CN110244047B - 肺癌血清诊断标志物及其应用、肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肺癌血清诊断标志物及其应用以及肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法。该肺癌血清诊断标志物包括表达上调全长可溶性hMSH3蛋白、表达下调的全长可溶性hMSH6蛋白、和表达下调的分子量为45KD‑50KD的可溶性hMSH6蛋白片段中的至少一种。本发明为进一步探索hMSH2及其互作蛋白的可溶形式在Vγ9δ2T细胞介导的癌症免疫逃逸中的作用和意义，创造性地对肺癌患者进行研究分析，利用血清蛋白提取、免疫印迹和/或免疫共沉淀等技术手段，明确了血清中可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6的存在形式与表达差异，并对与可溶性hMSH2互作的其它蛋白的可溶形式进行了筛测、分离、纯化、鉴定，为进一步探索hMSH2及其互作蛋白在Vγ9δ2T细胞介导的肺癌天然免疫中的作用提供了技术支持。

Description

肺癌血清诊断标志物及其应用、肺癌相关可溶性蛋白的分离 鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种肺癌血清诊断标志物及其应用、肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法。

背景技术

肺癌是当前人类死亡率最高的癌症之一。据2018年全球癌症统计数据，其年发病总数为209万例，占癌症病例总数的11.6％；年死亡总数为176万例，占癌症死亡总数的18.4％。在过去30年里，肺癌在我国的发生率和死亡率增长快速，仅2015年，我国肺癌总发病数就达73万例。

肺癌目前的常规治疗手段有手术治疗、放射性治疗、化学药物治疗等。这些传统疗法的常见副作用，如外科手术所致的肿瘤转移，放、化疗伴随的恶心、呕吐、脱发等不良反应和极低的五年生存率，促进了基于肿瘤相关抗原(或配体)活化的免疫过继治疗策略的产生与发展。其中，Vγ9δ2T细胞以能以MHC(major histocompatibility complex，组织相容性复合体)非限制性方式直接识别及结合抗原、配受体活化后可产生大量IFN-γ、易于体内外活化扩增等优势接踵NK细胞成为肿瘤免疫过继治疗的后起之秀。

鉴于目前肺癌的治疗副作用大、致死率高等问题，进行肺癌的早期诊断对于肺癌的预防和治疗具有重要的意义。

发明内容

基于此，有必要提供一种肺癌血清诊断标志物及其应用，以及肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，以用于指导肺癌的诊断实践，拓宽肺癌的诊断方法和治疗方法的范围。

一种肺癌血清诊断标志物，包括相对于健康人血清的表达上调的分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白、表达下调的分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白、和表达下调的分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述肺癌血清诊断标志物还包括相对于健康人血清的表达下调的分子量为70KD的全长可溶性Hsp70蛋白。

上述任一实施例所述肺癌血清诊断标志物在制备肺癌诊断试剂、诊断芯片、诊断试剂盒或检测设备中的应用。

一种肺癌血清诊断芯片，其上固定有上述任一实施例所述的肺癌血清诊断标志物对应的抗体，所述抗体能与相应的标志物特异性结合。

在其中一个实施例中，所述抗体为单克隆抗体。

一种肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，包括如下步骤：

提取肺癌患者血清样品中的血清蛋白；

使用hMSH2蛋白、hMSH3蛋白和hMSH6蛋白的相关抗体对提取的血清蛋白利用免疫印迹方法和/或免疫共沉淀方法进行分离鉴定。

在其中一个实施例中，所述肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法还包括在提取肺癌患者血清样品中的血清蛋白之后去除血清蛋白中的白蛋白和免疫球蛋白的步骤，后续分离鉴定时是对去除了白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白进行分离鉴定。

在其中一个实施例中，所述肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法还包括使用BCA蛋白浓度检测法对去除了白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白进行浓度检测的步骤。

在其中一个实施例中，使用免疫印记方法对肺癌患者血清样品与健康人血清样品进行目的蛋白的存在形式与表达差异进行检测分析。

在其中一个实施例中，使用抗体-琼脂偶联旋转柱免疫共沉淀方法对肺癌患者血清样品与健康人血清样品进行目的蛋白及与目的蛋白互作的其他蛋白的存在形式进行筛选、分离、纯化和鉴定分析。

