CN112931197A - 一种菠萝组织培养苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菠萝组织培养苗的制备方法，属于菠萝组培苗制备技术领域。本发明中的菠萝组织培养苗的制备方法，取菠萝植株上的芽诱导产生胚性愈伤，然后建立胚性悬浮细胞系，利用胚性悬浮细胞系再生获得菠萝组织培养苗。本发明中的方法繁殖系数大，一个芽体通过愈伤组织和悬浮细胞系能够获得数万个独立的细胞，这些独立的细胞在合适条件下都能够单独发育成一个单独的植株；另一方面悬浮细胞容易保存，当需要某一个品种的种苗时，应用保存的悬浮细胞系，很快就可以再生生成相应的种苗，缩短了菠萝种苗的培养时间，有效提高了菠萝种苗的可持续供应。

Description

一种菠萝组织培养苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种菠萝组织培养苗的制备方法，属于菠萝组培苗制备技术领域。

背景技术

菠萝是海南省主要的热带水果，在海南省经济发展中的地位举足轻重。海南省光热资源充沛，发展菠萝产业具有得天独厚的优势。目前海南省菠萝主栽品种之一是巴厘，其催花容易，管理简单；但是品质不高，效益低，上市时间集中，近几年多次出现滞销的情况。因此，菠萝种植户已经倾向于用经济效益高的新品种代替巴里菠萝；获得足够多的菠萝新品种优质种苗是实现品种更新换代的前提。

目前生产上菠萝种苗一般有吸芽、冠芽、裔芽、组培苗四种。其中吸芽是母株处于最旺盛阶段所抽生的芽体。用吸芽繁殖，定植后生长快，结果早，果中等个，可溶性固形物含量高。用作种苗的吸芽要充分成熟，叶身***、开张，长达25-35厘米，剥去基部叶片后，显出褐色小根点时，即为成熟的表现。一般在采果后喷施根外肥和雨后撒施速效肥，吸芽长至能做种苗时取出，摘下即可作为种苗使用。用冠芽繁殖的植株果大，开花整齐，成熟期比较一致。摘除冠芽的时间是：芽长20厘米，叶身***，上部开张，有有根出现时即可摘下。裔芽发生多影响果实发育，应该分批摘除。为繁殖种苗可以适当保留2-3个，采果后留在果柄上的小裔芽仍然能够继续生长，待长达18-20厘米时摘下栽植。这三种方法都是从结果植株上直接采集芽体。繁殖系数小，可以获得的种苗少。例如每个母株上可以获得大苗仅为6-8个。每个母株上的冠芽仅为1个。每个母株上裔芽仅有2-3个。

大规模品种更新换代要求有足够多的新品种优质种苗依靠；而吸芽、冠芽、裔芽繁殖菠萝的数量少、速率满，显然不能够满足大规模更新换代菠萝品种的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种菠萝组织培养苗的制备方法，该方法能够大幅度提高菠萝种苗的组培苗的培养效率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种菠萝组织培养苗的制备方法，包括如下步骤：

1)取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；

2)选取步骤1)中的愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；

3)将步骤2)中的胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养，得到成熟胚；所述再生培养基为半固体培养基，所述再生培养基上铺设有细胞载体，胚性悬浮细胞置于细胞载体上进行培养；

4)将步骤3)中成熟胚进行生芽培养和生根培养，得增殖芽苗，即为菠萝组织培养苗。

本发明中的菠萝组织培养苗的制备方法，通过诱导胚性愈伤，然后建立胚性悬浮细胞系，利用胚性悬浮细胞系再生获得菠萝组织培养苗。该方法繁殖系数大，一个芽体通过愈伤组织和悬浮细胞系能够获得数万个独立的细胞，这些独立的细胞在合适条件下都能够单独发育成一个单独的植株；另一方面悬浮细胞容易保存，当需要某一个品种的种苗时，应用保存的悬浮细胞系，很快就可以再生生成相应的种苗，缩短了菠萝种苗的培养时间，有效提高了菠萝种苗的可持续供应。

优选的，步骤1)中所述芽为冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽。

优选的，步骤1)中取菠萝植株上的芽的芽体茎段中间(厚度约0.4-0.6厘米)的片状部位，于愈伤组织诱导培养基上暗培养。在外植体材料选取上，本发明选择菠萝芽体茎段中间约0.5厘米厚度的部位，菠萝芽内生菌多，在组织培养时经常遇到外植体内生菌污染的情况，选用芽体茎段中间部位，能够有效避免这个问题。

