CN112867511A - 用于治疗眼咽肌营养不良(opmd)的方法 - Google Patents

用于治疗眼咽肌营养不良(opmd)的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及施用基因治疗构建体的方法，该基因治疗构建体包括RNA干扰(RNAi)试剂，例如短发夹微小RNA(shmiR)，以及PABPN1替代试剂，例如编码未被RNAi试剂靶向的功能性PABPN1蛋白的多核苷酸，用于治疗患有OPMD或易患OPMD的个体的眼咽肌营养不良(OPMD)。在某些方面，该方法包括直接注射至受试对象的咽肌。

Description

用于治疗眼咽肌营养不良(OPMD)的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月17日提交的美国临时No.62/747,089的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于在患有OPMD或对其易感的个体中治疗眼咽肌营养不良(OPMD)的方法。
背景技术
OPMD是一种常染色体显性遗传性，进展缓慢，迟发性退行性肌肉疾病。该病的主要特征是进行性眼睑下垂(上睑下垂)和吞咽困难(噎膈)。咽肌和环咽肌是OPMD的特定靶点。近端肢体无力倾向于在疾病进展的较晚阶段随之而来。引起该疾病的突变是多聚(A)结合蛋白核1(PABPN1)编码区中的(GCN)n三核苷酸重复的异常扩增。这种扩增导致PABPN1蛋白N端的聚丙氨酸束扩增：正常蛋白中存在10个丙氨酸，扩增到11至18个突变形式的丙氨酸(expPABPN1)。该疾病的主要病理标志是expPABPN1的核聚集体。扩增的PABPN1的错误折叠导致不溶性聚合物纤维状聚集体在受影响细胞的核内累积。PABPN1是一种易聚集的蛋白，在OPMD中突变的丙氨酸扩增的PABPN1具有比野生型正常蛋白更高的聚集率。然而，仍然不清楚OPMD中的核聚集体是否由于细胞防御机制而具有病理功能或保护作用。
目前没有药理学或其他治疗可用于OPMD。有症状的手术干预可以部分矫正上睑下垂并改善中度至严重患病个体的吞咽功能。例如，环咽肌切开术目前是可用于改善这些患者吞咽功能的唯一可能的治疗。然而，这并不能纠正咽肌***的进行性退化，其通常会导致吞咽困难和窒息后死亡。
因此，仍然需要治疗剂来治疗患有OPMD和/或易患OPMD的患者。
发明内容
本发明部分基于本发明人的认识，即目前不存在用于治疗OPMD的批准的治疗剂。因此，本发明提供了靶向引起OPMD的PABPN1 mRNA转录物区域的RNAi试剂的施用方法。此外，本发明提供了用于施用用于表达具有并非由本发明的RNAi试剂靶向的mRNA转录物的野生型人PABPN1蛋白的试剂的方法(以下简称“PABPN1替代试剂”)。
本发明的某些方面涉及用于治疗患有眼咽肌营养不良(OPMD)的受试对象的方法，该方法包括向受试对象施用组合物，该组合物包括：
(a)包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列的核酸；以及
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被核酸编码的shmiR靶向的mRNA转录物；其中通过直接注射将该组合物施用到受试对象的咽肌来施用。
某些方面涉及一种抑制在受试对象中引起眼咽肌营养不良(OPMD)的PABPN1蛋白表达的方法，该方法包括给受试对象施用组合物，该组合物包括：
(a)一种ddRNAi构建体，包括包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列的核酸；以及
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物；其中通过直接注射将该组合物施用到受试对象的咽肌来施用。
在一个实例中，通过直接注射将组合物施用到受试对象的咽肌来改善受试对象吞咽功能。
在一个实例中，组合物包括表达载体(vector)，该表达载体(vector)包括ddRNAi构建体、PABPN1构建体或其组合。
在一个实例中，表达载体(vector)在5’至3’方向包括ddRNAi构建体和PABPN1构建体。
在一个实例中，表达载体(vector)在5’至3’方向包括PABPN1构建体和ddRNAi构建体。
在一个实例中，表达载体(vector)是质粒或微环。
在一个实例中，表达载体(vector)是选自腺相关病毒(AAV)载体(vector)、逆转录病毒载体(vector)、腺病毒(AdV)载体(vector)和慢病毒(LV)载体(vector)组成的组的病毒载体(vector)。例如，表达载体(vector)可以是AAV载体(vector)，例如，来自血清型AAV2、AAV8或AAV9的AAV。
在一个实例中，核酸、ddRNAi构建体和/或PABPN1构建体由表达构建体组成，并且表达构建体包括来自AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)。
在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被核酸或ddRNAi构建体编码的shmiR靶向。例如，编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列可以是SEQ ID NO：73所示的DNA序列。
在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列与包括在PABPN1构建体内并位于编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列上游的启动子可操作地连接。例如，包括在PABPN1构建体中的启动子可以是肌肉特异性启动子。
在一个实例中，核酸包括编码靶向人PABPN1的RNA转录物的shmiR的DNA序列，其中shmiR包括：
长度至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；以及
初级微小RNA(pti-miRNA)骨架；
其中效应子序列与人PABPN1的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。例如，效应子序列可以与SEQ ID NO：87所示序列中相应长度的区域(即，编码人PABPN1的信使RNA转录物)基本上互补。
在一些实例中，核酸包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：
长度至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；以及
pri-miRNA骨架；
其中效应子序列与SEQ ID NO：1-13中任一个所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
优选地，效应子序列的长度小于30个核苷酸。例如，合适的效应子序列的长度可以在17-29个核苷酸的范围内。优选地，效应子序列的长度为20个核苷酸。更优选效应子序列长度为21个核苷酸，效应子互补序列长度为20个核苷酸。
在某些实例中，由核酸编码的shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13)中任一个所示的序列或由其中任一个所示的序列组成。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ IDNO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQID NO：1-13任一个所示序列或由SEQ ID NO：1-13任一个所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。当存在错配时，优选它们不位于对应于shmiR的种子区，即效应子序列的第2-8位核苷酸的区域内。
可用于本发明的方法的示例性核酸可包括编码具有表2中的效应子/效应子互补序列组合的shmiR的DNA序列。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：14所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：15所示效应子序列和SEQ ID NO：14所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：16所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：17所示效应子序列和SEQ ID NO：16所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：18所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：19所示效应子序列和SEQ ID NO：18所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：20所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：21所示效应子序列和SEQ ID NO：20所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：22所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：23所示效应子序列和SEQ ID NO：22所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：24所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：25所示效应子序列和SEQ ID NO：24所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：26所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：27所示效应子序列和SEQ ID NO：26所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：28所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：29所示效应子序列和SEQ ID NO：28所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：30所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：31所示效应子序列和SEQ ID NO：30所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：32所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：33所示效应子序列和SEQ ID NO：32所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：34所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：35所示效应子序列和SEQ ID NO：34所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：36所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：37所示效应子序列和SEQ ID NO：36所示效应子互补序列的shmiR。
在一个实例中，由核酸编码的shmiR是包括与SEQ ID NO：38所示序列基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，包括SEQ ID NO：39所示效应子序列和SEQ ID NO：38所示效应子互补序列的shmiR。
在一个示例中，shmiR在5’至3’方向上包括：
pri-miRNA骨架的5’侧翼序列；
效应子互补序列；
茎环序列；
效应子序列；以及
pri-miRNA骨架的3’侧翼序列。
在一个示例中，shmiR在5’至3’方向上包括：
pri-miRNA骨架的5’侧翼序列；
效应子序列；
茎环序列；
效应子互补序列；以及
pri-miRNA骨架的3’侧翼序列。
在一个实例中，茎环序列可以是SEQ ID NO：40所示的序列。
在一个实例中，pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架。例如，pri-miRNA骨架的5’侧翼序列可以是SEQ ID NO：41所示的序列，pri-miRNA骨架的3’侧翼序列可以是SEQ ID NO：42所示的序列。
可用于本发明的方法的示例性核酸可包括编码具有表3中的序列和/或由表4中的序列编码的shmiR的DNA序列。例如，由本发明的核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：43-55中任一个所示的序列。shmiR可以由SEQ ID NO：56-68中任一个所示的DNA序列编码。
在一些实例中，方法包括施用编码shmiR的至少两种核酸，或施用包括至少两种核酸的ddRNAi构建体，其中每种shmiR包括与对应于引起OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物基本上互补的效应子序列，并且其中每种shmiR包括不同的效应子序列。
至少两种核酸可以单独施用或在单一ddRNAi构建体中施用。在一个实例中，至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，至少两种核酸可选自以下组成的组：包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和SEQ ID NO：14(shmiR2)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16(shmiR3)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和SEQ ID NO：20(shmiR5)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和SEQ ID NO：26(shmiR9)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32(shmiR14)所示的效应子互补序列；以及包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
在一个实例中，至少两种核酸选自由以下组成的组：包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸；和包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，至少两种核酸中的每一种编码包括与SEQ ID NO：2、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。例如，至少两种核酸可选自以下组成的组：包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16(shmiR3)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32(shmiR14)所示的效应子互补序列；以及包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
在一个实例中，至少两种核酸选自由以下组成的组：包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸；和包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
在一例中，该至少两种核酸或包括其的ddRNAi构建体包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
在一例中，该至少两种核酸或包括其的ddRNAi构建体
(a)包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；以及
(b)包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
在本文任何实例中描述的组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的载体(carrier)。
在一些实例中，其中咽肌包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽鼓管咽肌、茎突咽肌或其任何组合中的一个或多个
根据一个具体实例，本发明提供用于向有需要的受试对象的咽肌施用DNA构建体的方法，该DNA构建体包括：
(a)如本文所述的ddRNAi构建体；以及
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物。优选地，编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。在一个实例中，功能性PABPN1蛋白是野生型人PABPN1蛋白，例如具有SEQ ID NO：74所示的序列。在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的DNA序列在SEQ ID NO：73中示出。在一些实施方案中，DNA构建体可包括一个或多个启动子。用于本发明的DNA构建体的示例性启动子是肌肉特异性启动子，例如Spc512和CK8。在一些实施方案中，DNA构建体包括可操作地连接至PABPN1构建体和ddRNAi构建体的启动子，其中启动子位于PABPN1构建体和ddRNAi构建体的上游。
在一些实施方案中，DNA构建体在5’至3’方向上包括：
(a)肌肉特异性启动子，例如，Spc512；
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的本文所述的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物；以及
(c)包括包括编码本文所述的shmiR13的DNA序列的核酸和包括编码本文所述的shmiR17的DNA序列的核酸的本发明的ddRNAi构建体。
在一些实施方案中，咽肌包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽鼓管咽肌、茎突咽肌或其任何组合中的一个或多个。
附图说明
图1A是说明构建体的示意图，，该构建体用于同时使内源PABPN1基因沉默和用密码子优化的PABPN1替代，密码子优化的PABPN1通过将靶向wtPABPN1的两个shmiR亚克隆到两个pAAV2 ITR之间的密码子优化的PABPN1转录物的3’非翻译区中而产生。
图1B是说明“沉默和替代”构建体(SR-构建体)的示意图，该构建体设计用于同时使内源PABPN1基因沉默和用密码子优化的PABPN1替代，该密码子优化的PABPN1通过将靶向wtPABPN1的两个shmiR(shmiR17和shmiR13)亚克隆到pAAV2载体(vector)骨架中密码子优化的PABPN1转录物的3’非翻译区中而产生。
图1C示出了包括5’侧翼区、siRNA有义链；茎/环连接序列、siRNA反义链和3’侧翼区的代表性shmiR构建体的预测二级结构。
图2是示出SR构建体的示意图。在SR-构建体中，“替代”和“沉默”盒全部***具有Spc512肌肉特异性启动子的单一载体(vector)中。将两个shmiR序列***密码子优化的PABPN1盒的3’UTR中。
图3A显示了在注射SR-构建体的A17小鼠的(胫骨前肌)TA肌肉中shRNA的表达。SR构建体给药后14周，从TA样本中提取RNA。
图3B显示了在用SR-构建体处理的A17小鼠的TA肌肉中PABPN1表达(包括expPABPN1)的沉默。SR构建体给药后14周，从TA样本中提取RNA。
图3C说明了在用SR-构建体处理后，A17小鼠模型中正常PABPN1水平的恢复。SR-构建体给药后14周，从TA肌肉样本中提取RNA。
图4A显示了具有SR构建体剂量效应的包括PABPN1的不溶性聚集体(核内内含物(INI))的形成显著减少。将SR构建体注射到A17小鼠的TA肌肉中。SR构建体给药后14周，收集肌肉并固定用于组织学研究。对于PABPN1的免疫荧光显示为绿色，而对于层粘连蛋白的免疫荧光显示为红色。
图4B显示肌肉切片中含有INI的细胞核百分比的定量，表明与未处理的A17 TA肌肉相比，用SR-构建体处理显著降低了INI的量(用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验(One-way Anova test)，*p＜0.001，ns：不显著)。
图5A显示A17小鼠TA肌肉产生的最大力量以SR构建体剂量依赖的方式显著增加。采用原位肌肉生理学方法测量最大力值。
图5B显示了A17小鼠经SR构建处理的TA肌肉的肌肉重量与体重(BW)的归一化。每TA注射剂量在1e10 Vg以上时，归一化肌重与对照组FvB小鼠的相当(平均值±SEM，n＝10，使用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验，*p＜0.05，**p＜0.001，*p＜0.01，ns：不显著)。
图6A显示SR-构建体给药后14周，A17小鼠的TA肌肉产生的最大力。采用原位肌肉生理学方法测量最大力值。
图6B显示SR-构建体给药后20周，A17小鼠的TA肌肉产生的最大力。采用原位肌肉生理学方法测量最大力值。
图7A显示SR-构建体向绵羊咽肌中直接注射。
图7B显示了使用可放射乳膏剂的影像图像，显示了有“误入”风险的人OPMD患者的严重吞咽困难。
序列表的关键字
SEQ ID NO：1：对应于称为PABPN1 mRNA区域2的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：2：对应于称为PABPN1 mRNA区域3的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：3：对应于称为PABPN1 mRNA区域4的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：4：对应于称为PABPN1 mRNA区域5的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：5：对应于称为PABPN1 mRNA区域6的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：6：对应于称为PABPN1 mRNA区域7的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：7：对应于称为PABPN1 mRNA区域9的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：8：对应于称为PABPN1 mRNA区域11的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：9：对应于称为PABPN1 mRNA区域13的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：10：对应于称为PABPN1 mRNA区域14的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：11：对应于称为PABPN1 mRNA区域15的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：12：对应于称为PABPN1 mRNA区域16的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：13：对应于称为PABPN1 mRNA区域17的PABPN1蛋白的mRNA转录物区域的RNA序列。
SEQ ID NO：14：命名为shmiR2的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：15：命名为shmiR2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：16：命名为shmiR3的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：17：命名为shmiR3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：18：命名为shmiR4的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：19：命名为shmiR4的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：20：命名为shmiR5的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：21：命名为shmiR5的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：22：命名为shmiR6的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：23：命名为shmiR6的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：24：命名为shmiR7的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：25：命名为shmiR7的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：26：命名为shmiR9的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：27：命名为shmiR9的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：28：命名为shmiR11的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：29：命名为shmiR11的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：30：命名为shmiR13的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：31：命名为shmiR13的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：32：命名为shmiR14的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：33：命名为shmiR14的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：34：命名为shmiR15的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：35：命名为shmiR15的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：36：命名为shmiR16的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：37：命名为shmiR16的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：38：命名为shmiR17的shmiR的RNA效应子互补序列。
SEQ ID NO：39：命名为shmiR17的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：40：shmiR的RNA茎环序列
SEQ ID NO：41：pri-miRNA骨架的5’侧翼序列。
SEQ ID NO：42：pri-miRNA骨架的3’侧翼序列
SEQ ID NO：43：命名为shmiR2的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：44：命名为shmiR3的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：45：命名为shmiR4的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：46：命名为shmiR5的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：47：命名为shmiR6的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：48：命名为shmiR7的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：49：命名为shmiR9的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：50：命名为shmiR11的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：51：命名为shmiR13的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：52：命名为shmiR14的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：53：命名为shmiR15的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：54：命名为shmiR16的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：55：命名为shmiR17的shmiR的RNA效应子序列。
SEQ ID NO：56：编码命名为shmiR2的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：57：编码命名为shmiR3的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：58：编码命名为shmiR4的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：59：编码命名为shmiR5的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：60：编码命名为shmiR6的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：61：编码命名为shmiR7的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：62：编码命名为shmiR9的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：63：编码命名为shmiR11的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：64：编码命名为shmiR13的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：65：编码命名为shmiR14的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：66：编码命名为shmiR15的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：67：编码命名为shmiR16的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：68：编码命名为shmiR17的shmiR的DNA序列。
SEQ ID NO：69：编码肌肉特异性CK8启动子控制下的shmiR3和shmiR14和Spc512控制下的密码子优化的PABPN1的双构建体版本1的DNA序列
SEQ ID NO：70：编码肌肉特异性CK8启动子控制下的shmiR17和shmiR13和Spc512控制下的密码子优化的PABPN1的双构建体版本1的DNA序列
SEQ ID NO：71：在Spc512的控制下，编码coPABPN1和被称为shmiR3和shmiR14的shmiR的双构建体版本2的DNA序列。
SEQ ID NO：72：在Spc512的控制下，编码coPABPN1和命名为shmiR17和shmiR13的shmiR的双构建体版本2的DNA序列。
