CN112285224A - 一种抗pd-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗PD‑1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，涉及微生物发酵技术领域生物药物检测领域。该质量标准检测方法包括对待测样品的鉴定、纯度分析、蛋白含量检测和相关杂质含量检测。该方法专属性强、线性好、精密度和准确度高，对于抗PD‑1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。

Description

一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法
技术领域：
本发明涉及生物药物检测领域，具体涉及一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法。
背景技术：
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)和程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)是一对免疫共抑制分子。PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤和病毒的免疫逃逸密切相关，以PD-1/PD-L1为靶点的药物重新激活了机体自身的抗肿瘤免疫并且在多种肿瘤中取得了良好而持久的疗效，具有很好的应用前景。
PD-1是一种免疫共抑制分子，属于CD28家族成员，由268个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜蛋白，包含1个IgV样区、1个IsC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。PD-1主要表达在T细胞、B细胞、NK细胞及多种肿瘤细胞的膜表面。PD-1有2个配体，即PD-L1和PD-L2，属于B7家族的跨膜分子。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域，主要表达于成熟的CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞，且在多种肿瘤细胞均高表达PD-L1分子。PD-L2是由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，与PD-L1有很高的相似性，但两者也具有一定的差异，如PD-L2的体内组织分布具有局限性，只在巨噬细胞、树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达。
PD-1/PD-L1信号通路在T细胞免疫过程中起重要作用。T细胞在静息状态下低表达PD-1，而激活则引起PD-1的表达上调。PD-1作为一种抑制共受体，与PD-L1相互作用后能够抑制T细胞的活性，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制T细胞的增殖，阻碍其分化为浆细胞，并诱导T细胞的凋亡。这样就避免了T细胞的无限增殖，使其维持动态平衡。这种PD-1/PD-L1信号通路参与的T细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至关重要的作用。
PD-1/PD-L1作为负性共刺激分子，其高表达可见于多种肿瘤，如黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌等。在肿瘤发生时，肿瘤细胞表面PD-L1与T细胞表面的PD-1受体相互作用，能够抑制T细胞的免疫应答，发生肿瘤免疫逃逸。抗PD-1单克隆抗体通过与PD-1的结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，从而恢复T细胞功能。
目前，在肿瘤治疗中，抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体药物的研制已成为热点，在生产抗PD-1单克隆抗体药物的过程中，对其质量的检测是一项必不可少的工作。因此，本发明提供了一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，本发明针对抗PD-1单克隆抗体药物鉴定，建立了等电点检测方法和基于UPLC(超高效液相色谱)分离的肽图分析方法；针对产品纯度分析，建立了SEC-HPLC(体积排阻色谱法)、非还原CE-SDS(毛细管凝胶电泳法)、还原CE-SDS、CEX-HPLC(阳离子交换高效液相色谱法)等检测方法；针对抗PD-1单克隆抗体药物的定量，建立了蛋白质含量测定方法；针对相关杂质含量检测，建立了ELISA方法对Protein A残留和宿主蛋白(HCP)残留进行分析、建立了qPCR对CHO宿主细胞DNA残留进行检测。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，该方法专属性强、线性好、精密度和准确度高，对于抗PD-1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