优选的，步骤1)中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基配方为MS+2.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+1.5mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.3。

优选的，步骤2)中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L 2,4-D、1-2mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH＝5.0-5.5。步骤2)中于胚性细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。更为优选的，所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基配方为MS+2mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+45g/L蔗糖，pH＝5.3。

优选的，步骤2)在选择愈伤组织中的松脆易碎的胚性愈伤进行培养。在胚性愈伤转接到液体培养基以后，以每14天转接一次为宜，转接太频繁会增大被污染的几率，而且效果也不明显。转接时培养瓶内应保留10％-20％的原培养液不变。每次转接时，用移液器去除培养液内的黄色的分生组织小球、处于子叶期白色的胚、褐化坏死的组织和高度液泡化的细胞。

优选的，步骤3)中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3μmol/L生物素、650-700μmol/L谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L脯氨酸、80-120mg/L麦芽糖、1.0-1.2μmol/L NAA、0.15-0.25μmol/L玉米素、0.3-0.7μmol/L激动素、0.5-0.9μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine、110-150mmol/L蔗糖、27-31mmol/L乳糖、0.8-1.2g/L植物凝胶；所述再生培养基的pH＝5.6-6.0。步骤3)中是将胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养30-60天，得到成熟胚。

所述再生培养基为半固体培养基。再生培养基使用半固体培养基较好，铺在半固体培养基上面的滤纸能够更好地与培养基相接触，胚性悬浮细胞在滤纸上能够更容易地生长得到幼胚；而如果用全固体的培养基，则胚性悬浮细胞死亡率较高，生长出来的幼胚也呈现失水症状。

更为优选的，所述再生培养基配方为SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L生物素+680μmol/L谷氨酰胺+2mmol/L脯氨酸+100mg/L麦芽糖+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/L玉米素+0.5μmol/L激动素+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine(异戊基腺嘌呤)+130mmol/L蔗糖+29mmol/L乳糖+1g/L植物凝胶，pH5.8。其中SH即SH培养基；MS即MS培养基；adenine即腺嘌呤。在转移胚性悬浮细胞时，在再生培养基的上面铺一张细胞载体，转移1mL上述胚性悬浮细胞培养物到细胞载体上，即可。所述细胞载体为滤纸，优选为无菌定性分析滤纸。

优选的，步骤4)中所述生芽培养包括：将成熟胚于第一生芽培养基上暗培养，得到发芽的胚；将发芽的胚转移到第二生芽培养基上培养，得到从生芽；将从生芽中的小苗取出于芽苗恢复培养基上培养，得到幼芽，然后将幼芽进行生根培养。

优选的，所述第一生芽培养基中添加以下物质：MS培养基、1.5-2.5mg/L IAA、0.3-0.7mg/L BAP、25-35g/L蔗糖、2.5-3.5g/L植物凝胶；所述第一生芽培养基的pH＝5.6-6.0。然后将成熟胚于第一生芽培养基上黑暗培养20-40天，得到发芽的胚。第一生芽培养基为固体培养基，其上无需铺设滤纸。

更为优选的，所述第一生芽培养基配方为MS培养基+2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH＝5.8。其中MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤。将成熟胚转移到第一生芽培养基上，暗培养1个月左右获得发芽的胚。

优选的，所述第二生芽培养基为在MS培养基得基础上，添加0.5-1.5mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、4-6％椰子汁、25-35g/L蔗糖；所述第二生芽培养基的pH＝5.6-6.0。步骤4)中是将发芽的胚转移到第二生芽培养基上，暗培养10-20天，然后光照培养20-30天，得到从生芽。

更为优选的，所述第二生芽培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，将所述丛生芽中长至2-5cm的单棵苗切割分离，接种至芽苗恢复培养基上，光照培养10-20天；然后转移至生根培养基中培养至高8-12cm，然后去除培养器盖、练苗，得到菠萝抗寒种质。

优选的，所述芽苗恢复培养基为MS培养基，其中还包括椰子汁和糖类。更为优选的，所述芽苗恢复培养基配方为MS+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，步骤4)中将菠萝幼苗于生根培养基中培养至高8-12cm。所述生根培养基配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+3％香蕉粉+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，所述练苗为将菠萝幼苗至于阴凉处锻炼2-4天。练苗后取出苗，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至装有营养土：沙子＝1:1的盆中，阴凉处培养3天，移至自然光下生长。