研究发现，生理情况下，正常编码的人MutS同源蛋白2(human MutS homologue 2，hMSH2)与其配偶蛋白hMSH3、hMSH6是DNA错配修复(Mismatch repair，MMR)蛋白家族的重要成员，正常情况下定位于细胞核，用于维持基因组的稳定性。前期进一步研究发现，hMSH2、hMSH3、hMSH6在上皮来源肿瘤及EBV转化B淋巴细胞表面存在异位表达，并鉴定出这种异位表达的膜hMSH2(membrane-hMSH2，mhMSH2)是Vγ9δ2T细胞识别的内源性、应激性蛋白配体。

本发明为进一步探索hMSH2及其互作蛋白的可溶形式在Vγ9δ2T细胞介导的癌症免疫逃逸中的作用和意义，以及它们在临床癌症的早期诊疗和预后中的应用价值，创造性地对肺癌患者进行研究分析，利用血清蛋白提取、免疫印迹和/或免疫共沉淀等技术手段，明确了肺癌、肺结节患者血清、正常血清和肺癌细胞株全细胞裂解液中可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6的存在形式与表达差异，并对正常血清和肺癌全细胞裂解液中与可溶性hMSH2互作的其它蛋白的可溶形式进行了筛测、分离、纯化、鉴定，为进一步探索可溶性hMSH2及其互作蛋白在Vγ9δ2T细胞介导的肺癌天然免疫中的作用和意义，及在临床肺癌早期诊疗和预后中的应用价值提供了线索和依据。

本发明研究发现了几种可作为肺癌诊断的血清诊断标志物，如相对于健康人血清的表达上调的分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白、表达下调的分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白、和表达下调的分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段等。这些血清诊断标志物可以用于指导肺癌的诊断实践，有利于丰富肺癌的诊断和治疗技术。

附图说明

图1为肺癌、肺结节及健康志愿者血清可溶性hMSH2的表达；其中，A、B、C、D分别是三组人群血清可溶性hMSH2的WB(western blot，免疫印迹)分析及MW 50、105、170KD蛋白条带的灰度比较。

图2为肺癌、肺结节及健康志愿者血清可溶性hMSH3的表达；其中，A、B、C、D分别是三组人群血清可溶性hMSH3的WB分析及MW 130、50、40KD蛋白条带的灰度比较。

图3为肺癌、肺结节及健康志愿者血清可溶性hMSH6的表达；其中，A、B、C、D分别是三组人群血清可溶性hMSH6的WB分析及MW 160、100、45KD蛋白条带的灰度比较。

图4为肺癌、肺结节及健康志愿者血清可溶性Hsp70的表达；其中，A、B、C分别是三组人群血清可溶性Hsp70的WB分析及70、45KD蛋白条带的灰度比较。

图5为正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6化学修饰及截短形式的IP验证；其中，A、B、C分别是健康志愿者血清中可溶性hMSH2(A)、hMSH3(B)及hMSH6(C)IP样品的WB结果。

图6为正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6间的相互作用；其中，A说明以hMSH3和hMSH6为诱饵蛋白可共沉淀hMSH2(C端)；B说明以hMSH3和hMSH6为诱饵蛋白可共沉淀hMSH2(N端)；C说明以hMSH2和hMSH6为诱饵蛋白可共沉淀hMSH3；D说明以hMSH2和hMSH3为诱饵蛋白可共沉淀hMSH6。

图7为正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6与其它共定位蛋白的相互作用；其中，A说明以hMSH2、hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白未能共沉淀Exo-1；B说明以hMSH2、hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白未能共沉淀PMS2；C说明以hMSH2、hMSH3为诱饵蛋白可微弱共沉淀Hsp27。

图8为NCI-H520全细胞裂解液可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6的相互作用；其中，A说明以hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白可共沉淀hMSH2(C端)(MW 105、50KD)；B说明以hMSH2为诱饵蛋白可共沉淀hMSH2(N端)(MW 105、50KD)；C说明以hMSH2、hMSH3为诱饵蛋白可微弱共沉淀hMSH3(MW 130KD)；D说明以hMSH2和hMSH6为诱饵蛋白可共沉淀hMSH6(35KD条带最清晰；50、65KD处亦有微弱条带)；E说明以hMSH2、hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白未能共沉淀Exo-1；F说明以hMSH2、hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白未能共沉淀PMS2；G说明以hMSH2、hMSH3或hMSH6为诱饵蛋白未能共沉淀Hsp27。

