CN105755005A

CN105755005A - 一种用于骨癌检测的适配子及其试剂盒

Info

Publication number: CN105755005A
Application number: CN201610143614.4A
Authority: CN
Inventors: 曹帅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-13
Filing date: 2016-03-13
Publication date: 2016-07-13

Abstract

本发明涉及一种能够特异性结合骨癌细胞的适体，所述适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以骨癌细胞为靶目标，从随机文库中筛选出了能与骨癌细胞特异性结合的DNA适配子。本发明还涉及一种用于分离骨癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含能够快速鉴定骨癌细胞，具有极高的应用价值。

Description

一种用于骨癌检测的适配子及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于骨癌检测的适配子及其试剂盒。

背景技术

骨癌(Osteosarcoma)，其是一种由骨骼***长出的恶性肿瘤，且为骨肿瘤中最常见的一种，会侵犯邻近的组织及器官，也可能会转移至远处的其它器官，好发于年纪介于十岁至二十岁之间的小孩及青少年身上，且男性发生几率略高于女性。骨癌的致病原因迄今未明，由它的原发部位和多发生于快速生长的年纪，显示其跟成骨细胞的活性增加可能有关，而遗传因素在骨癌似乎也扮演一个角色，此外也可能与慢性发炎、辐射或病毒感染有关。

目前针对骨癌的检测一般都是都是抽血采用胶体金技术进行检测，比如CN103267856B中公开的试纸检测，但是该检测方法具有一定的局限性，检测浓度有限制，并且准确性也有待提高。

SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合骨癌细胞的适配体具有较为重要的意义。

发明内容

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

本发明的目的是提供一种骨癌细胞的核酸适配体序列。

本发明中，所述的骨癌细胞的核酸适配体(序列1-29)能够特异结合骨癌细胞细胞。

本发明中，所述的骨癌细胞选自骨髓瘤细胞株XG7细胞。

本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性分离人骨髓瘤细胞株XG7的试剂盒。

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-ATTCGACATGCCTGGACATA(N36)CATGCCACATGACCAAGGCA-3’。中筛选出与骨髓瘤细胞株XG7特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物F(5，-FAM-ATTCGACATGCCTGGACATA-3，)和R(5，-biotin-TGCCTTGGTCATGTGGCATG-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以骨髓瘤细胞株XG7为正筛靶标，以人骨髓间充质干细胞为反筛靶标，筛选与骨髓瘤细胞株XG7特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合骨髓瘤细胞株XG7的序列，本发明中命名为适配体GSL1-GSL29。序列如下：

GSL1：

TCGACATGCCTGGACATATAACCCCCCTTCTCAAACAATATTCAAATTTCTATACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL2：

ATTCGACATGCCTGGACATACCTTTTAACACAACCTACCTTCTTTCCTACACATCCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL3：

ATTCGACATGCCTGGACATAAACCACATTAATACATCTTATAATTATTCTTACTACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL4：

ATTCGACATGCCTGGACATATATCACACTACATTATATTCTTCTCCACCCTTATCTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL5：

ATTCGACATGCCTGGACATACTTAAAATACACCCTAAATTCTTACATAAATAACAACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL6：

ATTCGACATGCCTGGACATACTCAAATAATCACTTATACAAAAAAACTCTATTTTTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL7：

ATTCGACATGCCTGGACATAAACAACACACACATACCCCTCCATAACCCCACAATTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL8：

ATTCGACATGCCTGGACATAAACCATTACAAACGCTATATTAACATACCTATCTTACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL9：

ATTCGACATGCCTGGACATACAACAATACCAGCCACAATCTAAAACTCTTCTTTCTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL10：

ATTCGACATGCCTGGACATATTCTCCCTTTACACATATTAATCCCACATCTTTTACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL11：

ATTCGACATGCCTGGACATACAAAATTTCCAATATTTATATAACTCTTAAACACTTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL12：

ATTCGACATGCCTGGACATACTCCCATTCAGACAATTTACCCACTTATAATTCACTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL13：

ATTCGACATGCCTGGACATAATTTATACACTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL14：