本发明中菠萝组织培养苗的制备方法，通过在菠萝芽体茎段中间部位胚性愈伤诱导、胚性悬浮细胞系转接和再生的不同关键阶段运用不同的培养基配方和工艺，达到大幅提高菠萝种苗繁殖系数的目的，本发明的运用能够使菠萝种苗做到可持续供应，利于菠萝不同品种周年供果栽培模式的开展和新品种的推广。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。以下实施例中MS的配方如表1所示。

表1 MS培养基配方

1/2MS是指MS中大量元素(硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁和磷酸二氢钾)的用量减半，其它成分用量不变。

SH培养基配方为：硝酸钾2.5g/L，硫酸镁0.195g/L，磷酸二氢铵0.3g/L，无水氯化钙151mg/L，甘氨酸2.0mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸铁钠19.8mg/L，六水氯化钴0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，硼酸5.0mg/L，碘化钾1.0mg/L，一水硫酸锰10.0mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，七水硫酸锌1.0mg/L。

SH大量元素：硝酸钾2.5g/L，硫酸镁0.195g/L，磷酸二氢铵0.3g/L，无水氯化钙151mg/L。

SH微量元素：六水氯化钴0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，硼酸5.0mg/L，碘化钾1.0mg/L，一水硫酸锰10.0mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，七水硫酸锌1.0mg/L。

MS维生素：肌醇100.0mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫氨素0.4mg/L。

实施例1

本实施例中菠萝组织培养苗的制备方法，包括如下步骤：

1)选用菠萝品种巴厘(Comte de Paris)和台农4号；

选取花序抽生后4至6个月的菠萝植株，摘取这些植株的冠芽、裔芽、吸芽、或者块茎芽，剥掉叶片，用软刷蘸1％洗涤灵轻轻刷洗茎段至干净，将茎段用自来水冲洗干净，去掉茎段表面的附着物。

2)将上述茎段用75％酒精对其表面喷洒，然后转至超净工作台，在超净工作台中，将茎段放入75％的酒精中浸泡1分钟，然后取出茎段，用无菌水冲洗5次，放至滴加有2滴Tween20的0.1％氯化汞中浸泡1分钟，然后用无菌水冲洗5次，将茎段转移至一个直径为90毫米的培养皿中。

3)在培养皿中，用无菌手术刀片和镊子切去茎段上下两端，仅留下茎段中间厚度约0.5厘米的片状部位，接种在愈伤组织诱导培养基M1上，M1配方为MS+2.0mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L Sucrose+7g/LAgar，pH＝5.3。将创伤面紧贴在培养基上，暗培养，每两周继代一次，培养条件为黑暗，温度26℃，培养时间2个月。

2个月后，将诱导出的愈伤组织切下，放至愈伤组织诱导培养基M1上，继续暗培养，扩繁愈伤组织。

4)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6mL液体培养基M2中；液体培养基M2为：MS+2mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+45g/Lsucrose,pH＝5.3。培养条件：黑暗，温度26℃，转速90rpm，培养时间2个月。

胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系。

5)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％。

在直径为90mm的培养皿中盛放25mL再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/L glutamine+2mmol/L proline+100mg/Lmaltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/L zeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/L sucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel,pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺一张无菌定性分析滤纸，转移1mL上述培养物到滤纸上。

黑暗，温度26℃，培养时间为1-2个月。

6)在直径为90mm的培养皿中盛放25mL第一生芽培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA+30g/L sucrose+3g/Lphytagel,pH＝5.8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，暗培养1个月获得发芽的胚。

7)将发芽的胚转移到第二生芽培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8；暗培养15天，温度为26℃，然后光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux。温度为26℃，培养1个月，即可获得菠萝再生丛生芽。

8)将丛生芽中已长至3厘米左右的单棵幼苗切割分离，接种至芽苗恢复培养基M6上，光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux.温度为26℃，每两周继代一次。M6配方为MS+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

9)15天后将幼苗转移至生根培养基M7上，M7配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+3％香蕉粉+30g/L蔗糖，pH＝5.8；光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux，温度为26℃。

10)2-3个月后，苗长至10厘米左右，去除培养瓶盖子，阴凉处锻炼3天，取出苗，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至装有营养土：沙子＝1:1的盆中，阴凉处培养3天，移至自然光下生长。

