CN112969696A - 乙酰化书写器抑制剂的开发及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了靶向HAT EP300进行降解的双功能化合物(降解剂)。还公开了含有所述降解剂的药物组合物和使用该化合物治疗疾病的方法。

Description

乙酰化书写器抑制剂的开发及其用途

相关申请

根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年11月2日提交的美国临时申请号62/754,934的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

高危神经母细胞瘤(NB)是一种来源于原始神经嵴细胞的周围交感神经***的儿科肿瘤，并且其存活率低。这些神经内分泌肿瘤的特征是原癌基因MYC家族成员的高表达。(Matthay et al.,Nat.Rev.Dis.Primers 2:16078(2016)；Zimmerman et al.,CancerDiscov.8(3):320-35(2018))。MYCN是转录因子(TFs)正向前馈自动调节回路的组成部分，所述转录因子在MYCN扩增的NB中确定细胞命运。这组转录因子被称为核心调节回路(CRC)，每个成员都由一个超级增强子(SE)基因调节，这是NB生存能力所必需的。MYC家族原癌基因驱动肿瘤生长的一种机制是通过侵入基因增强子并招募转录和表观遗传装置(machinery)(Zeid et al.,Nat.Genet.50(4):515-23(2018))。已经显示，结合药理学抑制SE介导的转录起始和延伸可在体内、外迅速破坏NB CRC，从而导致转录塌陷和细胞凋亡(Durbin etal.,Nat.Genet.50(9):1240-60(2018))。由于转录抑制不足以驱动体内肿瘤消退(Mortonet al.,Mol.Oncol.7(2):248-58(2013))，因此需要一种替代方法。

最近发现EP300或组蛋白乙酰转移酶(HAT)p300是NB细胞存活的必要成分(Durbinet al.,Nat.Genet.50(9):1240-60(2018))。像其旁系同源cAMP反应元件(CREB)结合蛋白(CBP，CREBBP)一样，EP300催化SE元件典型的H3K27ac标记(Dancy et al..,Chem.Rev.115(6):2419-52(2015))。许多肿瘤类型显示出对EP300的依赖性，而不是对CBP的依赖性，这表明这一发现可能是不同人类癌症亚群的普遍特征。其他EP300依赖性和MYC家族依赖性癌症包括急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、横纹肌肉瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。最近报道的EP300抑制剂在体外和体内均表现出对EP300/CBP的高度选择性抑制(Lasko et al.,Nature 550:128–132(2017)；Michaelides,et al.,ACSMed.Chem.Lett.9:28-33(2018))。然而，该分子在EP300和CBP之间没有显示出选择性。

发明内容

本发明的第一方面涉及双功能化合物，其具有由式I表示的结构:

其中靶向配体(Targeting Ligand)代表结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)p300(本文也称为EP300)的部分，降解决定子(Degron)代表结合E3泛素连接酶的部分，接头(Linker)代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分；或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体是本文定义的A-485或其类似物。

本发明的另一方面涉及双功能化合物，其具有由式II表示的结构:

其中靶向配体代表结合组蛋白乙酰转移酶p300(本文也称为EP300)的部分，接头代表共价连接生物素(Biotin)和所述靶向配体的部分。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。

本发明的另一方面涉及制备式(I)或(II)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的方法。

本发明的其他方面涉及治疗涉及EP300活性功能异常或失调的疾病或病症的方法，该方法需要向有此需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是高风险神经母细胞瘤(NB)。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)或弥漫性大B细胞淋巴瘤。在其他实施方案中，所述疾病或病症是实体瘤。在其他实施方案中，所述疾病或病症是黑素瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。

不希望被任何特定的操作理论所束缚，本发明的式(I)的双功能化合物被认为通过招募细胞的泛素/蛋白酶体***(其功能是常规地识别和去除受损蛋白质)，由于p300和靶向配体之间的结合，使泛素/蛋白酶体***与P300非常接近，从而引起EP300的降解。EP300分子被破坏后，降解剂被释放并继续作用。因此，通过参与和利用身体自身的天然蛋白质处理***，本发明的双功能化合物可以代表对当前EP300的小分子抑制剂的潜在改进。因此，降解剂的有效细胞内浓度可能明显低于小分子EP300抑制剂。总的来说，本发明的双功能化合物可以代表对已知的EP300抑制剂的改进，并且可以克服关于其使用的一个或多个限制，并且还可以选择性靶向EP300而不是CBP。

本发明的其他方面涉及使用式(II)的双功能化合物作为EP300蛋白的探针的方法，所述方法包括将怀疑含有EP300的裂解细胞与式(II)的化合物和固定在载体(如珠)上的链霉亲和素接触；通过生物素-链霉亲和素结合，分离由分子和蛋白质结合形成的复合物；并确认分离的复合物中存在EP300。这种确认可以通过本领域标准的技术来完成，例如免疫印迹。

附图说明

图1A是显示即使经过强化治疗，高危神经母细胞瘤患者的存活率仍然很低的图。

图1B是显示MYCN扩增的NB和高死亡率之间的相关性的图。

图2A是显示EP300和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)-结合蛋白(CBP)作为多结构域蛋白的图像。

图2B是显示EP300/CBP抑制剂C646、CBP30和A485在7天集落形成测定中对KellyNB细胞的影响的图。还显示了抑制剂的结构和IC₅₀值。

图2C是显示在集落形成测定中抑制剂A485在五种NB细胞系中的作用的图。还显示了IC₅₀值。

图2D是显示在CellTiter-

生长测定中用增加剂量的A485处理的Kelly NB细胞中的生长抑制的图。

图2E是显示在CellTiter-

生长测定中用增加剂量的A485处理的Kelly NB细胞中的凋亡诱导的图。

图3A是显示Kelly NB细胞的菌落形成测定的图，所述Kelly NB细胞被遗传编辑为缺乏EP300或CBP。结果证实，NB细胞的细胞生长不需要CBP，但需要EP300。Ch2.2是一种靶向基因沙漠的对照sgRNA。

图3B是显示EP300和CBP的成功的特异性CRISPR编辑的免疫印迹。

图4A是基于CRBN的P300降解剂设计原则的示意图。

图4B是显示用于评估降解剂的催化功能抑制的EP300的HAT结构域的

测定的图像。

图4C是显示EP300溴结构域和CRBN的AlphaScreen^TM测定的图像。

图4D显示基于EP300/CBP溴结构域抑制剂和EP300抑制剂的EP300降解剂的结构导向设计，通过用不同的接头将IMiD连接到不同的修饰位点。

图4E是显示在CRBN AlphaScreen^TM测定中评价本发明降解剂化合物(CPD)1和CPD2(阴性对照化合物)的图。

图4F是显示用CPD 1、CPD 2和A485以不同剂量处理Kelly NB细胞24小时后EP300降解和H3K27Ac水平的免疫印迹。

图4G是显示用1μM的CPD 1处理Kelly NB细胞0、8、12、14和16小时后，EP300和CBP降解以及PARP1、cPARP1、Caspase-4和cCaspase-3水平的免疫印迹。结果证实了CPD 1对EP300的选择性降解。

图4H是显示通过CellTiter-

测定的，用CPD 1处理Kelly细胞系后的相对细胞生长的图。

图5A是显示开发一个集中的EP300降解剂化合物库的药物化学计划的图像。

图5B是本发明化合物CPD 1与EP300和CRBN的计算对接模型的图像。

图5C是显示二聚化分析以评估由降解剂诱导的EP300和CRBN二聚化的示意图。

图6A是显示在雄性CD1小鼠中腹膜内(IP)注射剂量为10mg/kg(n＝3)后CPD 1的时间曲线的图。通过在不同时间点的一系列出血，用LCMS/MS测定动物血液中的化合物浓度。数据显示，化合物在血液中Cmax 5μM和半衰期(13小时)。A-485在小鼠体内的半衰期为0.7小时。

图6B是显示在0.25μM和0.5μM CPD 1下NB斑马鱼模型中肿瘤生长抑制的图。在PK和斑马鱼研究中都没有观察到毒性。

图7A是显示通过4天细胞计数试剂盒(CCK)测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后，MM.1S细胞生长抑制的图。

图7B是显示通过4天细胞计数试剂盒(CCK)测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后，U266细胞生长抑制的图。

图7C是显示通过4天细胞计数试剂盒(CCK)测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后，RPMI8226细胞生长抑制的图。

图8A是显示通过6天3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后在MM.1S细胞生长抑制的图。

图8B是显示通过6天MTT测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后，U266细胞生长抑制的图。

图8C是显示通过6天MTT测定的，用0-10μM CPD 1、CPD 2和A-485处理后，RPMI8226细胞生长抑制的图。

图9A是显示用CPD 1、CPD 2和A485以不同剂量处理Kelly NB细胞24小时后EP300降解和H3K27Ac水平的免疫印迹。

图9B是显示在时间过程实验中用CPD 1(500nM)处理Kelly NB细胞后EP300降解以及CBP和PAP1水平的免疫印迹。

图9C是用CPD 1(500nM)处理Kelly NB细胞后6小时和36小时的蛋白质组学分析结果的图。

图9D是显示使用集落形成测定，用CPD 1处理，在10天中Kelly细胞以剂量依赖性方式生长的图。

图10A是显示CPD 1中靶向配体的手性中心(R，S)的图像。

图10B是显示用CPD 1及其S，S异构体处理Kelly NB细胞后，EP300降解和CBP、H3K27Ac和总H3水平的免疫印迹。

图10C是显示用不同浓度(μM)的CPD 1、CPD 2(不渗透细胞的阴性对照)、来那度胺、沙利度胺和泊马度胺处理后，Kelly细胞的生长抑制的图。

图10D是显示由ATPlite^TM测定的，用不同浓度(μM)的CPD 1、其(S，S)-异构体和A485处理后的Kelly细胞的生长抑制的图。

图11A是描述用于确定本发明化合物的底物特异性的AlphaScreen^TM测定的机理的图。

图11B是显示通过AlphaScreen^TM测定的，CPD 1、CPD 2和A485(HAT抑制剂)结合HAT(EP300)结构域的图。

图11B是显示通过AlphaScreen^TM测定的，CPD 1、CPD 2、来那度胺、沙利度胺和泊马度胺结合cereblon蛋白(CRBN)的图。如预期的那样，没有观察到与A485的结合。

图12A是显示Ch2.2、LACZ和CRBN敲除细胞系中的CRBN水平的免疫印迹。

图12B是显示用CPD 1(500nM)处理Ch2.2，LACZ和CRBN敲除细胞系后的EP300降解和CBP、H3K27Ac和总H3水平的免疫印迹。

图12C是显示用不同浓度(μM)的CPD 1处理后Ch2.2、LACZ和CRBN敲除细胞系的细胞存活力的图。

图13A是显示用10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg处理的小鼠在14天内的总体重变化的图。

图13B是显示用40mg/kg处理的小鼠在21天内的初始体重百分比变化的图。

图13C是显示来自使用CPD 1的最大耐受剂量(MTD)研究的小鼠肝脏的免疫组织化学(IHC)染色结果的图。

图14A是显示用40mg/kg处理的小鼠的肿瘤体积(mm³)随时间(天)的变化的图。

图14A是显示用40mg/kg处理的小鼠随时间(天)的存活百分比的图。

图15A-15G是显示通过ATPlite^TM测定的，用不同浓度(μM)的本发明降解剂CPD 1至CPD 22和A485处理后Kelly细胞的生长抑制的一组图。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非有相反的说明，否则下列术语具有所示的含义，以便于理解本发明。

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“一种组合物”包括两种或多种这种组合物的混合物，“一种抑制剂”包括两种或多种这种抑制剂的混合物，等等。

除非另有说明，术语“大约”是指由术语“大约”修饰的特定值的10％以内(例如，在5％、2％或1％之内)。

与“包括”、“包含”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未记载的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤“以及那些实质上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”。

关于本发明的化合物，在以下术语在本文用于进一步描述它们的程度上，适用以下定义。

如本文所用，术语“脂族”是指非环状烃基，包括支链和非支链烷基、烯基或炔基。

如本文所用，术语“烷基”是指饱和的直链或支链单价烃基。在一个实施方案中，烷基是C₁-C₁₈基团。在其他实施方案中，烷基是C₀-C₆、C₀-C₅、C₀-C₃、C₁-C₁₂、C₁-C₈、C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄或C₁-C₃基团(其中C₀烷基是指键)。烷基的例子包括甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。在一些实施方案中，烷基是C₁-C₃烷基。在一些实施方案中，烷基是C₁-C₂烷基。

如本文所用，术语“亚烷基”是指将分子的其余部分连接到基团上的直链或支链二价烃链，所述基团仅由碳和氢组成，不含不饱和键并且具有1至12个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基等。亚烷基链可以通过单键连接到分子的其余部分，并通过单键连接到基团。在一些实施方案中，亚烷基包含1至8个碳原子(C₁-C₈亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至5个碳原子(C₁-C₅亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至4个碳原子(C₁-C₄亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至3个碳原子(C₁-C₃亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含1至2个碳原子(C₁-C₂亚烷基)。在其他实施方案中，亚烷基包含一个碳原子(C₁亚烷基)。

如本文所用，术语“卤代烷基”是指被一个或多个(例如1、2、3或4个)卤素基团取代的如本文所定义的烷基。

如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的直链或支链单价烃基。烯基包括具有“顺式”和“反式”取向，或者“E”和“Z”取向的基团。在一个例子中，烯基是C₂-C₁₈基团。在其它实施方案中，烯基是C₂-C₁₂、C₂-C₁₀、C₂-C₈、C₂-C₆或C₂-C₃基团。例子包括乙烯基(ethenyl)或乙烯(vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基和己-1,3-二烯基。

如本文所用，术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的直链或支链单价烃基。在一个例子中，炔基是C₂-C₁₈基团。在其它例子中，炔基是C₂-C₁₂、C₂-C₁₀、C₂-C₈、C₂-C₆或C₂-C₃。例子包括乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基和丁-3-炔基。

如本文所用，术语“醛”由式—C(O)H表示。术语“C(O)”和C＝O在本文中可互换使用。

这里使用的术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指如上定义的烷基，其上连接有氧基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两个烃类化合物。因此，使烷基成为醚的烷基的取代基是或类似于烷氧基，例如可以由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一表示。

如本文所用，术语“卤素”(或“卤代”或“卤化物”)指氟、氯、溴或碘。

如本文所用，术语“羧酸”由式—C(O)OH表示，而“羧酸酯”由式—C(O)O-表示。

如本文所用，术语“酯”由式-OC(O)Z¹或-C(O)OZ¹表示，其中Z¹可以是烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，所有这些都如本文所述。

如本文所用，术语“醚”由式Z¹OZ²表示，其中Z¹和Z²可以独立地是烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，所有这些都如本文所述。

如本文所用，术语“酮”由式Z¹C(O)Z²表示，其中A¹和A²独立地表示烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，所有这些都如本文所述。

如本文所用，术语“磺酰基”是指由式-S(O)₂Z¹表示的磺基-氧代基团，其中Z¹可以是氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基，所有这些都如本文所述。

如本文所用，术语“磺酰氨基”(或“磺酰胺”)由式--S(O)₂NH₂表示。

如本文所用，术语“硫醇”由式--SH表示。

如本文所用，术语“环状基团”广义上指单独使用或作为更大部分的一部分使用的任何基团，包含饱和、部分饱和或芳环体系，例如碳环(环烷基、环烯基)、杂环(杂环烷基、杂环烯基)、芳基和杂芳基。环状基团可具有一个或多个(例如稠合的)环体系。因此，例如，环状基团可以包含一个或多个碳环、杂环、芳基或杂芳基。

