察0、1、3、5、7天短期稳定性。
标准物质短期稳定性考察结果为：N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质可在4℃稳定保存3天，室温下可稳定保存1天。储存条件为置于-70℃冰箱中保存。运输条件为采用干冰运输。
长期稳定性实验关注的是在特定贮存条件下标准物质的稳定性状况。本研究贮存条件为-70℃。表6为-70℃条件下N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质的长期稳定性。
表6 N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质长期稳定性检验数据
Figure BDA0002968936710000111
6、标准物质定值
(一)实验方法
采用所建立的基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法经两名操作者对N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质进行定值。
HPLC-IDMS分析在Agilent1200液相***串联AB5500三重四级杆质谱中完成，采用多反应监测模式(Multi reaction monitoring model，MRM)。通过对色谱条件的优化，选择了如下色谱分离条件：色谱柱为菲罗门公司KINETEX C18柱(2.6μm*150*2.1mm)；洗脱条件：含0.1％三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)的流动相A(水)与流动相B(100％乙腈)按91:9的体积比等梯度洗脱10min，流速为200μl/min。
质谱条件的优化：由于本实验采用MRM模式，因此主要对离子化条件、母离子扫描的去簇电压(Declustering potential，DP)和入口电压(Entrance potential，EP)、子离子产生的碰撞能量(Collision energy，CE)进行优化，其采集条件及监测的离子对(Q1>Q3)如表7所示。
表7 HPLC-IDMS分析时质谱采集条件及监测的离子对
Figure BDA0002968936710000121
根据括号法的计算公式：
Figure BDA0002968936710000122
其中，C为样品水解后氨基酸的浓度；M为水解溶液中样品的质量；R1为高标溶液中氨基酸与标记氨基酸的峰面积比；R2为低标溶液中氨基酸与标记氨基酸的峰面积比；P为氨基酸的纯度；m标为水解样品中标记氨基酸的质量；R样为样品水解后氨基酸与标记氨基酸的峰面积比；W1为高标溶液中氨基酸与标记氨基酸的质量比；R2为低标溶液中氨基酸与标记氨基酸的质量比。
在单抗蛋白溶液标准物质的定值研究中，均采用Val、Leu、Ile及Phe四种氨基酸对蛋白进行定量。先求得水解后Val、Leu、Ile及Phe氨基酸的浓度，再根据每种氨基酸的浓度计算蛋白含量，最后由这四种氨基酸所测定的蛋白含量取平均值即为蛋白的精确含量。
(二)实验结果
采用同位素稀释质谱法分别对N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质进行定值，结果如表8所示。
表8 N蛋白人源IgG单抗四种氨基酸测定蛋白含量结果
Figure BDA0002968936710000131
7、计量溯源性
标准物质均采用同位素稀释质谱方法定值，以国家氨基酸一级标准物质作为溯源标准，分别是Val国家一级标准物质(GBW 09236)，Leu国家一级标准物质(GBW 09237)，Ile国家一级标准物质(GBW 09238)Phe国家一级标准物质(GBW 09235)。氨基酸标准物质采用定量核磁和质量平衡方法定值，最终结果可以溯源到SI单位，溯源图如图3所示。
8.标准物质的验证与试用
用所研制的N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质对市售的胶体金免疫层析试纸条进行评价并确定阳性参考值。由于没有标准物质，胶体金免疫层析试纸条无法提供检测限等参数，用所研制的N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质可以为试纸条提供检测限参考值，实现检测结果的可比和质量控制。
根据胶体金免疫层析试纸条产品说明书操作步骤进行评价。设置N蛋白人源IgG单抗标准物质浓度分别为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL。
根据所研制的标准物质定值，4款胶体金免疫层析试纸条的检测限见表9。
表9胶体金免疫层析试纸条评价结果汇总
Figure BDA0002968936710000132
Figure BDA0002968936710000141
通过以上结果可以看出：用所研制的N蛋白人源IgG单抗溶液标准物质可以对抗体检测试剂盒和方法的性能进行质量控制与评价。
利用单克隆抗体安全、易生产、可复制、能准确表征、可应用基准方法准确定值的特点，可设计、研制病毒单克隆抗体标准物质，用于如传染病中血清抗体的免疫检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，实验室质量控制与测量结果的一致化，突破目前临床疾病中血清抗体标准物质研制和应用的瓶颈限制。
实施例2
对于常见的重要传染病，以艾滋病为例，也可依照本发明的技术方案研制IgG单克隆抗体标准物质：
目前国内没有艾滋病IgG抗体有证标准物质，主要有两个原因：
1、无法在日常条件下获取、处理艾滋病病人血清作为标准品；