SEQ ID NO：73：人密码子优化的PABPN1 cDNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO：74：密码子优化的人PABPN1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：75：具有FLAG标签的野生型人PABPN1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：76：具有FLAG标签的经密码子优化的人PABPN1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：77：命名为wtPABPN1-Fwd的引物的DNA序列。
SEQ ID NO：78：命名为wtPABPN1-Rev的引物的DNA序列
SEQ ID NO：79：命名为wtPABPN1-探针的探针的DNA序列
SEQ ID NO：80：命名为optPABPN1-Fwd的引物的DNA序列
SEQ ID NO：81命名为optPABPN1-Rev的引物的DNA序列
SEQ ID NO：82命名为optPABPN1-探针的探针的DNA序列
SEQ ID NO：83命名为shmiR3-FWD的引物的DNA序列
SEQ ID NO：84命名为shmiR13-FWD的引物的DNA序列
SEQ ID NO：85命名为shmiR14-FWD的引物的DNA序列
SEQ ID NO：86命名为shmiR17-FWD的引物的DNA序列
SEQ ID NO：87：编码野生型人PABPN1蛋白的RNA序列
SEQ ID NO：88：AAV VP1的经修饰的磷脂酶A2(PLA2)结构域的共有序列
SEQ ID NO：89：AAV8的经修饰的PLA2结构域
SEQ ID NO：90：AAV9的经修饰的PLA2结构域
具体实施方式
概要
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，引用单个步骤、特征、物质组成、步骤组特征组、或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或更多个)那些步骤、特征、物质组成、步骤组、特征组、或物质组成组。
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
本发明不限于本文描述的特定实施例的范围，这些实施例仅用于示例性目的。功能上等同的产物、组合物和方法清楚地在本发明的范围内。
除非另外具体说明，否则应对其加以必要的变更后适用于本发明的任何其他实例。
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有说明，本发明中使用的重组DNA、重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在以下来源文献中都有描述和解释，例如，J.Perbal，《分子克隆实用指南》(APractical Guide to Molecular Cloning)，John Wileyand Sons(1984)，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编)，《基本分子生物学：一种实用的方法》(Essential Molecular Biology：A PracticalApproach)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，《DNA克隆：一种实用的方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，1-4卷，IRLPress(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人，(编)，《分子生物学现行实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编)，《抗体：实验室手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)，以及J.E.Coligan等人，(编)，《免疫学现行实验指南》(Current Protocols in Immunology)，John Wiley&Sons(包括目前为止的所有更新)。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体应理解为暗示包括所述的步骤或元件或整数，或步骤或元件或整数组，但不排除任何其他步骤或元件或整数或元素或整数组。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应理解为提供对两种含义或任一含义的明确支持。
选定的定义
“RNA”是指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2’位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸物质，例如添加到siNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“RNA干扰”或“RNAi”通常是指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子引发的基因表达的RNA依赖性沉默。dsRNA分子减少或抑制靶核酸序列的转录产物，从而使基因沉默或减少该基因的表达。
如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指具有双链体结构并包括彼此长度相似的效应子序列和效应子互补序列的RNA分子。效应子序列和效应子互补序列可以是单一RNA链或分开的RNA链。“效应子序列”(通常称为“引导链”)与靶序列基本上互补，靶序列在本发明中是PABPN1 mRNA转录物的区域。“效应子序列”也可称为“反义序列”。“效应子互补序列”将与效应子序列充分互补，使得其可与效应子序列退火以形成双链体。在这点上，效应子互补序列将与靶序列的区域基本上同源。对于本领域技术人员显而易见的是，术语“效应子互补序列”也可称为“效应子序列的补体”或有义序列。
如本文所用，术语“双链体”是指在单链核酸(例如RNA)的两个互补或基本上互补的核酸(例如RNA)中的区域，或在彼此形成碱基对的单链核酸(例如RNA)的两个互补或基本上互补的区域中的区域，通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或允许互补或基本上互补的核苷酸序列之间的稳定双链体的任何其他方式。本领域技术人员将理解，在双链体区域内，不需要100％互补性；实质互补性是允许的。实质互补性包括可包括79％或更大互补性。例如，由19个碱基对组成的双链体区域中的单一错配(即，共同配对，18个碱基对和一个错配)导致94.7％的互补性，使得双链体区域基本上互补。在另一个实例中，在由19个碱基对组成的双链体区域中的两个错配(即，17个碱基对和两个错配)导致89.5％的互补性，使得双链体区域基本上互补。在另一个实例中，由19个碱基对组成的双链区的3个错配(即，16个碱基对和3个错配)导致84.2％的互补性，使得双链区基本上互补，等等。
dsRNA可以作为发夹或茎环结构提供，其具有由效应子序列和效应子互补序列构成的双链体区域，效应子序列和效应子互补序列通过称为茎环的至少2个核苷酸序列连接。当dsRNA以发夹或茎环结构提供时，其可以被称为“发夹RNA”或“短发夹RNAi剂”或“shRNA”。在发夹结构或茎环结构中提供的或产生发夹结构或茎环结构的其他dsRNA分子包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和前体微小RNA(pre-miRNA)。pre-miRNA shRNA可以通过Drosha和Pasha酶的作用从pri-miRNA天然产生，Drosha和Pasha酶识别并释放形成茎-环结构的初级miRNA转录物的区域。或者，pri-miRNA转录物可被工程化以用人工/重组茎-环结构替代天然茎-环结构。即，可以将人工/重组茎-环结构***或克隆到缺乏其天然茎-环结构的pri-miRNA骨架序列中。在设计为表达pri-miRNA分子的茎环序列的情况下，Drosha和Pasha识别并释放人工shRNA。使用该方法产生的dsRNA分子称为“shmiRNA”、“shmiR”或“微小RNA框架shRNA”。
如本文所用，关于序列的术语“互补”是指与通过沃森-克里克碱基配对的序列的互补，由此鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，并且腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)配对。一个序列可以与另一个序列的全长互补，或者它可以与另一个序列的特定部分或长度互补。本领域技术人员将认识到，U可存在于RNA中，并且T可存在于DNA中。因此，RNA或DNA序列中的任一个内的A可与RNA序列中的U或DNA序列中的T配对。本领域技术人员还将认识到RNA中存在的G可以与RNA中的C或U配对。
如本文所用，术语“基本上互补”用于指示足够程度的互补性或精确配对，使得稳定和特异性结合发生在核酸序列之间，例如发生在效应子序列和效应子互补序列之间，或发生在效应子序列和靶序列之间。应理解核酸序列不必与其靶序列或互补序列100％互补。该术语涵盖与除突出端之外的另一序列互补的序列。在一些情况下，除1-2个错配外，该序列与另一个序列互补。在一些情况下，除1个错配外，序列是互补的。在一些情况下，除2个错配外，序列是互补的。在其他情况下，除3个错配外，序列是互补的。在还有的其他情况下，除4个错配外，序列是互补的。
在本发明的shRNA或shmiR的上下文中使用的术语“编码的”应理解为意指能够从DNA模板转录的shRNA或shmiR。因此，编码或为本发明的shRNA或shmiR编码的核酸将包括用作转录相应shRNA或shmiR的模板的DNA序列。
术语“DNA指导的RNAi构建体”或“ddRNAi构建体”是指包括DNA序列的核酸，DNA序列在转录时产生引起RNAi的shRNA或shmiR分子(优选shmiR)。ddRNAi构建体可以包括转录为能够自退火成发夹结构的单个RNA的核酸，发夹结构具有通过至少2个核苷酸的茎环连接的双链体区域，即shRNA或shmiR，或转录为具有多个shRNA或shmiR的单个RNA，或转录为各自能够分别折叠为单个shRNA或shmiR的多个RNA转录物。可以在包括一种或多种另外的DNA序列的较大“DNA构建体”内提供ddRNAi构建体。例如，可以在包括编码功能性PABPN1蛋白的另外的DNA序列的DNA构建体中提供ddRNAi构建体，功能性PABPN1蛋白已经被密码子优化，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。ddRNAi构建体和/或包括该构建体的DNA构建体可在与启动子可操作连接的表达载体(vector)(例如质粒)内。
如本文所用，术语“可操作连接的”或“可操作连接”(或类似)意指编码核酸序列以促进编码序列表达的方式连接至调节序列(例如启动子)或与调节序列(例如启动子)缔合。调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件，它们是本领域公知的并被选择用于指导编码序列的表达。
“载体(vector)”应理解为是指将核酸引入细胞的载体(vehicle)。载体(vector)包括但不限于衍生自病毒或细菌来源的质粒、噬菌粒、病毒、细菌和载体(vehicle)。“质粒”是环状双链DNA分子。根据本发明使用的有用类型的载体(vector)是病毒载体(vector)，其中将异源DNA序列***到可以被修饰以缺失一个或多个病毒基因或其部分的病毒基因组中。某些载体(vector)能够在宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体(vector))。其他载体(vector)可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。如本文所用，术语“表达载体(vector)”应理解为意指能够表达本发明的RNA分子的载体(vector)。
“功能性PABPN1蛋白”应理解为是指具有野生型PABPN1蛋白的功能特性的PABPN1蛋白，例如，在哺乳动物细胞中控制mRNA聚腺苷酸化和/或内含子剪接位点的能力。因此，“功能性PABPN1蛋白”应理解为当在受试对象中表达或存在时不会引起OPMD的PABPN1蛋白。在一个实例中，本文提及的“功能性PABPN1蛋白”是指人野生型PABPN1蛋白。人野生型PABPN1蛋白的序列在NCBI RefSeq NP_004634中给出。因此，功能性人PABPN1蛋白可具有NCBI RefSeq NP_004634中列出的人PABPN1蛋白的体内功能特性。
如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”及其变化形式是指设计用于在临床病理过程期间改变所治疗个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的期望效果包括降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。因此，OPMD的治疗包括降低或抑制受试对象中引起OPMD的PABPN1蛋白的表达和/或在受试对象中表达具有正常长度的聚丙氨酸残基的PABPN1蛋白。优选地，OPMD的治疗包括降低或抑制受试对象中引起OPMD的PABPN1蛋白的表达和/或在受试对象中表达具有正常长度的聚丙氨酸残基的PABPN1蛋白。例如，如果实现上述治疗结果中的一个或多个，则成功地“治疗”个体。
“治疗有效剂量”至少是使OPMD病情有明显改善所需的最低浓度或量，例如OPMD的一个或多个症状(包括但不限于受试对象的上睑下垂、吞咽困难和肌肉无力)的明显改善。本文的治疗效应量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的能力，以在个体中引起期望的反应和/或表达载体(vector)在受试对象中表达功能性PABPN1蛋白的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的任何毒性或有害作用超过shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的治疗有益作用的量，以在受试对象中抑制、压制或减少引起OPMD的PABPN1蛋白的表达(单独考虑或与功能性PABPN1蛋白的表达组合考虑)。
如本文所用，“受试对象”或“患者”可以是患有OPMD或在遗传上倾向于OPMD的人或非人动物，即，具有引起OPMD的PABPN1基因变体的人或非人动物。“非人类动物”可以是灵长类动物、家畜(例如羊、马、牛、猪、驴)、同伴动物(例如狗和猫等宠物)、实验室实验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼)、性能动物(例如赛马、骆驼、灰狗)或圈养野生动物。在一个实例中，受试对象或患者是哺乳动物。在一个实例中，受试对象或患者是人。
术语“表达降低”、“降低表达”或类似术语是指靶基因(例如，PABPN1基因)的蛋白和/或mRNA产物的水平不存在或可观察到降低。降低不必是绝对的，但可以是部分降低，足以导致由shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括本发明的这些的组合物引起的RNAi的可检测或可观察到的变化。降低可以通过测定来自靶核酸的mRNA和/或蛋白产物的水平相对于缺乏shmiR、编码shmiR的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)或包括其的组合物的细胞的降低来测量，并且可以低至1％、5％或10％，或可以是绝对的，即100％抑制。降低的效果可以通过检查细胞或生物体的外向特性(即，细胞或生物体的定量和/或定性表型)来测定，并且还可以包括在本发明的shmiR、编码shmiR的核酸，ddRNAi构建体，DNA构建体，表达载体(vector)或包括其的组合物给药之后，检测细胞或生物体中expPABPN1的核聚集体的存在或核聚集体的量的变化。
如本文所用，“递送***”是指用于包装外来遗传物质如DNA或RNA的载体(vector)，并且其可被引入细胞中。递送***可以包括病毒载体(vector)，例如，腺病毒相关病毒(AAV)载体(vector)、逆转录病毒载体(vector)、腺病毒载体(vector)(AdV)和慢病毒(LV)载体(vector)。如本文所述，病毒载体(vector)可用于在细胞中递送和表达外源遗传物质。因此，本文所述的病毒表达载体(vector)可用作递送***。
如本文所用的“咽肌”是指形成咽的一组或多组肌肉。咽肌可以包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽喉肌和/或茎突咽肌中的一个或多个。
治疗方法
本发明的某些方面涉及向有需要的人类受试对象施用一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***或包括与本文所述相同的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***的组合物、其用于治疗受试对象和/或抑制内源性PABPN1蛋白(包括引起OPMD的PABPN1蛋白)的表达，在受试对象中，其中通过直接注射到受试对象的咽肌施用组合物。
在一些实施方案中，如本文所述的一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***或包括其的组合物可用于治疗患有OPMD的受试对象中的OPMD。类似地，如本文所述的一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***或包括它们的组合物可用于在患有或易患OPMD的受试对象中预防OPMD的一种或多种症状的发展或进展。
在一些实施方案中，在通过直接注射至受试对象的咽肌而施用如本文所述的一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***或包括它们的组合物之后，受试对象的吞咽功能改善。
在某些实施方案中，本发明的表达载体(vector)和/或组合物可以包括本发明的ddRNAi构建体和编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸。因此，表达载体(vector)或组合物的给药可以有效地(i)抑制、降低或敲除内源PABPN1的表达，包括包括引起OPMD的扩增的聚丙氨酸束的PABPN1蛋白，和(ii)提供功能性PABPN1蛋白的表达，功能性PABPN1蛋白不被抑制、降低或敲除内源PABPN1表达的shmiR或shRNA靶向。因此，本发明的组合物可以在施用其的细胞或动物中恢复PABPN1蛋白功能，例如RNA的转录后加工。
在某些实施方案中，OPMD的治疗可以包括通过直接注射至受试对象的咽肌单独给受试对象施用(i)一种或多种用于抑制引起OPMD的PABPN1蛋白表达的试剂，和(ii)包括编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸的表达载体(vector)或包括其的组合物。如本文，用于抑制引起OPMD的PABPN1蛋白的表达的一种或多种试剂可以是核酸、ddRNAi构建体、包括如本文所述的核酸、ddRNAi构建体的表达载体(vector)或包括其的组合物，或其任何一种或多种的多个。受试对象可以一起、同时或连续施用组分(i)和(ii)。
在一些实施方案中，OPMD的治疗可以包括通过直接注射至受试对象的咽肌施用编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸，其中受试对象先前已经被施用一种或多种用于抑制引起OPMD但不抑制密码子优化的核酸的表达的PABPN1蛋白的表达的药剂。例如，受试对象可以先前已经被施用了核酸、ddRNAi构建体、包括如本文所述的核酸、ddRNAi构建体的表达载体(vector)或包括其的组合物，或其任何一种或多种的多个。
在一些实施方案中，给药途径是IM(例如，直接注射至受试对象的咽肌)，并且实现向肌肉组织的有效递送和编码本发明的PABPN1的ddRNAi构建体和/或密码子优化的核酸的转染，以及其中shmiR或shRNA和/或密码子优化的核酸的表达。
用于任何特定患者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：采用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；核酸，ddRNAi构建体，DNA构建体，包括如本文所述的核酸、ddRNAi构建体的表达载体(vector)或包括其的组合物，或其任何一种或多种的多个的螯合速率，治疗持续时间以及其他相关因素。
核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体、表达载体(vector)、递送***或包括其的组合物减少或抑制引起OPMD的PABPN1蛋白的表达并表达不引起OPMD的功能性PABPN1蛋白的量足以恢复PABPN1功能的有效性可以通过评估治疗受试对象的肌肉收缩特性和/或吞咽困难来测定。用于测试吞咽能力和肌肉收缩特性的方法是本领域已知的。例如，吞咽困难可以使用电视透视检查、UGI内窥镜或食道测压和阻抗测试来评估。用于评估OPMD的临床特征的其他方法描述于Rüegg等人，(2005)《瑞士医学周刊》(Swiss Medical Weekly)，135：574-586。
用于RNAi的试剂
如本文所述，可用于本发明的方法的核酸包括编码靶向人PABPN1的信使RNA转录物的区域的短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列，其中shmiR包括：
长度至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；以及
初级微小RNA(pri-miRNA)骨架；
其中效应子序列与人PABPN1的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。例如，效应子序列可以与SEQ ID NO：87所示序列中相应长度的区域基本上互补。在一些实例中，本发明提供了包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括：
长度至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；以及
pri-miRNA骨架；
其中效应子序列与SEQ ID NO：1-13中任一个所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。优选地，效应子序列的长度小于30个核苷酸。例如，合适的效应子序列的长度可以在17-29个核苷酸的范围内。在特别优选的实例中，效应子序列长度为21个核苷酸。更优选效应子序列长度为21个核苷酸，效应子互补序列长度为20个核苷酸。
在某些实施方案中，shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13)中任一个所示的序列或由其中任一个所示的序列组成。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列或由SEQ ID NO：1-13中任一个所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ IDNO：1-13任一个所示序列或由SEQ ID NO：1-13任一个所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域i00％互补。
在一个实例中，shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ IDNO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：9所示的序列或由SEQ ID NO：9所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ ID NO：9所示序列或由SEQ ID NO：9所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。
在一个实例中，shmiR包括与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补的效应子序列，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含4个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含3个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含2个错配碱基。例如，效应子序列可以与RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，RNA转录物包括SEQ ID NO：13所示的序列或由SEQ ID NO：13所示的序列组成，并且相对于RNA转录物含1个错配碱基。例如，效应子序列可以与包括SEQ ID NO：13所示序列或由SEQ ID NO：13所示序列组成的RNA转录物中的相应长度的区域100％互补。
根据一个实例，其中本发明的shmiR的效应子序列与本文所述的PABPN1 miRNA转录物中的相应长度的区域基本上互补并且相对于其包括1、2、3或4个错配碱基，优选错配不位于对应于shmiR种子区，即效应子序列的第2-8位核苷酸的区域内。
在一些实施方案中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：14所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：14所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和与SEQ ID NO：15所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：15所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：14所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR2”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：16所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：16所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和与SEQ ID NO：17所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：17所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：16所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR3”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：18所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：18所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：19所示的效应子序列和与SEQ ID NO：19所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：19所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：18所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR4”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：20所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：20所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和与SEQ ID NO：21所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：21所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：20所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR5”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：22所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：22所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：23所示的效应子序列和与SEQ ID NO：23所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：23所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：22所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR6”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：24所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：24所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：25所示的效应子序列和与SEQ ID NO：25所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：25所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：24所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR7”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：26所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：26所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和与SEQ ID NO：27所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：27所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：26所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR9”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：28所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：28所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：29所示的效应子序列和与SEQ ID NO：29所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：29所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：28所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR11”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：30所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：30所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：31所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：30所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR13”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：32所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：32所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和与SEQ ID NO：33所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：33所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：32所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR14”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：34所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：34所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：35所示的效应子序列和与SEQ ID NO：35所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：35所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：34所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR15”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：36所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：36所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：37所示的效应子序列和与SEQ ID NO：37所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：37所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：36所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR16”。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括编码shmiR的DNA序列，shmiR包括：(i)除了1、2、3或4个碱基错配外与SEQ ID NO：38所示序列基本上互补的效应子序列，条件是效应子序列能够与SEQ ID NO：38所示序列形成双链体；和(ii)效应子互补序列，其包括与效应子序列基本上互补的序列。例如，由核酸编码的shmiR可以包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本上互补并且能够与其形成双链体的效应子互补序列。与SEQ ID NO：39所示序列基本上互补的效应子互补序列可以是SEQ ID NO：38所示序列。根据本实例的shmiR在下文中称为“shmiR17”。