图9为NCI-H520细胞培养上清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6、Exo-1、PMS2、Hsp27的WB分析；其中，A-G表示不同时间、不同密度NCI-H520细胞培养上清原液中均未检测出hMSH2(C端)、hMSH2(N端)、hMSH3、hMSH6、Exo-1、PMS2、Hsp27的可溶形式；H表示浓缩培养上清中的可溶性hMSH2(105,60KD)(C端)；I表示浓缩培养上清中的可溶性hMSH2(60KD)(N端)；J表示浓缩培养上清中的可溶性hMSH3(80KD)；K表示浓缩培养上清中的hMSH6(55,60KD)；L表示浓缩培养上清中的Exo-1(40,55,70,85KD)；M表示浓缩培养上清中的PMS2(60,70KD)；N表示浓缩培养上清中的Hsp27(27KD)。

图10为NCI-H520全细胞裂解液45-55KD条带的质谱测序结果；其中，A中加粗字体显示的是NCI-H520细胞裂解液45-55KD肽段测序所匹配的hMSH2蛋白序列(覆盖率35％)；B中加粗字体显示的是NCI-H520细胞裂解液45-55KD肽段测序所匹配的hMSH6蛋白序列(覆盖率12％)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种肺癌血清诊断标志物，其包括相对于健康人血清的表达上调的分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白、表达下调的分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白、和表达下调的分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段中的至少一种。

优选地，该肺癌血清诊断标志物还包括相对于健康人血清的表达下调的分子量为70KD的全长可溶性Hsp70蛋白。

上述肺癌血清诊断标志物在肺癌患者血清与健康人血清中的表达量有差异，表达显著上调或表达显著下调，因而，可以通过检测相应的诊断标志物的表达量来辅助诊断患者是否患有肺癌，为肺癌的确诊提供了进一步的技术支持。

该肺癌血清诊断标志物可以应用在制备肺癌诊断试剂、诊断芯片、诊断试剂盒或检测设备中。

例如，一个具体示例提供了一种肺癌血清诊断芯片，其上固定有上述肺癌血清诊断标志物对应的抗体，抗体能与相应的标志物特异性结合。优选地，所述抗体为单克隆抗体。通过在肺癌血清诊断芯片上固定抗体，可以与目标蛋白标志物相结合，可以进一步通过但不限于双抗夹心法检测原理，利用发光标记物发光来检测血清样品中目标蛋白标志物的表达量，可以辅助诊断血清样品来源的患者是否患有肺癌。

本发明进一步还提供了一种肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，其包括如下步骤：

提取肺癌患者血清样品中的血清蛋白；

使用hMSH2蛋白、hMSH3蛋白和hMSH6蛋白的相关抗体对提取的血清蛋白利用免疫印迹方法和/或免疫共沉淀方法进行分离鉴定。

在一个具体示例中，该分离鉴定方法还包括在提取肺癌患者血清样品中的血清蛋白之后去除血清蛋白中的白蛋白和免疫球蛋白的步骤，后续分离鉴定时是对去除了白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白进行分离鉴定。

进一步，该分离鉴定方法还包括使用BCA蛋白浓度检测法对去除了白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白进行浓度检测的步骤。

具体地，本发明使用免疫印记方法对肺癌患者血清样品与健康人血清样品进行目的蛋白的存在形式与表达差异进行检测分析。

进一步，本发明使用抗体-琼脂偶联旋转柱免疫共沉淀方法对肺癌患者血清样品与健康人血清样品进行目的蛋白及与目的蛋白互作的其他蛋白的存在形式进行筛选、分离、纯化和鉴定分析。

