CN112851776B - 一种基因定点突变方法及其胁迫抗性育种应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因定点突变方法及其胁迫抗性育种应用。本发明方法首次应用胞苷脱氨酶碱基编辑技术定点突变酿酒酵母基因组上的全局转录调控因子Spt15,扩大了转录因子Spt15的突变范围,实现了转录因子Spt15的精确突变,获得了36株突变体;在高糖高渗、高温和乙醇胁迫条件下成功且高效地筛选到14株、18株和19株耐受性明显提高的菌株,其中14株菌株在这三种胁迫下均是抗性菌株。本发明可解决实际工业发酵中酵母细胞胁迫耐受性不足的缺陷。本发明的方法操作简单方便,选育效率高,为今后耐性机制研究和菌株分子改造与应用奠定了良好基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种基因定点突变方法及其胁迫抗性育种应用。
背景技术
酿酒酵母具有悠久的发酵历史,从传统食品发酵到现代工艺发酵生产药物、能源替代品和大宗化学品等,最终发展成为重要的细胞工厂。然而,在实际工业发酵生产中,酿酒酵母发酵受多种胁迫的制约,尤其是高渗、高温和乙醇等胁迫的毒害作用。因此,改善酿酒酵母的胁迫耐受性对于提高菌株的生产性能至关重要。改善酿酒酵母胁迫耐受性的育种策略很多,包括原生质体融合、诱变育种、适应性进化等。在2006年,Alper等报道了通过全局转录机器工程(Global transcription machinery engineering,gTME)的方法对酵母菌执行转录的RNA聚合酶II中的起始转录因子Spt15进行随机突变,该方法原理是易错PCR,将错误碱基随机地引入到Spt15基因编码区,通过改造全局转录调控因子使整个转录调控过程发生变化,从而影响相关基因启动子区域TATA结合能力的改变,使相关基因过量表达或受到抑制,在表型上提高了酿酒酵母对高糖高渗和高乙醇的胁迫耐受性。转录因子Spt15属于转录起始复合物,是一种TATA结合蛋白,与RNA聚合酶II及其他转录因子结合后转录mRNA基因,从而影响基因表达。
公开号为CN105950649B的中国专利中记载了通过易错PCR的方法突变质粒上的SPT15基因,然后转化酵母来筛选高产乙醇的菌株的方法,该方法只获得一株有益突变体。该方法是利用TaqDNA聚合酶保真度低且不具备3’→5’端的外切酶活性,在扩增过程中产生碱基错配,产生随机突变,适用范围有限,且突变不易控制,突变过度对细胞有害。公开号为CN107988092A的中国专利中公开了具有胁迫耐受性的简单节杆菌突变菌株及工程菌,通过紫外-亚硝酸钠复合诱变结合压力驯化的方法选育出一株耐乙醇的简单节杆菌突变株。该方法诱变育种周期长、性状不稳定、筛选效率低。
胞苷脱氨酶碱基编辑(cytidine deaminase base editing,CBE)技术能够对基因组进行操作,实现碱基C到T的精确突变。该技术应用范围广,操作简单,不产生DNA双链断裂,不需外源模板,细胞存活率高等优点。该技术在高等真核生物中,比如哺乳动物和植物,已经实现了突变纠正等应用。在2016年,Nishida报道了酿酒酵母的单碱基编辑***,利用CBE技术产生终止密码子,从而评价该技术在酿酒酵母中的效率。该研究表明,CBE技术可以对PAM上游-13到-20窗口的碱基进行编辑,其中-18位置的编辑效率最高。CBE技术除了产生C到T的碱基突变外,该研究还发现了一定比例的C到G和C到A突变。然而,利用CBE技术对酿酒酵母基因组基因编码区进行氨基酸突变,从而实现蛋白突变,尚无相关文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因定点突变方法及其胁迫抗性育种应用。
第一方面,本发明保护突变体蛋白,为将Spt15蛋白进行如下(a1)至(a21)中任意一种或多种突变得到的蛋白质:(a1)自N端第140位氨基酸残基由A突变为G;(a2)自N端第169位氨基酸残基由P突变为A;(a3)自N端第238位氨基酸残基由R突变为K;(a4)自N端第2位氨基酸残基由A突变为D;(a5)自N端第6位氨基酸残基由R突变为C;(a6)自N端第9位氨基酸残基由E突变为K;(a7)自N端第26位氨基酸残基由W突变为S;(a8)自N端第26位氨基酸残基由W突变为C;(a9)自N端第38位氨基酸残基由T突变为I;(a10)自N端第56位氨基酸残基由D突变为E;(a11)自N端第101位氨基酸残基由A突变为P且第102位氨基酸残基由V突变为I;(a12)自N端第102位氨基酸残基由V突变为L;(a13)自N端第214位氨基酸残基由L突变为F;(a14)自N端第238位氨基酸残基由R突变为T;(a15)自N端第20位氨基酸残基由P突变为L;(a16)自N端第150位氨基酸残基由A突变为P;(a17)自N端第20位氨基酸残基由P突变为R;(a18)自N端第38位氨基酸残基由T突变为S;(a19)自N端第65位氨基酸残基由P突变为L;(a20)自N端第71位氨基酸残基由V突变为L;(a21)自N端第192位氨基酸残基由G突变为S。
所述Spt15蛋白具体可为SEQ ID No.4所示的蛋白质。
所述Spt15蛋白具体可为将SEQ ID No.4的氨基酸序列经过除(a1)至(a21)中所述的位置以外的其他位置的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQ ID No.4衍生的蛋白质。
第二方面,本发明还保护编码前文所述突变体蛋白的多核苷酸。
编码(a1)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第419位由C突变为G得到的DNA分子;编码(a2)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第505位由C突变为G得到的DNA分子;编码(a3)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ IDNo.3自5’端第713位由G突变为A得到的DNA分子;编码(a4)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第5位由C突变为A且第6位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a5)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第16位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a6)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第24位由G突变为A且第25位由G突变为A得到的DNA分子;编码(a7)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ IDNo.3自5’端第77位由G突变为C且第78位由G突变为A得到的DNA分子;编码(a8)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第78位由G突变为C得到的DNA分子;编码(a9)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第113位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a10)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第168位由C突变为G得到的DNA分子;编码(a11)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第301位由G突变为C且第304位由G突变为A得到的DNA分子;编码(a12)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第304位由G突变为C得到的DNA分子;编码(a13)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第640位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a14)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第713位由G突变为C得到的DNA分子;编码(a15)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第58位由C突变为T且第59位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a16)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第448位由G突变为C得到的DNA分子;编码(a17)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第59位由C突变为G得到的DNA分子;编码(a18)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第113位由C突变为G得到的DNA分子;编码(a19)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第194位由C突变为T得到的DNA分子;编码(a20)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第211位由G突变为C且第213位由G突变为A得到的DNA分子;编码(a21)所述突变体蛋白的多核苷酸具体为将SEQ ID No.3自5’端第574位由G突变为A且第579位由G突变为A得到的DNA分子。