在本文所述的任何实例中，由本发明的核酸编码的shmiR可以在5’至3’方向包括：
pri-miRNA骨架的5’侧翼序列；
效应子互补序列；
茎环序列；
效应子序列；以及
pri-miRNA骨架的3’侧翼序列。
在本文所述的任何实例中，由本发明的核酸编码的shmiR可以在5’至3’方向包括：
pri-miRNA骨架的5’侧翼序列；
效应子序列；
茎环序列；
效应子互补序列；以及
pri-miRNA骨架的3’侧翼序列。
合适的环序列可以选自本领域已知的那些。然而，示例性茎环序列在SEQ ID NO：40中示出。
用于本发明的核酸的合适的初级微小RNA(pri-miRNA或pri-R)骨架可选自本领域已知的那些。例如，pri-miRNA骨架可选自pri-miR-30a骨架、pri-miR-155骨架、pri-miR-21骨架和pri-miR-136骨架。然而优选pri-miRNA骨架为pri-miR-30a骨架。根据pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架的实例，pri-miRNA骨架的5’侧翼序列在SEQ ID NO：41中示出，pri-miRNA骨架的3’侧翼序列在SEQ ID NO：42中示出。因此，编码本发明的shmiR(例如，本文所述的shmiR-1至shmiR-17)的核酸可以包括编码SEQ ID NO：41所示序列的DNA序列和编码SEQ ID NO：42所示序列的DNA序列。
在一个实例中，本文所述的核酸可包括选自SEQ ID NO：56-68中任一个所示序列的DNA序列。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：56所示的DNA序列或由SEQ IDNO：56所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：43所示的序列或由SEQ ID NO：43所示的序列组成的shmiR(shmiR2)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：57所示的DNA序列或由SEQ IDNO：57所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：44所示的序列或由SEQ ID NO：44所示的序列组成的shmiR(shmiR3)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：58所示的DNA序列或由SEQ IDNO：58所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：45所示的序列或由SEQ ID NO：45所示的序列组成的shmiR(shmiR4)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：59所示的DNA序列或由SEQ IDNO：59所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：46所示的序列或由SEQ ID NO：46所示的序列组成的shmiR(shmiR5)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：60所示的DNA序列或由SEQ IDNO：60所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：47所示的序列或由SEQ ID NO：47所示的序列组成的shmiR(shmiR6)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：61所示的DNA序列或由SEQ IDNO：61所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：48所示的序列或由SEQ ID NO：48所示的序列组成的shmiR(shmiR7)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：62所示的DNA序列或由SEQ IDNO：62所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：49所示的序列或由SEQ ID NO：49所示的序列组成的shmiR(shmiR9)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：63所示的DNA序列或由SEQ IDNO：63所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：50所示的序列或由SEQ ID NO：50所示的序列组成的shmiR(shmiR11)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：64所示的DNA序列或由SEQ IDNO：64所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：51所示的序列或由SEQ ID NO：51所示的序列组成的shmiR(shmiR13)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：65所示的DNA序列或由SEQ IDNO：65所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：52所示的序列或由SEQ ID NO：52所示的序列组成的shmiR(shmiR14)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：66所示的DNA序列或由SEQ IDNO：66所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：53所示的序列或由SEQ ID NO：53所示的序列组成的shmiR(shmiR15)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：67所示的DNA序列或由SEQ IDNO：67所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：54所示的序列或由SEQ ID NO：54所示的序列组成的shmiR(shmiR16)。
在一个实例中，本文所述的核酸包括SEQ ID NO：68所示的DNA序列或由SEQ IDNO：68所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：55所示的序列或由SEQ ID NO：55所示的序列组成的shmiR(shmiR17)。
本发明的示例性核酸编码选自本文所述的shmiR2、shmiR3、shmiR5、shmiR9、shmiR13、shmiR14和shmiR17的shmiR。编码如本文所述的选自shmiR3、shmiR13、shmiR14和shmiR17的shmiR的本发明的核酸是特别优选的。
本领域技术人员应理解，根据本发明的核酸可与包括编码shRNA或shmiR的DNA序列的一种或多种其他核酸组合或联合使用，shRNA或shmiR包括至少17个连续核苷酸的效应子序列，效应子序列与对应于引起OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物的区域基本上互补。在一个实例中，提供了多种核酸，其包括：
(a)至少一种本文所述的核酸；以及
(b)至少一种另外的核酸，其选自：
(i)包括编码本文所述的shmiR的DNA序列的核酸；或
(ii)包括编码短发夹RNA(shRNA)的DNA序列的核酸，shRNA包括如本文所述的shmiR的同源效应子和效应子互补序列；
其中在(a)由核酸编码的shmiR和在(b)由核酸编码的shmiR或shRNA包括不同的效应子序列。
因此，在一个实例中，本发明的多种核酸可以包括两种或更多种编码本文所述的shmiR的核酸，例如两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种编码本文所述shmiR的核酸。
在另一个实例中，本发明的多种核酸包括至少一种编码本文所述的shmiR的核酸和至少一种包括编码shRNA的DNA序列的核酸，shRNA包括本文所述的shmiR的同源效应子和效应子互补序列。例如，包括shmiR2的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA2”。例如，包括shmiR3的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA3”。例如，包括shmiR4的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA4”。例如，包括shmiR5的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA5”。例如，包括shmiR6的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA6”。例如，包括shmiR7的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA7”。例如，包括shmiR9的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA9”。例如，包括shmiR11的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA11”。例如，包括shmiR13的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA13”。例如，包括shmiR14的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA14”。例如，包括shmiR15的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA15”。例如，包括shmiR16的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA16”。例如，包括shmiR17的效应子序列和效应子互补序列的shRNA在下文中称为“shRNA17”。
根据本文所述的多种核酸中的一种或多种核酸编码shRNA的任何实例，该shRNA可以包括位于该同源效应子序列与该效应子互补序列之间的环或茎环序列。合适的环序列可以选自本领域已知的那些。或者，可重新形成合适的茎环。在一个实例中，本文所述的多个编码shRNA的核酸可以包括编码茎环的DNA序列，茎环分别位于编码效应子序列和效应子互补序列的DNA序列之间。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR2的DNA序列或由编码shmiR2的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR2的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：56所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：43所示的序列或由SEQ ID NO：43所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR3的DNA序列或由编码shmiR3的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR3的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：57所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：44所示的序列或由SEQ ID NO：44所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR4的DNA序列或由编码shmiR4的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR4的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：58所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：45所示的序列或由SEQ ID NO：45所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：58(shmiR4)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58(shmiR4)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR5的DNA序列或由编码shmiR5的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR5的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：59所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：46所示的序列或由SEQ ID NO：46所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR6的DNA序列或由编码shmiR6的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR6的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：60所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：47所示的序列或由SEQ ID NO：47所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：60(shmiR6)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60(shmiR6)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR7的DNA序列或由编码shmiR7的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR7的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：61所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：48所示的序列或由SEQ ID NO：48所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：61(shmiR7)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61(shmiR7)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR9的DNA序列或由编码shmiR9的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR9的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：62所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：49所示的序列或由SEQ ID NO：49所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR11的DNA序列或由编码shmiR11的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR11的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID No：63所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：50所示的序列或由SEQ ID NO：50所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：63(shmiR11)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：63(shmiR11)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR13的DNA序列或由编码shmiR13的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR13的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：64所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：51所示的序列或由SEQ ID NO：51所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR14的DNA序列或由编码shmiR14的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR14的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：65所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：52所示的序列或由SEQ ID NO：52所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR15的DNA序列或由编码shmiR15的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR15的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：66所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：53所示的序列或由SEQ ID NO：53所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：66(shmiR15)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：66(shmiR15)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR16的DNA序列或由编码shmiR16的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR16的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：67所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：54所示的序列或由SEQ ID NO：54所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：67(shmiR16)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：67(shmiR16)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，本文所述的多种核酸包括含有编码shmiR17的DNA序列或由编码shmiR17的DNA序列组成的核酸和本发明的编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的至少一种其他核酸。本文描述了编码shmiR17的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸包括核酸和本发明的至少一种其他核酸，核酸包括SEQ ID NO：68所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68所示的DNA序列组成，和编码包括SEQ ID NO：55所示的序列或由SEQ ID NO：55所示的序列组成的shmiR，本发明的至少一种其他核酸编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA。例如，本文所述的多种核酸可以包括(i)包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。
根据本文所述的多种核酸的任何实例，多种核酸可包括两种或更多种编码本文所述的shmiR或shRNA的核酸，例如两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种编码本文所述的shmiR的核酸，条件是至少一种核酸编码本发明的shmiR。
在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的两种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的三种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的四种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的五种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的六种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的七种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的八种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的九种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，多种核酸包括编码本文所述的shmiR或shRNA的十种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：1所示序列或由SEQ ID NO：1所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR2描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：1所示序列或由SEQ ID NO：1所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：2所示序列或由SEQ ID NO：2所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR3描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：2所示序列或由SEQ ID NO：2所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：4所示序列或由SEQ ID NO：4所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR5描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：4所示序列或由SEQ ID NO：4所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：7所示序列或由SEQ ID NO：7所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR9描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：7所示序列或由SEQ ID NO：7所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：9所示序列或由SEQ ID NO：9所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR13描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：9所示序列或由SEQ ID NO：9所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：10所示序列或由SEQ ID NO：10所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR14描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：10所示序列或由SEQ ID NO：10所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
在本文所述的多种核酸的一个实例中，核酸之一包括编码shmiR的DNA序列，shmiR具有与包括SEQ ID NO：13所示序列或由SEQ ID NO：13所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文针对shmiR17描述了编码具有效应子序列的shmiR的合适核酸，效应子序列与包括SEQ ID NO：13所示序列或由SEQ ID NO：13所示序列组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
本发明的示例性多种核酸包括至少两种核酸，每种核酸包括编码本发明的shmiR的DNA序列，其中每种shmiR包括不同的效应子序列。
在一个实例中，至少两种核酸中编码包括与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的本发明的示例性核酸，效应子序列与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13所示的RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和SEQ ID NO：14所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和SEQ ID NO：20所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和SEQ ID NO：26所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸：
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，至少两种核酸中的每一种编码包括与SEQ ID NO：2、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的本发明的示例性核酸，效应子序列与SEQ ID NO：2、9、10和13所示的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，多种核酸包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：9所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：13所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，多种核酸可以包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
本发明的示例性多种核酸包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，多种核酸包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：2所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：10所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，多种核酸可以包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的序列或由其组成的核酸。
本发明的示例性多种核酸包括包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸。
根据其中提供了多种核酸的实例，这些核酸中的两种或更多种可以形成相同多核苷酸的分开的部分。在另一个实例中，多种核酸中的两种或更多种分别形成不同多核苷酸的部分。在另一个实例中，本文所述的多种核酸作为多组分(例如多种组合物)提供。例如，可以分别提供多种核酸中的每一种。或者，在提供本发明的三种或更多种核酸的实例中，至少一种核酸可单独提供，并且多种核酸中的两种或更多种可一起提供。
在一些实例中，根据本发明的该核酸或每种核酸可以包括额外的元件或与额外的元件可操作地连接，以促进shmiR或shRNA的转录。例如，或每种核酸可以包括与本文所述的编码shmiR或shRNA的序列可操作地连接的启动子。其他元件，例如转录终止子和起始子，是本领域已知的和/或本文描述的。
可替换地或附加地，根据本发明的该核酸或每种核酸可以包括一个或多个限制性位点，例如，以便于将核酸克隆到克隆或表达载体(vector)中。例如，本文所述的核酸可以包括编码本发明的shmiR或shRNA的序列的上游和/或下游的限制性位点。合适的限制性内切酶识别序列是本领域技术人员已知的。然而，在一个实例中，本发明的核酸可以包括在编码shmiR或shRNA的序列的5’端即上游的BamH1限制性位点(GGATCC)和在编码shmiR或shRNA的序列的3’端即下游的EcoR1限制性位点(GAATTC)。
ddRNAi构建体
