CN112870383A - Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体的是Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤；一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况；二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制；三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制等。本发明使用Lgr5‑EGFP‑CreERT2工具鼠可使得内耳干细胞(Lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠Lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究Hippo信号通路对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究Hippo信号通路在调控内耳干细胞增殖/分化及毛细胞再生中的具体作用机制。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的是Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。
背景技术
听觉是人类最重要的知觉之一，也是语言交流的基础。听觉感知作为语言识别和理解的基础，在人类社会活动起着重要的作用。由于社会经济和工业化的快速发展、人口老龄化不断加剧、耳毒性药物滥用和噪音等环境污染因素，患有不同程度上的耳疾病的人数逐年增长。据WHO 2019年的统计显示全球大约有5％即4.66亿人患有残疾性听力损失，其中3400万是儿童。
听力损失和耳聋已成为严重威胁人类健康和影响人们的生活质量的全球性问题，其中感音神经性耳聋约占耳聋患者的63％。感音神经性耳聋源于耳蜗前庭蜗神经或中枢听觉***的异常，其主要特征为耳蜗高频区域听力易损性和外毛细胞损伤。目前主要的技术是通过人工耳蜗辅助患者恢复一定的听觉功能，但这也只是治标不治本，此外人工耳蜗植入效果因人而异，但只有部分人可以达到或者接近正常人听力水平。因此如何使内耳毛细胞在损伤和丢失后修复和再生，是近年来听觉领域研究的重点。
近年来的很多研究发现Hippo信号通路关键因子YAP是Wnt信号通路的直接靶基因，Lgr5是一种Wnt信号通路下游的靶基因，在小肠和胃中Lgr5阳性细胞具有成体干细胞的特性。有研究表明，在耳蜗的胚胎发育期，Lgr5表达于将生成感觉上皮的前感觉区域，在新生期Lgr5表达于部分支持细胞，在活体小鼠耳蜗中Lgr5阳性细胞可以分化成为毛细胞，在离体培养中Lgr5阳性细胞可以自我更新形成单克隆细胞群体，并再生新的毛细胞，这都表明在耳蜗中Lgr阳性细胞可以作为内耳干细胞Lgr5阳性内耳干细胞增值并分化成为毛细胞的过程受到多种信号通路的调控，最经典的是受到Wnt信号通路的调控。在耳蜗中激活Wnt信号通路可以促进Lgr5阳性内耳干细胞的增殖，部分增殖后的Lgr5阳性内耳干细胞也可以分化成毛细胞。这就表明Wnt信号可以调控耳蜗Lgr5阳性内耳干细胞的增殖和分化。Hippo信号通路关键因子YAP作为Wnt信号通路的直接靶基因，是否Hippo信号通路通过激活或者抑制某些信号通路，从而促进内耳干细胞的增殖并且分化成为毛细胞。然而，到目前为止，Hippo信号通路在内耳中的研究几乎没有报道。因此我们猜想Hippo信号通路可能也参与哺乳动物内耳毛细胞再生的过程。此外，Dickkopf-3(Dkk3)是一种肿瘤抑制因子，是人类DKK家族中编码分泌蛋白的成员，主要调节经典Wnt/β-catenin信号通路。DKK3拮抗Wnt配体，作为Wnt信号转导途径的负调控因子为人所知。
同时，现有技术存在以下缺陷：
1、内耳干细胞很难获取，分选的效率低：因为小鼠耳蜗干细胞主要存在于毛细胞下面的支持细胞中，但并不是所有的支持细胞都是干细胞，只有部分可以具有再生或者分化为毛细胞的潜能，因此精确并高效的分离获得内耳干细胞是目前的难题；
2、目前研究领域中，针对Hippo信号通路相关作用的研究基础很少，因此相应的专用试剂和药物缺乏；
3、目前临床上常用的助听器和人工耳蜗植入虽然在一定程度上改善了患者的听力，但是其效果完全依赖于残存毛细胞的数量和质量，治标不治本。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用，解决了内耳干细胞很难获取，分选的效率低的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤；
一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况；
二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制；
三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制；
四、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo信号如何调控内耳干细胞，从而促进毛细胞再生；
五、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况；
六、研究DDK3对内耳干细胞的调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况。
进一步地，所述步骤一中的检测方法为：使用RT-PCR、Western blotting、Immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测Hippo信号通路中重要因子Yap1的表达。
进一步地，所述步骤二的研究方法为：解剖出Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出Lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，调控Hippo或/和Wnt信号通路的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生。
进一步地，所述步骤三的研究方法为：通过筛选的一些小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控Hippo信号通路的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。
进一步地，所述步骤六的研究方法为：从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术下调细胞中Dkk3的表达水平，在体外培养的细胞中，通过成球实验和分化实验，研究Dkk3基因的作用。
Hippo在毛细胞再生中的应用，包括如上所述的Hippo信号通路，将Hippo信号通路应用在毛细胞再生中。
本发明的有益效果：