本发明提供了一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，其特征在于，所述的质量标准检测方法包括如下步骤：
(1)鉴定：包括待测样品的等电点测定和肽谱图分析；
(2)纯度分析：包括待测样品的单体纯度检测、主峰纯度检测、轻链和重链纯度检测，以及电荷异质体含量检测；
(3)蛋白含量检测：利用紫外分光光度法对待测样品进行检测；
(4)相关杂质含量检测：包括待测样品中的Protein A残留量检测、HCP残留量检测和CHO宿主细胞DNA残留量检测；
所述的待测样品为抗PD-1单克隆抗体药物。
优选地，所述的等电点测定是利用CIEF法将带不同电荷的异质体根据其等电点的不同进行聚焦分离。
包括以下步骤：
利用PA/MDQ毛细管电泳仪和中性涂层毛细管组件进行毛细管等电聚焦分析，取3M尿素CIEF胶80μl、3-10载体两性电解质(Pharmalyte3-10)5μl、100mM阳极电解液(H3PO4)10μl、200mM阴极电解液(NaOH)15μl和等电点标记物(包含多肽标记物pI5.85和pI8.18)4μl和10mg/mL的待测样品混合，制成上样混合液；将上样混合液上样于毛细管中，室温下聚焦分离，173kPa下进样99s，聚焦条件是聚焦电压25kV，维持10min，分离条件是采用100mM氨水作为迁移液，电压25kV，维持30min；利用紫外吸收检测器在280nm波长下进行检测，记录等电聚焦图谱。
优选地，所述的肽谱图分析是利用胞内蛋白酶酶切-反相色谱法，将待测样品用Lys-C酶水解，经反相色谱柱梯度洗脱，得到肽谱图，包括以下步骤：
取待测样品，用尿素缓冲液将稀释至1mg/mL，68℃条件下变性10min，加入DTT，36℃还原45min，DTT和待测样品体积比为1:50；加入IAA，避光反应30min，IAA和待测样品体积比为1:40；加入DTT终止反应，DTT和待测样品体积比为1:20；将原尿素缓冲液置换为NH4HCO3，加入Lys-C酶，37℃水浴10h，Lys-C酶和待测样品体积比为1:20；5％的TFA终止反应，得到酶切产物；所得酶切产物经反相高效液相色谱检测分析，色谱条件为：流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；梯度洗脱(5-120min，2％B→85％B)，流速为0.5mL/min，检测波长214nm，得到肽谱图。
具体地，肽谱图分析步骤如下：
取10mg/mL待测样品，用5mol/L尿素缓冲液将待测样品稀释至1mg/mL，68℃条件下变性10min，加入1mol/L DTT于36℃条件下还原45min，DTT和待测样品体积比为1:50；加入1mol/L的IAA进行烷基化，避光反应30min，IAA和待测样品体积比为1:40；加入1mol/L DTT终止反应，DTT和待测样品体积比为1:20；使用10KD离心浓缩管将原尿素缓冲液置换为20mmol/L的NH4HCO3，加入1mg/mL的Lys-C酶，37℃水浴，酶切水解10h，Lys-C酶和待测样品体积比为1:20；5％的TFA终止反应，得到酶切产物；所得酶切产物经反相高效液相色谱检测分析，色谱条件为：流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；梯度洗脱(5-120min，2％B→85％B)，流速为0.5mL/min，检测波长214nm，得到肽谱图。
优选地，所述的单体纯度检测是利用SEC-HPLC法，用分子排阻色谱柱对待测样品进行分离，包括以下步骤：
将待测样品用流动相稀释至10mg/mL，流动相为50mmol/L磷酸钾和300mmol/L氯化钠的混合溶液，pH为6.8，上样量为10μl，流速为0.8mL/min,在280nm下进行检测，采用峰面积归一化法计算单体的含量。
优选地，所述的主峰纯度检测是利用非还原CE-SDS法，包括以下步骤：
用超纯水将待测样品稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入巯基乙醇5μl，SDS样品缓冲液70μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一化法计算主峰的峰面积百分比，即主峰纯度。
优选地，所述的轻链和重链纯度检测是利用还原CE-SDS法，包括以下步骤：