如本文所用，术语“碳环”(也称为“碳环基”)是指单独使用或作为较大部分的一部分使用的基团，其包含具有3至20个碳原子的饱和、部分不饱和或芳环体系，其单独或作为较大部分(例如，烷基碳环基团)的一部分。术语碳环基包括单环、双环、三环、稠环、桥环和螺环体系及其组合。在一个实施方案中，碳环基包括3至15个碳原子(C₃-C₁₅)。在一个实施方案中，碳环基包括3至12个碳原子(C₃-C₁₂)。在另一个实施方案中，碳环基包括C₃-C₈、C₃-C₁₀或C₅-C₁₀。在另一个实施方案中，碳环基作为单环，包括C₃-C₈、C₃-C₆或C₅-C₆。在一些实施方案中，碳环基作为双环，包括C₇-C₁₂。在另一个实施方案中，碳环基作为螺环体系，包括C₅-C₁₂。单环碳环基的代表性例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊基-1-烯基、1-环戊基-2-烯基、1-环戊基-3-烯基、环己基、全氘代环己基、1-环己基-1-烯基、1-环己基-2-烯基、1-环己基-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、苯基和环十二烷基；具有7至12个环原子的双环碳环基包括[4,3]、[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环体系，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、萘和双环[3.2.2]壬烷。螺环碳环基的代表性例子包括螺环[2.2]戊烷、螺环[2.3]己烷、螺环[2.4]庚烷、螺环[2.5]辛烷和螺环[4.5]癸烷。术语碳环基包括本文定义的芳基环体系。术语碳环基也包括环烷基环(例如，饱和或部分不饱和的单、双或螺碳环)。术语碳环基团还包括与一个或多个(例如1、2或3个)不同的环状基团(例如芳基或杂环)稠合的碳环，其中基团或连接点在碳环环上。

因此，术语碳环也包括碳环基烷基基团，如本文所用，其是指式--R^c-碳环基的基团，其中R^c是亚烷基链。术语碳环也包括碳环基烷氧基基团，如本文所用，其指通过式--O--R^c-碳环基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链。

如本文所用，术语“杂环基”是指“碳环基”，其单独使用或作为更大部分的一部分使用，包含饱和、部分不饱和或芳环体系，其中一个或多个(例如,1、2、3或4个)碳原子已经被杂原子(例如，O、N、N(O)、S、S(O)或S(O)₂)取代。术语杂环基包括单环、双环、三环、稠环、桥环和螺环体系及其组合。在一些实施方案中，杂环基是指3至15元杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指3至12元杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指饱和环体系，例如3至12元饱和杂环基环体系。在一些实施方案中，杂环基是指杂芳基环体系，例如5至14元杂芳基环体系。术语杂环基也包括C₃-C₈杂环烷基，它是含有3-8个碳和一个或多个(1、2、3或4个)杂原子的饱和或部分不饱和的单、双或螺环体系。

在一些实施方案中，杂环基包括3-12个环原子，并且包括单环、双环、三环和螺环体系，其中环原子是碳，1-5个环原子是杂原子，例如氮、硫或氧。在一些实施方案中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的3-至7-元单环。在一些实施方案中，杂环基包括具有一个或多个选自氮、硫或氧的杂原子的4-至6-元单环。在一些实施方案中，杂环基包括3元单环。在一些实施方案中，杂环基包括4元单环。在一些实施方案中，杂环基包括5-6元单环。在一些实施方案中，杂环基包括0至3个双键。在任一前述实施方案中，杂环基包括1、2、3或4个杂原子。任何氮或硫杂原子可以任选被氧化(例如，NO、SO、SO₂)，并且任何氮杂原子可以任选被季铵化(例如，[NR₄]⁺Cl^-、[NR₄]⁺OH^-)。杂环基的代表性例子包括环氧乙烷基、氮丙啶基、硫杂丙啶基、氮杂环丁啶基、氧杂环丁啶基、噻吩基、1,2-二噻吩基、1,3-二噻吩基、吡咯烷基、二氢-1H-吡咯基、二氢呋喃基、四氢吡喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢噻喃基、六氢嘧啶基、恶嗪烷基(oxazinanyl)、噻嗪基(thiazinanyl)、噻吨基(thioxanyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)、高哌啶基(homopiperidinyl)、氮杂环庚烷基(azepanyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂基(oxazepinyl)、氧杂氮杂环庚烷基(oxazepanyl)、二氮杂环庚烷基(diazepanyl)、1,4-二氮杂环庚烷基、二氮杂基(diazepinyl)、硫氮杂基(thiazepinyl)、硫氮杂环庚烷基(thiazepanyl)、四氢硫代吡喃基、唑烷基、噻唑基、异噻唑基、1,1-二氧硫代噻唑啉基、唑烷基、咪唑烷基、4，5，6，7-四氢[2H]吲唑基、四氢苯并咪唑基、4，5，6，7-四氢苯并[d]咪唑基、1，6-二氢咪唑基[4，5-d]吡咯并[2，3-b]吡啶基、噻嗪基、噻吩基、噁嗪基、噻二嗪基、噁二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、噁噻嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、吲哚基、噻吡喃基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂蒽基、1，3-二氧杂戊环基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻烷基、二硫杂蒽基、嘧啶壬基、嘧啶二壬基、嘧啶-2，4-二酮基、哌嗪壬基、哌嗪二壬基、吡唑烷基咪唑基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基、6-氮杂双环[3.1.1]庚基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、氮杂双环[2.2.2]己基、2-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、2-氮杂双环[2.2.2]辛基、8-氮杂双环[2.2.2]辛基、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、氮杂螺环[3.5]壬基、氮杂螺环[2.5]辛基、氮杂螺环[4.5]癸基、1-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基、氮杂螺[5.5]十一烷基、四氢吲哚基、八氢吲哚基、四氢异吲哚基、四氢吲唑基、1,1-二氧六环氢化吡喃基。含有硫或氧原子和1-3个氮原子的5元杂环的例子是噻唑基，包括噻唑-2-基和噻唑-2-基氮氧化物，噻二唑基，包括1,3,4-噻二唑-5-基和1,2,4-噻二唑-5-基，唑基，例如唑-2-基，和噁二唑基，例如1,3,4-噁二唑-5-基，和1,2,4-噁二唑-5-基。含有2-4个氮原子的5元环杂环的例子包括咪唑基，如咪唑-2-基；***基，例如1,3,4-***-5-基；1,2,3-***-5-基、1,2,4-***-5-基和四唑基，例如1H-四唑-5-基。苯并稠合5元杂环基的代表性例子是苯并恶唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。6-元杂环基的例子包括1-3个氮原子和任选的硫或氧原子，例如吡啶基，如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；嘧啶基，例如嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，例如1,3,4-三嗪-2-基和1,3,5-三嗪-4-基；哒嗪基，特别是哒嗪-3-基和吡嗪基。吡啶氮氧化物和哒嗪氮氧化物以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1,3,4-三嗪-2-基是杂环基的其他例子。在一些实施方案中，杂环基团包括与一个或多个(例如，1、2或3个)不同的环状基团(例如，碳环或杂环)稠合的杂环，其中基团或连接点在杂环上，并且在一些实施方案中，其中连接点是杂环中包含的杂原子。

因此，术语杂环包括氮杂环基，如本文所用，其指含有至少一个氮的杂环基，其中杂环基与分子其余部分的连接点是通过杂环基中的氮原子。氮杂环基的代表性例子包括1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基和咪唑烷基。术语杂环也包括C-杂环基，如本文所用，它指含有至少一个杂原子的杂环基，其中杂环基与分子其余部分的连接点是通过杂环基中的碳原子。碳杂环基的代表性例子包括2-吗啉基、2-或3-或4-哌啶基、2-哌嗪基和2-或3-吡咯烷基。术语杂环也包括杂环基烷基基团，如上所述，它是指式--R^c-杂环基的基团，其中R^c是亚烷基链。术语杂环还包括杂环基烷氧基，如本文所用，它是指通过式-O-R^c-杂环基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链。

如本文所用，术语“芳基”单独使用或作为更大部分的一部分使用(例如，“芳烷基”，其中烷基上的末端碳原子是连接点，例如，苄基)、“芳烷氧基”，其中氧原子是连接点，或“芳氧基烷基”，其中连接点在芳基上，是指包括单环、双环或三环碳环体系的基团，其包括稠环，其中该体系中至少一个环是芳族的。在一些实施方案中，芳烷氧基是苯氧基。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在一个实施方案中，芳基包括具有6-18个碳原子的基团。在另一个实施方案中，芳基包括具有6-10个碳原子的基团。芳基的例子包括苯基、萘基、蒽基、联苯基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氢萘基、1H-茚基、2,3-二氢-1H-茚基、萘啶基等，它们可以被一个或多个本文所述的取代基取代或独立取代。一种特殊的芳基是苯基。在一些实施方案中，芳基包括与一个或多个(例如，1、2或3个)不同的环状基团(例如，碳环或杂环)稠合的芳基环，其中基团或连接点在芳基环上。

因此，术语芳基包括芳烷基基团(例如,苄基)，如上所述，它是指式--R^c-芳基的基团，其中R^c是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。在一些实施方案中，芳烷基基团是任选取代的苄基。术语芳基也包括芳烷氧基基团，本文使用的芳烷氧基是指通过式--O—R^c--芳基的氧原子键合的基团，其中R^c是亚烷基链，例如亚甲基或亚乙基。

如本文所用，术语“杂芳基”单独使用或作为更大部分的一部分使用(例如,“杂芳基烷基”(也称为“杂芳烷基”)或“杂芳基烷氧基”(也称为“杂芳烷氧基”),是指具有5至14个环原子的单环、双环或三环环体系，其中至少一个环是芳族的并含有至少一个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基包括5-6元单环芳族基团，其中一个或多个环原子是独立任选取代的氮、硫或氧。在另一个实施方案中，杂芳基包括5-6元单环芳族基团，其中一个或多个环原子是氮、硫或氧。杂芳基基团的代表性例子包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、***基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻***基、噁***基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑基[1,5-b]哒嗪基、嘌呤基、去氮杂嘌呤基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并***基、苯并咪唑基、吲哚基、1,3-噻唑-2-基、1,3,4-***-5-基、1,3-唑-2-基、1,3,4-噁二唑-5-基、1,2,4-噁二唑-5-基、1,3,4-噻二唑-5-基、1H-四唑-5-基、1,2,3-***-5-基和吡啶-2-基氮氧化物。术语“杂芳基”还包括其中杂芳基稠合至一个或多个环状(例如碳环基或杂环基)环的基团,其中基团或连接点在杂芳基环上。非限制性的例子包括吲哚基、吲哚嗪基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并硫代苯基、亚甲二氧基苯基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并二氧杂唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹啉基、咔唑基、吖啶基、苯并嗪基、吩噻嗪基、苯并噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。杂芳基可以是单环、双环或三环的。在一些实施方案中，杂芳基包括与一个或多个(例如1、2或3个)不同的环状基团(例如碳环或杂环)稠合的杂芳基环，其中基团或连接点在杂芳基环上，并且在一些实施方案中，其中连接点是杂环中包含的杂原子。

因此，术语杂芳基包括N-杂芳基，如本文所用，其是指如上定义的含有至少一个氮的杂芳基基团，其中杂芳基基团与分子其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的氮原子。术语杂芳基也包括C-杂芳基基团，如本文所用，指如上定义的杂芳基基团，并且其中杂芳基与分子其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的碳原子。术语杂芳基也包括杂芳基烷基基团，如上文所公开的，其是指式--R^c-杂芳基的基团，其中R^c是如上所定义的亚烷基链。术语杂芳基也包括杂芳烷氧基(或杂芳基烷氧基)基团，如本文所用，其指通过式--O--R^c-杂芳基的氧原子键合的基团，其中R^c是如上定义的亚烷基。

本文所述的任何基团可以是取代的或未取代的。如本文所用，术语“取代的”广义上指所有允许的取代基，隐含的条件是此类取代是根据取代原子和取代基的允许化合价确定的，并且该取代产生稳定的化合物，即,一种不会自发发生转化(如重排、环化、消除等)的化合物。代表性的取代基包括卤素、羟基和任何其它含有任意数量碳原子(例如，1-14个碳原子)的有机基团，并且其可以包括一个或多个(例如，1、2、3或4)杂原子(例如氧、硫和氮)，以线性、支化或环状结构形式分组。

取代基的代表性例子因此可以包括烷基、取代的烷基(例如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、烷氧基(例如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、取代的烷氧基(例如，C1-C6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C1)、卤代烷基(例如，CF3)、烯基(例如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、取代的烯基(例如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、炔基(例如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、取代的炔基(例如，C2-C6、C2-5、C2-4、C2-3、C2)、环(例如，C3-C12，C5-C6)，取代的环(例如，C3-C12，C5-C6)，碳环(例如，C3-C12，C5-C6)，取代的碳环(例如，C3-C12，C5-C6)，杂环(例如，C3-C12，C5-C6)，取代的杂环(例如，C3-C12，C5-C6)，芳基(例如，苄基和苯基)、取代的芳基(例如，取代的苄基或苯基)、杂芳基(例如，吡啶基或嘧啶基)、取代的杂芳基(例如，取代的吡啶基或嘧啶基)、芳烷基(例如，苄基)、取代的芳烷基(例如，取代的苄基)、卤素、羟基、芳氧基(例如，C6-C12，C6)，取代的芳氧基(例如，C6-C12，C6)，烷硫基(例如，C1-C6)，取代的烷硫基(例如，C1-C6)、芳硫基(例如，C6-C12，C6)，取代的芳硫基(例如，C6-C12，C6)，氰基，羰基，取代的羰基，羧基，取代的羧基，氨基，取代的氨基，酰氨基，取代的酰氨基，硫代，取代的硫代，亚磺酰基，取代的亚磺酰基，磺酰基，取代的磺酰基，亚磺酰亚胺，取代的亚磺酰亚胺，磺酰胺，取代的磺酰胺，脲，取代的脲，氨基甲酸酯，取代的氨基甲酸酯，氨基酸和肽基。

术语“结合”在涉及靶向配体和靶蛋白质(在本发明中是EP300及其突变体形式(统称为“EP300”))之间的相互作用时，通常指分子间的相互作用，其可以是优先的或基本上特异性的(在本文中也称为“选择性的”)，因为靶向配体与细胞中存在的其它蛋白质实体(如CBP)的结合在功能上是不重要的。本发明的双功能化合物可以优先结合和招募EP300用于靶向降解，包括其突变形式。

术语“结合”在涉及降解决定子和E3泛素连接酶之间的相互作用时，通常是指分子间相互作用，该相互作用可以表现出或不表现出等于或超过靶向配体和靶蛋白之间亲和力的亲和力水平，但是，其中亲和力足以实现招募连接酶到靶向降解和靶蛋白的选择性降解。

广义而言，本发明一个方面的双功能化合物具有由式I表示的结构:

其中靶向配体代表结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)p300(EP300)的部分，降解决定子代表结合E3泛素连接酶的部分，接头代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分，或其药学上可接受的盐或立体异构体。

靶向配体

在一些实施方案中，EP300靶向配体是A-485或其类似物。A-485由结构TL-1表示：

A-485(也称为N-[(4-氟苯基)甲基]-2-{(1R)-5-[(甲基氨基甲酰基)氨基]-2',4'-二氧代-2,3-二氢-3'H-螺[茚-1],5'-[1,3]噁唑烷]-3'-基}-N-[(2S)-1,1,1-三氟丙烷-2-基]乙酰胺)及其螺环类似物已在美国专利申请公开2016/0235716和Michaelides,etal.,ACS Med.Chem.Lett.9:28-33(2018)中被描述。

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体是A-485类似物，并由结构TL-1a表示：

其中A是CH₂、NH或O；

B是CH₂或CO；

并且R是H、卤素(例如，Cl或F)、CN、CF₃、烷基或烷氧基。

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1a表示:

其中A是CH₂、NH或O；

B是CH₂或CO；

并且R是卤素(例如，C1或F)、CN、CF₃、烷基或烷氧基，或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体是A-485类似物，并由结构TL-1b表示：