在一个实例中，本发明的核酸或每种核酸以DNA指导的RNAi(ddRNAi)构建体的形式提供或包括在DNA指导的RNAi(ddRNAi)构建体中。因此，在一个实例中，本发明提供了包括如本文描述的核酸的ddRNAi构建体。在另一个实例中，本发明提供了包括本文描述的多种核酸的ddRNAi构建体。在又一个实例中，本发明提供了多种ddRNAi构建体，每种包括如本文描述的多种核酸中的一种核酸(即，使得该多种核酸中的所有核酸都代表该多种ddRNAi构建体)。本文描述了编码包括靶向引起OPMD的PABPN1的mRNA转录物的效应子序列的shmiR或shRNA的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，ddRNAi构建体包括与启动子可操作连接的本发明的核酸。
根据其中ddRNAi构建体包括本文所述的多种核酸的实例，每种核酸可以可操作地连接至启动子。在一个实例中，ddRNAi构建体中的核酸可以可操作地连接至相同的启动子。在一个实例中，ddRNAi构建体中的核酸可以可操作地连接至不同的启动子。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR2的DNA序列或由编码shmiR2的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：1所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR2的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：56所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：43所示的序列或由SEQ ID NO：43所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：56(shmiR2)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR3-shmiR7、shmiR9、shmiR11和shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR3的DNA序列或由编码shmiR3的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：2所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR3的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：57所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：44所示的序列或由SEQ ID NO：44所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2、shmiR4-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR4的DNA序列或由编码shmiR4的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：3所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR4的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：58所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：45所示的序列或由SEQ ID NO：45所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：58(shmiR4)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：58(shmiR4)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2、shmiR3、shmiR5-shmiR7、shmiR9、shmiR1 1或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR5的DNA序列或由编码shmiR5的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：4所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR5的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：59所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：46所示的序列或由SEQ ID NO：46所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR1 1或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR4、shmiR6-shmiR7、shmiR9、shmiR1 1或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR6的DNA序列或由编码shmiR6的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：5所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR6的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：60所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：47所示的序列或由SEQ ID NO：47所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：60(shmiR6)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：60(shmiR6)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR5、shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR7的DNA序列或由编码shmiR7的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：6所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR7的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：61所示的DNA序列或由SEQ ID NO：61所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：48所示的序列或由SEQ ID NO：48所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：61(shmiRT)所示的DNA序列或由SEQ IDNO：61(shmiR7)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR6、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR9的DNA序列或由编码shmiR9的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：7所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR9的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：62所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ IDNO：49所示的序列或由SEQ ID NO：49所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR11或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR11的DNA序列或由编码shmiR11的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：8所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR11的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：63所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：50所示的序列或由SEQ ID NO：50所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：63(shmiR11)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：63(shmiR11)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9或shmiR13-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR13的DNA序列或由编码shmiR13的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：9所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR13的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：64所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：51所示的序列或由SEQ ID NO：51所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR14-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR14的DNA序列或由编码shmiR14的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：10所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR14的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：65所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：52所示的序列或由SEQ ID NO：52所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13、shmiR15-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR15的DNA序列或由编码shmiR15的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：11所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR15的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：66所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：53所示的序列或由SEQ ID NO：53所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：66(shmiR15)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：66(shmiR15)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR14、或shmiR16-shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR16的DNA序列或由编码shmiR16的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：12所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR16的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：67所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：54所示的序列或由SEQ ID NO：54所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：67(shmiR16)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：67(shmiR16)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR15、或shmiR17之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-hmiR15、或shmiR17的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括核酸，核酸包括编码shmiR17的DNA序列或由编码shmiR17的DNA序列组成。例如，ddRNAi构建体可包括包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，shmiR具有与包括SEQ ID NO：13所示序列或由其组成的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。本文描述了编码shmiR17的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，ddRNAi构建体包括核酸，该核酸包括SEQ ID NO：68所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68所示的DNA序列组成，并且编码包括SEQ ID NO：55所示的序列或由SEQ ID NO：55所示的序列组成的shmiR。ddRNAi构建体可以包括本发明的一种或多种另外的核酸，核酸包括编码靶向PABPN1 mRNA转录物的区域的shmiR或shRNA的DNA序列，例如包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16中的一种或其任何一种的相应shRNA的DNA序列组成的核酸。例如，本文所述的ddRNAi构建体可以包括(i)包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸，和(ii)包括编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一或其任何相应shRNA的DNA序列或由编码shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16之一或其任何相应shRNA的DNA序列组成的核酸。本文描述了编码命名为shmiR2-shmiR7、shmiR9、shmiR11或shmiR13-shmiR16的shmiR的示例性核酸，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
根据包括如本文所述的多种核酸的ddRNAi构建体的任何实例，ddRNAi构建体可以包括两种或更多种编码本文所述的shmiR或shRNA的核酸，例如两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种编码本文所述的shmiR或shRNA的核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。
在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的两种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的三种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的四种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的五种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的六种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的七种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的八种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的九种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码本文所述的shmiR或shRNA的十种核酸，条件是至少一种核酸编码本文所述的shmiR。
本发明的示例性ddRNAi构建体包括至少两种核酸，每种核酸包括编码本发明的shmiR的DNA序列，其中每种shmiR包括不同的效应子序列。在一个实例中，ddRNAi构建体中至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的本发明的示例性核酸，效应子序列与SEQ ID NO：1、2、4、7、9、10和13所示的RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于描述ddRNAi构建体的本发明的本实例。
在一个实例中，ddRNAi构建体包括选自以下组成的组的至少两种核酸：
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：15所示的效应子序列和SEQ ID NO：14所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：21所示的效应子序列和SEQ ID NO：20所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：27所示的效应子序列和SEQ ID NO：26所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体中至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQ IDNO：2、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。本文描述了编码包括效应子序列的shmiR的本发明的示例性核酸，效应子序列与SEQ IDNO：2、9、10和13所示的RNA转录物中的相应长度的区域基本上互补，并应对其加以必要的变更后适用于描述ddRNAi构建体的本发明的本实例。
在一个实例中，ddRNAi构建体包括选自以下组成的组的至少两种核酸：
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQID NO：9所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：13所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，ddRNAi构建体可包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由其组成的核酸。
本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
在一个实例中，ddRNAi构建体包括编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：2所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列，和编码shmiR的核酸，该shmiR包括与SEQ ID NO：10所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。例如，ddRNAi构建体可包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：17所示的效应子序列和SEQID NO：16所示的效应子互补序列，例如包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由其组成的核酸；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由其组成的核酸，其包括SEQ ID NO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32所示的效应子互补序列，例如，包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的序列或由其组成的核酸。
本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸和包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸。
在描述本发明内容的ddRNAi构建体的每种前述实例中，包括在其中的核酸或每种核酸可操作地连接至启动子。例如，如本文所述的ddRNAi构建体可包括单一启动子，其可操作地连接至包括于其中的核酸或每种核酸，例如，以驱动来自ddRNAi构建体的一种或多种shmiR和/或shRNA的表达。
在另一个实例中，包括在ddRNAi构建体中的编码本发明的shmiR或shRNA的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。
根据存在多个启动子的实例，启动子可以相同或不同。例如，构建体可以包括相同启动子的多个拷贝，每种拷贝与本发明的不同核酸可操作地连接。在另一个实例中，与本发明的核酸可操作地连接的每个启动子是不同的。例如，在编码两种shmiR的ddRNAi构建体中，编码shmiR的两种核酸各自与不同的启动子可操作地连接。同样地，在其中ddRNAi构建体编码一种shmiR和一种shRNA的实例中，编码shmiR和shRNA的相应核酸各自可操作地连接至不同的启动子。
在一个实例中，启动子是组成型启动子。当涉及启动子时，术语“组成型”意指启动子能够在不存在特定刺激(例如热休克、化学品、光等)的情况下指导可操作连接的核酸序列的转录。通常，组成型启动子能够指导编码序列在基本上任何细胞和任何组织中的表达。用于从本发明的核酸转录shmiR或shRNA的启动子包括泛素、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1d或由RNA聚合酶II控制的pgk基因的启动子、或由RNA聚合酶I控制的启动子元件。
在一个实例中，使用Pol II启动子如CMV、SV40、U1、β-肌动蛋白或杂交Pol II启动子。其他合适的Pol II启动子是本领域已知的并且可根据本发明的该实例使用。例如，在表达pri-miRNA的本发明的ddRNAi构建体中，Pol II启动子***可以是优选的，pri-miRNA在酶Drosha和Pasha的作用下被加工成一种或多种shmiR。在包括编码在单一启动子控制下的多种shRNA或shmiR的序列的本发明的ddRNAi构建体中，Pol II启动子***也可以是优选的。在需要组织特异性的情况下，Pol II启动子***也可以是期望的。
在另一个实例中，使用由RNA聚合酶III控制的启动子，例如U6启动子(U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人Y启动子(hY1，hY3，hY4(参见Maraia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)22(15)：3045-52(1994))和hY5(参见Maraia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)24(18)：3552-59(1994))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、或5s核糖体RNA启动子。
美国专利8,008,468号和美国专利8,129,510号中描述了用于本发明的ddRNAi构建体的适合的启动子。
在一个实例中，启动子是RNA Pol III启动子。例如，启动子是U6启动子(例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子)。在另一个实例中，启动子是H1启动子。
在如本文所述的编码多种shmiR或编码一种或多种shmiR和shRNA的本发明的ddRNAi构建体的情况下，ddRNAi构建体中的每种核酸可操作地连接至U6启动子，例如单独的U6启动子。
在一个实例中，构建体中的启动子是U6启动子。例如，启动子是U6-1启动子。例如，启动子是U6-8启动子。例如，启动子是U6-9启动子。
在一些实例中，使用具有可变强度的启动子。例如，使用两种或更多种强启动子(例如Pol III型启动子)可通过，例如去除转录所需的可用核苷酸或其他细胞组分的汇集而使细胞死亡。此外，或可替代地，使用几种强启动子可以引起细胞中RNAi剂(例如，shmiR或shRNA)的表达的毒性水平。因此，在一些实例中，多启动子ddRNAi构建体中的一个或多个启动子弱于构建体中的其他启动子，或者构建体中的所有启动子可以以小于最大速率的速率表达shmiR或shRNA。还可以使用各种分子技术修饰启动子，或者通过修饰各种调节元件修饰启动子，以获得较弱水平或较强水平的转录。实现降低的转录的一种方法是修饰已知控制启动子活性的启动子内的序列元件。例如，已知近端序列元件(PSE)影响人U6启动子的活性(参见Domitrovich等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)，31：2344-2352(2003))。用来自弱启动子如人U6-7启动子的元件替代存在于强启动子如人U6-1、U6-8或U6-9启动子中的PSE元件，降低了杂合U6-1、U6-8或U6-9启动子的活性。在本申请中描述的示例中使用了该方法，但是实现该结果的其他手段在本领域中是已知的。
可用于本发明的一些实例中的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。当应用于启动子时，术语“组织特异性的”是指在不同类型的组织(例如，肝)中相对缺乏目的相同核苷酸序列的表达时，能够引导目的核酸在特定类型的组织(例如，眼睛或肌肉的组织)中选择性转录的启动子。应用于启动子时，术语“细胞特异性的”是指在相同组织内不同类型细胞中相对缺乏相同目的核苷酸序列表达时，能够指导目的核酸在特定类型细胞中选择性转录的启动子。根据一个实例，使用肌肉特异性启动子，例如Spc512或CK8。然而，其他肌肉特异性启动子是本领域已知的并且预期用于本发明的ddRNAi构建体中。
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体可另外包括一种或多种增强子以增加由本文所述的核酸编码的shmiR或shRNA的表达。适用于本发明的实例的增强子包括Apo E HCR增强子，CMV增强子(Xia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res)，31-17(2003))和本领域技术人员已知的其他增强子。美国专利8，008，468号中描述了用于本发明的ddRNAi构建体中的适合的增强子。
在另一个实例中，本发明的ddRNAi构建体可包括与编码本发明的shmiR或shRNA的核酸连接的转录终止子。在包括本文所述的多种核酸(即编码多种shmiR和/或shRNA)的ddRNAi构建体的情况下，连接至每种核酸的终止子可以相同或不同。例如，在使用RNA polIII启动子的本发明的ddRNAi构建体中，终止子可以是4个或更多个或5个或更多个或6个或更多个T残基的连续片段。然而，当使用不同的启动子时，终止子可以不同并且与来自产生终止子的基因的启动子匹配。这些终止子包括，但不限于SV40 poly A、AdV VA1基因、5S核糖体RNA基因和人t-RNA的终止子。其他启动子和终止子组合是本领域已知的并且预期用于本发明的ddRNAi构建体中。
此外，启动子和终止子可以混合并匹配，如通常使用RNA pol II启动子和终止子所进行的。
在一个实例中，用于包括多种核酸的ddRNAi构建体中的每种核酸的启动子和终止子组合是不同的，以降低组分之间的DNA重组事件的可能性。
本发明的一个示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR13的DNA序列的核酸或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR17的DNA序列的核酸或由其组成的核酸。例如，本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：64所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：68所示的DNA序列的核酸或由其组成的核酸。在一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。在另一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与相同的启动子可操作地连接。例如，启动子或每个启动子可以是U6启动子，例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子。例如，启动子或每个启动子可以是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。
根据其中编码shmiR13和shmiR17的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同Spc512启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：72所示的DNA序列或由SEQ ID NO：72所示的DNA序列组成。根据其中编码shmiR13和shmiR17的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同CK8启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：70所示的DNA序列或由SEQ IDNO：70所示的DNA序列组成。
本发明的另一个示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR3的DNA序列或由其组成的核酸和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR14的DNA序列或由其组成的核酸。例如，本发明的示例性ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：57所示的DNA序列的核酸或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成的核酸和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：65所示的DNA序列的核酸或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成的核酸。在一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。在另一个实例中，编码shmiR的ddRNAi构建体中的每种核酸与相同的启动子可操作地连接。例如，启动子或每个启动子可以是U6启动子，例如，U6-1、U6-8或U6-9启动子。例如，启动子或每个启动子可以是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。
根据其中编码shmiR3和shmiR14的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同Spc512启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：71所示的DNA序列或由SEQ ID NO：71所示的DNA序列组成。根据其中编码shmiR3和shmiR14的ddRNAi构建体中的核酸可操作地连接至相同CK8启动子的实例，ddRNAi构建体包括SEQ ID NO：69所示的DNA序列或由SEQ IDNO：69所示的DNA序列组成。