用超纯水将待测样品稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入0.1mol/L的N-乙基马来酰亚胺5μl，SDS样品缓冲液95μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一法计算重链和轻链的相对面积百分比，即轻链和重链纯度。
优选地，所述的电荷异质体含量检测是利用CEX-HPLC法，包括以下步骤：
用流动相A将待测样品稀释至1mg/mL，上样量为25μl，流动相A为0.05M磷酸盐，pH4.0，流动相B为0.05M磷酸盐和0.5M氯化钠混合溶液，pH10.0，流速为0.8mL/min梯度洗脱，30分钟内流动相B由5％线性增加到50％，检测波长为280nm，采用峰面积归一化法计算待测样品的主峰、酸性峰及碱性峰含量，即电荷异质体含量。
优选地，所述的Protein A残留量检测包括以下步骤：
将100μl/孔的梯度浓度为0.1-2.0ppm的Protein A标准品和待测样品分别加入预先包被的鸡抗Protein A多克隆抗体的96孔板上，洗板；加入生物素标记的鸡抗Protein A多克隆抗体，40℃孵育2h，洗板；加入辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素，洗板；加入TMB溶液，室温静置显色30min，用终止液终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，使用四参数拟合回归模型绘制标准曲线，计算待测样品中Protein A的浓度。
优选地，所述的HCP残留量检测包括以下步骤：
将梯度浓度为0.1-20.0ppm的HCP标准品和待测样品分别加入预先包被有抗HCP捕获抗体的96孔板上，洗板；加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗HCP多克隆抗体，37℃孵育2.5h，洗板；加入HRP偶联的链霉亲和素，洗板；加入TMB底物溶液，室温静置显色30min；用终止液终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，使用四参数拟合回归模型绘制标准曲线，计算待测样品中HCP的浓度。
优选地，所述的CHO宿主细胞DNA残留量检测是利用荧光定量PCR检测待测样品中CHO宿主细胞DNA残留量，包括如下步骤：
S1.DNA标准品的制备：提取CHO细胞基因组DNA，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，纯化回收酶切片段，检测A260/A280，并计算纯化产物的浓度和纯度，用Tris-EDTA稀释成100、101、102、103、104和105pg/mL的标准品；
S2.qPCR扩增及标准曲线的绘制：反应体系为0.5μM的上、下游引物各1.2μl，5U的Taq DNA聚合酶0.5μl，dNTPs 2.0μl，DNA buffer 3μl，模板DNA 0.5μl，ddH2O 16.6μl；反应条件为：预变性95℃变性40s；95℃8min，54℃1min，72℃1min，共45个循环；以Ct值为纵坐标，以模板DNA浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线；
所述的上游引物为：5’-CCAGGCATTGGTGGCAC-3’；
所述的下游引物为：5’-AGACAGGGTTTCTCTGT--3’；
S3.待测样品CHO宿主细胞DNA残留量检测：提取待测样品的DNA，利用步骤S2中的反应体系和反应条件进行qPCR扩增，根据标准曲线计算待测样品中CHO宿主细胞DNA浓度。
本发明所述的PD-1包括但不限于下述专利申请：201610656318.4。
本发明另一方面还提供了上述的质量标准检测方法在抗PD-1单克隆抗体药物的质控中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的目的在于提供一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，该方法专属性强、线性好、精密度和准确度高，能够全面、精确的检测抗PD-1单克隆抗体类药物的质量，对于抗PD-1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中1.1的参考品的等点聚焦谱图；
图2为实施例1中1.1的样品1的等点聚焦谱图；
图3为实施例1中1.1的样品2的等点聚焦谱图；
图4为实施例1中1.1的样品3的等点聚焦谱图；
图5为实施例1中1.2的样品1与参考品的肽谱分析对比图；
图6为实施例1中1.2的样品2与参考品的肽谱分析对比图；
图7为实施例1中1.2的样品3与参考品的肽谱分析对比图；