其中A是CH₂、NH或O；

B是CH₂或CO；

R是H、卤素(例如，Cl或F)、CN、CF₃、烷基或烷氧基。

并且R1是C3-C5碳环或烷基碳环基团或3-5元氮杂环或烷基氮杂环基团(其中氮连接到烷基基团)，并且其中烷基是C1-C10烷基(例如，C1-C3)烷基基团。

在一些实施方案中，R₁是

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1b表示：

其中A是CH₂、NH或O；

B是CH₂或CO；

R是卤素(例如，Cl或F)、CN、CF₃、烷基或烷氧基。

并且R₁是C3-C5碳环或烷基碳环基团或3-5元氮杂环或烷基氮杂环基团，并且其中烷基基团是C1-C10烷基(例如，C1-C3)烷基基团，或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体由结构TL-1c表示：

其中Q是CH₂、O、N、CO、C(O)O、C(O)N、CH₂N、CH₂C(O)、CH₂C(O)O、CH₂C(O)N或CH₂CH₂N；

并且R₂是

C3-C5碳环或烷基碳环基团或3-5元氮杂环或烷基氮杂环基团，并且其中烷基基团是C1-C10烷基(例如，C1-C3)烷基基团。

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-c表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，靶向配体由结构TL-1d表示：

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1d表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体由结构TL-1e表示：

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1e表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，EP300靶向配体由结构TL-1f表示：

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构I-1f表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

接头

接头(“L”)为靶向配体和降解决定子提供共价连接。接头的结构可能并不重要，只要它基本上不干扰靶向配体或降解决定子的活性。在一些实施方案中，接头是亚烷基链(例如，具有2-20个亚烷基单元)。在其他实施方案中，接头可以是亚烷基链或二价亚烷基链，它们中的任一个可以被–O–、–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C₃-C₁₂碳环烯、3至12元杂环烯、5至12元杂环烯或其任意组合中的至少一个中断和/或终止(在一个或两个末端)，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中中断基团和一个或两个终止基团可以相同或不同。

在其他实施方案中，接头可以是聚乙二醇链。在其他实施方案中，接头可以是聚乙二醇链或二价亚烷基链，它们中的任一个可以被–S–、–N(R')–、–C≡C–、–C(O)–、–C(O)O–、–OC(O)–、–OC(O)O–、–C(NOR')–、–C(O)N(R')–、–C(O)N(R')C(O)–、–C(O)N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)–、–N(R')C(O)N(R')–、–N(R')C(O)O–、–OC(O)N(R')–、–C(NR')–、–N(R')C(NR')–、–C(NR')N(R')–、–N(R')C(NR')N(R')–、–OB(Me)O–、–S(O)₂–、–OS(O)–、–S(O)O–、–S(O)–、–OS(O)₂–、–S(O)₂O–、–N(R')S(O)₂–、–S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)–、–S(O)N(R')–、–N(R')S(O)₂N(R')–、–N(R')S(O)N(R')–、C_3-12碳环烯、3至12元杂环烯、5至12元杂环烯或其任意组合中的至少一个中断和/或终止(在一个或两个末端)，其中R’是H或C₁-C₆烷基，其中一个或两个终止基团可以相同或不同。

在一些实施方案中，接头可以是终止于NH-基团的C₁-C₁₀亚烷基链，其中氮也结合到降解决定子上。

在某些实施方案中，接头是具有1-10个亚烷基单元并被

中断或终止于

的亚烷基链。

在其他实施方案中，接头是具有1-8个PEG单元并终止于

的聚乙二醇链。

“亚碳环基”是指任选被取代的二价碳环基团。

“亚杂环基”是指可以任选被取代的二价杂环基。

“亚杂芳基”是指可以任选被取代的二价杂芳基。

适用于本发明的接头的代表性例子包括亚烷基链，例如：

其中n是1-10的整数(“从”意为包括在内)，例如，1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、9-10和1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，其例子包括:

终止于各种官能团(如上所述)的亚烷基链，其例子如下:

被各种官能团(如上所述)中断的亚烷基链，其例子如下:

用亚杂环基基团中断或终止的亚烷基链，例如，

其中m和n独立地是0-10的整数，其例子包括:

被酰胺、亚杂环基和/或芳基中断的亚烷基链，其例子包括:

被亚杂环基和芳基基团以及杂原子中断的亚烷基链，其例子包括:

以及

被杂原子如氮、氧或硼中断或终止的亚烷基链，例如，

其中每个n独立地是1-10的整数，例如，1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、9-10和1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且R是氢或C₁至C₄烷基，其例子是

在一些实施方案中，接头是聚乙二醇链，其例子包括：

其中n是1-10的整数，其例子包括:

在一些实施方案中，聚乙二醇链可以终止于官能团，所述官能团的例子如下：

在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物包括由结构L10表示的接头：

其中X是CH₂、NH、NMe、NEt或O；n是从0到11的整数。

在一些实施方案中，接头由结构L11至L26中的任何一个表示：

因此，在一些实施方案中，本发明的双功能化合物由结构I-2至I-12中的任何一个表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一些实施方案中，本发明的双功能化合物由选自由如下组成的组的结构表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

降解决定子

降解决定子(“D”)是结合E3泛素连接酶的功能部分。在一些实施方案中，降解决定子结合cereblon(CRBRN)。在一些实施方案中，降解决定子结合Von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子。

在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物包括结合cereblon的降解决定子。在美国专利申请公开2018/0015085中描述了结合cereblon的降解决定子的代表性例子(例如，其中式IA和IA'所包含的吲哚啉酮(例如异吲哚啉酮和异吲哚啉-1,3-二酮)，以及其中式IB和IB’所包含的桥连的环烷基化合物)。

在一些实施方案中，式(I)化合物包括结合cereblon的降解决定子，并由结构D1表示：

其中Y是CH₂或CO；

并且Z是NH、O或OCH₂CO，曲线

代表接头和EP300靶向部分的连接点。

在一些实施方案中，降解决定子由结构D1-a表示：

在一些实施方案中，降解决定子结合VHL。结合VHL的降解决定子的代表性例子如下：

，其中Y’是键、氮、氧或碳；

其中Z是环状基团，例如C₅-C₆碳环或C₅-C₆杂环基团；和

美国专利申请公开2017/0121321 A1公开了结合VHL并可适用于本发明的其他降解决定子。

因此，在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物由结构TL-1、TL-1a、TL-1b、TL-1c和L1-L11与本文所述的降解决定子结构(包括D1、D1a和D2-a至D2-e)的组合产生的任何结构，或其药学上可接受的盐或立体异构体表示。

在一些实施方案中，本发明的化合物由选自由如下组成的组的结构表示：

及其药学上可接受的盐和立体异构体。

生物素化的化合物

本发明的另一方面涉及双功能化合物，其具有由式II表示的结构:

其中靶向配体代表结合组蛋白乙酰转移酶p300(本文也称为EP300)的部分，接头(上文公开的)代表共价连接生物素和所述靶向配体的部分。

因此，在一些实施方案中，式(II)的双功能化合物由选自由如下组成的组的结构表示:

或其盐或立体异构体。

式(I)和式(II)的双功能化合物可以是游离酸或游离碱或药学上可接受的盐的形式。如本文所用，在盐的上下文中，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或性质并且相对无毒的化合物的盐，即，盐形式的化合物可以施用于受试者，而不会引起不希望的生物学效应(如头晕或胃部不适)或以有害的方式与包含它的组合物的任何其它组分相互作用。术语“药学上可接受的盐”是指通过本发明的化合物与合适的酸或碱反应获得的产物。本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括那些衍生自合适的无机碱如锂、钠、钾、钙、镁、铁、铜、铝、锌和锰盐的盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的例子是与无机酸形成的氨基的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡聚糖盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本发明的某些化合物可以与各种有机碱如赖氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺或二甲双胍形成药学上可接受的盐。

本发明的双功能化合物可以具有至少一个手性中心，并因此可以是立体异构体的形式，如本文所用，其包括单个化合物的所有异构体，这些异构体的不同之处仅在于其原子在空间中的取向不同。术语立体异构体包括镜像异构体(包括化合物的(R-)或(S-)构型的对映异构体)、化合物的镜像异构体的混合物(对映异构体的物理混合物和外消旋物或外消旋混合物)、化合物的几何(顺式/反式或E/Z，R/S)异构体和具有一个以上手性中心但彼此不是镜像的化合物的异构体(非对映异构体)。化合物的手性中心可能在体内发生差向异构化；因此，对于这些化合物来说，以(R-)形式施用的化合物被认为等同于以(S-)形式施用的化合物。因此，本发明的化合物可以以单独异构体的形式制备和使用，并且基本上不含其他异构体，或者以各种异构体的混合物的形式，例如，立体异构体的外消旋混合物。

在一些实施方案中，式(I)或式(II)的双功能化合物是同位素衍生物，因为它具有至少一个原子的期望的同位素取代，其取代度高于同位素的自然丰度，即,被富集。在一个实施方案中，该化合物包括氘或多个氘原子。用较重的同位素(例如氘(即²H))替代，可提供由于更高的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在某些情况下可能是有利的。

此外，式(I)的化合物包括所述化合物的N-氧化物、晶体形式(也称为多晶型物)、具有相同活性类型的化合物的活性代谢物、互变异构体和用药学上可接受的溶剂(例如水，乙醇等)制成的非溶剂化物和溶剂化物形式的使用。本文给出的缀合物的溶剂化形式也被认为是本文公开的。

合成方法

另一方面，本发明涉及制备本发明双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的方法。广义而言，本发明的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体可以通过任何已知适用于制备化学相关化合物的方法来制备。结合在各种工作实施例中描述的合成方案，将更好地理解本发明的化合物，这些合成方案说明了可以制备本发明化合物的非限制性方法。

药物组合物

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的双功能性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。如本领域已知的，术语“药学上可接受的载体”是指适于向哺乳动物施用本发明化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。合适的载体可以包括，例如，液体(水性和非水性的，及其组合)、固体、封装材料、气体及其组合(例如，半固体)，和气体，其功能是将化合物从一个器官或身体的一部分运送或输送到另一个器官或身体的另一部分。载体是“可接受的”，意思是对制剂的其它成分呈生理惰性并与之相容，且对受试者或患者无害。根据制剂的类型，组合物还可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

广义而言，式(I)的双功能化合物及其药学上可接受的盐和立体异构体可根据常规制药实践如常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、胶囊化、包埋和压缩方法(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000 and Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)配制成给定类型的组合物。制剂的类型取决于施用方式，所述施用方式可以包括肠内(例如，口服、含服、舌下和直肠)、肠胃外(例如，皮下(s.c.)、静脉注射(i.v.)、肌内注射(i.m.)、和胸骨内注射、或输注技术、眼内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、真皮内、***内、腹膜内、粘膜、鼻腔、气管内滴注、支气管滴注和吸入)和局部(例如透皮)。一般来说，最合适的施用途径取决于多种因素，包括例如药剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)和/或受试者的状况(例如，受试者是否能够耐受口服给药)。例如，肠胃外的(例如，静脉内)施用也是有利的，因为例如在单剂量治疗和/或急性病症的情况下，化合物可以相对快速地施用。

在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物被配制用于口服或静脉施用(例如，全身静脉注射)。

因此，式(I)的双功能化合物可以配制成固体组合物(例如，粉末、片剂、可分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂)、液体组合物(例如，化合物溶解于其中的溶液、化合物固体颗粒分散于其中的悬浮液、乳液和含有脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液、糖浆和酏剂)；半固体组合物(例如，凝胶、悬浮液和乳膏)；和气体(例如，气溶胶组合物的推进剂)。化合物也可以配制成用于快速、中间或延长释放。

口服固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物与载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和另外的载体或赋形剂如a)填充剂或增量剂(如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)，b)粘合剂(如甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶)，c)湿润剂(如甘油)，d)崩解剂(如交联聚合物(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、淀粉乙醇酸钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)，e)溶液阻滞剂(如石蜡)，f)吸收促进剂(如季铵化合物)，g)润湿剂(如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)，h)吸收剂(如高岭土和膨润土)，和i)润滑剂(如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)及其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖或乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳(如肠溶衣和其它包衣)来制备。它们可以进一步包含遮光剂。

在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物可以配制在硬或软明胶胶囊中。可以使用的代表性赋形剂包括预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘露醇、硬脂酰富马酸钠、无水乳糖、微晶纤维素和交联羧甲基纤维素钠。明胶壳可以包括明胶、二氧化钛、氧化铁和着色剂。

口服液体剂型包括溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、糖浆剂和酏剂。除了化合物之外，液体剂型可以包含本领域常用的水性或非水性载体(取决于化合物的溶解度)，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。口服组合物还可包括赋形剂，如润湿剂、悬浮剂、着色剂、甜味剂、调味剂和加香剂。

注射制剂可包括无菌水溶液或油质悬浮液。它们可以根据标准技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(如油酸)用于制备注射剂。可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌保留过滤器过滤，或通过以无菌固体组合物的形式掺入灭菌剂，其可在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中。该化合物的效果可以通过减缓其吸收来延长，这可以通过使用水溶性差的液体悬浮液或结晶或无定形材料来实现。该化合物从肠胃外施用制剂中的延长吸收也可以通过将该化合物悬浮在油性载体中来实现。

在某些实施方案中，本发明的式(I)的化合物可以以局部而非全身的方式施用，例如，通过将缀合物直接注射到器官中，通常以贮库制剂或持续释放制剂的形式。在具体实施方案中，长效制剂通过植入(例如皮下或肌内)或肌内注射施用。可注射贮库形式是通过在可生物降解的聚合物中形成该化合物的微胶囊基质来制备的，所述可生物降解的聚合物例如，聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)。化合物的释放速率可以通过改变化合物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质来控制。可注射贮库制剂也是通过将化合物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备的。此外，在其他实施方案中，化合物在靶向药物递送***中递送，例如在涂有器官特异性抗体的脂质体中。在这样的实施方案中，脂质体靶向器官并被器官选择性吸收。

式(I)的双功能化合物可以配制成用于颊内或舌下施用，其例子包括片剂、锭剂和凝胶。

双功能化合物可以配制成用于吸入施用。适于吸入施用的各种形式包括气溶胶、薄雾或粉末。药物组合物可以通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，以气雾剂形式，从加压包装或喷雾器中递送。在一些实施方案中，加压气雾剂的剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。在一些实施方案中，例如用于吸入器或吹入器的包含明胶的胶囊和药筒(cartridge)可以被配制成包含化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

式(I)的双功能化合物可配制成用于局部施用，如本文所用，其是指通过将制剂施用于表皮的皮内施用。这些类型的组合物通常是软膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、溶液和喷雾剂的形式。

用于配制局部应用的组合物的载体的代表性例子包括溶剂(例如，醇、多元醇、水)、乳膏、洗液、软膏、油、膏药、脂质体、粉末、乳液、微乳液和缓冲溶液(例如，低渗或缓冲盐水)。乳膏，例如，可以使用饱和或不饱和脂肪酸(如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇)来配制。乳膏也可以含有非离子表面活性剂，如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。

在一些实施方案中，局部制剂还可以包括赋形剂，其一个例子是渗透增强剂。这些药剂能够将药理活性化合物输送通过角质层并进入表皮或真皮，优选地，具有很少或没有全身吸收。已经评价了多种化合物在提高药物渗透过皮肤的速率方面的效力。参见，例如，Percutaneous Penetration Enhancers,Maibach H.I.and Smith H.E.(eds.),CRCPress,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)，其调查了各种皮肤渗透增强剂的使用和测试，以及Buyuktimkin et al.,Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancementin Transdermal and Topical Drug Delivery Systems,Gosh T.K.,Pfister W.R.,YumS.I.(Eds.),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(1997)。渗透增强剂的代表性例子包括甘油三酯(例如，大豆油)、芦荟组合物(例如，芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、十八烷基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)和N-甲基吡咯烷酮。

可以包含在局部制剂以及其他类型制剂中的其他赋形剂的代表性例子(在它们相容的程度上)包括防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、皮肤保护剂和表面活性剂。合适的防腐剂包括醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯和酚类。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、生育酚和螯合剂如乙二胺四乙酸和柠檬酸。合适的保湿剂包括甘油、山梨醇、聚乙二醇、尿素和丙二醇。合适的缓冲剂包括柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲剂。合适的增溶剂包括季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。合适的皮肤保护剂包括维生素E油、尿囊素(allatoin)、二甲基硅油、甘油、凡士林和氧化锌。