还提供了多种ddRNAi构建体。例如，可以在多种ddRNAi构建体内提供编码本文所述的shmiR的多种核酸，其中每种ddRNAi构建体包括本文所述的多种核酸中的一种或多种。已经描述了编码shmiR的核酸的组合，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。在一个实例中，本文所述的多种核酸中的每种核酸被提供在其自身的ddRNAi构建体中。
根据其中提供多种ddRNAi构建体的任何实例，每种ddRNAi构建体还可以包括与包括在其中的编码shmiR的核酸可操作地连接的一个或多个启动子。在一个实例中，每种ddRNAi构建体包括编码shmiR的单一核酸和与其可操作连接的启动子。根据其中多种ddRNAi构建体中的一个或多个包括两种或更多种编码shmiR的核酸的实例，一种或多种ddRNAi构建体中的每种核酸与单独的启动子可操作地连接。在多种ddRNAi构建体中的一种或多种包括编码shmiR的两种或更多种核酸的另一个实例中，两种或更多种核酸与ddRNAi构建体中的相同启动子可操作地连接。
本发明的一个示例性多种ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR13的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR17的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体。例如，本发明的示例性多种ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：64所示的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：68所示的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体。在一个实例中，启动子是例如选自U6-1、U6-8或U6-9启动子的U6启动子。在另一个实例中，启动子是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。
本发明的另一个示例性多种ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR3的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体和包括与启动子可操作连接的由本文所述的编码shmiR14的DNA序列的核酸或由其组成的ddRNAi构建体。例如，本发明的示例性多种ddRNAi构建体包括包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：57所示的DNA序列的核酸或由SEQ ID NO：57所示的DNA序列组成的ddRNAi构建体和包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO：65所示的DNA序列的核酸或由SEQ ID NO：65所示的DNA序列组成的ddRNAi构建体。在一个实例中，启动子是例如选白U6-1、U6-8或U6-9启动子的U6启动子。在另一个实例中，启动子是肌肉特异性启动子，例如，Spc512或CK8启动子。
此外，ddRNAi构建体或每种ddRNAi构建体可包括一个或多个多克隆位点和/或位于策略上的独特限制性位点，使得启动子、编码shmiR或shRNA的核酸和/或其他调控元件易于移除或替代。该ddRNAi构建体或每种ddRNAi构建体可以使用策略性定位的限制性位点和/或互补粘性末端从较小的寡核苷酸组分组装。用于根据本发明的一种方法的基础载体(vector)包括具有多链接体的质粒，其中所有位点是独特的(尽管这不是绝对要求)。依次地，将每个启动子***其指定的独特位点之间，产生具有一个或多个启动子的碱基盒，所有这些可以具有可变的方向。依次地，再次将退火的引物对***每种单独启动子下游的独特位点，产生单、双或多表达盒构建体。可以使用在单、双或多表达盒***物侧翼的两个独特的限制性酶切位点(相同的或不同的酶切位点)将***物移入例如，AdV骨架或AAV骨架中。
可以使用本领域已知的任何合适的基因工程技术，包括但不限于PCR、寡核苷酸合成、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，完成ddRNAi构建体或每种ddRNAi构建体的产生。如果构建体或每种构建体为病毒构建体，则构建体包括例如将ddRNAi构建体包装到病毒颗粒中所需的序列和/或允许ddRNAi构建体整合到靶细胞基因组中的序列。在一些实例中，病毒构建体或每一病毒构建体另外含有允许病毒复制和增殖的基因，然而此类基因将以反式提供。另外，或每种病毒构建体可以含有来自以天然形式掺入或修饰的任何已知生物体的基因组的基因或遗传序列。例如，病毒构建体可包括用于在细菌中复制构建体的序列。
构建体或每种构建体还可以含有另外的遗传元件。可以包括在构建体中的元件的类型不以任何方式限制，并且可以由本领域技术人员选择。例如，另外的遗传元件可以包括报告基因，例如荧光标记蛋白如GFP或RFP的一个或多个基因；容易测定的酶，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎碱性磷酸酶；或免疫分析容易获得的蛋白，如激素或细胞因子。
可用于本发明的实施方案中的其他遗传元件包括编码赋予细胞选择性生长优势的蛋白的那些，例如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、耐药性，或编码提供缺乏营养缺陷型的生物合成能力的蛋白的那些基因。如果报告基因与该构建体或每种构建体一起包括，则可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。在一个实例中，额外的遗传元件与独立的启动子/增强子可操作地连接并受其控制。此外，可以使用用于在细菌中增殖构建体的合适的复制起点。复制起点的序列通常与ddRNAi构建体和其他遗传序列分离。这样的复制起点是本领域已知的，并且包括pUC、ColE1、2-微米或SV40复制起点。
表达载体(vector)
在一个实例中，本发明的ddRNAi构建体包括在表达载体(vector)内。
在一个实例中，表达载体(vector)是质粒，例如，本领域已知的。在一个实例中，合适的质粒表达载体(vector)是pAAV载体(vector)，例如，自身互补pAAV(pscAAV)质粒载体(vector)或单链pAAV(pssAAV)质粒载体(vector)。如本文所述，质粒可包括一个或多个启动子(描述了其合适的实例)以驱动本发明的一种或多种shmiR的表达。
在一个实例中，表达载体(vector)是微环DNA。美国专利公开2004/0214329号中描述了微环DNA。微环DNA可用于持续高水平的核酸转录。环状载体(vector)的特征在于缺乏表达沉默细菌序列。例如，微环载体(vector)与细菌质粒载体(vector)的不同在于它们缺乏复制起点，并且缺乏通常在细菌质粒中发现的药物选择标记，例如p-内酰胺酶、tet等。因此，微环DNA在尺寸上变得更小，允许更有效的递送。
在一个实施例中，表达载体(vector)是病毒载体(vector)。
基于任何合适病毒的病毒载体(vector)可用于递送本发明的ddRNAi。此外，可以使用杂交病毒***。病毒递送***的选择将取决于各种参数，例如递送的靶向组织、***的转导效率、致病性、免疫学和毒性问题等。
用于基因治疗的通常使用的病毒***的类别可以根据它们的基因组是整合到宿主细胞染色质(瘤病毒和慢病毒)中还是主要作为染色体外附加体(腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒)保留在细胞核中而分为两组。在一个实例中，本发明的病毒载体(vector)整合到宿主细胞的染色质中。在另一个实例中，本发明的病毒载体(vector)作为染色体外附加体存在于宿主细胞的细胞核中。
在一个实例中，病毒载体(vector)是腺病毒(AdV)载体(vector)。腺病毒是中等大小的双链、无包膜DNA病毒，具有26-48Kbp的线性基因组。腺病毒通过受体介导的结合和内化进入靶细胞，在非***细胞和***细胞中穿透细胞核。腺病毒主要依赖于宿主细胞存活和复制，并且能够利用宿主的复制机制在脊椎动物细胞核中复制。
在一个实例中，病毒载体(vector)来自细小病毒科。细小病毒科(parvoviridae)是一族单链、无包膜DNA病毒，其基因组长约5000个核苷酸。其中包括腺相关病毒(AAV)。在一个实例中，本发明的病毒载体(vector)是AAV。AAV是依赖性细小病毒，其通常需要与另一种病毒(通常是腺病毒或疱疹病毒)共同感染以引发和维持生产性感染循环。在没有这种辅助病毒的情况下，AAV仍然能够通过受体介导的结合和内化感染或转导靶细胞，穿透非***细胞和***细胞中的细胞核。因为子代病毒不是在缺乏辅助病毒的情况下由AAV感染产生的，所以转导的程度仅限于用病毒感染的初始细胞。该特征使得AAV成为本发明内容的理想载体(vector)。此外，与逆转录病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒不同，AAV似乎缺乏人的致病性和毒性(Kay等人，Nature.424：251(2003))。由于基因组通常仅编码两个基因，因此AAV作为递送载体(vehicle)受到4.5单链千碱基(kb/s)的包装容量的限制并不奇怪。然而，尽管该大小限制可能限制可递送用于替代基因治疗的基因，但其不会不利地影响较短序列如shmiR和shRNA的包装和表达。优选地，用作表达载体(vector)和递送***的AAV来自能够感染人的血清型，例如，AAV选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13组成的组。在一个具体实例中，使用血清型8或9的AAV作为载体(vector)。在一例中，AAV来自血清型8。在另一个实例中，AAV来自血清型9。根据AAV来自血清型2之外的血清型的任何实例，AAV可包括AAV血清型2反向末端重复序列(ITRs)，例如，以提高AAV的转导效率。可替换地或附加地，AAV可包括经修饰的衣壳蛋白，例如，以帮助使用杆状病毒***在昆虫细胞中产生AAV。例如，AAV可以包括病毒衣壳蛋白，病毒衣壳蛋白包括具有修饰的磷脂酶(PL)结构域序列的亚单位1(VP1)。例如，VP1的PL结构域可以包括包括位置1的丝氨酸、位置26的谷氨酸、位置40的精氨酸、位置43的天冬氨酸、位置44的丝氨酸和位置64的赖氨酸的序列，其中氨基酸位置是相对于在SEQ ID NO：88中列出的未修饰的序列定义的，其中在位置1、26、40、43、44和64的任何一个或多个的氨基酸是相对于相应的野生型序列修饰的。
在一个实例中，病毒载体(vector)是来自血清型8的AAV，或具有血清型8衣壳的AAV假型，其包括来自AAV血清型2的ITR和修饰的衣壳蛋白，其中VP1包括位置包括丝氨酸的PL结构域序列，其包括位置1的丝氨酸、位置26的谷氨酸、位置40的精氨酸、位置43的天冬氨酸、位置44的丝氨酸和位置64的赖氨酸，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO：88所示序列定义的。例如，来自AAV8的修饰的衣壳蛋白可以包括VP1，VP1包括含有SEQ ID NO：89所示序列的PL结构域。在另一个实例中，病毒载体(vector)是来自血清型9的AAV，或具有血清型9衣壳的AAV假型，其包括来自AAV血清型2的ITR和修饰的衣壳蛋白，其中VP1包括位置包括丝氨酸的PL结构域序列，其包括位置1的丝氨酸、位置26的谷氨酸、位置40的精氨酸、位置43的天冬氨酸和位置44的丝氨酸以及位置64的赖氨酸，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO：88所示的未修饰的序列定义的。例如，来自AAV9的修饰的衣壳蛋白可以包括VP1，VP1包括含有SEQ ID NO：90所示序列的PL结构域。
生产适用于基因治疗的AAV的方法(例如，不能复制AAV)是本领域熟知的并且在本文中考虑。例如，AAV可以使用杆状病毒***在昆虫细胞中产生，例如，如US20120028357A1、WO2007046703、US20030148506A1、WO2017184879、US20040197895 A1和WO2007148971中描述，其内容通过引用并入本文。重组AAV也可以在哺乳动物细胞(粘附细胞和悬浮细胞)中产生，其方法描述于WO2015031686、WO2009097129、WO2007127264、WO1997009441和WO2001049829中，其内容通过引用并入本文。生产用于基因治疗的重组AAV的方法也描述于以下文献，Berns KI和Giraud C(1996)腺相关病毒生物学(Biology of adeno-associatedvirus.)Curr Top Microbiol Immunol 218：1-23，Snyder和Flotte(2002)Curr.Opin.Biotechnol.，13：418-423，以及Synder RO和Moullier P，《腺相关病毒：方法和实验指南》(Adeno-associated virus；methods and protocols).New York：Humana Press(2011)，其内容通过引用并入本文。
与本发明的ddRNAi构建体一起有用的另一种病毒递送***是基于来自逆转录病毒科的病毒的***。逆转录病毒包括以两个独特特征为特征的单链RNA动物病毒。首先，逆转录病毒的基因组是二倍体，由RNA的两个拷贝组成。其次，该RNA通过病毒体相关酶逆转录酶转录成双链DNA。该双链DNA或前病毒然后可以整合到宿主基因组中并作为宿主基因组的稳定整合组分从亲代细胞传递到子代细胞。
在一些实例中，病毒载体(vector)是慢病毒。慢病毒载体(vector)常被假型化为疱疹性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)，来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)；引起绵羊脑炎(visna)或肺炎的visan-maedi；感染引起马科动物自身免疫性溶血性贫血和脑病的马传染性贫血病毒(EIAV)；引起猫的免疫缺陷的猫免疫缺陷病毒(FIV)；引起牛***病和淋巴细胞增多的牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及在非人灵长类中引起免疫缺陷和脑病的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。基于HIV的载体(vector)通常保留＜5％的亲代基因组，并且＜25％的基因组掺入到包装构建体中，这使产生返祖遗传的具有复制能力的HIV的可能性最小化。通过开发在下游长末端重复序列中含有调节元件缺失的自身失活载体(vector)，进一步增加了生物安全性，这种修饰消除了载体(vector)活动化所需的整合前病毒的转录。使用慢病毒载体(vector)的主要优点之一是基因转移在大多数组织或细胞类型中是持续的，甚至在转导细胞的细胞***之后。
用于从本发明的核酸和ddRNAi构建体表达shmiR和/或shRNA的基于慢病毒的构建体包括来自慢病毒的5’和3’长末端重复序列(LTR)的序列。在一个实例中，病毒构建体包括来自慢病毒的灭活的或自身灭活的3’LTR。可以通过本领域已知的任何方法使3’LTR自身失活。例如，3’LTR的U3元件含有其增强子序列的缺失，增强子序列例如是TATA盒、Sp1和NF-κB位点。由于3’LTR自身失活，整合到宿主基因组中的前病毒将包括失活的5’LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。基于慢病毒的构建体还可以掺入MMLV或MSCV、RSV或哺乳动物基因的序列。此外，慢病毒5’LTR的U3序列可以被替代为病毒构建体中的启动子序列。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。
本领域技术人员已知的其他病毒或非病毒***可用于将本发明的ddRNAi或核酸递送至目的细胞，包括但不限于基因缺失的腺病毒-转座子载体(vector)(参见Yant等人，Nature Biotech，20：999-1004(2002))；衍生自辛德毕斯病毒(Sindbis virus)或塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)的***(参见Perri等人，J.Virol.，74(20)：9802-07(2002))；衍生自新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus)或仙台病毒(Sendai virus)的***。
测试本发明的shmiR或ddRNAi构建体
细胞培养模型
用作OPMD细胞培养模型的细胞系的实例是HEK293T细胞系(HEK293T，ATCC，Manassas，USA)，其已经用表达正常Ala10-人PABPN1-FLAG(Ala10)或突变体Ala17-人PABPN1-FLAG(Ala17)的载体(vector)转染，后者是OPMD的标志。
可用作OPMD细胞培养模型的细胞系的其他实例为C2C12小鼠肌肉细胞和ARPE-19人视网膜细胞。
用作OPMD细胞培养模型的细胞系的另一个实例是稳定转染以表达正常Ala10-人PABPN1-FLAG(Ala10)或突变体Alai7-人PABPN1-FLAG(Ala17)的原代小鼠成肌细胞(IM2)细胞系。稳定表达突变体Ala17-人PABPN1-FLAG(Ala17)的示例性IM2衍生细胞系是H2kB-D7e细胞系。H2kB-D7e细胞系也描述于Raz等人，(2011)美国病理学杂志(American Journa1 ofPathology)，179(4)：1988-2000。
适用于OPMD的细胞培养模型的其他细胞系是本领域已知的，例如描述于Fan等人(2001)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，10：2341-2351，Bao等人(2002)生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，277：12263-12269和Abu-Baker等人(2003)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，12：26092623。
如本文所例示，通过将编码shmiR的核酸或包括其的ddRNAi构建体或表达载体(vector)施用至细胞并随后测量由PABPN1基因编码的RNA或蛋白的表达水平来测定本发明的shmiR的活性。例如，可以通过RT-PCR、定量PCR、半定量PER或在严格条件下的原位杂交中的任何一种或多种，使用对PABPN1特异的一种或多种探针或引物来测定细胞内PABPN1基因表达。PABPN1 mRNA或DNA也可通过使用一种或多种对PABPN1具有特异性的探针或引物的PCR或蛋白印迹(Western blot)或ELISA来检测PABPN1蛋白。
用于检测PABPN1表达的可用于RT-PCR、定量PCR或半定量PCR技术的多核苷酸是已知的并且是可商购的(Thermo Fisher)。然而，可使用本领域已知的方法和/或软件基于PABPN1可获得的序列信息设计可用于基于PCR的检测方法的多核苷酸。在一个实例中，可以使用本领域已知的标准方法使用RT-PCR检测PABPN1 mRNA的存在或不存在。在一个实例中，可以使用蛋白印迹、ELISA或本领域可用的其他标准定量或半定量技术中的任何一种或多种，或这些技术的组合来检测PABPN1多肽或蛋白的存在或不存在或相对量。考虑并描述了依赖于PABPN1的抗体识别的技术。在一个实例中，可以使用包括PABPN1多肽的抗体捕获以及捕获的PABPN1多肽的电泳拆分的技术检测PABPN1多肽的存在或不存在或相对丰度，例如使用IsonosticTM Assay(Target Discovery，公司)。可购得PABPN1蛋白的抗体。
将转染或转导效率和样本回收率的差异归一化的各种方法是本领域已知的。
本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)相对于由PABPN1编码的mRNA表达或蛋白的水平或在没有本发明的RNA的情况下PABPN1蛋白的核聚集的水平，减少PABPN1编码的mRNA或蛋白的表达，或减少PABPN1蛋白的核聚集的存在，被认为对于治疗应用是有用的，例如，通过减少内源性PABPN1的表达并替代一些或全部具有本文所述的引起OPMD的PABPN1蛋白的内源性PABPN1来治疗OPMD。
动物模型
有几种小动物模型可用于研究OPMD，其实例描述于Uyama等人，(2005)ActaMyologica，24(2)：84-88和Chartier和Simonelig(2013)Drug Discovery Today：technologies，10：e103-107。示例性动物模型是A17.1转基因小鼠模型，先前已描述于Davies等人(2005)自然医学(Nature Medicine)，11：672-677和Trollet等人(2010)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)，19(11)：2191-2207。
任何前述动物模型可用于测定本发明的shmiR或ddRNAi构建体敲低、降低或抑制由PABPN1基因编码的RNA或蛋白的表达的功效。
本文已经就细胞模型描述了用于测定PABPN1基因表达的方法，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
用于替代功能性PABPN1的试剂
在一个实例中，本发明提供了用于将功能性PABPN1蛋白替代为例如，细胞或动物的试剂。功能性PABPN1蛋白不会引起OPMD，也不会由本发明的shmiR或shRNA靶向的mRNA转录物编码。
在一个实例中，用于将功能性PABPN1蛋白替代至细胞或动物的试剂是编码功能性PABPN1蛋白的核酸，例如DNA或cDNA。例如，编码功能性PABPN1蛋白的核酸可以是密码子优化的，例如，含相对于野生型PABPN1核酸但编码相同氨基酸的一个或多个简并或摆动碱基，使得编码功能性PABPN1蛋白的相应mRNA序列不被本发明的shmiR或shRNA识别。例如，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸可在本发明的shmiR或shRNA靶向的区域内包括相对于野生型PABPN1核酸的一个或多个简并或摆动碱基。在一个实例中，一个或多个简并或摆动碱基位于本发明的效应子序列shmiR或shRNA的种子区内。
在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的核酸被密码子优化，使得其相应的mRNA序列不被本发明的shmiR或shRNA识别。优选地，由密码子优化的核酸序列编码的功能性PABPN1蛋白包括SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列，即，野生型人PABPN1蛋白的氨基酸序列。技术人员将理解存在许多可用于编码功能性PABPN1蛋白的核苷酸序列组合，并且核苷酸序列的选择将最终取决于shmiR或shRNA的效应子序列，即，使得密码子优化的核酸不被shmiR或shRNA识别。在一个实例中，用于替代功能性PABPN1蛋白的试剂是包括SEQ ID NO：73所示序列的核酸。在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的核酸还可以包括Kozak序列。
在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸与适于表达功能性PABPN1蛋白的启动子可操作地连接。适于在肌肉中表达功能性PABPN1蛋白的启动子可能是特别合适的。适用于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的一个示例性启动子是Spc512启动子。适用于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的另一个示例性启动子是CK8启动子。然而，可以使用本领域已知的任何合适的启动子。例如，在US 20110212529A1中描述了与编码功能性PABPN1蛋白的核酸一起使用的其他合适的启动子。
如本文所述，可用于本发明的一些实例中的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。
在一个实例中，编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸可以另外包括一种或多种增强子以增加该功能性PABPN1蛋白及其对应的mRNA转录物的表达。适用于本发明的该实例的增强子将是本领域技术人员已知的。
编码功能性PABPN1蛋白的核酸可以包括在表达载体(vector)中。已经在本发明的核酸和ddRNAi构建体的上下文中描述了示例性表达载体(vector)，并应对其加以必要的变更后适用于本实例。
因此，在一个实例中，用于将功能性PABPN1蛋白替代至细胞或动物的试剂可以是包括编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸的表达载体(vector)。例如，本发明的表达载体(vector)可以包括编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸和用于其表达的启动子，例如，SPC512启动子或CK8启动子。在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸还可以包括Kozak序列。
在一个实例中，编码如本文所述的功能性PABPN1蛋白的核酸可以包括在质粒表达载体(vector)内。合适的质粒表达载体(vector)已经在本文中描述并且将是本领域已知的。在一个实例中，合适的质粒表达载体(vector)是pAAV载体(vector)，例如，pscAAV质粒载体(vector)或pssAAV质粒载体(vector)。
在一个实例中，表达载体(vector)是微环DNA。本文已经描述了微环DNA载体(vector)。
在一个实施例中，表达载体(vector)是病毒载体(vector)。例如，基于任何合适的病毒的病毒载体(vector)可用于递送编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸。此外，可以使用杂交病毒***。病毒递送***的选择将取决于各种参数，例如递送的靶向组织、***的转导效率、致病性、免疫学和毒性问题等。
在本发明的RNA和ddRNAi构建体的上下文中已经描述了用于将遗传物质递送至细胞或动物的示例性病毒***，并应对其加以必要的变更后适用于本实例。
在一个实例中，病毒载体(vector)是AAV(例如，AAV9或修饰的AAV9)。
在一个实例中，病毒载体(vector)是AdV载体(vector)。
在一个实例中，病毒载体(vector)是慢病毒。
本领域技术人员已知的其他病毒或非病毒***可用于将编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸递送至目的细胞，包括但不限于基因缺失的腺病毒-转座子载体(vector)(参见Yant等人，Nature Biotech，20：999-1004(2002))；衍生自辛德毕斯病毒(Sindbis virus)或塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)的***(参见Perri等人，J.Virol.，74(20)：980207(2002))；衍生自新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus)或仙台病毒(Sendai virus)的***。
根据一个实例，其中编码如本文所述的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸与本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)一起提供，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸可以包括在与该核酸或ddRNAi构建体相同的表达载体(vector)内。因此，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸和本发明的核酸或ddRNAi构建体可作为单一DNA构建体提供，例如，在表达载体(vector)内。
在其中一起提供编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸和本发明的核酸或ddRNAi构建体的替代实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸和核酸或ddRNAi构建体可包括在不同的表达载体(vector)内。当编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸和核酸或ddRNAi构建体包括在不同的表达载体(vector)内时，相应的表达载体(vector)可以是相同类型的载体(vector)或不同类型的载体(vector)。
测试功能性PABPN1
动物模型
已经描述了用于研究OPMD的示例性动物模型。
前述动物模型中的任一种可用于测定在本发明的一种或多种核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)(表达本发明的一种或多种shmiR)存在下，本发明的试剂在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效。
本文已经就细胞模型描述了用于测定PABPN1表达的方法，并应对其加以必要的变更后适用于本发明的本实例。
在一个实例中，组织学和形态学分析可用于测定在本发明的一种或多种核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)(表达本发明的一种或多种shmiR)存在下，本发明的试剂在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效。可用于确定本发明的药剂在体内替代功能性PABPN1蛋白的功效的其他测定描述于Trollet等人，(2010)人类分子遗传学(HumanMolecular Genetics)，19(11)：2191-2207。
用于ddRNAi和功能性PABPN1替代的单一DNA构建体
本发明还提供了包括编码如本文描述的功能性PABPN1蛋白的核酸和本发明的一种或多种ddRNAi构建体的单一DNA构建体。实施例2中描述了包括编码功能性PABPN1蛋白的核酸和本发明的ddRNAi构建体的示例性DNA构建体。在一个实例中，DNA构建体可包括如本文所述的单一ddRNAi构建体以及编码功能性PABPN1蛋白的核酸。在另一个实例中，DNA构建体可以包括与编码功能性PABPN1蛋白的核酸组合的多种ddRNAi构建体。在DNA构建体的每种实例中，编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被ddRNAi构建体的shmiR靶向。
在一个实例中，功能性PABPN1蛋白是野生型人PABPN1蛋白，例如具有SEQ ID NO：74所示的序列。应理解，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的DNA序列可根据ddRNAi构建体编码的shmiR而变化。即，待修饰的PABPN1 mRNA转录物中的特异性密码子可根据ddRNAi构建体编码的shmiR的效应子序列而变化。在一个实例中，编码功能性PABPN1蛋白的密码子优化的DNA序列在SEQ ID NO：73中示出。
DNA构建体还可以包括一个或多个启动子，例如，以驱动由ddRNAi构建体编码的功能性PABPN1蛋白和/或shmiR的表达。可用于本发明的一些实例中的启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。用于本发明的DNA构建体的示例性启动子是肌肉特异性启动子，例如Spc512和CK8。然而，本领域已知的任何合适的启动子都被考虑用于本文所述的DNA构建体，例如在US 20110212529A1中描述的那些。
该DNA构建体可以以表达载体(vector)的形式提供或可以包括在表达载体(vector)内。合适的表达载体(vector)已经在本文中描述并且将是本领域已知的。
在一个实施例中，表达载体(vector)是病毒载体(vector)。例如，基于任何合适病毒的病毒载体(vector)可用于递送本发明的单一DNA构建体。此外，可以使用杂交病毒***。病毒递送***的选择将取决于各种参数，例如递送的靶向组织、***的转导效率、致病性、免疫学和毒性问题等。
在另一个实例中，合适的质粒表达载体(vector)是pAAV载体(vector)，例如，pscAAV质粒载体(vector)或pssAAV质粒载体(vector)。在本发明的ddRNAi构建体的上下文中已经描述了用于将遗传物质递送至细胞或动物的其他示例性病毒***，并应对其加以必要的变更后适用于本实例。