图8为实施例2中样品1的SEC色谱图；
图9为实施例2中样品2的SEC色谱图；
图10为实施例2中样品3的SEC色谱图；
图11为实施例2中2.2的非还原CE-SDS色谱图，其图A、B、C分别为样品1-3的非还原CE-SDS色谱图；
图12为实施例2中2.3的还原CE-SDS色谱图，其图A、B、C分别为样品1-3的还原CE-SDS色谱图；
图13为实施例2中2.4的CEX-HPLC色谱图，其图A、B、C分别为样品1-3的CEX-HPLC色谱图；
图14为实施例4中4.3的qPCR标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的药品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
抗PD-1单克隆抗体药物的鉴定：
1.1等电点测定
利用PA/MDQ毛细管电泳仪和中性涂层毛细管组件进行毛细管等电聚焦分析，取3M尿素CIEF胶80μl、3-10载体两性电解质(Pharmalyte3-10)5μl、100mM阳极电解液(H3PO4)10μl、200mM阴极电解液(NaOH)15μl和等电点标记物(包含多肽标记物pI5.85和pI8.18)4μl和10mg/mL的待测样品或者参考品混合，制成上样混合液；将上样混合液上样于毛细管中，室温下聚焦分离，173kPa下进样99s，聚焦条件是聚焦电压25kV，维持10min，分离条件是采用100mM氨水作为迁移液，电压25kV，维持30min；利用紫外吸收检测器在280nm波长下进行检测，记录等电聚焦图谱。
待测样品(本公司生产的3批抗PD-1单克隆抗体原液，批号分别为3055S150525Y08、3055S150630Y08、3055S150717Y08，样品名分别为样品1-3)，参考品(WBP3055STD，批号3055SD150630K01M01)。
检测结果如图1-4所示，3批原液等电点分别为原液主峰的等电点分别为7.05，6.99和7.02，与参考品(等电点为7.08)基本一致。
1.2肽谱图分析
取10mg/mL将待测样品或参考品(与1.1中的样品相同)，用5mol/L尿素缓冲液将待测样品稀释至1mg/mL，68℃条件下变性10min，加入1mol/L DTT(二硫苏糖醇)于36℃条件下还原45min，DTT和待测样品体积比为1:50；加入1mol/L的IAA(碘乙酰胺)进行烷基化，避光反应30min，IAA和待测样品体积比为1:40；加入1mol/L DTT终止反应，DTT和待测样品体积比为1:20；使用10KD离心浓缩管将原尿素缓冲液置换为20mmol/L的NH4HCO3，加入1mg/mL的Lys-C酶，37℃水浴，酶切水解10h，Lys-C酶和待测样品体积比为1:20；5％的TFA(三氟乙酸)终止反应，得到酶切产物；所得酶切产物经反相高效液相色谱检测分析，色谱条件如下：
流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；梯度洗脱(5-120min，2％B→85％B)，流速为0.5mL/min，检测波长214nm，得到肽谱图。
根据蛋白酶切产物图谱，挑选了3个CDR区域主要的肽段色谱峰(peak 1，2和3)作为肽图分析的主要考察和参照标准。
检测结果如图5-7所示，3批原液的肽谱图与参考品基本一致。
实施例2
抗PD-1单克隆抗体药物的纯度分析：
2.1单体纯度检测
用分子排阻色谱柱对待测样品(与实施例1的1.1中的样品相同)进行分离。将待测样品用流动相稀释至10mg/mL，流动相为50mmol/L磷酸钾和300mmol/L氯化钠的混合溶液，pH为6.8，上样量为10μl，流速为0.8mL/min,在280nm下进行检测，采用峰面积归一化法计算单体的含量；
检测结果如图8-10所示，样品1-3的单体纯度分别为99.2％，99.3％和99.3％。
2.2主峰纯度检测
利用非还原CE-SDS法，用超纯水将待测样品(与实施例1的1.1中的样品相同)稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入巯基乙醇5μl，SDS样品缓冲液70μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一化法计算主峰的峰面积百分比，即主峰纯度。
检测结果如图11所示，样品1-3的非还原CE-SDS主峰纯度含量分别为99.3％、99.2％和99.2％，3批原液间无明显差异。
2.3轻链和重链纯度检测
利用还原CE-SDS法，所述的轻链和重链纯度检测是利用还原CE-SDS法，包括以下步骤：
用超纯水将待测样品(与实施例1的1.1中的样品相同)稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入0.1mol/L的N-乙基马来酰亚胺5μl，SDS样品缓冲液95μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一法计算重链和轻链的相对面积百分比，即轻链和重链纯度；