本发明为进一步探索hMSH2及其互作蛋白的可溶形式在Vγ9δ2T细胞介导的癌症免疫逃逸中的作用和意义，以及它们在临床癌症的早期诊疗和预后中的应用价值，创造性地对肺癌患者进行研究分析，利用血清蛋白提取、免疫印迹和/或免疫共沉淀等技术手段，明确了肺癌、肺结节患者血清、正常血清和肺癌细胞株全细胞裂解液中可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6的存在形式与表达差异，并对正常血清和肺癌全细胞裂解液中与可溶性hMSH2互作的其它蛋白的可溶形式进行了筛测、分离、纯化、鉴定，为进一步探索可溶性hMSH2及其互作蛋白在Vγ9δ2T细胞介导的肺癌天然免疫中的作用和意义，及在临床肺癌早期诊疗和预后中的应用价值提供了线索和依据。本发明研究发现了几种可作为肺癌诊断的血清诊断标志物，如相对于健康人血清的表达上调的分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白、表达下调的分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白、和表达下调的分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段等。这些血清诊断标志物可以用于指导肺癌的诊断实践，有利于丰富肺癌的诊断和治疗技术。

以下结合具体实施例对本发明的肺癌血清诊断标志物及其应用、肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法作进一步详细的说明。

以下实施例所使用的主要试剂及检测仪器情况说明如下：

试剂：anti-MSH2(ab70270)、anti-MSH2(ab92473)、anti-MSH3(ab154521)、anti-MSH6(ab208940)、anti-Hsp70(ab5442)、anti-PMS2(ab110638)；anti-Exonuclease1(ab155553)均购自Abcam公司；

anti-MSH2(15520-1-AP)、anti-MSH3(22393-1-AP)、anti-MSH6(18120-1-AP)、anti-HSP27(18284-1-AP)均购自Proteintech公司；

山羊抗兔IgG200(ZB5301)、山羊抗鼠IgG200(ZB5305)均购自中山金桥公司；

Mouse anti-rabbit IgG(Conformation Specific)(L27A9)mAb(HRP Conjugate)(5127S)、Normal Rabbit IgG(2729S)均购自CST公司；

Pierce^TM ECL Western Blotting Substrate(Pierce，32109)、Pierce Albumin/IgG Removal Kit(Thermo Scientific^TM89875)、Thermo Scientific^TM Pierce^TM Co-Immunoprecipitation Kit(Thermo Scientific^TM 26149)、BeyoColor彩色预染蛋白分子量标准(10-170kD)、Protein A+G Agarose(Fast Flow)、Protein A+G Agarose(Fast Flow,进口分装)均购自碧云天公司。

实验仪器：电泳仪(BIO-RED)；转膜仪(BIO-RED)；移液器(吉尔森)；质谱仪(ThermoScientific Q Exactive)；液相色谱(Thermo Dionex Ultimate 3000RSLCnano)。

细胞株：肺癌细胞株NCI-H520由中国医学科学院基础医学研究所何维教授课题组赠送。

实施例所使用的肺癌患者血清、肺结节患者血清和健康人(志愿者)血清来源于中山大学肿瘤防治中心。所有血清来源均经患者或志愿者的知情同意，并通过中山大学肿瘤防治中心及广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准。

本实施例首次研究了肺癌、肺结节患者血清、正常血清(健康人血清)和肺癌细胞株全细胞裂解液上清中hMSH2及其配偶蛋白hMSH3、hMSH6的可溶形式，以及在正常血清及肺癌全细胞裂解液上清中与可溶性hMSH2互作的其它蛋白的可溶形式。

一、实验方法

1、免疫印迹法(Western blot，WB)

①常规配制10％SDS-PAGE分离胶和浓缩胶；

②将蛋白样品和分子量标准与5×上样缓冲液等体积混合，煮沸10min；

③上样电泳：先恒压80V，待样品入分离胶后恒压120V，至溴酚蓝泳至胶底；

④将SDS-PAGE胶置于转膜缓冲液中浸泡；

⑤将滤纸与PVDF膜剪成凝胶大小，分别在转膜液与甲醇中浸泡30sec和5min；

⑥将滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸按照从下到上顺序放在阴极电转板上，每层间勿产生气泡，100V恒流电转2h；