在一个实例中，以pAAV表达载体(vector)的形式提供DNA构建体，pAAV表达载体(vector)在5’至3’方向上包括肌肉特异性启动子(例如，Spc512启动子)，如本文所述的ddRNAi构建体和如本文所述的PABPN1构建体，例如，其中ddRNAi构建***于编码功能性PABPN1蛋白的核酸的3’非翻译区(UTR)。根据本实施例的DNA构建体示于图1A。
根据本实施例的示例性DNA构建体是pAAV表达载体(vector)，其在5’至3’方向包括：
(a)肌肉特异性启动子，例如，Spc512；
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的本文所述的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被ddRNAi构建体编码的shmiR靶向的mRNA转录物；以及
(c)包括包括编码本文所述的shmiR17的DNA序列的核酸和包括编码本文所述的shmiR13的DNA序列的核酸的本发明的ddRNAi构建体。
根据该实施例，DNA构建体可以包括SEQ ID NO：72所示的DNA序列或由SEQ ID NO：72所示的DNA序列组成。
包括在本发明的DNA构建体中的编码shmiR13和shmiR17的示例性ddRNAi构建体包括包括编码包括SEQ ID NO：31所示的效应子序列的shmiR的DNA序列和与SEQ ID NO：31所示的序列基本互补的效应子互补序列例如，SEQ ID NO：30(ShmiR13)所示的效应子互补序列或由其组成的核酸，以及包括编码shmiR的DNA序列的核酸，shmiR包括SEQ ID NO：39所示的效应子序列和与SEQ ID NO：39所示的序列基本互补的效应子互补序列，例如SEQ ID NO：38(ShmiR17)所述的效应子互补序列或由其组成的核酸。例如，根据DNA构建体的该实例的ddRNAi构建体可包括包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸，以及包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
虽然已经描述了某些实例，但是应当理解，根据本发明的DNA构建体可包括本文所述的编码一种或多种shmiR的任何ddRNAi构建体。例如，编码实施例1至5中描述的shmiR的ddRNAi构建体可特别适于包括在本发明的DNA构建体中。
组合物和载体(carrier)
在一些实例中，在组合物中提供本发明的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)。在一些实例中，在组合物中提供了编码本发明的功能性PABPN1蛋白的核酸。在一些实例中，本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)与编码本发明的功能性PABPN1蛋白的核酸一起以组合物提供。在一些实例中，一种或多种核酸或ddRNAi构建体和编码功能性PABPN1蛋白的核酸提供于组合物中(例如，本发明的DNA构建体中)的相同表达载体(vector)中。
如本文，表达载体(vector)可包括单独的或与编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸组合的本发明的ddRNAi构建体。本文提及的表达载体(vector)和/或包括该表达载体(vector)的组合物因此将被理解为涵盖：(i)包括本发明的ddRNAi构建体的表达载体(vector)，或包括其的组合物；(ii)包括本发明的ddRNAi构建体和编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸两者的表达载体(vector)，或包括其的组合物；或(iii)包括编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸的表达载体(vector)，或包括其的组合物。
因此，本发明的组合物可包括(i)包括本发明的ddRNAi构建体的表达载体(vector)，和(ii)包括编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸的表达载体(vector)。或者，本发明的组合物可包括含有本发明的ddRNAi构建体的单一表达载体(vector)和编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸。
在又一个实例中，可以在一种组合物中提供包括本发明的ddRNAi构建体的表达载体(vector)，并且可以在另一种组合物中提供包括编码本发明的功能性PABPN1蛋白的密码子优化的核酸的表达载体(vector)，例如，将其包装在一起。
本发明的组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体(carrier)或稀释剂。例如，该组合物可以包括适于在给药之后将本发明的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)递送到受试对象肌肉的载体(carrier)。
在一些实例中，载体(carrier)是基于脂质的载体(carrier)、阳离子脂质或脂质体核酸复合物、脂质体、微团、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。
在一些实例中，载体(carrier)是基于可生物降解聚合物的载体(carrier)，从而形成阳离子聚合物-核酸复合物。例如，载体(carrier)可以是适于将本发明的一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)递送至眼的肌细胞或组织的阳离子聚合物微粒。使用阳离子聚合物将组合物递送至细胞是本领域已知的，如Judge等人，自然(Nature)25：457-462(2005)中描述的，其内容通过引用并入本文。示例性的基于阳离子聚合物的载体(carrier)是阳离子DNA结合聚合物，例如聚乙烯亚胺。适用于与本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)复合和递送本发明的核酸，ddRNAi构建体或表达载体(vector)的其他阳离子聚合物包括聚(L-赖氨酸)(PLL)、壳聚糖、PAMAM树枝状大分子和聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯(pDMAEMA)。其他聚合物包括聚β-氨基酯。这些是本领域已知的其他合适的阳离子聚合物，并且描述于Mastrobattista和Hennink，自然材料(NatureMaterials)，11：10-12(2012)，WO/2003/097107和WO/2006/041617，其全部内容通过引用并入本文。已经开发了用于各种递送途径的此类载体(carrier)制剂，递送途径包括肠胃外皮下注射、静脉注射和吸入。
在另一个实例中，载体(carrier)是基于环糊精的载体(carrier)，例如环糊精聚合物-核酸复合物。
在另一个实例中，载体(carrier)是基于蛋白的载体(carrier)，例如阳离子肽-核酸复合物。
在另一个实例中，载体(carrier)是脂质纳米颗粒。示例性纳米颗粒描述于例如US7514099中。
在一些实例中，本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)与脂质纳米颗粒组合物一起配制，脂质纳米颗粒组合物(例如，以40/48/2/10的比率)包括阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC，(例如，以40/48/2/10的比率)包括阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMA/DSPC，或例如，(以60/38/2的比率使用)包括阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG。在一些实例中，阳离子脂质是DMA中的辛基CL、DMA中的DL、L-278、DLinKC2DMA或MC3。
在另一个实例中，本发明的核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)与WO 2010/021865中描述的任何阳离子脂质制剂一起配制；WO 2010/080724；WO 2010/042877；WO2010/105209或WO 2011/022460。
在另一个实例中，本发明的核酸或ddRNAi构建体或表达载体(vector)被缀合至或复合至另一种化合物，例如以促进核酸、ddRNAi构建体或表达载体(vector)的递送。此类缀合物的非限制性实例描述于US 2008/0152661和US 2004/0162260(例如，CDM-LBA、CDM-Pip-LBA、CDM-PEG、CDM-NAG等)中。
在另一个实例中，聚乙二醇(PEG)共价连接至本发明的核酸或ddRNAi构建体或DNA构建体或表达载体(vector)。所连接的PEG可以是任何分子量，例如，从约100至约50，000道尔顿(Da)。
在又一个实例中，本发明的核酸构建体、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)与包括表面修饰的脂质体的载体(carrier)一起配制，这些脂质体含有聚(乙二醇)脂质(经PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体)，如在例如WO 96/10391中公开的；WO 96/10390；或WO 96/10392。
在一些实例中，本发明的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)也可以与聚乙烯亚胺或其衍生物配制或复合，如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物。
在其他实例中，本发明的核酸构建体、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)与膜破裂剂(例如美国专利申请公开2001/0007666号中描述的那些)复合。
其他载体(carrier)包括环糊精(参见例如，Gonzalez等人，结合物化学(Bioconjugate Chem.)，1999，10，1068-1074；或WO 03/46185)，聚(乳酸-共-乙醇)酸(PLGA)和PLCA微球(参见例如US 2002130430)。
组合物将合意地包括增加本发明的核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)的生物稳定性的材料和/或增加组合物选择性地定位至肌细胞和/或穿透肌细胞的能力的材料。本发明的治疗组合物可以以在药学上可接受的载体(carrier)(例如，生理盐水)中施用，其基于给药的模式和途径以及标准药学实践来选择。本领域普通技术人员可以容易地配制包括本发明的一种或多种核酸、ddRNAi构建体、DNA构建体或表达载体(vector)的药物组合物。在一些情况下，使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实例中，将血管收缩剂加入到制剂中。提供无菌且无热原的根据本发明的组合物。在本领域的标准参考书，雷明顿：药物科学和实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(以前为雷明顿药学科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版公司，和在USP/NF中描述了用于药物制剂的合适的药物载体(carrier)以及药物需要。
药物组合物的体积、浓度和制剂以及给药方案可以特别定制以使细胞递送最大化，同时使毒性如炎性反应最小化，例如，如果需要可以使用具有相应低浓度活性成分的相对大体积(5、10、20、50ml或更多)，以及包括抗炎化合物如皮质类固醇。
本发明的组合物可以被配制用于通过任何合适的途径(例如，适合于递送至受试对象的咽肌的途径)给药。例如，给药途径包括但不限于肌内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及经皮或通过吸入或栓剂。示例性给药途径包括静脉内(IV)注射、肌内(IM)注射、口服、腹膜内、皮内、动脉内和皮下注射。在一个实例中，本发明的组合物被配制成用于肌内注射给药(例如，配制成用于咽肌给药)。在一个优选的实施方案中，直接给药到受试对象的咽肌。此类组合物可用于药物应用，并且可容易地在合适的无菌、无热原的载体(vehicle)(例如，用于注射的缓冲盐水)中配制，用于肠胃外给药，例如，肌内注射(例如，直接用于咽肌)、静脉内注射(包括静脉内输注)、皮下注射和腹膜内给药。在一个优选的实施方案中，给药途径例如肌内注射(例如，直接施用至咽肌)实现了向肌肉组织的有效递送和编码本发明的PABPN1的ddRNAi构建体和/或密码子优化的核酸的转染，以及RNA和/或密码子优化的核酸在其中的表达。
表1-PABPN1中的靶向区域
区域ID 区域序列(5′-3′) SEQ ID NO：
区域2 GAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUCCACCUC SEQ ID NO：1
区域3 GAACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUG SEQ ID NO：2
区域4 GAAGCUGAGAAGCUAAAGGAGCUACAGA SEQ ID NO：3
区域5 GGGCUAGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCC SEQ ID NO：4
区域6 CUGUGUGACAAAUUUAGUGGCCAUCCCA SEQ ID NO：5
区域7 GACUAUGGUGCAACAGCAGAAGAGCUGG SEQ ID NO：6
区域9 CGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU SEQ ID NO：7
区域11 CAGUGGUUUUAACAGCAGGCCCCGGGGU SEQ ID NO：8
区域13 AGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCCUUACU SEQ ID NO：9
区域14 GGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUCCA SEQ ID NO：10
区域15 AUUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUGCCC SEQ ID NO：11
区域16 GGAGGAAGAAGCUGAGAAGCUAAAGGAG SEQ ID NO：12
区域17 AACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGA SEQ ID NO：13
表2-shmiR效应子和效应子互补序列
Figure BDA0003012696340000531
表3-shmiR序列
Figure BDA0003012696340000541
表4-Shmir编码盒
Figure BDA0003012696340000551
实施例1-靶向PABPN1的shmiR的设计
使用公众可获得的siRNA设计算法(包括Ambion、Promega、Invitrogen、Origene和MWG)从PABPN1 mRNA序列中鉴定出代表用于siRNA构建体设计的潜在靶点的序列：选择的序列在人、非人灵长类、牛和小鼠物种中是保守的。将编码候选siRNA的序列掺入pre-miR30a支架以产生编码短发夹微小RNA(shmiR)的序列，短发夹微小RNA(shmiR)包括5’侧翼区(SEQID NO：41)、siRNA有义链序列(效应子互补序列)、茎/环连接序列(SEQ ID NO：40)、siRNA反义链(效应子序列)和3’侧翼区(SEQ ID NO：42)。代表性shmiR的预测二级结构示于图1C中。所设计的shmiR的PABPN1 mRNA转录物的靶区域示于表1中，相应的shmiR效应子序列(反义链)示于表2中。
实施例2-产生用于同时发生内源PABPN1的基因沉默和用密码子优化的PABPN1替代的单一“沉默和替代构建体”。
创建了表达shmiR17和shmiR13(例如，如在表3和4中描述的)以及optPABPN1序列的单链腺相关病毒2型(ssAAV2)质粒。
沉默和替代构建体(下文称为“SR-构建体”)通过将编码shmiR17和shmiR13的DNA序列(如表4中)亚克隆到pAAV2载体(vector)骨架(pAAV-shmiR病毒质粒)中的optPABPN1转录物的3’非翻译区中而产生。optPABPN1和两种shmiR在单一转录物中的表达由肌肉特异性启动子Spc512驱动。图1(A)、图1(B)和图2中提供了SR构建体的示意图。
然后产生重组假型AAV载体(vector)原种。简言之，HEK293T细胞在Dulbecco‘s改良的Eagle’s培养基中的细胞工厂中培养，添加10％的FBS，在37℃和5％CO2的条件下孵育。根据制造商的说明书将pAAV-shmiR病毒质粒(SR-构建体)和pAAV辅助病毒和pAAV repcap8质粒或pAAV repcap9或pAAV辅助病毒和pAAVRH74质粒(如WO 2013123503A1所述)与磷酸钙进行复合。然后用pAAV-shmiR质粒(SR-构建体)结合pAAV辅助病毒和以下衣壳之一进行三重转染；在HEK293T细胞中的pAAVrepcap8、pAAVrepcap9或pAAVRH74。然后将HEK293T细胞在37℃和5％CO2下培养72小时，此后将细胞裂解并通过碘克沙醇(Sigma-Aldrich)分级-梯度超速离心然后氯化铯超速离心来纯化表达SR构建体的颗粒。用定量聚合酶链反应(Q-PCR)对载体(vector)基因组进行定量。
实施例3-使用单一载体(vector)“沉默和替代”方法的体内研究。
为了测试实施例2中描述的SR-构建体在OPMD相关疾病模型中的体内功效，将SR-构建体以一定剂量范围单独施用，通过肌内注射到10-12周龄的A17小鼠的胫骨前肌(TA)中。给药剂量分别为每块肌肉7.5x1011、2.5x1011、5x1010、1x1010、2x109和4x108个载体(vector)基因组(vg)。给年龄匹配的A17小鼠注射盐水作为未处理组。在处理后14或20周处死小鼠。
实施例4-SR-构建体处理的A17小鼠中shmiR产生、PABPN1沉默和密码子优化的PABPN1表达的定量测量。
SR-构建体处理14周后，收获实施例3的A17小鼠的TA肌并提取RNA。对TA肌肉中shmiR的SR-构建体依赖的表达进行了定量(图3A)。shmiR的定量表达水平依赖于SR-构建体剂量，PABPN1(包括expPABPN1)(图3B)的沉默和正常PABPN1水平(图3C)的恢复也是如此。
实施例5-SR-构建体处理的A17小鼠中的核内内含物(INI)的减少。
在实施例3的第14周A17小鼠中测试SR-构建体对核内内含物(INI)的持久性的影响。还包括FvB野生型小鼠作为健康对照。AAV注射后14周，收集肌肉并安置用于组织学研究。切片用1M KCl预处理以优先从组织中洗脱所有可溶PABPN1。PABPN1(绿色)和层粘连蛋白(一种在肌肉细胞外基质中丰富的蛋白质)(红色)的免疫荧光在处理的肌肉的部分中被检测到，并且显示在SR-构建体处理的肌肉中PABPN1阳性的核内内含物(INI)的数量显著减少，并且具有剂量效应(图4A)。对肌肉切片中含有INI的细胞核百分比的量化表明，与未经处理的A17肌肉相比，使用SR-构建体的治疗显著减少了INI的数量(采用Bonferroni事后检验的单因素方差检验(One-way Anova test)，***p＜0.001，ns：不显著)(图4B)。
实施例6-用SR-构建体治疗改善了所治疗肌肉的生理特性和功能。
在实施例3的第14周的A17小鼠中，测量了处理过的肌肉的生理特性和功能。还包括FvB野生型小鼠作为健康对照。通过原位肌肉生理学测量TA肌肉产生的最大力(图5A)。SR-构建体以剂量依赖性方式显著增加由TA肌肉产生的最大力。还在SR-构建体给药后14周测量相对于体重(BW)归一化的肌肉重量(图5B)。当每TA注射剂量超过1e10 Vg时，归一化至体重的SR处理组的肌重与对照组FvB小鼠的相当(平均值±SEM，n＝10，使用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验，*p＜0.05，**p＜0.001，*p＜0.01，ns：不显著)。
实施例7-肌肉功能随时间恢复
SR-构建体处理的A17小鼠和FvB野生型小鼠的TA肌肉产生的最大力通过SR-构建体给药后14周(图6A)和SR-构建体给药后20周(图6B)的原位肌肉生理学来测量。对于中等剂量(每TA 1e10 vg和6e10 vg)，与注射后14周相比，在20周时对肌肉力量的有益效果更加显著(平均值±SEM，n＝10，使用Bonferroni事后检验进行单因素方差检验，***p＜0.001，**p＜0.01)。
实施例8-直接给药至绵羊咽肌
将SR-构建体直接注射到绵羊的咽肌中，PABPN1在绵羊和人类之间高度保守，包括第95位的一个氨基酸残基以外的所有氨基酸残基。
将SR-构建体直接注射到绵羊的咽肌中(图7A)。分别向绵羊研究中的两只动物的环咽肌(CP)注射1.5e13 vg SR-构建体，并向咽肌(咽部))注射1.0e13 vg SR-构建体。用SR-构建体(1.0e10 vg至1.0e13 vg)处理的剩余10只动物仅接受CP注射。CP注射总量1.5ml(每次3次，每次0.5ml)。咽部注射总量为6ml(左右各注射2次，每次1.5ml)。
使用放射性标记乳膏剂的放射成像显示，人类OPMD患者存在严重的吞咽困难，存在“误入”的风险(图7B)。
本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的广义范围的情况下，可以对上述实施方案行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
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gagaagcaga ugaauaugag uccaccuc 28
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gaacgaggua gagaagcaga ugaauaug 28
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gaagcugaga agcuaaagga gcuacaga 28
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<213> 智人
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gggcuagagc gacaucaugg uauucccc 28
<210> 5
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<213> 智人
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cugugugaca aauuuagugg ccauccca 28
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gacuauggug caacagcaga agagcugg 28
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cgagguagag aagcagauga auaugagu 28
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cagugguuuu aacagcaggc cccggggu 28
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<213> 智人
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agagcgacau caugguauuc cccuuacu 28
<210> 10
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<212> RNA
<213> 智人
<400> 10
gguagagaag cagaugaaua ugagucca 28
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auugaggaga agauggaggc ugaugccc 28
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<212> RNA
<213> 智人
<400> 12
ggaggaagaa gcugagaagc uaaaggag 28
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<212> RNA
<213> 智人
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aacgagguag agaagcagau gaauauga 28
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR2的效应子序列
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agcagaugaa uaugagucca 20
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<223> shmiR2的效应子互补序列
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uggacucaua uucaucugcu u 21
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<213> 人工序列
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<223> shmiR3的效应子序列
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gagguagaga agcagaugaa 20
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR3的效应子互补序列
<400> 17
uucaucugcu ucucuaccuc g 21
<210> 18
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR4的效应子序列
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<223> shmiR4的效应子互补序列
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uagcuccuuu agcuucucag c 21
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<223> shmiR5的效应子序列
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uagagcgaca ucaugguauu 20
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<223> shmiR5的效应子互补序列
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aauaccauga ugucgcucua g 21
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gugacaaauu uaguggccau 20
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<223> shmiR6的效应子互补序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
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auggugcaac agcagaagag 20
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<223> shmiR7的效应子互补序列
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cucuucugcu guugcaccau a 21
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<213> 人工序列
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guagagaagc agaugaauau 20
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<213> 人工序列
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<223> shmiR9的效应子互补序列
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<223> shmiR11的效应子互补序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR13的效应子序列
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cgacaucaug guauuccccu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR13的效应子互补序列
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aggggaauac caugaugucg c 21
<210> 32
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR14的效应子序列
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gagaagcaga ugaauaugag 20
<210> 33
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR14的效应子互补序列
<400> 33
cucauauuca ucugcuucuc u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR15的效应子序列
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aggagaagau ggaggcugau 20
<210> 35
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR15的效应子互补序列
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aucagccucc aucuucuccu c 21
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> shmiR16的效应子序列
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gaagaagcug agaagcuaaa 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR16的效应子互补序列
<400> 37
uuuagcuucu cagcuucuuc c 21
<210> 38
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR17的效应子序列
<400> 38
agguagagaa gcagaugaau 20
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR17的效应子互补序列
<400> 39
auucaucugc uucucuaccu c 21
<210> 40
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 茎环
<400> 40
acugugaagc agaugggu 18
<210> 41
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pri-miRNA骨架的5'侧翼序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is u or a