本发明使用Lgr5-EGFP-CreERT2工具鼠可使得内耳干细胞(Lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠Lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究Hippo信号通路对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究Hippo信号通路在调控内耳干细胞增殖/分化及毛细胞再生中的具体作用机制。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明Hippo-YAP信号通路在小鼠耳蜗中的表达情况示意图；
图2是本发明Hippo信号调节Lgr5+祖细胞的球形形成能力示意图；
图3是本发明Hippo信号调节Ex Vivo全器官培养物中Lgr5+祖细胞的HC再生能力示意图；
图4是本发明Hippo信号调节Lgr5+祖细胞在新霉素处理的耳蜗中的增殖能力示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明将从Hippo信号通路调控方面着手研究其对内耳毛细胞再生的作用。首先，从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术上调或者下调细胞中Hippo信号通路关键因子YAP的表达水平，最后，在小鼠活体毛细胞新霉素损伤模型中，通过病毒感染的方式调控组织中YAP的表达水平，研究Hippo信号调控毛细胞再生的作用及其机制。此外通过敲低Dkk3基因，探究其调控Hippo信号通路活性，调控毛细胞再生。
具体研究内容包括以几个方面：
一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况
实验内容：
Ⅰ、RT-PCR检测：取15～20只P3的野生型小鼠，取出耳蜗基底膜，使用TRIzol法提取总RNA；以提取的RNA作为模板，加入Oligo(dT)及逆转录酶等组分，进行逆转录反应，使用特异性引物进行PCR反应，扩增目的条带。通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定Mst1/2、Lats1/2、YAP等在小鼠耳蜗中的表达情况。
Ⅱ、Westernblotting检测：取15～20只P3的野生型小鼠，取出耳蜗基底膜，加入适量的蛋白裂解液及相应的蛋白酶抑制剂，在冰上充分研磨，以保证蛋白充分释放，离心后弃去未充***解的组织碎片，加入SDS并煮沸使蛋白变性；使用YAP特异性抗体，进行Westernblotting实验，鉴定YAP蛋白在小鼠耳蜗中的表达情况。
Ⅲ、Immunohistochemistry检测：取2～3只P3的野生型小鼠，取出完整的耳蜗基底膜，按照其原有的形态铺在包被有Cell-Tak的玻片上；加入4％PFA溶液，于室温下进行固定1h后，用含0.1％TritonX-100的PBS溶液洗涤数遍，再用封闭液于室温下封闭1h；使用YAP特异性抗体及相应的二抗进行孵育，洗涤后加入抗荧光猝灭封片液，进行封片。在激光共聚焦显微镜下进行观察，鉴定YAP蛋白在小鼠耳蜗中的表达情况。
如图1所示为Hippo-YAP信号通路在小鼠耳蜗中的表达情况。
二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制
实验内容：
Ⅰ、成球实验(SphereAssay)：在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用YAP siRNA转染细胞，使细胞内的YAP表达受到抑制。在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况。同时，通过细胞成球实验、传代实验，观察YAP敲降后对细胞成球能力及其传代能力的影响。在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用pcDNA3-YAP-HA质粒来转染细胞，使细胞过表达YAP。在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况。同时，通过细胞成球实验、传代实验，观察YAP过表达后对细胞成球能力及其传代能力的影响。
Ⅱ、分化实验(DifferentiationAssay)：在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用YAP siRNA转染细胞，使细胞内的YAP表达受到抑制。在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况。同时，通过分化实验，观察YAP敲降后，毛细胞数目、细胞球数目、EdU+/Myo7a+毛细胞数目有何变化。在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用pcDNA3-YAP-HA质粒来转染细胞，使细胞过表达YAP。在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况。同时，通过分化实验，观察YAP过表达后，毛细胞数目、细胞球数目、EdU+/Myo7a+毛细胞数目有何变化。
如图2所示为Hippo信号调节Lgr5+祖细胞的球形形成能力。
三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制
实验内容：
1、在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用YAP siRNA转染细胞，使细胞内的YAP表达受到抑制。最后通过qPCR实验来定量分析YAP和Wnt信号通路相关蛋白β-catenin及其下游基因Lgr5，Axin2，SP5等的表达情况，并通过Westernblot实验进一步验证YAP、pYAP、β-catenin、p-β-catenin的表达量变化情况。
2、在Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗中分选出Lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用pcDNA3-YAP-HA质粒来转染细胞，使细胞过表达YAP。最后通过qPCR实验来定量分析YAP和Wnt信号通路相关蛋白β-catenin及其下游基因Lgr5，Axin2，SP5等的表达情况，并通过Westernblot实验进一步验证YAP、pYAP、β-catenin、p-β-catenin的表达量变化情况。
四、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo信号如何调控内耳干细胞，从而促进毛细胞再生
实验内容：
1、取2～3只P3的野生型小鼠，在解剖镜下进行解剖，小取出完整的耳蜗基底膜，进行培养，同时在培养液中加入适量的新霉素，特异性的损伤毛细胞；
2、在培养液中加入诱导或抑制YAP表达的病毒载体，感染耳蜗组织后使耳蜗细胞上调或下调YAP的表达。(注：此处可基于上述步骤1和步骤2的实验结果，选择诱导或抑制YAP表达的病毒载体进行实验)
3、在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，并通过Myo7a染色来观察毛细胞的再生情况。