⑦将PVDF膜浸入丽春红染液，摇动3-5min或更长时间至出现清晰条带，拍照记录；蒸馏水漂洗2-3次,每次3-5min，去除丽春红，进行后续WB检测；

⑧将膜没入5％脱脂奶粉中室温封闭1h；

⑨将一抗按1:1000稀释，4℃孵育过夜；用0.1％PBST洗膜，7min/次，共三次；

⑩将辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗1:2000稀释，室温孵育1h；用0.1％PBST洗膜，7min/次，共三次；将发光底物1:1混匀滴加于PVDF膜，化学发光显色并保存结果。

2、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)

2.1固定抗体

①将氨基连接臂耦合琼脂和试剂平衡至室温；

②用超纯水稀释20×coupling buffer(26149共沉淀试剂盒中包含，下同)至1×，每个Co-IP反应需200μL 1×coupling buffer；

③缓慢旋转瓶底的氨基连接臂耦合琼脂使之均匀悬浮；用剪掉尖端的枪头将50μL琼脂加入旋转管柱；置入离心管，1000g离心1min，弃废液；

④使用200μL 1×coupling buffer清洗琼脂，离心弃废液，重复一次；

⑤轻柔将管柱底部吸到滤纸上，弃多余液体，插上底塞；将10μg抗体(hMSH2/hMSH3/hMSH6)、20×coupling buffer、超纯水加入含琼脂的旋转管柱致总体积为200μL；

⑥通风橱中加入氰基硼氢化钠(3μL/200μL反应体系)；盖帽，室温旋孵90-120min；

⑦取下底塞并保留，去帽；将旋转柱置于一收集管，离心收滤液并检测抗体耦联情况；

⑧加入200μL 1×coupling buffer，离心弃滤液，重复一次；加入200μLQuenching Buffer，离心弃滤液；

⑨轻柔将管柱底部吸到滤纸上，除去多余液体，插上底塞；加入200μL QuenchingBuffer，通风橱中加入氰基硼氢化钠，盖帽，轻摇孵育15min；

⑩松开塞、帽，将旋转柱置于一收集管，离心弃滤液；用200μL 1×couplingbuffer清洗琼脂两次，离心，备Co-IP用。

2.2使用对照琼脂糖树脂进行Pre-clear

①以1mg样品加80μL对照琼脂糖树脂(40μL琼脂树脂)比例将对照琼脂糖树脂加入旋转柱；

②离心弃贮存缓冲液；

③加入200μL 1×coupling buffer，离心，弃滤液；

④加入样品，4℃孵育30-60min；

⑤1000g离心1min，弃耦合树脂的旋转柱，保留滤液进行Co-IP。

2.3Co-IP

①用IP Lysis/Washing Buffer稀释样品，推荐反应体积100-500μL；

②用IP Lysis/Washing Buffer将上述抗体-琼脂耦合旋转柱洗两次；200μL/次，离心；

③轻柔地将管柱底部吸到滤纸上，弃残液，插上底塞；

④将样品加入对应旋转柱，4℃孵育过夜；

⑤离心，置旋转柱入新收集管，加200μL IP Lysis/Washing Buffer，离心；重复3次；

⑥将旋转柱放入新收集管，加入10μL Elution Buffer，离心；

⑦加入50μL Elution Buffer，室温孵育5min，离心，收集目的蛋白滤液；

⑧质谱测序：将Co-IP所得目的蛋白样品SDS-PAGE电泳后切胶，生物质谱鉴定未知蛋白。

3、血清蛋白提取

每100μL血清加入200μL蛋白提取液(每100μL加入1μL PMSF，1μL Proteinaseinhibitor cocktail，2μL Phosphatase inhibitor)充分混匀，4℃静置5min；4℃12000rpm离心10min取上清蛋白液。

4、血清白蛋白/IgG等免疫球蛋白去除

①用Binding/Washing Buffer(89875试剂盒组分)将30μL上清蛋白液稀释至75μL；

②将上述蛋白稀释液加入胶床，盖帽，轻摇混悬，并将柱子放入离心管；旋转摇床室温孵育10min；

③除塞、帽，将柱子放入离心管，10000g离心1min；

④将滤液再次加入胶床，盖塞、帽；旋转摇床室孵10min；

⑤除塞、帽，将柱子放入离心管，10000g离心1min，收集滤液；

⑥将75μL Binding/Washing Buffer加入胶床，10000g离心1min，与上一步滤液收集入同一离心管，即得去除白蛋白和免疫球蛋白的目的蛋白溶液。