本实施例中，巴厘(Comte de Paris)和台农4号一棵冠芽能够获得3000±52株组培苗，一棵吸芽能够获得2000±57株组培苗，一棵裔芽能够获得1500±45株组培苗，一棵块茎芽能够获得1000±53株组培苗。冠芽、吸芽、裔芽和块茎芽的繁殖系数分别为3000、2000、1500和1000。巴厘和台农4号品种间没有显著差异。组培苗健康状况良好。

实施例2

本实施例中菠萝组织培养苗的制备方法，选用菠萝品种金钻、甜蜜蜜和金菠萝的冠芽、裔芽、吸芽、或者块茎芽制备组织培养苗。其余制备过程同实施例1。

本实施例中，金钻和甜蜜蜜一棵冠芽能够获得3000±31株组培苗，一棵吸芽能够获得2000±59株组培苗，一棵裔芽能够获得1500±66株组培苗，一棵块茎芽能够获得1000±72株组培苗。冠芽、吸芽、裔芽和块茎芽的繁殖系数分别为3000、2000、1500和1000。金钻和甜蜜蜜品种间没有显著差异。组培苗健康状况良好。

金菠萝一棵冠芽能够获得2500±89株组培苗，一棵吸芽能够获得2000±38株组培苗，一棵裔芽能够获得1500±93株组培苗，一棵块茎芽能够获得1000±55株组培苗。冠芽、吸芽、裔芽和块茎芽的繁殖系数分别为2500、2000、1500和1000。组培苗健康状况良好。

实施例3

本实施例中菠萝组织培养苗的制备方法，选用菠萝品种维多利亚和西瓜凤梨的冠芽、裔芽、吸芽、或者块茎芽制备组织培养苗。其余制备过程同实施例1。

本实施例中，维多利亚和西瓜凤梨一棵冠芽能够获得3000±31株组培苗，一棵吸芽能够获得2000±58株组培苗，一棵裔芽能够获得1500±62株组培苗，一棵块茎芽能够获得1000±72株组培苗。冠芽、吸芽、裔芽和块茎芽的繁殖系数分别为3000、2000、1500和1000。维多利亚和西瓜凤梨品种间没有显著差异。组培苗健康状况良好。

Claims (10)

1.一种菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；

2）选取步骤1）中的愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；

3）将步骤2）中的胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养，得到成熟胚；所述再生培养基为半固体培养基，所述再生培养基上铺设有细胞载体，胚性悬浮细胞置于细胞载体上进行培养；

4）将步骤3）中成熟胚进行生芽培养和生根培养，得增殖芽苗，即为菠萝组织培养苗。

2.根据权利要求1所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤1）中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。

3.根据权利要求1或2所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L 2,4-D、1-2mg/L6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、40-50 g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH=5.0-5.5。

4.根据权利要求3所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤2）中于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。

5.根据权利要求1所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3 µmol/L 生物素、650-700µmol/L 谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L 脯氨酸、80-120mg/L 麦芽糖、1.0-1.2µmol/LNAA、0.15-0.25µmol/L 玉米素、0.3-0.7µmol/L 激动素、0.5-0.9µmol/L N6-(2-isopentenyl) adenine、110-150mmol/L 蔗糖、27-31mmol/L 乳糖、0.87-1.2g/L 植物凝胶；所述再生培养基的pH=5.6-6.0。

6.根据权利要求5所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤3）中于再生培养基上暗培养30-60天，得到成熟胚。

7.根据权利要求1所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤4）中所述生芽培养包括：将成熟胚于第一生芽培养基上暗培养，得到发芽的胚；将发芽的胚转移到第二生芽培养基上培养，得到从生芽；将从生芽中的小苗取出于芽苗恢复培养基上培养，得到幼芽，然后将幼芽进行生根培养。

8.根据权利要求7所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：所述第一生芽培养基中添加以下物质：MS大量元素、MS微量元素、MS维生素、1.5-2.5 mg/L IAA、0.3-0.7mg/LBAP、25-35 g/L 蔗糖、2.5-3.5g/L植物凝胶；所述第一生芽培养基的pH=5.6-6.0。

9.根据权利要求7或8所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：于第一生芽培养基上黑暗培养20-40天，得到发芽的胚。

10.根据权利要求7所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：所述第二生芽培养基为在MS培养基得基础上，添加0.5-1.5mg/L 6-BA、.05-0.15mg/L NAA、4-6 %椰子汁、25-35g/L 蔗糖；所述第二生芽培养基的pH=5.6-6.0。