<400> 41
gguauauugc uguugacagu gagcgn 26
<210> 42
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pri-miRNA骨架的3'侧翼序列
<400> 42
cgccuacugc cucggacuuc aa 22
<210> 43
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR2的RNA序列
<400> 43
gguauauugc uguugacagu gagcguagca gaugaauaug aguccaacug ugaagcagau 60
ggguuggacu cauauucauc ugcuucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 44
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR3的RNA序列
<400> 44
gguauauugc uguugacagu gagcgagagg uagagaagca gaugaaacug ugaagcagau 60
ggguuucauc ugcuucucua ccucgcgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 45
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR4的RNA序列
<400> 45
gguauauugc uguugacagu gagcgacuga gaagcuaaag gagcuaacug ugaagcagau 60
ggguuagcuc cuuuagcuuc ucagccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 46
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR5的RNA序列
<400> 46
gguauauugc uguugacagu gagcgauaga gcgacaucau gguauuacug ugaagcagau 60
ggguaauacc augaugucgc ucuagcgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 47
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR6的RNA序列
<400> 47
gguauauugc uguugacagu gagcgaguga caaauuuagu ggccauacug ugaagcagau 60
ggguauggcc acuaaauuug ucacacgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 48
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR7的RNA序列
<400> 48
gguauauugc uguugacagu gagcgaaugg ugcaacagca gaagagacug ugaagcagau 60
gggucucuuc ugcuguugca ccauacgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 49
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR9的RNA序列
<400> 49
gguauauugc uguugacagu gagcgaguag agaagcagau gaauauacug ugaagcagau 60
ggguauauuc aucugcuucu cuacccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 50
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR11的RNA序列
<400> 50
gguauauugc uguugacagu gagcgagguu uuaacagcag gccccgacug ugaagcagau 60
gggucggggc cugcuguuaa aaccacgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 51
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR13的RNA序列
<400> 51
gguauauugc uguugacagu gagcgacgac aucaugguau uccccuacug ugaagcagau 60
ggguagggga auaccaugau gucgccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 52
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR14的RNA序列
<400> 52
gguauauugc uguugacagu gagcgugaga agcagaugaa uaugagacug ugaagcagau 60
gggucucaua uucaucugcu ucucucgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 53
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR15的RNA序列
<400> 53
gguauauugc uguugacagu gagcgaagga gaagauggag gcugauacug ugaagcagau 60
ggguaucagc cuccaucuuc uccuccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 54
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR16的RNA序列
<400> 54
gguauauugc uguugacagu gagcgagaag aagcugagaa gcuaaaacug ugaagcagau 60
ggguuuuagc uucucagcuu cuucccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 55
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR17的RNA序列
<400> 55
gguauauugc uguugacagu gagcgaaggu agagaagcag augaauacug ugaagcagau 60
ggguauucau cugcuucucu accuccgccu acugccucgg acuucaa 107
<210> 56
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR2的DNA序列
<400> 56
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtagca gatgaatatg agtccaactg tgaagcagat 60
gggttggact catattcatc tgcttcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 57
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR3的DNA序列
<400> 57
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagagg tagagaagca gatgaaactg tgaagcagat 60
gggtttcatc tgcttctcta cctcgcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 58
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR4的DNA序列
<400> 58
ggtatattgc tgttgacagt gagcgactga gaagctaaag gagctaactg tgaagcagat 60
gggttagctc ctttagcttc tcagccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 59
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR5的DNA序列
<400> 59
ggtatattgc tgttgacagt gagcgataga gcgacatcat ggtattactg tgaagcagat 60
gggtaatacc atgatgtcgc tctagcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 60
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR6的DNA序列
<400> 60
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtga caaatttagt ggccatactg tgaagcagat 60
gggtatggcc actaaatttg tcacacgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 61
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR7的DNA序列
<400> 61
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaatgg tgcaacagca gaagagactg tgaagcagat 60
gggtctcttc tgctgttgca ccatacgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 62
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR9的DNA序列
<400> 62
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtag agaagcagat gaatatactg tgaagcagat 60
gggtatattc atctgcttct ctacccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 63
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR11的DNA序列
<400> 63
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaggtt ttaacagcag gccccgactg tgaagcagat 60
gggtcggggc ctgctgttaa aaccacgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 64
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR13的DNA序列
<400> 64
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgac atcatggtat tcccctactg tgaagcagat 60
gggtagggga ataccatgat gtcgccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 65
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR14的DNA序列
<400> 65
ggtatattgc tgttgacagt gagcgtgaga agcagatgaa tatgagactg tgaagcagat 60
gggtctcata ttcatctgct tctctcgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 66
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR15的DNA序列
<400> 66
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaagga gaagatggag gctgatactg tgaagcagat 60
gggtatcagc ctccatcttc tcctccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 67
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR16的DNA序列
<400> 67
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagaag aagctgagaa gctaaaactg tgaagcagat 60
gggttttagc ttctcagctt cttcccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 68
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR17的DNA序列
<400> 68
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaggt agagaagcag atgaatactg tgaagcagat 60
gggtattcat ctgcttctct acctccgcct actgcctcgg acttcaa 107
<210> 69
<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR3、shmiR14和密码子优化的PABPN1的双构建体版本1
<400> 69
cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60
ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120
ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180
gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240
ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300
ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360
ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420
cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480
cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540
tgctgttgac agtgagcgag aggtagagaa gcagatgaaa ctgtgaagca gatgggtttc 600
atctgcttct ctacctcgcg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660
ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720
agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgtg agaagcagat 780
gaatatgaga ctgtgaagca gatgggtctc atattcatct gcttctctcg cctactgcct 840
cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900
gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960
tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020
tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080
ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140
gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200
tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260
gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320
catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380
ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440
tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500
gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560
ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620
agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680
agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740
gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800
catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860
ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920
ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980
cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040
gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100
cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160
ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220
ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280
ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520
tgggctctat gg 2532
<210> 70
<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR17、shmiR13和密码子优化的PABPN1的双构建体版本1
<400> 70
cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60
ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120
ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180
gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240
ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300
ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360
ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420
cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480
cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540
tgctgttgac agtgagcgaa ggtagagaag cagatgaata ctgtgaagca gatgggtatt 600
catctgcttc tctacctccg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660
ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720
agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgac gacatcatgg 780
tattccccta ctgtgaagca gatgggtagg ggaataccat gatgtcgccg cctactgcct 840
cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900
gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960
tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020
tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080
ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140
gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200
tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260
gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320
catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380
ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440
tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500
gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560
ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620
agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680
agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740
gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800
catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860
ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920
ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980
cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040
gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100
cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160
ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220
ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280
ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520
tgggctctat gg 2532
<210> 71
<211> 1943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR3、shmiR14和密码子优化的PABPN1的双构建体版本2
<400> 71
cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60
ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120
gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180
gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240
cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300
gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360
gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420
cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480
gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540
tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600
ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660
ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720
gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780
aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840
ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900
acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960
cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020
gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080
tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140
acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200
ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260
gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320
tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgagaggta gagaagcaga tgaaactgtg 1380
aagcagatgg gtttcatctg cttctctacc tcgcgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440
ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500
tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560
gcgtgagaag cagatgaata tgagactgtg aagcagatgg gtctcatatt catctgcttc 1620
tctcgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680
tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920
tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943
<210> 72
<211> 1943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码shmiR17、shmiR13和密码子优化的PABPN1的双构建体版本2
<400> 72
cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60
ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120
gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180
gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240
cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300
gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360
gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420
cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480
gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540
tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600
ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660
ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720
gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780
aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840
ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900
acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960
cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020
gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080
tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140
acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200
ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260
gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320
tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgaaggtag agaagcagat gaatactgtg 1380
aagcagatgg gtattcatct gcttctctac ctccgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440
ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500
tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560
gcgacgacat catggtattc ccctactgtg aagcagatgg gtaggggaat accatgatgt 1620
cgccgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680
tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920
tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943
<210> 73
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人密码子优化的PABPN1 cDNA序列
<400> 73
atggccgctg ccgccgctgc tgctgccgca gccggcgctg ccggcggaag aggcagcggc 60
cctggcagac ggcggcatct ggtccctggc gccggagggg aggccggcga aggcgcccct 120
ggcggagccg gcgactacgg caacggcctg gaaagcgagg aactggaacc cgaggaactg 180
ctgctggaac ctgagcccga gccagagccc gaggaagagc cccctaggcc aagagccccc 240
cctggcgccc caggaccagg accaggctct ggggcaccag gctctcagga agaggaagaa 300
gagcccggcc tcgtcgaggg agacccaggc gatggcgcta tcgaagatcc cgagctggaa 360
gccatcaagg ccagagtgcg ggagatggaa gaggaggccg aaaaattgaa agagctgcag 420
aacgaagtcg aaaaacaaat gaacatgtcc ccccctcctg gaaatgctgg ccctgtgatc 480
atgagcatcg aggaaaagat ggaagccgac gcccggtcta tctacgtggg caacgtggac 540
tacggcgcca ccgccgaaga actggaagcc cactttcacg gctgtggcag cgtgaaccgg 600
gtgaccatcc tgtgcgacaa gttcagcggc caccccaagg gcttcgccta catcgagttc 660
agcgacaaag aaagcgtgcg gacctctctg gctctcgacg agtctctgtt caggggaagg 720
cagatcaagg tcatccccaa gcggaccaac aggcccggca tcagcaccac cgacagaggc 780
ttccctaggg ctaggtacag agcccggacc accaactaca acagcagcag aagccggttc 840
tacagcggct tcaattctcg gcctagaggc agagtgtacc ggggcagggc cagggccacc 900
tcctggtaca gcccctactg a 921
<210> 74
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人野生型PABPN1氨基酸序列
<400> 74
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn
35 40 45
Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro
50 55 60
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly
100 105 110
Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu
115 120 125
Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu
130 135 140
Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile
145 150 155 160
Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val
165 170 175
Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe
180 185 190
His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe
195 200 205
Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu
210 215 220
Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg
225 230 235 240
Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr
245 250 255
Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn
260 265 270
Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro
275 280 285
Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser
290 295 300
Pro Tyr
305
<210> 75
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人野生型PABPN1氨基酸序列（带FLAG标签）
<400> 75
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn
35 40 45
Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro
50 55 60
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly
100 105 110
Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu
115 120 125
Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu
130 135 140
Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile
145 150 155 160
Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val
165 170 175
Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe
180 185 190
His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe
195 200 205
Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu
210 215 220
Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg
225 230 235 240
Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr
245 250 255
Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn
260 265 270
Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro
275 280 285
Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser
290 295 300
Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
305 310
<210> 76
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人密码子优化的PABPN1氨基酸序列（带FLAG-标签）
<400> 76
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn
35 40 45
Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro
50 55 60
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly
100 105 110
Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu
115 120 125
Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu
130 135 140
Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile
145 150 155 160
Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val
165 170 175
Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe
180 185 190
His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe
195 200 205
Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu
210 215 220
Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg
225 230 235 240
Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr
245 250 255
Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn
260 265 270
Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro
275 280 285
Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser
290 295 300
Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
305 310
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtPABPN1-Fwd引物
<400> 77
atggtgcaac agcagaagag 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtPABPN1-Rev引物
<400> 78
ctttgggatg gccactaaat 20
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtPABPN1-探针
<400> 79
cggttgactg aaccacagcc atg 23
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optPABPN1-For引物
<400> 80
accgacagag gcttcccta 19
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optPABPN1-Rev引物
<400> 81
ttctgctgct gttgtagttg g 21
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optPABPN1-探针
<400> 82
tggtccgggc tctgtaccta gcc 23
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR3-Fwd引物
<400> 83
ttcatctgct tctctacctc g 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR13-Fwd引物
<400> 84
aggggaatac catgatgtcg c 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR14-Fwd引物
<400> 85
ctcatattca tctgcttctc t 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shmiR17-Fwd引物
<400> 86
attcatctgc ttctctacct c 21
<210> 87
<211> 921
<212> RNA
<213> 智人
<400> 87
auggcggcgg cggcggcggc ggcagcagca gcgggggcug cgggcggucg gggcuccggg 60
ccggggcggc ggcgccaucu ugugcccggg gccggugggg aggccgggga gggggccccg 120
gggggcgcag gggacuacgg gaacggccug gagucugagg aacuggagcc ugaggagcug 180
cugcuggagc ccgagccgga gcccgagccc gaagaggagc cgccccggcc ccgcgccccc 240
ccgggagcuc cgggcccugg gccugguucg ggagcccccg gcagccaaga ggaggaggag 300
gagccgggac uggucgaggg ugacccgggg gacggcgcca uugaggaccc ggagcuggaa 360
gcuaucaaag cucgagucag ggagauggag gaagaagcug agaagcuaaa ggagcuacag 420
aacgagguag agaagcagau gaauaugagu ccaccuccag gcaaugcugg cccggugauc 480
auguccauug aggagaagau ggaggcugau gcccguucca ucuauguugg caauguggac 540
uauggugcaa cagcagaaga gcuggaagcu cacuuucaug gcugugguuc agucaaccgu 600
guuaccauac ugugugacaa auuuaguggc caucccaaag gguuugcgua uauagaguuc 660
ucagacaaag agucagugag gacuuccuug gccuuagaug agucccuauu uagaggaagg 720
caaaucaagg ugaucccaaa acgaaccaac agaccaggca ucagcacaac agaccggggu 780
uuuccacgag cccgcuaccg cgcccggacc accaacuaca acagcucccg cucucgauuc 840
uacagugguu uuaacagcag gccccggggu cgcgucuaca ggggccgggc uagagcgaca 900
ucaugguauu ccccuuacua a 921
<210> 88
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有AAV VP1子序列包括PLA2结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is Gly or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Glu or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa is Val or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa is Arg or Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa is Ile or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa is Ser or Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa is Asn or Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa is Lys or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> Xaa is Glu or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa is Lys or Arg
<400> 88
Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Xaa Asn
1 5 10 15
Gly Leu Asp Xaa Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Asp Xaa Xaa Ala Xaa
20 25 30
Glu His Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro
35 40 45
Tyr Leu Xaa Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Xaa Xaa Leu Lys
50 55 60
<210> 89
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV8的修饰的VP1 PLA2子序列
<400> 89
Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn
1 5 10 15
Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu
20 25 30
Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro
35 40 45
Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys
50 55 60
<210> 90
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV9的修饰的VP1 PLA2子序列
<400> 90
Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu
20 25 30
Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro
35 40 45
Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys
50 55 60

Claims (35)

1.一种用于治疗患有眼咽肌营养不良(OPMD)的受试对象的方法，所述方法包括向所述受试对象施用组合物，所述组合物包括：
(a)包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列的核酸；以及
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的PABPN1构建体，功能性PABPN1蛋白具有不被所述核酸编码的所述shmiR靶向的mRNA转录物；其中所述组合物通过直接注射到所述受试对象的咽肌来施用。
2.一种抑制在受试对象中引起眼咽肌营养不良(OPMD)的PABPN1蛋白表达的方法，所述方法包括向所述受试对象施用组合物，所述组合物包括：
(a)ddRNAi构建体，包括包括编码短发夹微小RNA(shmiR)的DNA序列的核酸；以及
(b)包括编码功能性PABPN1蛋白的DNA序列的PABPN1构建体，所述功能性PABPN1蛋白具有不被所述ddRNAi构建体编码的所述shmiR靶向的mRNA转录物；其中所述组合物通过直接注射到所述受试对象的咽肌来施用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过直接注射到所述受试对象的咽肌来施用所述组合物以改善所述受试对象吞咽功能。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中组合物包括表达载体(vector)，所述表达载体(vector)包括所述ddRNAi构建体、所述PABPN1构建体或其组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表达载体(vector)在5’至3’方向包括所述ddRNAi构建体和所述PABPN1构建体。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述表达载体(vector)在5’至3’方向上包括所述PABPN1构建体和所述ddRNAi构建体。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述表达载体(vector)是质粒或微环。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述表达载体(vector)是选自腺相关病毒(AAV)载体(vector)、逆转录病毒载体(vector)、腺病毒(AdV)载体(vector)和慢病毒(LV)载体(vector)组成的组的病毒载体(vector)。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述核酸、ddRNAi构建体和/或PABPN1构建体包括在表达构建体中，并且所述表达构建体包括来自AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型是AAV2、AAV8或AAV9。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列是密码子优化的，使得其mRNA转录物不被所述ddRNAi构建体的所述shmiR靶向。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列如SEQ ID NO：73所示。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列与包括在所述PABPN1构建体内并位于编码所述功能性PABPN1蛋白的所述DNA序列上游的启动子可操作地连接。
14.根据权利要求13所述的方法，其中包括在PABPN1构建体中的所述启动子是肌肉特异性启动子。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述shmiR包括：
长度至少17个核苷酸的效应子序列；
效应子互补序列；
茎环序列；以及
初级微小RNA(pri-miRNA)骨架；
其中所述效应子序列与人PABPN1的RNA转录物中相应长度的区域基本上互补。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述shmiR包括与SEQ ID NO：87所示的所述RNA序列中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述shmiR包括与SEQ ID NO：1-13任一个所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述shmiR选自由以下组成的组：
包括SEQ ID NO：15所示效应子序列和SEQ ID NO：14所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：17所示效应子序列和SEQ ID NO：16所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：19所示效应子序列和SEQ ID NO：18所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：21所示效应子序列和SEQ ID NO：20所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：23所示效应子序列和SEQ ID NO：22所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：25所示效应子序列和SEQ ID NO：24所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：27所示效应子序列和SEQ ID NO：26所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：29所示效应子序列和SEQ ID NO：28所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：31所示效应子序列和SEQ ID NO：30所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：33所示效应子序列和SEQ ID NO：32所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：35所示效应子序列和SEQ ID NO：34所示效应子互补序列的shmiR；
包括SEQ ID NO：37所示效应子序列和SEQ ID NO：36所示效应子互补序列的shmiR；以及
包括SEQ ID NO：39所示效应子序列和SEQ ID NO：38所示效应子互补序列的shmiR。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述shmiR在5’至3’方向上包括：
所述pri-miRNA骨架的5’侧翼序列；
所述效应子互补序列；
所述茎环序列；
所述效应子序列；以及
所述pri-miRNA骨架的3’侧翼序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述茎环序列是SEQ ID NO：40所示的所述序列。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述pri-miRNA骨架是pri-miR-30a骨架。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述pri-miRNA骨架的所述5’侧翼序列如SEQ ID NO：41所示，并且所述pri-miRNA骨架的所述3’侧翼序列如SEQ ID NO：42所示。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述shmiR包括如SEQ ID NO：43-55中任一项所示的序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中编码所述shmiR的所述DNA序列如SEQ ID NO：56-68的任一项所示。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，包括施用编码shmiR的至少两种核酸，或施用包括所述至少两种核酸的ddRNAi构建体，其中每种shmiR包括与对应于引起OPMD的PABPN1蛋白的RNA转录物基本上互补的效应子序列，并且其中每种shmiR包括不同的效应子序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQID NO：1、2、4、7、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：15所示的效应子序列和SEQ ID NO：14(shmiR2)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16(shmiR3)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：21所示的效应子序列和SEQ ID NO：20(shmiR5)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：27所示的效应子序列和SEQ ID NO：26(shmiR9)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32(shmiR14)所示的效应子互补序列；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：56(shmiR2)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：59(shmiR5)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：62(shmiR9)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸；以及
包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少两种核酸中的每一种均编码包括与SEQID NO：2、9、10和13之一所示RNA转录物中相应长度的区域基本上互补的效应子序列的shmiR。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：17所示的效应子序列和SEQ ID NO：16(shmiR3)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：33所示的效应子序列和SEQ ID NO：32(shmiR14)所示的效应子互补序列；以及
包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少两种核酸选自由以下组成的组：
包括SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：57(shmiR3)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；
包括SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：65(shmiR14)所示的DNA序列组成的核酸；以及
包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述ddRNAi构建体包括：
(a)包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：31所示的效应子序列和SEQ ID NO：30(shmiR13)所示的效应子互补序列；以及
(b)包括编码shmiR的DNA序列或由编码shmiR的DNA序列组成的核酸，shmiR包括SEQ IDNO：39所示的效应子序列和SEQ ID NO：38(shmiR17)所示的效应子互补序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述ddRNAi构建体包括：
(a)包括SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：64(shmiR13)所示的DNA序列组成的核酸；以及
(b)包括SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列或由SEQ ID NO：68(shmiR17)所示的DNA序列组成的核酸。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体(carrier)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述咽肌包括下缩肌、中缩肌、上缩肌、腭咽肌、咽鼓管咽肌、茎突咽肌或其任何组合中的一个或多个。
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