5、BCA蛋白定量

(1)蛋白标准品的准备

①取1.2mL蛋白标准配制液加入蛋白标准品(30mg BSA)，充分溶解后配成25mg/mL蛋白标准溶液，即用或-20℃长期保存；

②取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL，即用或-20℃长期保存。

(2)BCA工作液配制

据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；BCA工作液室温24h内稳定。

(3)蛋白浓度检测

①将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，补标准品稀释液至20μL，对应浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；

②加适当体积样品至96孔板，若样品不足20μl则加标准品稀释液补足；注意记录样品体积；

③各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min；

④用酶标仪测定A₅₆₂，或540-595nm波长A值；

⑤据标准曲线和使用的样品体积计算样品的蛋白浓度。

二、检测结果及分析

1、肺癌、肺结节患者及健康志愿者血清中可溶性hMSH2的表达及其形式

实验发现，肺癌、肺结节患者及正常健康志愿者血清在分子量(MW)105KD、170KD、50KD处均存在不同水平可溶性hMSH2蛋白的表达，而正常编码的细胞核hMSH2及上皮来源肿瘤细胞异位表达的膜hMSH2均为MW约105KD的全长蛋白(图1中A)。对受检的肺癌(n＝26)、肺结节(n＝13)及健康志愿者(n＝26)血清的Western blot灰度分析结果显示，可溶性hMSH2(105KD、170KD、50KD)在疾病组与对照组中的表达无显著统计学差异(图1中B-D)。实验报道了可溶性hMSH2在肺癌、肺结节及健康志愿者血清中的存在，并使用目标抗体在MW 105KD、170KD、50KD处杂出明显条带，提示除正常编码的全长蛋白外，血清中的可溶性hMSH2存在因化学修饰或基因删除等原因形成的变异体。

2、肺癌、肺结节患者及健康志愿者血清可溶性hMSH3的表达及形式

hMSH3是hMSH2的配偶蛋白，二者可形成MutSβ异二聚体，参与长链损伤DNA的识别、修复。实验对三种血清样本可溶性hMSH3的WB分析结果显示，MW 130KD(全长蛋白)、50KD及40KD处均有较清晰的蛋白条带(图2中A)。其中，MW 130KD的全长可溶性hMSH3在肺癌患者血清中的表达较健康志愿者显著增加(*P<0.05)，而50KD、40KD的可溶性hMSH3在各组中的表达则无显著统计学差异(图2中B-D)。实验结果提示MW 130KD的全长可溶性hMSH3有望作为肺癌的血清诊断标志物。

3、肺癌、肺结节患者及健康志愿者血清可溶性hMSH6的表达及形式

hMSH6亦是hMSH2的配偶蛋白，二者可形成MutSα异二聚体，与子宫内膜癌及骨肉瘤的发生发展及生存预后有关。实验发现，三种血清样本中的可溶性hMSH6在160KD、130KD、50KD处均存在较清晰蛋白条带(图3中A)。其中，MW 160KD、45-50KD处的可溶性hMSH6在肺癌患者血清中的表达较健康志愿者显著降低(*P<0.05)；各组在100KD处的表达则无显著统计学差异(图3中B-D)。

4、肺癌、肺结节患者及健康志愿者血清可溶性Hsp70的表达及形式

热休克蛋白70(Hsp70)是γδT细胞识别的另一蛋白质配体。实验发现，与健康志愿者相比，肺癌患者血清Hsp70在70KD处的表达显著降低(P<0.005)；45KD处亦有明显条带，但该处蛋白在各组间的表达无显著统计学差异(图4中A-C)。