ATTCGACATGCCTGGACATACCCACTCATATTAATATATCTTTTCACCATTAAAACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL15：

ATTCGACATGCCTGGACATATACATTTTACTTCCAATATTCATAATACCATAATTCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL16：

ATTCGACATGCCTGGACATAAATTCTACACATAAATCCTCCACTTAATAAAATCTTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL17：

ATTCGACATGCCTGGACATACTTTAATCAACAACCACTTTATTACCCTTCAATCACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL18：

ATTCGACATGCCTGGACATATTCCCAATATATTATAATATACTTCTAATCTTTCCCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL19：

ATTCGACATGCCTGGACATATCCATTCTTAGATCTCTATACATAATACTCTTTTACCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL20：

ATTCGACATGCCTGGACATAAAAACCCATATTATTCCACCACATTACCACCTTACCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL21：

ATTCGACATGCCTGGACATAATTTAACTCCGACTACTCACTCAATCTTCACCCTCACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL22：

ATTCGACATGCCTGGACATATTCCCTTTATTCAAACAACACTTCATTTTCCCAATACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL23：

ATTCGACATGCCTGGACATAACACTTTCTATATCCTCATCCATTCACCTATTTTTACATGCCACATGACCAAGGCA

GSL24：

ATTCGACATGCCTGGACATATATCTTAACTACACTTACATTACCACAATCTCATTTCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL25：

ATTCGACATGCCTGGACATAAACTTTTATCATCTAATACCCACACACCTATTCCCCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL26：

ATTCGACATGCCTGGACATAATCTCTTTATTAATCTCATACCATTATCAATCCCATCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL27：

ATTCGACATGCCTGGACATATATACTTCGTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL28：

ATTCGACATGCCTGGACATAATAATACTCTTATTACCAATTTAATCTAAAACCCATCATGCCACATGACCAAGGCA

GSL29：

ATTCGACATGCCTGGACATACACATTACCGACCTTACCTCAATTACCCAACACATTCATGCCACATGACCAAGGCA

本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离骨髓瘤细胞株XG7，具有分离效果快，效率高，节省时间，节约成本的功效。具有极强的应用价值。

本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合骨髓瘤细胞株XG7的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为特异性筛选和富集骨髓瘤细胞株XG7的试剂盒。

具体实施方式

实施例1:核酸适配体筛选

从体外合成的随机寡聚DNA文库，5’-ATTCGACATGCCTGGACATA(N36)CATGCCACATGACCAAGGCA-3’。

富集所用引物:

F：5，-FAM-ATTCGACATGCCTGGACATA-3

R：5，-biotin-TGCCTTGGTCATGTGGCATG-3

将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥；用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgCl2,2mg/mLBSA,0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库,取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。

反筛:将250pmol的文库吸入生长覆盖度达到85％的人骨髓间充质干细胞直径6cm培养皿中，用结合缓冲液补足到1mL；4℃摇床振荡1.2h；取上清液。

正筛:将反筛上清液加入外周血骨髓瘤细胞株XG7生长覆盖度达到85％的直径6cm培养皿中中，4℃摇床振荡1h；弃上清液；用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgC12)洗涤外周血骨髓瘤细胞株XG7细胞三遍；用细胞刮刮下外周血骨髓瘤细胞株XG7，用1mL洗涤缓冲液将外周血骨髓瘤细胞株XG7转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变冷后，10000rpm离心5min；上清转移到一干净的EP管中。

富集:配置PCR体系(总体积1000ul):H20740ul，10XPCR缓冲液100ul，dNTP80ul，引物混合物25ul(F:100uM，100uM),DNA模板(正筛上清)50ul，TaqHS酶5ul。

按如下条件在PCR仪上扩增:94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退火20s，72℃延伸20s,20个循环，72℃延伸4min，4℃保温<lh。

纯化:纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ulGE的StreptavidinSepharose后PBS洗两遍,加入PCR产物,摇床振荡20min,放出液体,PBS洗两遍后,加0.5mLNaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱盐柱，待液体从脱盐柱几乎流尽时加1mLMilliQ水洗脱，同时开始接洗脱液lmL，该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库。将富集了的寡聚DNA文库进行常规的TA克隆，而后进行菌落PCR与测序。测序结果为SEQIDNO：1-29所示。

实施例2亲和性能验证

取靶细胞骨髓瘤细胞株XG7分别与不同浓度0、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、500nM、800nM、1000nM的适配子GSL1-25孵育20min，洗涤后进行流式细胞术实验，结果发现，随着适配子浓度的增加，其对靶细胞的结合力就越强，最终结合趋于饱和。当适配子与细胞结合率达到50％时，此时所需的适配子的浓度就是其平衡解离常数Kd，由此我们可以得到适配子各自与细胞的结合力常数分别如下：

实施例3所述适配子特异性分析

将50nM的FITC标记的适配子GSL1-25分别与个靶细胞骨髓瘤细胞株XG7或反筛骨髓间充质干细胞以及口腔上皮细胞结合20min，洗涤，4％的多聚甲醛固定后进行共聚焦显微镜实验，结果发现，对于骨髓瘤细胞株XG7来说，适配子GSL1-25均能很好的与其结合，且在细胞膜上可以看到很明显的荧光，而对于骨髓间充质干细胞以及口腔上皮细胞来说，适配子GSL1-GSL25均没有明显地与其结合，所以在荧光场中我们基本看不到荧光。