透皮制剂通常采用透皮施用装置和透皮施用贴片，其中化合物被配制成亲脂性乳液或缓冲水溶液，溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中。贴片可以构造成用于连续、脉动式(pulsatile)或按需递送药剂。化合物的透皮递送可以通过离子电渗贴片来完成。透皮贴片可以提供化合物的受控递送，其中通过使用速率控制膜或通过将化合物捕获在聚合物基质或凝胶中来减缓吸收速率。吸收增强剂可用于增加吸收，其例子包括可吸收的药学上可接受的溶剂，其有助于通过皮肤。

眼科制剂包括滴眼剂。

用于直肠施用的制剂包括灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂和滞留灌肠剂，其可包含常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)，以及合成聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇)等。用于直肠或***施用的组合物也可以配制成栓剂，其可以通过将化合物与合适的非刺激性载体和赋形剂(如可可脂、脂肪酸甘油酯的混合物、聚乙二醇、栓剂蜡及其组合)混合来制备，所有这些物质在环境温度下是固体，但在体温下是液体，因此在直肠或***腔中熔化并释放化合物。

剂量

如本文所用，术语“治疗有效量”是指式(I)的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；或包含式(I)的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的组合物的量，该量能有效地在患有由EP300活性异常引起的疾病或病症的特定患者中产生所需的治疗反应。术语“治疗有效量”因此包括本发明化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体的量，当施用时，该量能诱导待治疗的疾病或病症的积极改变(例如，以选择性地抑制/降解EP300)，或足以防止疾病或病症的发展或进展，或在某种程度上减轻受试者中正在治疗的疾病或病症的一种或多种症状，或仅杀死或抑制患病(例如神经母细胞瘤)细胞的生长，或减少患病细胞中EP300的量。

式(I)的双功能化合物的总日剂量及其用法可根据标准医学实践决定，例如，由主治医师运用合理的医学判断。任何特定受试者的具体的治疗有效剂量可取决于多种因素，包括所治疗的疾病或病症及其严重程度(例如，其现状)；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和***速率；治疗的持续时间；与使用的特定化合物组合使用或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素(参见，例如，Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th Edition,A.Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001)。

式(I)的双功能化合物及其药学上可接受的盐和立体异构体可在宽剂量范围内有效。在一些实施方案中，总日剂量(例如，对于成年人来说)可以在约0.001至约1600mg、0.01至约1600mg、0.01至约500mg、约0.01至约100mg、约0.5至约100mg、1至约100-400mg每天、约1至约50mg每天、约5至约40mg每天的范围内，并且在其他实施方案中，为约10至约30mg每天。根据化合物每天施用的次数，可以将单个剂量配制成包含所需的剂量。举例来说，胶囊可以用约1至约200mg的化合物(例如1、2、2.5、3、4、5、10、15、20、25、50、100、150和200mg)配制。

在一些实施方案中，施用的式(I)的双功能化合物的量将取决于所治疗的患者、疾病的严重程度、施用速率、化合物的配置(disposition)和开处方医生的判断。剂量范围为约0.001至约100mg/kg体重每天，优选约1至约35mg/kg每天，以单剂量或分剂量。对于70kg的人来说，这相当于约0.05至约7g/天，优选约0.1至约2.5g/天。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其他情况下，仍然可以使用更大的剂量而不会引起任何有害的副作用。

使用方法

在一些方面，本发明涉及治疗涉及异常(例如，功能异常或失调)的EP300活性的疾病或病症的方法，其需要向有此需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

可以说这些疾病或病症以异常的EP300或MYC活性为特征或由异常的EP300或MYC活性介导(例如，相对于非病理状态，EP300的水平升高或在功能上异常的EP300)。“疾病”通常被认为是受试者的健康状况，其中受试者不能保持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是指受试者能够保持体内平衡，但受试者的健康状况不如没有病症时的健康状况好的健康状况。如果不治疗，病症不一定会导致动物健康状况的进一步下降。

在一些实施方案中，本申请的化合物可用于治疗细胞增殖性疾病和病症(例如，癌症或良性肿瘤)。如本文所用，术语“细胞增殖性疾病或病症”是指以细胞生长失调或异常或两者兼有为特征的病况，包括非癌性病况(如瘤)、癌前病况、良性肿瘤和癌症。

本文使用的术语“受试者”(或“患者”)包括动物王国中易患或患有所述疾病或病症的所有成员。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，人类或非人类哺乳动物。这些方法也适用于伴侣动物，如狗和猫，以及家畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪和其他家养和野生动物。根据本发明“需要”治疗的受试者可能“患有或疑似患有”特定疾病或病症，受试者可能已被确诊或以其他方式呈现有足够数量的风险因素或足够数量或组合的体征或症状，使得医学专业人员可以诊断或怀疑该受试者患有该疾病或病症。因此，患有和疑似患有特定疾病或病症的受试者不一定是两个不同的群体。

可以用本发明的化合物治疗的非癌性(例如，细胞增生性)疾病或病症的示例性类型包括炎性疾病和病况、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、心脏病、病毒性疾病、慢性和急性肾脏疾病或损伤、代谢性疾病以及过敏性和遗传性疾病。

特定非癌性疾病和病症的代表性例子包括类风湿性关节炎、斑秃、淋巴组织增生性病况、自身免疫性血液病症(例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、无汗性外胚层发育不良、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、胆囊炎、肢端肥大症、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风、硬皮病、脓毒症、脓毒性休克、泪腺炎、蛋白相关周期性综合征(CAPS)、内毒素休克、子***、革兰氏阴性脓毒症、干燥性角膜结膜炎、中毒性休克综合征、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、慢性肺部炎症、慢性移植排斥、化脓性汗腺炎、炎症性肠病、克罗恩病、白塞氏综合征、***性红斑狼疮、肾小球性肾炎、多发性硬化症、幼年型糖尿病、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、自身免疫性血管炎、甲状腺炎、爱迪生氏病、扁平苔藓、阑尾炎、大疱性天疱疮、寻常型天疱疮、叶状天疱疮、副肿瘤性天疱疮、重症肌无力、免疫球蛋白A肾病、桥本氏病、干燥综合征、白癜风、韦格纳肉芽肿病、肉芽肿性***、自身免疫性***、结节病、风湿性心脏炎、强直性脊柱炎、格雷夫斯病、自身免疫性血小板减少性紫癜、银屑病、银屑病关节炎、湿疹、疱疹样皮炎、溃疡性结肠炎、胰腺纤维化、肝炎、肝纤维化、CD14介导的脓毒症、非CD14介导的脓毒症、急性和慢性肾病、肠易激综合征、发热、再狭窄、***、中风和缺血性损伤、神经损伤、急性和慢性疼痛、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性冠状动脉综合征、恶病质、疟疾、急性和慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性冠状动脉综合征、恶病质、疟疾、麻风病、利什曼病、莱姆病、雷特氏综合征、急性滑膜炎、肌肉退化、滑囊炎、肌腱炎、腱鞘炎、椎间盘突出、破裂或脱垂综合征、骨硬化、鼻腔鼻窦炎、血栓形成、矽肺、肺肌病、骨吸收疾病(如骨质疏松症)、纤维肌痛、AIDS和其他病毒性疾病(如带状疱疹、单纯疱疹I或II、流感病毒和巨细胞病毒)、I型和II糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗和糖尿病性视网膜病变、22q11.2缺失综合征、Angelman综合征、Canavan病、腹腔疾病、Charcot-Marie-Tooth病、色盲、Cri du chat、唐氏综合征、囊性纤维化、Duchenne肌营养不良、血友病、Klinefleter综合征、神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、Prader-Willi综合征、镰状细胞病、Tay-Sachs病、Turner综合征、尿素循环障碍、地中海贫血、中耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、肺炎、葡萄膜炎、多发性肌炎、直肠炎、间质性肺纤维化、皮肌炎、动脉粥样硬化、动脉硬化、肌萎缩性侧索硬化、血管性痴呆、静脉曲张、***炎、抑郁症和婴儿猝死综合征。

在其他实施方案中，该方法针对治疗患有癌症的受试者。概括地说，本发明的化合物可有效治疗癌(实体瘤，包括原发性和转移性肿瘤)、肉瘤、黑素瘤和血液学癌症(影响血液(包括淋巴细胞、骨髓和/或***)的癌症))，如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。癌症可以是血管化的，或者还没有实质上血管化的，或者是非血管化的肿瘤。

癌症的代表性例子包括肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症(例如，卡波西氏和AIDS相关的淋巴瘤)、阑尾癌、儿童期癌症(例如，儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤)、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿膀胱癌、脑癌(例如，胶质瘤和胶质母细胞瘤(如脑干胶质瘤、妊娠滋养细胞肿瘤胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、神经***癌(例如，中枢神经***癌症、中枢神经***淋巴瘤)、***、慢性骨髓增生性疾病、结肠直肠癌(例如，结肠癌、直肠癌)、淋巴肿瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠癌(例如，胃癌、小肠癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST))、胆管癌、生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、头颈癌、神经内分泌瘤、霍奇金淋巴瘤、Ann Arbor III期和IV期儿童非霍奇金淋巴瘤、ROS1阳性难治性非霍奇金淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、肾癌(例如，肾母细胞瘤、肾细胞癌)、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤、ALK阳性晚期恶性实体瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、伴隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、多发性内分泌瘤(MEN)、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌(例如，口腔癌、唇癌、口腔癌、舌癌、口咽癌、喉癌、咽癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤)、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体细胞瘤、转移性间变性甲状腺癌、未分化甲状腺癌、***状甲状腺癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌、子宫肉瘤、子宫体癌)、鳞状细胞癌、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、青少年黄色肉芽肿、肾盂和输尿管及其他泌尿器官的移行细胞癌、尿道癌、妊娠滋养细胞肿瘤、***癌、外阴癌、肝母细胞瘤、横纹肌样瘤和肾母细胞瘤。

可用本发明双功能化合物治疗的肉瘤包括软组织癌和骨癌，其代表性例子包括骨肉瘤或成骨性肉瘤(骨)(例如，尤因氏肉瘤)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜性内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(发现于大脑中的神经源性***)、粘液肉瘤(原始胚胎***)、间叶或混合中胚叶肿瘤(混合***类型)和组织细胞肉瘤(免疫癌)。

在一些实施方案中，本发明的方法能够治疗患有血液***、肝、脑、肺、结肠、胰腺、***、卵巢、***、皮肤和子宫内膜的细胞增殖性疾病或病症的受试者。

如本文所用，“血液***的细胞增殖性疾病或病症”包括淋巴瘤、白血病、髓样肿瘤、肥大细胞肿瘤、脊髓发育不良、良性单克隆丙种球蛋白病、淋巴瘤样丘疹病、真性红细胞增多症、慢性髓细胞白血病、特发性髓样化生和原发性血小板增多症。因此，血液学癌症的代表性例子可以包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和ALK+间变性大细胞淋巴瘤(例如，选自弥漫性大B细胞淋巴瘤的B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如，生发中心B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤或活化的B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋白血症、转移性胰腺癌、难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤、和复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤、儿童淋巴瘤以及淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤，例如，小淋巴细胞淋巴瘤、白血病(包括儿童白血病)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性髓细胞性白血病(例如，急性单核细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病和肥大细胞白血病、髓样肿瘤和肥大细胞肿瘤。

如本文所用，“肝脏的细胞增殖性疾病或病症”包括影响肝脏的所有形式的细胞增殖性病症。肝脏的细胞增殖性病症可以包括肝癌(例如，肝细胞癌、肝内胆管细胞癌和肝母细胞瘤)、肝脏的癌前或癌前期病况、肝脏的良性生长或病变、肝脏的恶性生长或病变以及除肝脏以外的体内组织和器官的转移性病变。肝脏的细胞增殖性病症可能包括肝脏的增生、化生和发育不良。

如本文所用，“脑的细胞增殖性疾病或病症”包括影响脑的所有形式的细胞增殖性病症。大脑的细胞增殖性病症可以包括脑癌(例如，胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤和原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤))、脑的癌前或癌前期病况、脑的良性生长或病变、脑的恶性生长或病变以及除脑以外的身体组织和器官的转移性病变。大脑的细胞增殖性病症可能包括大脑的增生、化生和发育不良。

如本文所用，“肺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。肺的细胞增殖性病症包括肺癌、肺的癌前和癌前期病况、肺的良性生长或病变、肺的增生、化生和发育不良以及除肺以外的身体组织和器官的转移性病变。肺癌包括所有形式的肺的癌症，例如，恶性肺肿瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤。肺癌包括小细胞肺癌(“SLCL”)、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、腺癌、小细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌和间皮瘤。肺癌可包括“疤痕癌”、细支气管癌、巨细胞癌、梭形细胞癌和大细胞神经内分泌癌。肺癌还包括具有组织学和超微结构异质性的肺肿瘤(例如，混合细胞类型)。在一些实施方案中，本发明的化合物可用于治疗非转移性或转移性肺癌(例如，NSCLC、ALK阳性NSCLC、含有ROS1重排的NSCLC、肺腺癌和鳞状细胞肺癌)。

如本文所用，“结肠的细胞增殖性疾病或病症”包括影响结肠细胞的所有形式的细胞增殖性病症，包括结肠癌、结肠癌前或癌前期病况、结肠腺瘤性息肉和结肠异时病变。结肠癌包括散发性和遗传性结肠癌、恶性结肠瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤、腺癌、鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。结肠癌可能与遗传性综合征有关，如遗传性非息肉病性结肠直肠癌、常见的腺瘤性息肉病、MYH相关的息肉病、Gardner氏综合征、Peutz-Jeghers综合征、Turcot氏综合征和青少年息肉病。结肠的细胞增殖性病症也可以以结肠的增生、化生或发育不良为特征。

如本文所用，“胰腺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响胰腺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。胰腺的细胞增殖性病症可包括胰腺癌、胰腺的癌前或癌前期病况、胰腺的增生、胰腺的发育不良、胰腺的良性生长或病变、胰腺的恶性生长或病变以及除胰腺之外的身体组织和器官的转移性病变。胰腺癌包括所有形式的胰腺癌，包括导管腺癌、腺鳞癌、多形性巨细胞癌、粘液腺癌、破骨细胞样巨细胞癌、粘液性囊腺癌、腺泡癌、未分类的大细胞癌、小细胞癌、胰腺母细胞瘤、***状肿瘤、粘液性囊腺瘤、***状囊性肿瘤和浆液性囊腺瘤，以及具有组织学和超微结构异质性的胰腺肿瘤(例如，混合细胞)。

如本文所用，“***的细胞增殖性疾病或病症”包括影响***的所有形式的细胞增殖性病症。***的细胞增殖性病症可包括***癌、***的癌前或癌前期病况、***的良性生长或病变、***的恶性生长或病变，以及除***之外的体内组织和器官的转移性病变。***细胞增生性疾病可能包括***增生、化生和发育不良。

如本文所用，“卵巢的细胞增殖性疾病或病症”包括影响卵巢细胞的所有形式的细胞增殖性病症。卵巢的细胞增殖性病症可包括卵巢的癌前或癌前期病况、卵巢的良性生长或病变、卵巢癌以及除卵巢之外的体内组织和器官的转移性病变。卵巢的细胞增殖性病症可能包括卵巢增生、化生和发育不良。

如本文所用，“乳腺的细胞增殖性疾病或病症”包括影响乳腺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。乳腺的细胞增殖性病症可以包括乳腺癌、乳腺的癌前或癌前期病况、乳腺的良性生长或病变以及除乳腺之外的身体组织和器官中的转移性病变。乳腺的细胞增殖性病症可能包括乳腺增生、化生和发育不良。

如本文所用，“皮肤的细胞增殖性疾病或病症”包括影响皮肤细胞的所有形式的细胞增殖性病症。皮肤的细胞增殖性病症可以包括皮肤的癌前或癌前期病况、皮肤的良性生长或病变、黑色素瘤、恶性黑色素瘤或皮肤的其他恶性生长或病变，以及除皮肤之外的身体组织和器官中的转移性病变。皮肤的细胞增殖性病症可能包括皮肤增生、化生和发育不良。