5、正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6化学修饰或截短形式的IP验证

因上述WB结果显示，肺癌、肺结节患者及健康志愿者血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6蛋白条带位置基本相同，实验即采用免疫共沉淀及WB技术在可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6表达水平较高的健康志愿者血清对可溶性的目的蛋白进行了进一步的纯化验证。实验进一步证实，健康志愿者血清中的可溶性hMSH2存在105、170、50KD三种形式，正常兔IgG亦与之有非特异性结合(图5中A)；hMSH3出现较多杂带，提示样品中靶蛋白含量或抗体浓度不适(图5中B)；hMSH6在MW 130、105、85、65及43KD处均杂出清晰条带，提示IP后样品浓缩提高了对可溶性目的蛋白的检测敏感性，正常编码的MW约160KD的全长hMSH6可能因降解在血清中形成了片段化的截短形式(图5中C)。

6、正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6的相互作用

实验进一步检测了正常健康志愿者血清可溶性hMSH2与其配偶蛋白hMSH3、hMSH6的相互作用。以三种可溶性hMSH为诱饵蛋白的免疫共沉淀结果显示，hMSH2、hMSH3、hMSH6IP组均在55KD处出现清晰条带，提示血清中的可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6存在相互作用(图6中A-D)。实验结果同时提示，不同于细胞核中全长hMSH2、hMSH3、hMSH6相互作用所形成的同源或异源二聚体形式，血清中与配偶蛋白互作的可溶性hMSH2可能是保留了正常N、C端的全长hMSH2的截短形式。

7、正常血清可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6与Exo-1、PMS2、Hsp27互作验证

鉴于正常情况下细胞核中的hMSH2与Exo-1C端位点互作从而调节DNA的损伤修复过程，并与Hsp27存在共定位；PMS2则与MLH1形成异二聚体MutLα，参与DNA损伤修复及肿瘤发生。本实验以可溶性hMSH2、hMSH3和hMSH6为诱饵蛋白，采用免疫共沉淀及Westernblotting分析它们与血清中可能存在的可溶性Exo-1、PMS2、Hsp27的相互作用。实验发现各IP分组均无特异性蛋白条带出现，提示它们在血清中可能不存在直接作用，或彼此间结合能力过弱(图7中A-C)。

8、NCI-H520全细胞裂解液可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6与Exo-1、PMS2、Hsp27互作验证

实验采用同样实验条件检测了NCI-H520全细胞裂解液可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6间的相互作用及它们与全细胞裂解液中可溶性Exo-1、PMS2、Hsp27的相互作用。实验发现，NCI-H520全细胞裂解液中的可溶性hMSH2与hMSH3、hMSH6间存在相互作用(图8中A-D)。以可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6为诱饵蛋白，采用免疫共沉淀及WB分析它们与全细胞裂解液中可能存在的Exo-1、PMS2、Hsp27的相互作用发现，各IP分组均无特异性蛋白条带，这与血清样本所得结果一致，提示它们在血清中可能不存在直接作用，或彼此间结合能力过弱(图8中E-G)。

9、NCI-H520细胞培养上清中可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6与Exo-1、PMS2、Hsp27的表达及形式

实验同时检测了正常培养以及饥饿不同时间、种植不同密度的NCI-H520细胞培养上清中可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6与Exo-1、PMS2、Hsp27的存在情况。实验结果显示，不同种植密度(5*10⁴cells/孔、10*10⁴cells/孔、20*10⁴cells/孔)的NCI-H520细胞在24孔板孵育24h后，更换新鲜完全培养液正常培养以及饥饿不同时间后收集的NCI-H520细胞培养上清均未检测到可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6、Exo-1、PMS2、Hsp27的存在(图9中A-G)。超滤浓缩后的细胞培养上清可检测到微量的可溶性hMSH2、hMSH3、hMSH6、Exo-1、PMS2、Hsp27蛋白(图9中H-N)。实验结果说明NCI-H520细胞的培养上清存在上述蛋白的可溶形式，但初始含量极低。

10、正常血清与NCI-H520全细胞裂解液中可溶性hMSH2新变体的质谱鉴定

实验取正常血清的IP样品行R250染色后，切取MW 170、50KD蛋白条带进行质谱鉴定，发现这两个条带的酶解肽段并未匹配出hMSH2的蛋白序列，而NCI-H520全细胞裂解液45-55KD处的条带则分别匹配到hMSH2、hMSH6蛋白序列，提示血清MW 170、50KD处的hMSH2蛋白可能因丰度太低而被相同MW的其它高丰度蛋白覆盖。NCI-H520全细胞裂解液MW 45-55KD蛋白条带质谱鉴定所得肽段序列与hMSH2、hMSH6蛋白序列(分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)的匹配率如图10中A和B所示。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市妇女儿童医疗中心