检测结果如图12所示，样品1-3的还原CE-SDS(轻链+重链％)纯度含量见表1，3批原液间无明显差异。
表1：轻链和重链纯度检测结果
Figure BDA0002713974040000071
2.4电荷异质体含量检测
单克隆抗体由于诸多氨基酸翻译后修饰，如氧化、脱酰胺基、糖基化、不完全的C-末端赖氨酸缺失和N端Q环化，存在着不同的电荷异构体，因此需要对样品的电荷异构体进行监测从而控制产品的质量。
利用CEX-HPLC法，使用TSK sp-5pw色谱柱，用流动相A将待测样品(与实施例1的1.1中的样品相同)稀释至1mg/mL，上样量为25μl，流动相A为0.05M磷酸盐，pH4.0，流动相B为0.05M磷酸盐和0.5M氯化钠混合溶液，pH10.0，流速为0.8mL/min梯度洗脱，30分钟内流动相B由5％线性增加到50％，检测波长为280nm，采用峰面积归一化法计算待测样品的主峰、酸性峰及碱性峰含量，即电荷异质体含量。
检测结果如图13所示，样品1-3的主峰含量分别为56.1％，55.7％，56.3％，具体电荷异质体分布见表2，三批原液间无明显差异。
表2：电荷异质体含量检测结果
批号 样品名称 主峰(％) 酸性峰(％) 碱性峰(％)
3055S150525Y08 样品1 56.1 21.0 22.8
3055S150630Y08 样品2 55.7 20.8 23.5
3055S150717Y08 样品3 56.3 19.8 24.0
实施例3
抗PD-1单克隆抗体药物的蛋白含量检测：
检测方法：利用酶标仪，紫外分光光度法对直接待测样品或参考品(与实施例1的1.1中的样品相同)进行检测，由于蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等含苯环氨基酸，在280nm波长附近有最大吸收峰。根据朗伯-比尔定律，蛋白溶液在某一固定紫外波长的吸光度值(A)与蛋白质的消光系数(ε)、蛋白浓度(C)以及光程(L)存在一定关系：A＝εLC。因此，蛋白溶液的浓度可以通过固定波长的吸光度值、比色皿的光程(10mm)和该蛋白物质的消光系数(该蛋白的理论消光系数ε为1.685)计算获得。
3.1精密度
由3名有资质的分析人员，每名分析人员平行测定5份(随机取5份已分装好的参考品)，按照上方法对其进行蛋白质浓度的检测，计算15个数据的平均值及其RSD。结果如表3所示。
表3：蛋白质含量和精密度结果
Figure BDA0002713974040000081
Figure BDA0002713974040000091
结果表明：5份样品所测得的蛋白质质含量在30.32-30.81mg/mL之间，RSD为0.5％，表明该方法的精密度良好。
3.2准确度
用已知蛋白质含量为10.3mg/mL，20.5mg/mL，和30.1mg/mL的抗PD-1单克隆抗体药物作为待测样品(即，样品A,BC，抗PD-1单克隆抗体注射液，批号：20150701，20150802，20150903)由3名分析人员各检测1次，统计实验结果，结果如表4所示。
表4：蛋白质含量和准确度结果
Figure BDA0002713974040000092
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜2％，说明本发明方法能够满足准确度要求。
实施例4
抗PD-1单克隆抗体药物的相关杂质含量检测：
4.1Protein A残留量检测
检测方法：夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，将100μl/孔的梯度浓度为0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ppm的Protein A标准品和待测样品分别加入预先包被有浓度为1.2μg/mL的鸡抗Protein A多克隆抗体的96孔板上，PBS溶液洗板3次；加入浓度为0.8μg/mL生物素标记的鸡抗Protein A多克隆抗体100μl/孔，40℃孵育2h，PBS溶液洗板3次；加入浓度为1.0μg/mL辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素100μl/孔，PBS溶液洗板3次；加入100μl/孔TMB溶液室温静置显色30min，用100μl/孔终止液终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，通过SoftMax Pro计算机软件，使用四参数拟合回归模型(权重因子Y)绘制标准曲线，通过待测样品的OD值与标准曲线，计算样品中Protein A的浓度。