如本文所用，“子宫内膜的细胞增殖性疾病或病症”包括影响子宫内膜细胞的所有形式的细胞增殖性病症。子宫内膜的细胞增殖性病症可包括子宫内膜的癌前或癌前期病况、子宫内膜的良性生长或病变、子宫内膜癌以及除子宫内膜之外的体内组织和器官的转移性病变。子宫内膜的细胞增殖性病症可能包括子宫内膜的增生、化生和发育不良。

在一些实施方案中，本发明的化合物或药学上可接受的盐或立体异构体所治疗的疾病或病症是高风险神经母细胞瘤(NB)。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、横纹肌肉瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。在其他实施方案中，所述疾病或病症是小实体瘤。在其他实施方案中，所述疾病或病症是结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。

式(I)的双功能化合物可施用于患者，例如，癌症患者，作为单一疗法或通过联合疗法。疗法可以是“前线的/一线的”，即，作为没有接受过先前抗癌治疗方案的患者的初始治疗，单独或与其他治疗组合；或“二线的”，作为对已经经历过先前抗癌治疗方案的患者的治疗，单独或与其它治疗组合；或作为“三线的”、“四线的”等治疗，单独治疗或与其他治疗联合治疗。也可以对以前接受过部分成功治疗但对特定治疗变得不耐受的患者进行治疗。也可以作为辅助治疗来给予疗法，即，以在当前未检测到疾病的患者中或在手术切除肿瘤之后防止癌症的再次发生。因此，在一些实施方案中，双功能化合物可以给予已经接受另一种疗法(例如化疗、放射免疫疗法、外科疗法、免疫疗法、放射疗法、靶向疗法或其任意组合)的患者。

本发明的方法可能需要以单剂量或多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多剂量)向患者施用式(I)的双功能化合物或其药物组合物。例如，施用频率可以从每天一次到大约每八周一次。在一些实施方案中，施用的频率范围约为每天一次，持续1、2、3、4、5或6周，在其他实施方案中需要28天的周期，其包括3周(21天)的每天施用和7天的“休息”期。在其他实施方案中，双功能化合物可以在两天半的过程中每天给药两次(BID)(总共5次剂量)，或者在两天的过程中每天施用一次(QD)(总共2次剂量)。在其他实施方案中，双功能化合物可以在五天内每天施用一次(QD)。

在一些方面，本发明涉及使用式(II)的双功能化合物作为EP300或CPB的探针的方法。例如，式II的双功能化合物可与链霉亲和素一起用于鉴定、分离、处理和下拉(pulldown)靶蛋白以及相关蛋白用于靶鉴定(IP)或Chem-seq(Anders et al.,Nat.Biotechnol.32(1):92-6(2014))。例如，

M-270 Streptavidin(ThermoFisher Scientific；目录号65305)可用于利用亲和素-生物素相互作用直接分离任何生物素化的分子。该探针分子可用于测定开发(参见，实施例26中描述的AlphaScreen^TM测定)。

组合疗法

式(I)的双功能化合物可以与至少一种其它活性剂(例如，抗癌剂)或疗法组合或同时使用，用于治疗疾病和病症。术语“组合”和“同时”在本文中是指药剂共同施用，其包括基本上同时施用，通过相同或单独的剂型，和通过相同或不同的施用模式，或顺序施用，例如，作为相同治疗方案的一部分，或者通过连续治疗方案。因此，如果连续施用，在开始施用第二种化合物时，在某些情况下，两种化合物中的第一种仍可以在治疗部位以有效浓度检测到。可以确定顺序和时间间隔，使得它们可以一起起作用(例如，协同作用以提供比以其他方式施用时增加的益处)。例如，可以同时施用或在不同的时间点以任何顺序依次施用治疗剂；然而，如果不同时施用，它们可以在足够接近的时间内施用，以提供期望的治疗效果，这可以是协同方式。因此，这些术语不限于在完全相同的时间施用活性剂。

在一些实施方案中，治疗方案可包括将本发明的式(I)化合物与一种或多种已知用于治疗疾病或病况(例如癌症)的其他治疗剂组合施用。另外的抗癌治疗剂的剂量可以与已知或推荐的剂量相同或甚至更低。参见，Hardman et al.,eds.,Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,2001；Physician's Desk Reference,60th ed.,2006。例如，可与本发明化合物联合使用的抗癌剂是本领域已知的。参见，例如，美国专利9,101,622(其中第5.2节)和美国专利9,345,705B2(其中第12-18栏)。另外的活性剂和治疗方案的代表性例子包括放射疗法、化学疗法(例如，有丝***抑制剂、血管生成抑制剂、抗激素、自噬抑制剂、烷化剂、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、抗雄激素、信号转导途径抑制剂、抗微管剂、铂配位络合物、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂)、免疫调节剂、治疗性抗体(例如，单特异性和双特异性抗体)和CAR-T疗法。

在一些实施方案中，本发明的式(I)的化合物和另外的抗癌治疗剂可以间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔小于1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时，间隔约5小时至约6小时，间隔约6小时至约7小时，间隔约7小时至约8小时，间隔约8小时至约9小时，间隔约9小时至约10小时，间隔约10小时至约11小时，间隔约11小时至约12小时，间隔约12小时至18小时，间隔18小时至24小时，间隔24小时至36小时，间隔36小时至48小时，间隔48小时至52小时，间隔52小时至60小时，间隔60小时至72小时，间隔72小时至84小时，间隔84小时至96小时，或间隔96小时至120小时施用。两种或更多种抗癌治疗剂可以在同一次患者就诊中施用。

在一些涉及癌症治疗的实施方案中，式(I)的双功能化合物和另外的抗癌剂或治疗剂被循环施用。循环疗法包括施用一种抗癌治疗剂一段时间，随后施用第二种抗癌治疗剂一段时间，并重复这种顺序施用(即，该循环)，以便减少对一种或两种抗癌疗法的耐药性的发展，避免或减少一种或两种抗癌疗法的副作用，和/或提高疗法的疗效。在一个实施例中，循环疗法包括施用第一种抗癌治疗剂一段时间，随后施用第二种抗癌治疗剂一段时间，任选地，随后施用第三种抗癌治疗剂一段时间等，并重复这种顺序施用(即，该循环)，以便减少对所述抗癌剂之一的耐药性的发展，避免或减少所述抗癌剂之一的副作用，和/或提高所述抗癌剂的疗效。

在一些实施方案中，式(I)的双功能化合物可与其它抗NB或抗癌剂联合使用，所述抗NB或抗癌剂的实例包括Dinutuximab(例如，用于NB)，环磷酰胺(例如，神经母细胞瘤)、白消安加盐酸美法仑、卡铂加磷酸依托泊苷和盐酸美法仑(盐酸阿霉素、Unituxin(Dinutuximab)、硫酸长春新碱(恩曲替尼(Entrectinib)(例如，用于脑癌、中枢神经***(CNS)癌)、Hu3F8加捐赠的自然杀伤细胞(例如，用于持续性或复发性神经母细胞瘤)，Hu3F8加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，对于复发性/难治性神经母细胞瘤)，Hu3F8/GM-CSF免疫疗法加异维A酸(例如，用于巩固NB患者的首次缓解)，维奈托克(Venetoclax)(例如，用于持续性或复发性癌症，包括n、白血病和非霍奇金淋巴瘤)，带有免疫佐剂OPT-821的二价疫苗，其与口服β-葡聚糖联合使用(例如，用于NB)，曲美替尼(例如，用于生殖细胞肿瘤、肝癌、肾癌、神经母细胞瘤、小儿脑瘤、骨肉瘤、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、威尔姆斯氏瘤)、考比替尼(Cobimetinib)(例如，用于黑色素瘤、儿童脑瘤和软组织肉瘤)和使用131I-8H9的鞘内放射免疫疗法(例如，用于脑瘤、原发性脑癌和CNS癌)。

药物试剂盒

本发明的组合物可以组装成试剂盒或药物***。根据本发明的这一方面的试剂盒或药物***包括载体或包装，例如盒、纸箱、管等，在其中具有严密限制的一个或多个容器，例如小瓶、管、安瓿或瓶，其包含本发明式(I)的双功能化合物或药物组合物。本发明的试剂盒或药物***还可以包括使用所述化合物和组合物的印刷说明书。

在一些实施方案中，使用式(II)的双功能化合物作为EP300的探针的方法包括将怀疑含有EP300的裂解细胞与式(II)的化合物和固定在载体(例如，珠子(例如磁珠))上的链霉亲和素接触；通过生物素-链霉亲和素结合，分离由分子和蛋白质结合形成的复合物；并通过本领域的标准技术(如免疫印迹)证实复合体中EP300的存在。

本发明的这些和其他方面将在考虑以下实施例后得到进一步理解，这些实施例旨在说明本发明的某些特定实施方案，但不旨在限制由权利要求限定的本发明的范围。

实施例

实施例1：12-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)-N- ((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧- 2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)十二酰胺(化合物(CPD)1)的合成。

向化合物A(18.5g，163.5mmol)和1-(溴甲基)-4-氟苯(37.2g，196.5mmol)在DMF(200mL)中的溶液中加入K₂CO₃(67.5g,490mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后用水淬灭。混合物用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤。有机提取物用Na₂SO₄干燥，并减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱纯化(甲醇∶CH₂Cl₂，1∶20)，得到化合物A-1(15g，41.5％)。

向化合物A-1(15g，67.8mmol)在干燥CH₂Cl₂(300mL)中的搅拌溶液中加入2-溴乙酰溴(27.4g，135.6mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，然后用NaHCO₃猝灭。反应用CH₂Cl₂萃取。有机提取物用Na₂SO₄干燥，并减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱纯化(石油醚∶乙酸乙酯，1∶1)，得到油状中间体SM-2(15.3g，66％)。

向SM-1(31g，164mmol)在甲苯和MeCN的1∶1混合物(800mL)的搅拌溶液中加入ZnI₂(5.2g，16.4mmol)和三甲基氰硅烷(TMSCN)(33g，328mmol)。将混合物加热回流1小时。将反应冷却，减压除去溶剂。残留物通过硅胶柱色谱纯化(己烷/乙酸乙酯，梯度)，得到中间体int-1(28g，60％)。

Int-1(28g，97.2mmol)溶于乙醇(400ml)中，冷却至4℃。乙酰氯(280mL，3.9mol)通过加料漏斗以一定速度滴加，以保持温度低于20℃。将反应物搅拌48小时，然后减压浓缩，得到浅黄色固体。浅黄色固体在乙酸乙酯和NaHCO₃水溶液之间分配。将有机提取物干燥、浓缩并用石油醚和乙酸乙酯的1∶1混合物研成粉末。粗产物int-2(15g)在随后的步骤中直接使用。

将粗产物int-2(15g)在THF(300mL)和三乙胺(12g，116mmol)中的溶液冷却至50℃，用三光气(8.6g，29mmol)在40mL THF中的溶液小心处理，以保持温度低于10℃。将混合物搅拌1小时，用6N盐酸处理至pH 2，所得混合物在5℃下再搅拌30分钟。在减压下从反应混合物中除去约一半体积的溶剂，剩余的混合物在水和乙酸乙酯之间分配。有机提取物用Na₂SO₄干燥，并减压浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯，梯度)纯化，得到中间体int-4(8g)，为黄色固体。

2-((R)-5-氨基-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄基)-N-((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)乙酰胺(int-6)

向int-4(8g，30.6mmol)在甲醇(80mL)中的搅拌悬浮液中加入浓盐酸水溶液(20mL，12M)。将混合物加热回流3小时。过滤所得沉淀并干燥，得到中间体int-5(4g，60％)，为黄色固体。

向int-5(4g，18mmol)和SM-2(6.2g，18mmol)在DMF(40mL)中的溶液中加入K₂CO₃(7.4g，54mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌2小时，用水淬灭，用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤，干燥，减压浓缩，通过硅胶柱色谱(甲醇：CH₂Cl₂，1∶20)纯化，得到中间体int-6(6g，69.5％)，为白色固体。

2-((R)-5-乙酰胺基-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-3'-基)-N-((S)-1-氨基丙烷-2-基)-N-(4-氟苄基)乙酰胺(Int-7)

Int-7是根据Michaelides et al.,ACS Med.Chem.Lett.2018,9:28-33(2018)的方法合成的。

4-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)氨基)-4-氧代丁酸(int-8)

Int-8是根据Michaelides et al.,ACS Med.Chem.Lett.2018,9:28-33(2018)的方法合成的。

向int-6(6mg，0.01mmol)和化合物SM-3(6mg，0.01mmol)在DMF(1mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(35μL，0.1mmol)，随后在室温下加入一份1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-***并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)(12mg，0.02mmol)。室温下搅拌反应混合物30分钟。在消耗原料后(其是通过薄层色谱监测的)，用水和乙酸乙酯稀释反应混合物。将合并的有机提取物用无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得到粗产物，所得粗产物通过硅胶柱色谱用1∶1乙酸乙酯/石油醚纯化，得到黄色固体形式的CPD 1(6.2mg，45％)。

实施例2：1-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((R)- 3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二 氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)-3，6，9，12，15，18-六氧杂廿一烷-21-酰胺(CPD 2)的合 成。

向int-6(6mg，0.01mmol)和化合物SM-4(6mg，0.01mmol)在DMF(1mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(17μL，0.05mmol)，然后在室温下加入一份HATU(11.4mg，0.025)(放热反应)。室温下搅拌反应混合物30分钟。消耗原料后(通过TLC监测)，用水和EtOAc稀释反应混合物。将合并的有机提取物用无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩得到粗产物，所得粗产物通过硅胶柱色谱用1∶1EtOAc/石油醚纯化，得到黄色固体形式的CPD 2(6mg，40％)。

实施例3：8-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((R)- 3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二 氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)辛酰胺(CPD3)的合成。

CPD 3以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 3(53％产率)。

实施例4：10-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，4-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)-N- ((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧- 2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)癸酰胺(CPD4)的合成。

CPD 4以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 4(15mg,40％产率)。

MS(ESI)计算为C₄₆H₄₈F₄N₆O₉:904.34；实测:[M+1]905.54,906.53.

实施例5：2-((1R)-5-(3-(8-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-5- 基)氨基)辛基)脲基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄 基)-N-(S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)乙酰胺(CPD 5)的合成。

CPD 5以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 5(2mg,12％产率)。

MS(ESI)计算为C₄₅H₄₇F₄N₇O₉:905.34；实测:[M+1]906.60,907.29.

实施例6：12-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，6-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-N- ((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧- 2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)十二酰胺(CPD 6)的合成。

CPD 6以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 6(7mg,72％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.90(d,J＝4.0Hz,1H),9.26(d,J＝5.1Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.59(td,J＝7.8,2.7Hz,1H),7.49(d,J＝9.7Hz,3H),7.36–7.31(m,1H),7.22(t,J＝8.6Hz,2H),7.13–7.00(m,3H),6.42(d,J＝5.9Hz,1H),5.51(p,J＝7.8Hz,1H),5.07(ddd,J＝12.1,7.6,4.2Hz,2H),4.97–4.81(m,1H),4.67(dd,J＝71.1,16.7Hz,1H),4.43(dd,J＝90.6,16.6Hz,1H),3.38(q,J＝6.3Hz,2H),3.28–3.04(m,2H),3.03–2.85(m,3H),2.85–2.70(m,4H),2.56(dddd,J＝14.5,12.1,8.6,4.2Hz,1H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),2.27–2.17(m,1H),2.07(p,J＝2.2Hz,2H),1.73–1.67(m,4H),1.39(dd,J＝38.4,5.3Hz,12H).

MS(ESI)计算为C₄₈H₅₂F₄N₆O₉:932.37；实测:[M+1]933.36,934.38.