2、即使能获取数十人份的艾滋病病人血清，里面的成分也非常复杂，只包含1％甚至0.1％以下的抗艾滋病病毒多克隆IgG抗体，难以精确表征、定量以使其成为有证标准物质。
故采用实施例1中的方案筛选针对艾滋病抗原的IgG抗体，进行人源化改造，在哺乳动物细胞中表达、纯化后作为原料，依次进行充分的纯度和结构表征，最后依照实施例1里建立的同位素稀释质谱法对抗艾滋病抗原的纯IgG进行定值，从而获得艾滋病IgG单克隆抗体标准物质，用于临床诊断方法开发、验证、质控与一致化。
为突出本发明的有益效果，例举以下对比例。
对比例
当直接用免疫动物得来的抗体做标准物质原料，不进行人源化改造时：
获得的IgG是被免疫动物种属来源的，理论上不应与试剂盒中的试剂反应，因而失去充当参考标准的作用，无法用于对病人血清IgG抗体的免疫检测方法的开发、检测试剂盒质量控制与评价、实验室质量控制和测量结果的一致化。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；所述抗体库包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体库，库容量在109以上；
(2)获得人源化的IgG单克隆抗体：
A.如原型抗体来自于病人抗体库、正常人天然抗体库或合成的人源抗体库，则获得的目标抗体已经是人源的，符合制备要求；
B.如原型抗体来自于免疫动物得到的抗体库或非人源合成抗体库，则将原型抗体进行人源化改造获得人源化的IgG单克隆抗体：
1)先利用人天然库对抗体轻链进行链替换，将轻链置换成人源序列；
2)再用CDR移植技术将异源抗体CDR移植入人源IgG框架，对重链进行人源化；
(3)通过细胞培养表达、纯化得到单克隆抗体的标准物质原料；
(4)对单克隆抗体进行纯度表征；
(5)对单克隆抗体进行蛋白质活性表征；
(6)对单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括单克隆抗体完整分子量测定、切去糖链后完整分子量测定、还原后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、糖基化修饰表征、肽谱表征；
(7)在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验后，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对该单克隆抗体进行标准物质定值。
2.根据权利要求1所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，需要针对病毒抗原筛选2种或2种以上达到亲和力阈值需求的原型抗体，所述原型抗体需针对抗原的不同表位；所述亲和力阈值Kd<10-7。
3.根据权利要求2所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)A中，需要时可对筛选得到的人源抗体进行框架优化，即把CDR移植到高表达的框架上；后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟；
所述步骤(2)B中，后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟。
4.根据权利要求3所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，单克隆抗体的标准物质原料的纯度需≥95％；如果纯度<95％，则通过不影响抗体活性的方法对单克隆抗体进行纯化，将纯度提高到95％以上；所述不影响抗体活性的方法包括高效凝胶排阻色谱法、亲和色谱法。
5.根据权利要求4所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，纯度表征方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱法。
6.根据权利要求5所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，活性表征方法包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振效价测定法、生物膜层干涉法。
7.根据权利要求6所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，还需确定不同糖型的分布比例；根据单抗的完整分子量和单抗不同糖型修饰的分布比例，计算单抗蛋白的加权分子量；
进行单抗的肽谱分析，将单抗经酶切处理后经质谱仪进行检测，通过软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率；
通过胰蛋白酶、糜蛋白酶的多种酶切方式或者多次质谱分析提高肽谱的序列覆盖率；肽图的序列覆盖率需达到90％以上。
8.根据权利要求7所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行均匀性检验，采用同位素稀释质谱法进行测定，通过统计学方法分析确定标准物质是否均匀；对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行稳定性检验，稳定性检验包括短期稳定性和长期稳定性，短期稳定性为模拟运输条件下为期一周的稳定性考察，长期稳定性为-70℃储存条件下6个月及以上的稳定性；
以亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行定值。
9.权利要求1-8任一所述制备方法制得的人源化IgG单克隆抗体标准物质。
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