五、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况
实验内容：
1、取2～3只P3的野生型小鼠，在解剖镜下进行解剖，小心取出完整的耳蜗基底膜，进行培养，同时在培养液中加入适量的新霉素，特异性的损伤毛细胞；
2、在培养液中加入诱导或抑制YAP表达的病毒载体，感染耳蜗组织后使耳蜗细胞上调或下调YAP的表达。
3、通过qPCR实验来定量分析Hippo信号通路相关蛋白及其相关上下游基因的表达情况，并通过Westernblot实验进一步验证相关蛋白(包括YAP、pYAP、β-catenin、p-β-catenin等)表达量变化情况。
六、研究DDK3对内耳干细胞的调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况
1、从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养。
2、再通过siRNA转染技术下调细胞中Dkk3基因的表达水平。
3、通过细胞成球实验，先敲低Dkk3，然后统计细胞球的数目和大小，从而观察对细胞成球能力的影响。
4、在培养的第2、3、4天的培养液中加入EdU来检测Lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况。同时，通过分化实验，观察敲低Dkk3后，毛细胞数目、细胞球数目、EdU+/Myo7a+毛细胞数目有何变化。
如图3所示为Hippo信号调节Ex Vivo全器官培养物中Lgr5+祖细胞的HC再生能力，如图4所示为Hippo信号调节Lgr5+祖细胞在新霉素处理的耳蜗中的增殖能力。
综上，本发明的方案可以概括如下：
一、在野生型小鼠耳蜗中检测Hippo信号通路成员的表达：使用RT-PCR、Westernblotting、Immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测Hippo信号通路中重要因子Yap1的表达。
二、在流式分选出的Lgr5阳性内耳干细胞中调控Hippo信号通路：解剖出Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出Lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，调控Hippo或/和Wnt信号通路的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生。
三、在活体毛细胞新霉素损伤模型上，调控Hippo信号通路：通过筛选的一些小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控Hippo信号通路的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。
四、从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术下调细胞中Dkk3的表达水平，在体外培养的细胞中，通过成球实验和分化实验，研究Dkk3基因的作用。
通过上述技术方案，在体外实现通过小分子和病毒感染技术，促进内耳毛细胞的再生，为临床上由于毛细胞损伤导致的听觉障碍提供新的治疗思路和方法。
本发明使用Lgr5-EGFP-CreERT2工具鼠可使得内耳干细胞(Lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠Lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究Hippo信号通路对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究Hippo信号通路在调控内耳干细胞增殖/分化及毛细胞再生中的具体作用机制。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (6)
1.Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，包括以下步骤；
一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况；
二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制；
三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制；
四、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo信号如何调控内耳干细胞，从而促进毛细胞再生；
五、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况；
六、研究DDK3对内耳干细胞的调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况。
2.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤一中的检测方法为：使用RT-PCR、Western blotting、Immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测Hippo信号通路中重要因子Yap1的表达。
3.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤二的研究方法为：解剖出Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出Lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，调控Hippo或/和Wnt信号通路的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生。
4.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤三的研究方法为：通过筛选的一些小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控Hippo信号通路的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。
5.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤六的研究方法为：从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术下调细胞中Dkk3的表达水平，在体外培养的细胞中，通过成球实验和分化实验，研究Dkk3基因的作用。
6.Hippo在毛细胞再生中的应用，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述的Hippo信号通路，将Hippo信号通路应用在毛细胞再生中。
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