实施例7：12-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-N- ((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧- 2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)十二酰胺(CPD7)的合成。

CPD 7以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 7(14mg,72％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.91(s,1H),9.31(s,1H),7.85(s,1H),7.60–7.56(m,1H),7.52–7.47(m,3H),7.34(dd,J＝8.3,5.3Hz,1H),7.22(t,J＝8.8Hz,2H),7.12–7.00(m,3H),6.60(t,J＝5.9Hz,1H),5.51(p,J＝7.7Hz,1H),5.12–5.04(m,2H),4.96–4.84(m,1H),4.67(dd,J＝69.9,16.7Hz,1H),4.43(dd,J＝91.2,16.6Hz,1H),3.80(t,J＝5.9Hz,2H),3.71(t,J＝5.1Hz,2H),3.51–3.47(m,2H),3.22(dt,J＝15.3,7.3Hz,1H),3.09(ddd,J＝15.2,8.8,4.0Hz,1H),3.00–2.95(m,2H),2.84(d,J＝16.7Hz,4H),2.78–2.75(m,2H),2.63–2.50(m,4H),2.22(ddt,J＝12.8,5.4,2.5Hz,1H),2.07(t,J＝2.2Hz,2H),1.50(d,J＝6.8Hz,1H),1.43(d,J＝7.2Hz,2H).

MS(ESI)计算为C₄₅H₄₆F₄N₆O₁₂:938.31；实测:[M+1]939.40,940.50.

实施例8：3-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氨 基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨 基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)丙酰胺(CPD 8)的 合成。

CPD 8以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 8(10.8mg,66％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.88(s,1H),9.65(d,J＝7.3Hz,1H),7.87(s,1H),7.59–7.49(m,4H),7.32(dt,J＝22.6,5.7Hz,2H),7.21(d,J＝8.8Hz,1H),7.01(d,J＝2.1Hz,1H),6.93(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),6.32(t,J＝5.5Hz,1H),5.51(p,J＝7.7Hz,1H),5.06(dd,J＝12.6,5.4Hz,2H),4.96–4.84(m,1H),4.67(dd,J＝70.8,16.7Hz,1H),4.43(dd,J＝88.2,16.6Hz,1H),3.99(h,J＝6.6Hz,2H),3.48(q,J＝7.4Hz,2H),3.25(dq,J＝36.5,7.5,6.9Hz,6H),3.09(ddd,J＝16.3,8.8,3.9Hz,2H),3.01–2.91(m,2H),2.82–2.73(m,4H),2.55(ddd,J＝14.4,8.2,3.9Hz,1H),2.40(t,J＝7.0Hz,2H),2.22–2.14(m,4H),2.07(p,J＝2.2Hz,2H),1.89–1.83(m,2H),1.68(p,J＝7.2Hz,2H),1.62–1.57(m,2H),1.48–1.41(m,7H).

MS(ESI)计算为C₅₂H₅₉F₄N₇O₁₀:1017.43；实测:[M+1]1018.67,1019.62.

实施例9：12-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰 胺基)-N-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'， 4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)十二酰胺(CPD 9)的合成。

CPD 9以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到白色粉末形式的CPD 9(2mg,20％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.96(s,1H),9.28(s,1H),7.98(s,1H),7.90–7.85(m,3H),7.53(d,J＝2.0Hz,2H),7.49(d,J＝3.0Hz,2H),7.22(t,J＝8.7Hz,2H),5.51(p,J＝7.8Hz,1H),5.20–5.13(m,2H),5.10–5.00(m,2H),4.96–4.83(m,2H),4.56(dd,J＝42.2,16.6Hz,2H),4.33(d,J＝16.8Hz,1H),3.37–3.19(m,6H),3.14–2.97(m,4H),2.78–2.71(m,2H),2.54(ddd,J＝14.5,8.3,3.8Hz,2H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.29–2.24(m,2H),1.69(t,J＝7.3Hz,3H),1.59–1.47(m,7H),1.43(d,J＝7.3Hz,4H).

MS(ESI)计算为C₅₀H₅₄F₄N₆O₁₁:990.38；实测:[M+1]991.57,992.37.

实施例10：6-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)-N-(4- (((R)-3’-(2-((4-氟苄基)((R)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2’，4’-二氧- 2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)氨基)-4-氧代丁基)己酰胺(CPD 10)的合成。

CPD 10以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 10(12mg,71％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.87(s,1H),9.62(d,J＝5.5Hz,1H),7.87(d,J＝5.6Hz,1H),7.58–7.43(m,6H),7.22(t,J＝8.7Hz,2H),7.01(d,J＝2.2Hz,1H),6.92(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.35(t,J＝5.5Hz,1H),5.51(p,J＝7.8Hz,1H),5.06(dt,J＝10.7,3.3Hz,2H),4.96–4.84(m,1H),4.67(dd,J＝70.1,16.7Hz,1H),4.43(dd,J＝90.3,16.6Hz,1H),3.25(dq,J＝39.8,7.6,7.0Hz,6H),3.10(ddt,J＝16.1,8.7,3.9Hz,2H),3.01–2.92(m,2H),2.80–2.71(m,4H),2.54(ddd,J＝14.4,8.3,3.9Hz,1H),2.40(t,J＝7.0Hz,2H),2.25–2.13(m,4H),1.84(q,J＝6.9Hz,2H),1.70–1.64(m,4H).

实施例11：4-(3-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基) 氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙烷酰胺)-N-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((R)-1，1，1-三氟丙 烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)丁酰胺 (CPD 11)的合成。

CPD 11以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int--6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 11(10mg,56％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.98(s,1H),9.57(s,1H),7.87(s,1H),7.62–7.57(m,1H),7.51–7.45(m,3H),7.25(dt,J＝31.7,7.3Hz,3H),7.13–7.01(m,3H),6.62(q,J＝5.9Hz,1H),5.51(p,J＝7.8Hz,1H),5.13–4.86(m,4H),4.67(dd,J＝69.4,16.7Hz,1H),4.43(dd,J＝92.2,16.6Hz,1H),3.73(tt,J＝13.1,6.0Hz,6H),3.60–3.48(m,6H),3.33–3.18(m,4H),3.10(ddd,J＝20.1,9.9,5.5Hz,2H),3.05–2.92(m,2H),2.75(ddd,J＝16.4,7.2,4.7Hz,4H),2.59–2.51(m,1H),2.40(q,J＝7.4,6.8Hz,4H),2.23(dtd,J＝10.4,5.5,2.8Hz,1H),1.84(t,J＝6.8Hz,2H).

MS(ESI)计算为C₄₉H₅₃F₄N₇O₁₃:1023.36；实测:[M+1]1024.67,1025.62.

实施例12：6-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)-N-(4- (3-(((R)-3’-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2’，4’-二 氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)氨基)-3-氧丙基)苯基)己酰胺(CPD 12)的合 成。

CPD 12以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 12(12.5mg,79％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.86(s,1H),9.30(d,J＝4.8Hz,1H),9.03(s,1H),7.98(s,1H),7.86(s,1H),7.56(d,J＝8.1Hz,4H),7.47(s,2H),7.21(d,J＝10.9Hz,3H),7.06–6.91(m,3H),6.35(t,J＝5.6Hz,1H),5.51(p,J＝7.9Hz,1H),5.11–5.01(m,3H),4.88(t,J＝13.7Hz,1H),4.67(dd,J＝70.4,16.8Hz,1H),4.53–4.31(m,1H),3.32–3.18(m,4H),3.14–3.04(m,2H),2.54(ddd,J＝13.3,8.1,3.7Hz,2H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.18(dt,J＝11.2,5.4Hz,2H),1.73(q,J＝8.0Hz,6H),1.51(d,J＝6.8Hz,6H).

MS(ESI)计算为C₅₁H₄₉F₄N₇O₁₀:995.35；实测:[M+1]996.70,997.73.

实施例13：12-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)-N-(4- (3-(((R)-3’-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2’，4’-二 氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5’-噁唑烷]-5-基)氨基)-3-氧丙基)苯基)十二酰胺(CPD 13)的合 成。

CPD 13以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 13(15mg,88％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.86(s,1H),9.30(d,J＝4.8Hz,1H),9.01(s,1H),8.73(d,J＝4.4Hz,1H),8.42(d,J＝8.3Hz,1H),7.98(s,1H),7.86(s,1H),7.57(d,J＝8.2Hz,2H),7.52–7.48(m,2H),7.22–7.17(m,3H),7.09–6.90(m,3H),6.32(t,J＝5.6Hz,1H),5.51(p,J＝7.7Hz,1H),5.11–5.01(m,3H),4.88(t,J＝13.9Hz,1H),4.67(dd,J＝70.0,16.7Hz,1H),4.42(dd,J＝91.7,16.6Hz,1H),3.25(dq,J＝43.4,7.4,6.9Hz,4H),3.09(ddd,J＝16.3,8.6,3.8Hz,2H),2.96(s,4H),2.79(s,4H),2.68(t,J＝7.4Hz,3H),2.54(ddd,J＝14.1,8.1,3.7Hz,2H),2.34(t,J＝7.4Hz,3H),2.18(t,J＝3.7Hz,1H),1.68(q,J＝7.5Hz,5H),1.50–1.41(m,9H).

MS(ESI)计算为C57H61F4N7O10:1079.44,实测:[M+1]1080.65,1081.48.

实施例14：3-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚啉-4-基)氨 基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N-(4-(3-(((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷- 2-基)氨基)-2-氧代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)氨基)-3- 氧代丙基)苯基)丙烯酰胺(CPD 14)的合成。

CPD 14以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-6和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 14(12mg,70％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.93(s,1H),9.28(d,J＝4.7Hz,1H),9.06(s,1H),7.86(s,1H),7.57(dd,J＝7.7,3.7Hz,3H),7.49(ddd,J＝8.6,4.6,1.7Hz,3H),7.24–7.15(m,4H),7.07(dd,J＝29.3,7.8Hz,3H),6.60(t,J＝5.7Hz,1H),5.51(p,J＝7.8Hz,1H),5.13–5.01(m,3H),4.96–4.86(m,1H),4.67(dd,J＝70.3,16.7Hz,1H),4.42(dd,J＝91.8,16.6Hz,1H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),3.70(t,J＝5.3Hz,2H),3.61–3.53(m,2H),3.49(q,J＝5.0Hz,3H),3.24–3.19(m,1H),3.12–3.06(m,1H),2.97–2.92(m,4H),2.79(p,J＝1.9Hz,2H),2.76(dd,J＝6.5,4.1Hz,2H),2.67(t,J＝7.5Hz,2H),2.56(t,J＝6.0Hz,3H),2.22(ddt,J＝9.5,5.2,2.6Hz,1H),1.50(d,J＝6.6Hz,4H),1.43(d,J＝7.3Hz,2H).

实施例15：N-((R)-2-(2-((R)-5-乙酰胺基-2',4'-二氧-2,3-二氢螺环[茚-1,5'- 噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄基)乙酰胺基)丙基)-12-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧 异吲哚啉-5-基)氨基)十二酰胺(CPD 15)的合成。

CPD 15以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-7的(R，R)-异构体和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD15(10mg,69％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.86(s,1H),9.32(s,1H),7.86(s,1H),7.57(dd,J＝8.3,1.4Hz,1H),7.52–7.40(m,4H),7.36–7.31(m,2H),7.25–7.16(m,2H),7.08–7.01(m,3H),6.93(ddd,J＝8.3,3.3,2.1Hz,2H),6.32(q,J＝6.1Hz,1H),5.06(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.84(d,J＝16.0Hz,1H),4.77(d,J＝16.5Hz,1H),4.72(d,J＝7.3Hz,1H),4.65(d,J＝16.5Hz,1H),4.52(d,J＝16.5Hz,1H),4.44(d,J＝16.0Hz,1H),4.37(dt,J＝8.4,6.3Hz,1H),4.27(d,J＝16.4Hz,1H),4.00(p,J＝6.6Hz,1H),3.52–3.39(m,3H),3.28(dt,J＝10.2,4.1Hz,5H),3.25–3.18(m,2H),3.10(ddd,J＝16.4,8.7,4.1Hz,2H),3.01–2.92(m,2H),2.82–2.74(m,6H),2.57(dddd,J＝17.6,14.2,8.2,3.7Hz,2H),2.28–2.14(m,4H),1.68(td,J＝7.4,4.2Hz,3H),1.61–1.53(m,3H).

MS(ESI)计算为C₅₀H₅₈FN₇O₁₀:935.42；实测:[M+1]936.74,937.65.

实施例16：N-((S)-2-(2-((R)-5-乙酰胺基-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'- 噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄基)乙酰胺基)丙基)-12-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧 异吲哚啉-5-基)氨基)十二酰胺(CPD 16)的合成。

CPD 16以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-7和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 16(9.6mg,68％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.86(s,1H),9.33(d,J＝4.0Hz,1H),7.87(s,1H),7.55(dd,J＝18.0,8.4Hz,3H),7.51–7.45(m,2H),7.42(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.38–7.32(m,2H),7.28(s,1H),7.19(t,J＝8.8Hz,1H),7.11–7.03(m,2H),7.02(d,J＝2.2Hz,2H),6.93(dt,J＝8.4,1.6Hz,1H),6.33(d,J＝5.7Hz,1H),5.06(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.88(d,J＝16.1Hz,1H),4.79(d,J＝16.6Hz,1H),4.72(d,J＝6.3Hz,1H),4.61(d,J＝16.6Hz,1H),4.48(d,J＝16.5Hz,1H),4.40(d,J＝16.0Hz,1H),4.30(d,J＝16.5Hz,1H),4.01(p,J＝6.6Hz,1H),3.53–3.39(m,2H),3.32–3.19(m,6H),3.10(ddt,J＝17.0,8.7,4.3Hz,2H),3.01–2.93(m,2H),2.83–2.72(m,6H),2.57(dddd,J＝18.5,14.4,8.2,3.7Hz,2H),2.29–2.13(m,4H),1.68(p,J＝7.2Hz,3H),1.58(p,J＝7.3Hz,3H).

MS(ESI)计算为C₅₀H₅₈FN₇O₁₀:935.42；实测:[M+1]936.74,937.65.

实施例17：N-((S)-2-(2-((R)-5-乙酰胺基-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'- 噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄基)乙酰胺基)丙基)-3-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)- 1，3-二氧异吲哚啉-5-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺(CPD 17)的合成。

CPD 17以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-7和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 17(8.4mg,86％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.96(s,1H),9.31(s,1H),7.85(d,J＝15.6Hz,1H),7.61–7.57(m,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,1H),7.47(dt,J＝8.5,4.2Hz,1H),7.43–7.38(m,1H),7.36–7.30(m,1H),7.21–6.99(m,5H),6.62(t,J＝5.8Hz,1H),5.09(ddd,J＝12.8,5.5,1.7Hz,1H),4.89(d,J＝16.0Hz,1H),4.80(d,J＝16.5Hz,1H),4.70(d,J＝9.4Hz,1H),4.61(d,J＝16.5Hz,1H),4.42–4.35(m,1H),3.76–3.73(m,2H),3.70(td,J＝6.2,1.4Hz,3H),3.65–3.62(m,4H),3.59–3.57(m,2H),3.56–3.51(m,4H),3.48–3.37(m,2H),3.25(dtt,J＝18.2,9.8,4.1Hz,2H),3.10(ddt,J＝12.6,8.8,3.9Hz,1H),3.02–2.91(m,2H),2.80–2.75(m,4H),2.61–2.37(m,4H),2.22(ddt,J＝13.0,5.7,2.1Hz,2H).

MS(ESI)计算为C₄₇H₅₂FN₇O₁₃:941.36；实测:[M+1]942.67,943.65.