4.1.1精密度
由3名有资质的分析人员，每名分析人员平行测定5份(随机取5份已分装好的参考品)，按照上方法对其进行Protein A浓度的检测，计算15个数据的平均值及其RSD。结果如表5所示。
表5：Protein A浓度和精密度结果
Figure BDA0002713974040000101
结果表明：5份样品所测得的Protein A含量均小于1.6ppm，RSD为3.03％，表明该方法的精密度良好，Protein A残留量符合标准。
4.1.2准确度
用已知含有Protein A浓度为0.32ppm，0.61ppm，和1.54ppm的抗PD-1单克隆抗体药物作为待测样品4-6，由3名分析人员各检测1次，统计实验结果，结果如表6所示。
表6：Protein A浓度和准确度结果
Figure BDA0002713974040000102
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜5％，说明本发明方法能够满足准确度要求。
4.2 CHO宿主细胞蛋白(HCP)残留量检测
检测方法：夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，将100μl/孔的梯度浓度为0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ppm的HCP标准品和待测样品分别加入预先包被有浓度为1.5μg/mL的抗HCP捕获抗体的96孔板上，PBS溶液洗板3次；加入浓度为1.0μg/mL辣根过氧化物酶偶联的羊抗HCP多克隆抗体100μl/孔，37℃孵育2.5h，PBS溶液洗板3次；加入浓度为1.0μg/mL的HRP偶联的链霉亲和素100μl/孔，PBS溶液洗板3次；加入TMB底物溶液100μl/孔，室温静置显色30min；用终止液100μl/孔终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，通过SoftMax Pro计算机软件，使用四参数拟合回归模型(权重因子Y)绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中HCP的浓度。
4.2.1精密度
由3名有资质的分析人员，每名分析人员平行测定5份(随机取5份已分装好的参考品)，按照上方法对其进行HCP浓度的检测，计算15个数据的平均值及其RSD。结果如表7所示。
表7：HCP浓度和精密度结果
Figure BDA0002713974040000111
结果表明：5份样品所测得的HCP含量为0.94ppm，RSD为1.26％，表明该方法的精密度良好，HCP残留量符合标准。
4.2.2准确度
用已知含有HCP浓度为1ppm，2ppm，和3ppm的抗PD-1单克隆抗体药物作为待测样品7-9，由3名分析人员各检测1次，统计实验结果，结果如表8所示。
表8：HCP浓度和准确度结果
Figure BDA0002713974040000112
Figure BDA0002713974040000121
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜5％，说明本发明方法能够满足准确度要求。
4.3CHO宿主细胞DNA残留量检测
检测方法：利用荧光定量PCR检测待测样品中CHO宿主细胞DNA残留量，包括以下步骤：
S1.DNA标准品的制备：利用DNeasy Tissue Kit试剂盒提取CHO细胞基因组DNA，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，纯化回收酶切片段，检测A260/A280，并计算纯化产物的浓度和纯度，用Tris-EDTA稀释分别为成100、101、102、103、104和105pg/mL的标准品；
S2.qPCR扩增及标准曲线的绘制：反应体系为0.5μM的上、下游引物各1.2μl，5U的Taq DNA聚合酶0.5μl，dNTPs 2.0μl，DNA buffer 3μl，模板DNA 0.5μl，ddH2O 16.6μl；反应条件为：预变性95℃变性40s；95℃8min，54℃1min，72℃1min，共45个循环；以Ct值为纵坐标，以模板DNA浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，如图14所示；
所述的上游引物为：5’-CCAGGCATTGGTGGCAC-3’；
所述的下游引物为：5’-AGACAGGGTTTCTCTGT--3’；
S3.待测样品CHO宿主细胞DNA残留量检测：提取待测样品的DNA，利用步骤S2中的反应体系和反应条件进行qPCR扩增，根据标准曲线计算待测样品中CHO宿主细胞DNA浓度。
4.3.1专属性