通过上述实验得出以下结论:本发明的适配子序列均能很好的与靶细胞结合，而且靶向性也很好。

实施例4降解活性分析

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。说明本发明的适配子具有良好的稳定性。

实施例5分析细胞实验

将本发明的适配子分别偶联磁珠，将健康志愿者无菌EDTA抗凝外周血样加入到无菌离心管中，取1mL外周血经流式细胞仪计数其中的骨髓瘤细胞株XG7数，其数量为5.0X10³。分别将偶联有磁珠的适配子与等量的外周血混合孵育20分钟，而后磁分离，即可获得相应的分离的细胞，通过检测剩余的细胞个数，按照(5.0X10³-剩余的个数)/5.0X10³*100％得到了相应的分离效率如下。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉曹帅

〈120〉一种用于骨癌检测的适配子及其试剂盒

〈210〉1

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL1

TCGACATGCCTGGACATATAACCCCCCTTCTCAAACAATATTCAAATTTCTATACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉2

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL2

ATTCGACATGCCTGGACATACCTTTTAACACAACCTACCTTCTTTCCTACACATCCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉3

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL3

ATTCGACATGCCTGGACATAAACCACATTAATACATCTTATAATTATTCTTACTACCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉4

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL4

ATTCGACATGCCTGGACATATATCACACTACATTATATTCTTCTCCACCCTTATCTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉5

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL5

ATTCGACATGCCTGGACATACTTAAAATACACCCTAAATTCTTACATAAATAACAACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉6

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL6

ATTCGACATGCCTGGACATACTCAAATAATCACTTATACAAAAAAACTCTATTTTTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉7

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL7

ATTCGACATGCCTGGACATAAACAACACACACATACCCCTCCATAACCCCACAATTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉8

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL8

ATTCGACATGCCTGGACATAAACCATTACAAACGCTATATTAACATACCTATCTTACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉9

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL9

ATTCGACATGCCTGGACATACAACAATACCAGCCACAATCTAAAACTCTTCTTTCTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉10

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL10

ATTCGACATGCCTGGACATATTCTCCCTTTACACATATTAATCCCACATCTTTTACCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉11

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL11

ATTCGACATGCCTGGACATACAAAATTTCCAATATTTATATAACTCTTAAACACTTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉12

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL12

ATTCGACATGCCTGGACATACTCCCATTCAGACAATTTACCCACTTATAATTCACTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉13

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL13

ATTCGACATGCCTGGACATAATTTATACACTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉14

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL14

ATTCGACATGCCTGGACATACCCACTCATATTAATATATCTTTTCACCATTAAAACCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉15

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL15

ATTCGACATGCCTGGACATATACATTTTACTTCCAATATTCATAATACCATAATTCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉16

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL16

ATTCGACATGCCTGGACATAAATTCTACACATAAATCCTCCACTTAATAAAATCTTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉17

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL17

ATTCGACATGCCTGGACATACTTTAATCAACAACCACTTTATTACCCTTCAATCACCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉18

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL18

ATTCGACATGCCTGGACATATTCCCAATATATTATAATATACTTCTAATCTTTCCCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉19

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL19

ATTCGACATGCCTGGACATATCCATTCTTAGATCTCTATACATAATACTCTTTTACCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉20

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL20

ATTCGACATGCCTGGACATAAAAACCCATATTATTCCACCACATTACCACCTTACCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉21

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL21

ATTCGACATGCCTGGACATAATTTAACTCCGACTACTCACTCAATCTTCACCCTCACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉22

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL22

ATTCGACATGCCTGGACATATTCCCTTTATTCAAACAACACTTCATTTTCCCAATACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉23

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL23

ATTCGACATGCCTGGACATAACACTTTCTATATCCTCATCCATTCACCTATTTTTACATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉24

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL24

ATTCGACATGCCTGGACATATATCTTAACTACACTTACATTACCACAATCTCATTTCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉25

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL25

ATTCGACATGCCTGGACATAAACTTTTATCATCTAATACCCACACACCTATTCCCCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉26

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL26

ATTCGACATGCCTGGACATAATCTCTTTATTAATCTCATACCATTATCAATCCCATCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉27

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL27

ATTCGACATGCCTGGACATATATACTTCGTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉28

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL28

ATTCGACATGCCTGGACATAATAATACTCTTATTACCAATTTAATCTAAAACCCATCATGCCACATGACCAAGGCA

〈210〉29

〈211〉74

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉GSL29

ATTCGACATGCCTGGACATACACATTACCGACCTTACCTCAATTACCCAACACATTCATGCCACATGACCAAGGCA

Claims

1.一种特异性结合骨癌细胞的适体，其特征在于为包括SEQIDNo.1-29任一条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。

2.权利要求1所示的适体在检测骨癌中的应用。

3.权利要求1所示的适体用于制备检测骨癌的试剂盒应用。

4.一种检测骨癌的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的适体。