实施例18：N-((S)-2-(2-((R)-5-乙酰胺基-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'- 噁唑烷]-3'-基)-N-(4-氟苄基)乙酰胺基)丙基)-8-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧 异吲哚啉-5-基)氨基)辛酰胺(CPD 18)的合成。

CPD 18以类似于实施例1中制备CPD 1的方式由int-7和适当的IMiD中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-10％)，得到黄色粉末形式的CPD 18(7.2mg,82％产率)。

¹H NMR(500MHz,丙酮-d₆)δ9.87(s,1H),9.28(d,J＝4.3Hz,1H),7.81(d,J＝2.9Hz,1H),7.53–7.48(m,3H),7.35–7.32(m,2H),7.18(t,J＝8.8Hz,1H),7.07(t,J＝8.8Hz,2H),6.95(t,J＝2.6Hz,1H),6.85(dt,J＝8.3,1.8Hz,1H),6.31–6.17(m,1H),5.06(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.92(d,J＝16.1Hz,1H),4.80(d,J＝16.5Hz,1H),4.72(d,J＝4.1Hz,1H),4.62(d,J＝16.6Hz,1H),4.49(d,J＝16.5Hz,1H),4.43–4.34(m,2H),4.28(dd,J＝16.5,1.4Hz,1H),3.51(ddq,J＝9.3,4.6,2.2Hz,1H),3.28–3.21(m,4H),3.10(dt,J＝8.3,4.0Hz,1H),2.98–2.92(m,1H),2.80–2.71(m,4H),2.56(ddt,J＝9.9,7.6,4.2Hz,1H),2.28–2.16(m,4H),1.67–1.62(m,4H),1.48–1.37(m,4H).

MS(ESI)计算为C₄₄H₄₆FN₇O₁₀:851.33；实测:[M+1]852.53,853.44.

实施例19：N1-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧 代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)-N4-(6-(((S)-1-((2S，4R)- 4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代 丁烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)琥珀酰亚胺(CPD 19)的合成。

CPD 19以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-8和适当的VHL-N₂中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-15％)，得到白色粉末形式的CPD 19(11mg,58％产率)。

MS(ESI)计算为C₅₅H₆₄F₄N₈O₁₀S:1104.44；实测:[M+1]1105.73,1106.72.

实施例20：N1-((S)-3'-(2-((4-氟苄基)((R)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧 代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)-N4-((S)-13-((2S，4R)-4- 羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-14，14-二甲基-11-氧 代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)琥珀酰亚胺(CPD20)的合成。

CPD 20以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-8和适当的VHL-N₂中间体制备。粗产物通过ISCO色谱纯化(MeOH/DCM,0-15％)，得到黄色粉末形式的CPD 20(12mg,59％产率)。

MS(ESI)计算为C₅₇H₆₈F₄N₈O₁₃S:1180.46；实测:[M+1]1181.77,1182.68.

实施例21：N1-((S)-3'-(2-((4-氟苄基)((R)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧 代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)-N4-((S)-13-((2S，4R)-4- 羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-14，14-二甲基-11-氧 代-3，6，9-三氧杂-12-氮杂十五烷基)琥珀酰胺(CPD 21)的合成。

CPD 21以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-8和合适的VHL-N₂中间体制备。

实施例22：N1-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧 代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)-N4-(4-(((S)-1-((2S，4R)- 4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代 丁烷-2-基)氨甲酰基)苄基)琥珀酰胺(CPD 22)的合成。

CPD 22以类似于实施例2中制备CPD 2的方式由int-8和合适的VHL-N₂中间体制备。

实施例23：N1-((R)-3'-(2-((4-氟苄基)((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)氨基)-2-氧 代乙基)-2'，4'-二氧-2，3-二氢螺环[茚-1，5'-噁唑烷]-5-基)-N5-(15-氧代-19-((3aS， 4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十九烷基) 戊二酰胺(CPD 23)的合成。

化合物3(30mg，产率>95％，通过LCMS检测)以类似于化合物1和2的制备方式由int-6(30mg，0.06mmol)和生物素-PEG3-20原子-酸(47.5mg，0.08mmol)获得。

实施例24：Kelly高危神经母细胞瘤(NB)细胞中p300/CBP的细胞降解。

EP300和CBP是多结构域蛋白质，其包含激酶诱导结构域(KID)相互作用结构域(KIX)、溴结构域、锌指结构域和乙酰转移酶(HAT)结构域。编码的表观遗传修饰结构域使EP300和CBP都能将转录因子识别与染色质重塑相结合，从而关键地介导基因表达。开发靶向EP300/CBP的小分子的研究主要集中在溴结构域、KIX结构域和HAT结构域(图2A)。

在Kelly NB细胞中测试了几种EP300/CBP抑制剂C646、CBP30和A485的作用(图2B)。结果表明，pan-HAT抑制剂A485优于其他已知的EP300/CBP抑制剂，在亚微摩尔水平上驱动NB细胞模型的生长变化(图2C，图2D)。在CellTiter-

生长测定中，用增加剂量的A485处理的Kelly NB细胞显示出生长抑制(图2E)和细胞凋亡的诱导(图2F)。

细胞降解测定

将Kelly神经母细胞瘤细胞以1,000,000个细胞每孔接种在6孔板中，并以剂量依赖性方式处理24至72小时。使用冰冷的裂解缓冲液[300mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5％Triton X-100，1％SDS，1mM二硫苏糖醇(DTT)，

蛋白酶抑制剂混合物(1:000)，25单位/mLBenzonase]收集全细胞裂解物，并以20μg的蛋白质浓度进行印迹(blot)。使用EpiQuik^TM Total Histone Extraction Kit(OP-0006-100,Epigentek)进行组蛋白提取，并以4μg的蛋白质浓度进行印迹。

化合物CPD 1至CPD 22通过ATPlite^TM测定(ATPlite^TM 1000测定试剂盒，

USA)使用标准方案进行测试。Kelly细胞系用化合物处理72小时，ATPlite^TM测定试剂盒用于测量细胞生长抑制。将信号相对于DMSO处理的细胞进行标准化。

结果如图15A-图15G所示，结果表明，本发明的化合物引起Kelly NB细胞抑制。CPD1(图15A)，CPD 8(图15C)和CPD 16(图15E)优于阳性对照A485。CPD 2(阴性对照)(其不渗透细胞)不抑制细胞生长(图15A)。

印迹

全细胞裂解物在

3-8％Tris-醋酸盐聚丙烯酰胺凝胶(EA03785BOX，Invitrogen^TM)中解析，组蛋白提取裂解物在Bolt 4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NW04125BOX，Invitrogen^TM)中解析。然后，将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(LC2001，Invitrogen^TM)。使用的一级抗体和二级抗体包括1:500稀释度的抗p300(ab 10485，

)、1:1000稀释度的抗CBP(ab 2832，

)、1:5000稀释度的抗肌动蛋白(3700S，Cell Signaling Technology)、1:1000稀释度的抗H3(4499s，Cell Signaling

)、1:1000稀释度的抗H3K27ac(ab 4729，

)、1:5000稀释度的

山羊抗兔(926-32211,

Biosciences)、和1:5000稀释度的

山羊抗鼠(926-68070,

)。可视化是在奥德赛红外成像***(

Biosciences)上进行的(图3B、图4F和图4G)。

实施例25：NB细胞中的EP300依赖性。

筛选和低通量数据表明，NB细胞生长选择性地需要EP300，而不是CBP。菌落形成测定的实验方法如Durbin et al.,Nat Genet.50(9):1240-60(2018)所述。结果如图3A所示。

实施例26：

和AlphaScreen^TM测定。

分别开发了用于检测EP300催化功能的

测定(图3B)和用于检测EP300溴结构域和cereblon(CRBN)的AlphaScreen^TM测定(其使用生物素化标记的小分子作为EP300溴结构域和CRBN的探针)(图3C)。

AlphaScreen^TM测定采用384孔板形式，使用白色AlphaPlate(

USA)，并使用Janus工作站(

USA)转移预稀释化合物(100nL)。所有后续步骤均在测定缓冲液(50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH 7.5，0.1％(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)和0.01％(vol/vol)吐温-20)中进行。简而言之，将10μL含酶(最终浓度为2nM)的测定缓冲液与化合物的稀释液预孵育15分钟。酶反应是通过添加由乙酰辅酶A 2-OG(最终浓度为5μM)组成的底物(5μL)而引发的。

FAS最终浓度为10μM。组蛋白尾-GGK生物素最终浓度为100nM。允许酶反应进行30分钟，并通过添加含有乙二胺四乙酸(EDTA)(40mM)和NaCl(1200mM)的5μL测定缓冲液来停止。二甲基亚砜(DMSO)的最终浓度为1％。将链霉亲和素供体珠(0.08mg/mL)和蛋白-A缀合受体珠(0.08mg/mL)与甲基标记抗体(300ng/mL最终)预孵育1小时，并使用预孵育的AlphaScreen^TM珠(5μL)检测组蛋白H3产物乙酰化标记的存在。检测在室温下进行2小时，检测板在Envision^TM 2104板读取器上读取。数据相对于(无酶)对照进行标准化，使用GraphPad Prism通过非线性回归曲线拟合确定IC₅₀值(图4E-图4H)。

表1中报告了由该测定产生的CDP 1至CPD 22的IC₅₀值。

表1.在Kelly细胞中的IC₅₀值。

ND:未检测到

TBD:待定

用本发明的降解剂CPD 1、CPD 8、CPD 10、CPD 13、CPD 15和CPD 16观察到细胞生长抑制。其余化合物未检测到或确定细胞生长抑制。

EP300对NB癌细胞存活很重要(图3A)。本发明的化合物CPD 1选择性地将靶蛋白(EP300)二聚化至E3连接酶(CRBN)，而不影响CBP。CPD 1诱导NB癌细胞中EP300的选择性降解，与单独使用抑制剂相比，杀死NB细胞的效能要高得多。

实施例27：推定的EP300降解剂的衔接子(adaptor)功能的评估。

为了通过实验评估推定的EP300降解剂的衔接子功能，如先前对于BRD4/CRBN-DDB1报道的所示(Winter,et al.Science 348(6241):1376-81(2015))，使用了用于人类重组EP300和CRBN-DDB1蛋白的发光邻近测定(AlphaScreen^TM，

)(图5E)。

实施例28：使用4天的ATPlite^TM测定，用CPD 1、CPD 2和A-485抑制细胞生长。

将一份ATP标准溶液(ATPlite^TM 1000 assay kit,

USA)用于在水中制备系列稀释。将一系列100μL的完全培养基用移液器移至平板的孔中，不含细胞。向每个孔中加入50μL哺乳动物细胞裂解溶液，并将平板在轨道震荡器中以700rpm的速度震荡5分钟。将10μL ATP系列稀释加入孔中，并将平板在轨道震荡器中以700rpm的速度震荡5分钟。加入50μL底物溶液，并将平板在轨道震荡器中以700rpm的速度震荡5分钟。在测量发光度和制备标准曲线之前，使平板暗适应平板10分钟。结果总结在图7A-图7C中。本发明化合物CPD 1在MM.1S和U266细胞中优于抑制剂A485。

实施例29：使用6天的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测 定，用CPD 1、CPD 2和A-485抑制细胞生长。

细胞培养的培养基被丢弃。对于贴壁细胞，小心吸出培养基。对于悬浮细胞，将96孔板在兼容微孔板的离心机中在4℃以1,000x g旋转5分钟，并小心吸出培养基。每个样本存在的培养基量必须相同。向每个孔中加入50μL无血清培养基和50μL的MTT溶液。将平板在37℃孵育3小时。

孵育后，向每个孔中加入150μL的MTT溶剂。该板用箔纸包裹，并在轨道震荡器上震荡15分钟。吸光度在OD＝590m处读取。读数在1小时内进行。结果总结在图8A-图8C中。本发明化合物CPD 1在MM.1S和U266细胞中优于抑制剂A485。

实施例30：CPD1对EP300的选择性降解。

实验方案与实施例24相同。使用EP300抗体、CBP抗体或H3K27ac抗体通过免疫印迹测定蛋白质水平。总H3被用作上样对照。以剂量依赖方式或时间依赖方式测量蛋白质水平。

结果如图9A-图9D所示，结果显示，EP300在最初36小时内明显降解而CBP水平不受影响，这证实了CPD 1相对于CBP对EP300的选择性。48小时后观察到CBP降解(图9B)。

蛋白质组学研究表明，EP300被本发明的降解剂CPD 1选择性地且显著地降解(图9C)。没有观察到CBP水平的变化。图9D中的结果显示，使用菌落形成测定法，CPD 1在10天内以剂量依赖的方式抑制Kelly细胞的生长。

实施例31：CPD 1和异构体(S,S)-CPD 1的生物活性评估。

结果如图10A-图10D所示，结果表明，CPD 1(R,S)的靶向配体中的手性中心对化合物的效能起重要作用。在(S,S)异构体中没有观察到EP300的细胞降解。

实施例32：定义本发明化合物的底物特异性。

AlphaScreen^TM测定用于确定本发明降解剂化合物与CRBN结构域和HAT结构域的结合。实验方案与实施例26相同。

结果如图11A-图11C所示，其显示了本发明降解剂CPD 1结合CRBN(图11C)和HAT结构域(图11B)两者。

实施例33：CPD 1是CRBN依赖性降解剂分子。

CPD 1在CRBN敲除(k/o)Kelly细胞系中进行测试。实验方案与实施例24相同。

结果如图12A-图12D所示，其显示CPD 1在CRBN k/o系(CRBN-1和CRBN-3)中不降解EP300或CBP，这证实了本发明化合物对EP300的降解是CRBN依赖性的。图12C和图12D中的细胞生长抑制曲线显示CPD 1不影响CRBN k/o细胞系。

实施例34：CPD 1在CD1小鼠中的体内研究。

在小鼠中测试CPD 1的最大耐受剂量(MTD)(图6A)。用10mg/kg(mpk)、20mpk和40mpk处理小鼠，每组4只小鼠。该化合物也在人类CRBN敲入小鼠中进行了测试，在治疗21天后收集血液样品。所有检测的血样都是正常的。

结果如图13A-图13C所示，其表明在小鼠中没有观察到体重减轻，这表明CPD1在体内研究中耐受性良好。此外，在人源化CRBN^I391V小鼠中未观察到毒性(图13C)。

每天用40mpk腹膜内注射(IP)处理小鼠，14天后取其血液样本。结果总结在表2中。血样测量表明CPD 1对小鼠没有毒性。

表2:体内研究血液分析。

免疫组织化学(IHC)染色用于检查来自MTD研究的肝脏。染色显示正常小鼠肝脏组织经40mpk的14天处理后EP300被敲除(图13C)。在体内观察到P300水平下降。没有观察到CBP和H3K27Ac水平的变化。

实施例35：CPD 1在体内具有抗肿瘤活性。

Kelly细胞系的异种移植模型用于评估体内效力。Kelly细胞被植入动物体内2M。治疗以40mpk IP从第10天开始。

结果如图14A-图14B所示，其表明CPD 1减少了肿瘤进展并延长了动物的存活。

实施例36：EP300降解剂的细胞效力和在靶效应评估。

为了报告靶蛋白降解，使用基于高通量流式细胞术的降解测定来评估细胞中EP300的降解。EP300被克隆到EGFP报告***中。使用FRT/Flp重组，EP300被表达为EGFP融合蛋白，随后是P2A位点和mCherry或mCardinal作为标准化标记，从而以可比较和稳定的水平表达EP300-EGFP融合蛋白和RFP报告子。

使用96孔流式细胞仪装置以单细胞分辨率测量靶蛋白降解，表示为EGFP比RFP信号的损失(Lu et al.,Chem.Biol.22(6):755-63(2015)；Winter et al.,Science 348(6241):1376-81(2015)；Zengerle et al.,ACS Chem.Biol.10(8):1770-7(2015)；Winteret al.,Mol.Cell.67(1):5-18(2017))。与其他方法相比，该测定显示出更高的灵敏度和稳定性，96孔流式细胞仪装置允许对大量分子进行完整的IC₅₀分析。与此同时，我们将开发一种类似的IKZF1报告细胞系来监测IKZF1降解，以评估推定的EP300降解剂的特异性(Kronkeet al.,Science 343(6168):301-5(2014)；Lu et al.,Science 343(6168):305-9(2014)。