利用试剂盒提取人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilical vein endothelialcells，HUVECs)、人胚肾293细胞(human embryo kidney 293cells，HEK293)和乳仓鼠肾细胞21(Baby Hamster Syrian Kidney，BHK21)的基因组DNA，将提取好的HUVECs细胞、HEK293细胞和BHK21细胞的DNA作为模板DNA，空白对照组用ddH2O代替模板DNA，用上述qPCR方法进行检测，来评价该方法的专属性。
检测结果表明，以HUVECs细胞、HEK293细胞和BHK21细胞的DNA为模板的qPCR结果与空白对照组基本一致，无特异性扩增曲线，表明该方法的专属性好，可用于CHO宿主细胞DNA残留量的检测。
4.3.2精密度
由3名有资质的分析人员，每名分析人员平行测定5份(随机取5份已分装好的参考品，每份5mL)，按照上方法对其进行CHO宿主细胞DNA残留量的检测，计算15个数据的平均值及其RSD。结果如表9所示。
表9：CHO宿主细胞DNA残留量和精密度结果
Figure BDA0002713974040000131
结果表明：5份样品所测得的CHO宿主细胞DNA残留量为0.94ppm，RSD为0.17％，表明该方法的精密度良好，CHO宿主细胞DNA残留量符合标准。
4.3.3准确度
用已知含有CHO宿主细胞DNA残留量为5pg/dose，15pg/dose，和20pg/dose的抗PD-1单克隆抗体药物作为待测样品10-12，由3名分析人员各检测1次，统计实验结果，结果如表10所示。
表10：CHO宿主细胞残留量和准确度结果
Figure BDA0002713974040000132
结果表明，每个待测样品的3次检测结果的RSD＜2％，说明本发明方法能够满足准确度要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础；当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗PD-1单克隆抗体药物的质量标准检测方法，其特征在于，所述的质量标准检测方法包括如下步骤：
(1)鉴定：包括待测样品的等电点测定和肽谱图分析；
(2)纯度分析：包括待测样品的单体纯度检测、主峰纯度检测、轻链和重链纯度检测，以及电荷异质体含量检测；
(3)蛋白含量检测：利用紫外分光光度法对待测样品进行检测；
(4)相关杂质含量检测：包括待测样品中的Protein A残留量检测、HCP残留量检测和CHO宿主细胞DNA残留量检测；
所述的待测样品为抗PD-1单克隆抗体药物。
2.根据权利要求1所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的等电点测定包括以下步骤：
取尿素CIEF胶、3-10载体两性电解质、100mM阳极电解液、200mM阴极电解液和等电点标记物和10mg/mL的待测样品混合，制成上样混合液；将上样混合液上样于毛细管中，室温下聚焦分离，173kPa下进样99s，聚焦条件是聚焦电压25kV，维持10min，分离条件是采用100mM氨水作为迁移液，电压25kV，维持30min；利用紫外吸收检测器在280nm波长下进行检测，记录等电聚焦图谱；
所述的3-10载体两性电解质为Pharmalyte(3-10)；所述的阳极电解液为H3PO4；所述的阴极电解液为NaOH；所述的等电点标记物为包含多肽标记物pI5.85和pI8.18；
所述的肽谱图分析包括以下步骤：
取待测样品，用尿素缓冲液将稀释至1mg/mL，68℃条件下变性10min，加入DTT，36℃还原45min，DTT和待测样品体积比为1:50；加入IAA，避光反应30min，IAA和待测样品体积比为1:40；加入DTT终止反应，DTT和待测样品体积比为1:20；将原尿素缓冲液置换为NH4HCO3，加入Lys-C酶，37℃水浴10h，Lys-C酶和待测样品体积比为1:20；5％的TFA终止反应，得到酶切产物；所得酶切产物经反相高效液相色谱检测分析，色谱条件为：流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；梯度洗脱(5-120min，2％B→85％B)，流速为0.5mL/min，检测波长214nm，得到肽谱图。
3.根据权利要求2所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的3-10载体两性电解质为Pharmalyte(3-10)；所述的阳极电解液为H3PO4；所述的阴极电解液为NaOH；所述的等电点标记物为包含多肽标记物pI5.85和pI8.18。
4.根据权利要求1所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的单体纯度检测包括以下步骤：