<120> 肺癌血清诊断标志物及其应用、肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 934

<212> PRT

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Claims (6)

1.肺癌血清诊断标志物的检测剂在制备肺癌诊断试剂或检测设备中的应用，所述肺癌血清诊断标志物的检测剂包括血清蛋白提取试剂、血清白蛋白和免疫球蛋白去除试剂以及免疫印迹试剂，所述血清蛋白提取试剂用于提取血清蛋白样品，所述血清白蛋白和免疫球蛋白去除试剂用于去除血清蛋白样品中的白蛋白和免疫球蛋白，所述免疫印记试剂用于执行免疫印迹方法检测血清蛋白样品中的所述肺癌血清诊断标志物的含量，所述肺癌血清诊断标志物包括分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白和分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段中的至少一种，肺癌患者所述肺癌血清诊断标志物的含量相对于健康人所述肺癌血清诊断标志物的含量显著下调；

所述血清蛋白样品的提取包括以下步骤：

将待测血清样品与丝氨酸蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂cooktail和磷酸酶抑制剂混合，静置离心取上清液得到所述血清蛋白样品，离心转速为12000rpm；

所述免疫印迹试剂用于：

将去除白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白样品通过SDS-PAGE胶电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，通过hMSH6蛋白抗体以及标记二抗对肺癌血清诊断标志物进行特异性检测，通过标记二抗进行显色反应，采用BCA蛋白定量法检测肺癌血清诊断标志物的含量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌血清诊断标志物的检测剂还包括Hsp70蛋白抗体和hMSH3蛋白抗体中的至少一种；

所述肺癌血清诊断标志物还包括分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白和分子量为70KD的全长可溶性Hsp70蛋白的至少一种，肺癌患者所述hMSH3蛋白的含量相对于健康人所述hMSH3蛋白的含量显著上调，肺癌患者所述Hsp70蛋白的含量相对于健康人所述Hsp70蛋白的含量显著下调。

3.一种非诊断目的的肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取血清蛋白样品；

去除血清蛋白样品中的白蛋白和免疫球蛋白；

使用目的蛋白的相关抗体利用免疫印迹方法对去除白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白样品进行分离鉴定，所述目的蛋白的相关抗体包括hMSH6抗体；

采用BCA蛋白定量法对分离鉴定得到的分子量为160KD的全长可溶性hMSH6蛋白和/或分子量为45KD-50KD的可溶性hMSH6蛋白片段进行蛋白定量分析；

提取血清蛋白样品包括以下步骤：

将待测血清样品与丝氨酸蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂cooktail和磷酸酶抑制剂混合，静置离心取上清液得到所述血清蛋白样品，离心转速为12000rpm；

利用免疫印迹方法对去除白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白样品进行分离鉴定包括：

将去除白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白样品通过SDS-PAGE胶电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，通过hMSH6蛋白抗体以及标记二抗对肺癌血清诊断标志物进行特异性检测，通过标记二抗进行显色反应。

4.如权利要求3所述的非诊断目的的肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，其特征在于，所述目的蛋白相关的抗体还包括hMSH3抗体和Hsp70抗体，对去除白蛋白和免疫球蛋白的血清蛋白样品进行分离鉴定后还包括：对分子量为130KD的全长可溶性hMSH3蛋白进行定量分析；

和/或

对分子量为70KD的全长可溶性Hsp70蛋白进行定量分析。

5.如权利要求3或4所述的非诊断目的的肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，其特征在于，使用免疫印迹方法对待测血清样品与健康人血清样品进行目的蛋白的存在形式与表达差异进行检测分析。

6.如权利要求3或4所述的非诊断目的的肺癌相关可溶性蛋白的分离鉴定方法，其特征在于，使用抗体-琼脂偶联旋转柱免疫共沉淀方法对待测血清样品进行目的蛋白及与目的蛋白互作的其他蛋白的存在形式进行筛选、分离、纯化和鉴定分析。