为了证明在细胞环境中EP300降解对CRBN的要求，制备了等基因NB系，即通过CRISPR/Cas9技术工程敲除CRBN的Kelly细胞(Winter et al.,Science 348(6241):1376-81(2015)；Winter et al.,Mol.Cell.67(1):5-18(2017))。WT Kelly和Kelly CRBN-/-细胞与浓度逐渐增加的EP300降解剂一起孵育，并通过免疫印迹法观察EP300蛋白的降解。还对该细胞系的增殖和生存能力进行评分，以确定是否存在可能阻碍细胞生长的脱靶毒性。与处理过的细胞系中的EP300，CBP和IKZF免疫印迹一起，该细胞***可用于鉴定其他有效的和选择性的EP300降解剂。

实施例37：NB细胞模型中EP300降解剂功能的评估。

在一组NB细胞系中分析了具有最有前景的生物化学活性和在靶细胞活性的其他EP300降解在(“强效和选择性化合物/分子”)。在剂量和时间范围的研究中，通过免疫印迹分析对比适当的非活性对照(A-485、CBP30和来那度胺)，研究了EP300在NB系(Kelly)中的降解。再次与A-485相比，在一组MLL-r白血病细胞系(CellTiter-

Promega^TM)中评估了对生存力的影响。通过免疫印迹评估对整体H3K27乙酰化的影响。前导分子用于以下所述的细胞表征方法。

为了精确评估降解剂诱导EP300降解的机制，首先用A-485和邻苯二甲酰亚胺单独作为阴性对照，在NB细胞中测试CP300降解。NB中的CRBN水平也进行了评估。接下来，使用竞争性化合物和基因编辑策略如(Winter et al.,Science 348(6241):1376-81(2015))所述进行对蛋白酶体功能、EP300结合和CRBN结合的降解要求。为了证实CRBN结合、E3复合物激活和蛋白酶体功能对EP300有效降解的细胞要求，在用假定的EP300降解剂处理之前，分别用卡非佐米(carfilzomib)(一种蛋白酶体抑制剂)、MLN4924(一种Nedd8活化酶抑制剂)或来那度胺(一种CRBN结合剂)预处理Kelly和BEC2细胞。

一种无偏见的全蛋白质组方法可用于评估前导EP300降解剂处理对NB细胞系中蛋白质稳定性的细胞后果。基于多重定量质谱的蛋白质组学用于评估NB细胞中EP300降解剂处理的特异性和后果(McAlister et al.,Anal.Chem.84(17):7469-78(2012)；McAlisteret al.,Anal.Chem.86(14):7150-8(2014))。Kelly和BEC2细胞用假定的EP300降解剂或DMSO处理24小时。选择24小时孵育来捕获小分子作用的主要直接后果，并减轻对EP300靶基因抑制反式激活的预期混杂效应。优先考虑EP300降解的特异性，而不是效力和脱靶效应(例如，degradation of CRBN neo-substrate IKZF1 Kronke et al.,Science 343(6168):301-5(2014)；Lu et al.,Science 343(6168):305-9(2014))。所有这些评估都用于最终确定体内研究的候选对象。

实施例38：用于体内研究的EP300降解剂的PK特性的优化。

为了准确评估EP300降解剂在体内的翻译潜力，对前导EP300降解剂的PK特性进行了优化。例如，对CPD 1的PK特性进行了评估，如半衰期和最大耐受剂量(MTD)(图6A，参见实施例34)。新型EP300降解剂利用A-485支架产生了强大的效能和选择性。大量生成前导化合物用于体内PK和功效研究。

实施例39：与EP300抑制剂相比，EP300降解对基因表达、染色质占位、组蛋白修饰 的影响的表征。

EP300降解对NB细胞影响的全面分子评估是通过RNA-seq的转录谱分析和通过ChIP-seq和ATAC-seq的染色质评估来完成的。使用通过RNA-seq的转录谱分析和通过ChIP-seq的表观基因组分析，对这些化合物对染色质的影响进行全面的分子评估。具体而言，在抗性系中，在用A485或我们的前导EP300降解剂处理的细胞的0、6和24h进行转录响应的动力学研究。对EP300/CBP蛋白定位、增强子活性(H3K27ac)和启动子完整性(H3K4me3)的影响通过ChIP-seq和Chem-seq在处理后0小时、6小时和24小时进行研究。通过ATAC-seq在药物响应之前和之后，测定可接近的染色质和潜在顺式调节元件。这些数据集的整合检验了这样一个假设，即，EP300的降解不仅抑制其酶活性，而且还废除其非酶功能，导致EP300驱动的基因表达程序(这些程序以前从未接触过EP300抑制剂)的崩溃。

实施例40：体外评估EP300降解剂与EP300抑制剂相比的抗肿瘤效果。

新开发的EP300降解剂用于深入研究NB中EP300降解与体外酶促抑制作用的关系。头对头比较了用A-485和EP300降解剂处理的一组人NB细胞的剂量响应形式(CellTiter-

)。此外，通过免疫印迹评估细胞随时间的生长、EP300蛋白降解和H3K79甲基化水平，并通过流式细胞分析评估细胞周期/细胞死亡。

实施例41：EP300降解与标准护理剂或其他抑制剂组合作为NB中的组合方法的评 估。

通过使用标准方法(CellTiter-

)评估细胞增殖来确定对NB细胞的体外协同作用。使用了自动定位***，该***可以将多个浓度的两种不同化合物各自滴定到培养细胞的平板上。孵育48-72小时后，在多标记平板阅读器上，通过ATP含量(CellTiter-

)测定细胞活力。根据Chou et al.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(198)描述的方法，将结果绘制在CompuSyn程序包中，以确定是否有药剂的累加或协同作用。在看起来协同作用的组合剂量下，通过Annexin V染色和DNA含量评估来确定凋亡与细胞周期阻滞。在所有实验中，EP300蛋白水平通过免疫印迹来评估，以确保蛋白降解。

实施例42:评估斑马鱼和小鼠中EP300降解剂和抑制剂的毒性。

在斑马鱼胚胎中测定每个候选物的最大耐受剂量(MTD)。将3天大的斑马鱼胚胎暴露于不同的药物浓度，并监测其不良健康影响。然后通过确定不会导致不良形态和行为影响的最高浓度来选择治疗剂量。在进一步设计前导EP300降解剂的MTD评估时，首先使用化合物CPD 1作为指导进行实验(图6B)。降解剂的MTD也在小鼠中以类似的方式测定。简而言之，给小鼠服用试验化合物，并在施用后的特定间隔(0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时)分离血液和血浆，并通过LC/MS/MS对试验制品的存在进行定量(n＝5只小鼠/化合物)。体内小鼠PK实验用于确定这些参数，并为优化EP300降解剂的药物化学迭代轮次提供信息(图6A)。由于降解剂具有相对较大的分子量，研究合适的配方以增加降解剂的溶解度和稳定性，用于体内研究。这些参数，包括确立的MTD，一起用于指导体内研究设计，如施用方法、剂量和后续实验的时间表。获得的信息也用于指导实施例36中进行的降解剂优化。

实施例43：斑马鱼模型和小鼠PDX模型中化合物的评价。

在NB的斑马鱼异种移植模型中比较了A-485和降解剂CPD 1的体内功效。首先，用EGFP稳定转染人NB细胞用于可视化。然后，如前所述(Haldi et al.,Angiogenesis 9(3):139-51(2016)；He et al.,J.Pathology 227(4):431-45(2012)；Tulotta et al.,MethodsMol.Biol.1451:155-69(2016))，通过卵黄和静脉注射将这些细胞移植到2天大的斑马鱼胚胎中。一天后，移植有荧光人类NB细胞的斑马鱼胚胎被排列在24孔板中，并用试验药物进行处理。，12条受体鱼分别暴露于添加到鱼水中的降解剂和抑制剂(以MTD)以及DMSO对照。处理5天后，使用荧光分析体内细胞增殖、细胞生长和侵袭((Tulotta et al.,MethodsMol.Biol.1451:155-69(2016))并在各组之间进行比较。韦尔奇的t检验用于解决方差的不均匀性。在一定浓度范围内进一步分析显示出显著肿瘤抑制作用的药物。为了阐明活性药物或药物组合抑制肿瘤的细胞机制，分析了经处理的NB细胞的细胞增殖(通过PCNA和磷酸化组蛋白H3的免疫组织化学)、细胞存活和凋亡(通过TUNEL和抗caspase 3染色)、衰老(通过β-半乳糖苷酶染色)和自噬(通过溶酶体染色)。PD对EP300蛋白水平、H3K27乙酰化、MYCN水平和基因表达的影响是在处理了0、1、2、3、4和5天后从解离的斑马鱼胚胎中分离出的NB细胞上通过qRT-PCR进行的。

接下来，在NB(Kelly)异种移植模型中，通过将1x10⁶个细胞分别注射到30只6-8周龄的NOD-SCID-IL2Rnull(NSG)小鼠中，比较A-485和前导EP300降解剂的体内功效。这些小鼠在移植后2-3周开始出现临床症状。在我们确认植入后，将动物分成功效或药效学(PD)群组(每组3只用于PD研究，每组5只用于功效研究)。两组受试者均通过腹膜内(IP)注射每日以MTD给药，每日A485或降解剂。对照组接受实施例10的制剂研究中确定的媒介物的腹膜内注射。对所有动物称重以评估毒性，每三天测量一次肿瘤大小。药物治疗21天后停药7天，确定疗效(存活率)。将评估PD的动物给药14天，并在输注完成后安乐死。研究完成后，对动物实施安乐死并收集组织。股骨、部分脾脏、部分肝脏和任何增大的***都用10％***固定，用于组织学检查。PD对EP300蛋白水平、H3K27乙酰化和基因表达的影响通过qRT-PCR进行。在异种移植研究中表现良好的EP300降解剂被用于在NB PDX模型中进行类似的实验。给30只6-8周龄的NSG小鼠注射1x106人PDX细胞(二次移植)。如上所述，监测小鼠的肿瘤植入。移植的小鼠也被分成用于用媒介物、EP300降解剂或A-485(如上所述施用)进行处理的处理组(每组3只用于PD研究，每组5只用于功效研究)。所有分析都按照上述方法进行。总之，这些研究是在3-5个不同的PDX上进行的。

实施例44：在PDX模型中评估用于NB治疗的EP300降解剂的组合。

PDX模型用于评估EP300降解剂与已鉴定的EP300抑制剂的组合效果。这些实验与实施例42中描述的相似，除了将动物随机分成四个治疗组，每组8只小鼠(每组3只用于PD研究，每组5只用于功效研究)：媒介物、EP300降解剂、第二抑制剂或降解剂/抑制剂。

所有专利出版物和非专利出版物都表明了本发明所属领域技术人员的技能水平。所有这些出版物都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。

尽管本文已经参照特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，这些实施方案仅仅是本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对说明性实施方案进行许多修改，并且可以设计出其他配置。

Claims (46)

1.一种双功能化合物，其具有由式I表示的结构:

其中靶向配体(Targeting Ligand)代表结合组蛋白乙酰转移酶(HAT)EP300的部分，降解决定子(Degron)代表结合E3泛素连接酶的部分，接头(Linker)代表共价连接降解决定子和靶向配体的部分；或其药学上可接受的盐或立体异构体。

2.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述EP300靶向配体是A-485，并且由结构TL-1表示:

3.根据权利要求2所述的双功能化合物，其由结构I-1a表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述EP300靶向配体是A-485类似物，并且由结构TL-1a表示:

其中A是CH₂、NH或O；

B是CH₂或CO；

并且R是H、卤素、CN、CF₃、烷基或烷氧基。

5.根据权利要求4所述的双功能化合物，其由结构I-1a表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

6.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述EP300靶向配体由结构TL-1b表示:

其中

R₁是C3-C5碳环或烷基碳环基团或3-5元氮杂环或烷基氮杂环基团，并且其中所述烷基基团是C1-C10烷基基团。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中R₁是

8.根据权利要求6所述的双功能化合物，其由结构I-1b表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

9.根据权利要求1所述的化合物，其中所述EP300靶向配体由结构TL-1c表示:

其中

Q是CH₂、O、N、CO、C(O)O、C(O)N、CH₂N、CH₂C(O)、CH₂C(O)O、CH₂C(O)N或CH₂CH₂N；

并且R₂是

C3-C5碳环或烷基碳环基团或3-5元氮杂环或烷基氮杂环基团，并且其中所述烷基基团是C1-C10烷基基团。

10.根据权利要求9所述的双功能化合物，其由结构I-1c表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

11.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述EP300靶向配体由结构TL-1d表示:

12.根据权利要求11所述的双功能化合物，其由结构I-1d表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

13.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述EP300靶向配体由结构TL-1e表示:

14.根据权利要求13所述的双功能化合物，其由结构I-1e表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

15.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述EP300靶向配体由结构TL-1f表示:

16.根据权利要求15所述的双功能化合物，其由结构I-1f表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

17.根据权利要求1所述的双功能化合物，其中所述接头由结构L10表示:

其中X是CH₂、NH、NMe、或O；并且n是从0到11的整数。

18.根据权利要求17所述的双功能化合物，其中所述接头由结构L11至L26中的任何一种表示:

19.根据权利要求17所述的双功能化合物，其由结构I-2至I-12中任一项表示:

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

20.根据权利要求1所述的双功能化合物，其由选自由如下组成的组的结构表示：

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的双功能化合物，其中所述降解决定子结合cereblon(CRBRN)。

22.根据权利要求21所述的双功能化合物，其中所述降解决定子由结构D1表示:

其中Y是CH₂或CO；

并且Z是NH、O或OCH₂CO，并且曲线

代表接头和EP300靶向部分的连接点。

23.根据权利要求21所述的双功能化合物，其中所述降解决定子由结构D1-a表示:

24.根据权利要求1-20中任一项所述的双功能化合物，其中所述降解决定子结合vonHippel Landau肿瘤抑制因子(VHL)。

25.根据权利要求24所述的双功能化合物，其中所述降解决定子由选自由如下组成的组的结构表示：

，其中Y’是键、N、O或C；

其中Z是C₅-C₆碳环或C₅-C₆杂环基团；和

26.根据权利要求1所述的双功能化合物，其由结构1和3-23中任一项表示:

及其药学上可接受的盐和立体异构体。

27.一种双功能化合物，其具有由式II表示的结构:

其中靶向配体(Targeting Ligand)代表结合组蛋白乙酰转移酶p300的部分，接头(Linker)代表共价连接生物素(Biotin)和所述靶向配体的部分，或其药学上可接受的盐或立体异构体。

28.根据权利要求27所述的双功能化合物，其由选自由如下组成的组的结构表示：

或其立体异构体。

29.根据权利要求27所述的双功能化合物，其由结构23表示:

或其立体异构体。

30.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-26中任一项所述的式(I)的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其为片剂形式。

32.根据权利要求30所述的药物组合物，其为胶囊形式。

33.一种治疗涉及EP300活性失调的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-26中任一项所述的式(I)的双特异性化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病或病症是EP300依赖性和MYC家族依赖性癌症。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病或病症是高风险神经母细胞瘤(NB)。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病或病症是急性髓细胞性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)或弥漫性大B细胞淋巴瘤。

37.根据权利要求33所述的方法，所述疾病或病症是实体瘤。

38.根据权利要求37所述的方法，所述实体瘤是黑色素瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。

39.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法进一步包括给所述受试者施用治疗有效量的式I的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及治疗有效量的额外的抗NB剂。

40.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的式I的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体以片剂的形式口服施用于受试者。

41.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的式I的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体以胶囊的形式口服施用于受试者。

42.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的式I的双功能化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体以液体形式肠胃外施用于受试者。

43.根据权利要求33-42中任一项所述的方法，其中式(I)的双官能化合物以盐的形式施用于受试者。

44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

45.一种分离或检测EP300溴结构域的方法，其包括将怀疑含有EP300的裂解细胞与权利要求27-29任一项所述的双功能化合物和固定在载体上的链霉亲和素接触；通过生物素-链霉亲和素结合，分离由分子和蛋白质结合形成的复合物；并确定复合物中EP300的存在。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述载体包括珠。

Images