将待测样品用流动相稀释至10mg/mL，流动相为50mmol/L磷酸钾和300mmol/L氯化钠的混合溶液，pH为6.8，上样量为10μl，流速为0.8mL/min,在280nm下进行检测，采用峰面积归一化法计算单体的含量；
所述的主峰纯度检测是利用非还原CE-SDS法，包括以下步骤：
用超纯水将待测样品稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入巯基乙醇5μl，SDS样品缓冲液70μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一化法计算主峰的峰面积百分比，即主峰纯度；
所述的轻链和重链纯度检测是利用还原CE-SDS法，包括以下步骤：
用超纯水将待测样品稀释至5.0mg/mL，取该溶液30μl，加入0.1mol/L的N-乙基马来酰亚胺5μl，SDS样品缓冲液95μl，混匀后，70℃水浴10min，上样检测；进样量为50μl，分离电压为15kV，毛细管温度30℃，检测波长为220nm，用面积归一法计算重链和轻链的相对面积百分比，即轻链和重链纯度；
所述的电荷异质体含量检测是利用CEX-HPLC法，包括以下步骤：
用流动相A将待测样品稀释至1mg/mL，上样量为25μl，流动相A为0.05M磷酸盐，pH4.0，流动相B为0.05M磷酸盐和0.5M氯化钠混合溶液，pH10.0，流速为0.8mL/min梯度洗脱，30分钟内流动相B由5％线性增加到50％，检测波长为280nm，采用峰面积归一化法计算待测样品的主峰、酸性峰及碱性峰含量，即电荷异质体含量。
5.根据权利要求1所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的Protein A残留量检测包括以下步骤：
将梯度浓度为0.1-2.0ppm的Protein A标准品和待测样品分别加入预先包被有鸡抗Protein A多克隆抗体的96孔板上，洗板；加入生物素标记的鸡抗Protein A多克隆抗体，40℃孵育2h，洗板；加入辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素，洗板；加入TMB溶液，室温静置显色30min，用终止液终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，使用四参数拟合回归模型绘制标准曲线，计算待测样品中Protein A的浓度。
6.根据权利要求1所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的HCP残留量检测包括以下步骤：
将梯度浓度为0.1-20.0ppm的HCP标准品和待测样品分别加入预先包被有抗HCP捕获抗体的96孔板上，洗板；加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗HCP多克隆抗体，37℃孵育2.5h，洗板；加入HRP偶联的链霉亲和素，洗板；加入TMB底物溶液，室温静置显色30min；用终止液终止反应，在酶标仪上读取吸光值450/650nm，使用四参数拟合回归模型绘制标准曲线，计算待测样品中HCP的浓度。
7.根据权利要求1所述的质量标准检测方法，其特征在于，所述的CHO宿主细胞DNA残留量检测包括以下步骤：
S1.DNA标准品的制备：提取CHO细胞基因组DNA，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，纯化回收酶切片段，检测A260/A280，并计算纯化产物的浓度和纯度，用Tris-EDTA稀释成100、101、102、103、104和105pg/mL的标准品；
S2.qPCR扩增及标准曲线的绘制：反应体系为0.5μM的上、下游引物各1.2μl，5U的TaqDNA聚合酶0.5μl，dNTPs 2.0μl，DNA buffer 3μl，模板DNA 0.5μl，ddH2O 16.6μl；反应条件为：预变性95℃变性40s；95℃8min，54℃1min，72℃1min，共45个循环；以Ct值为纵坐标，以模板DNA浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线；
所述的上游引物为：5’-CCAGGCATTGGTGGCAC-3’；
所述的下游引物为：5’-AGACAGGGTTTCTCTGT--3’；
S3.待测样品CHO宿主细胞DNA残留量检测：提取待测样品的DNA，利用步骤S2中的反应体系和反应条件进行qPCR扩增，根据标准曲线计算待测样品中CHO宿主细胞DNA浓度。
8.权利要求1-7任意一项所述的质量标准检测方法在抗PD-1单克隆抗体药物的质控中的应用。
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