第三方面,本发明还保护具有前文所述多核苷酸的表达盒、重组载体或重组微生物。所述重组微生物具体可为重组酿酒酵母。具有编码前文(a1)-(a14)所述突变体蛋白的多核苷酸的重组酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性高于具有编码野生型Spt15蛋白的多核苷酸的酿酒酵母。具有编码前文(a15)-(a16)所述突变体蛋白的多核苷酸的重组酿酒酵母的高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性高于具有编码野生型Spt15蛋白的多核苷酸的酿酒酵母。具有编码前文(a17)-(a18)所述突变体蛋白的多核苷酸的重组酿酒酵母的高温胁迫耐受性高于具有编码野生型Spt15蛋白的多核苷酸的酿酒酵母。具有编码前文(a19)-(a21)所述突变体蛋白的多核苷酸的重组酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性高于具有编码野生型Spt15蛋白的多核苷酸的酿酒酵母。所述重组酿酒酵母具体可为将酿酒酵母BY4741菌株经过上述改造得到的。
第四方面,本发明保护前文所述的突变体蛋白或多核苷酸或表达盒、重组载体或重组微生物在酿酒酵母育种中的应用。所述育种的目的是为了培育胁迫耐受性提高的酿酒酵母菌株。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
第五方面,本发明保护一种提高酿酒酵母的胁迫耐受性的方法,为如下方法1-方法21中的任一种或多种的组合;所述方法1为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白的第140位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基G的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法2为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第169位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基A的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法3为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第238位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基K的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法4为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第2位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基D的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法5为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第6位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基C的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法6为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第9位氨基酸残基E的密码子突变为编码氨基酸残基K的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法7为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第26位氨基酸残基W的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法8为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第26位氨基酸残基W的密码子突变为编码氨基酸残基C的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法9为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第38位氨基酸残基T的密码子突变为编码氨基酸残基I的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法10为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第56位氨基酸残基D的密码子突变为编码氨基酸残基E的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法11为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第101位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基P的密码子,将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第102位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基I的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法12为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第102位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法13为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第214位氨基酸残基L的密码子突变为编码氨基酸残基F的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法14为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第238位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基T的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法15为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第20位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法16为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第150位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基P的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;所述方法17为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第20位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基R的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性;所述方法18为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第38位氨基酸残基T的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性;所述方法19为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第65位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性;所述方法20为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第71位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性;所述方法21为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第192位氨基酸残基G的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性。
所述Spt15蛋白具体可为SEQ ID No.4所示的蛋白质。
所述Spt15蛋白具体可为将SEQ ID No.4的氨基酸序列经过除(a1)至(a21)中所述的位置以外的其他位置的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQ ID No.4衍生的蛋白质。
上述酿酒酵母具体可为酿酒酵母BY4741菌株。
第六方面,本发明保护一种获得定向性状改变的重组微生物的方法,包括如下步骤:
(1)以受体微生物中的目的蛋白的编码基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到多株重组微生物;每株重组微生物具有一种突变形式;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用1个或多个gRNA,gRNA的设计原则包括如下(A)、(B)和(C):(A)靶序列位于所述编码基因编码区;(B)引起编码目的蛋白的至少一个现有氨基酸残基的密码子突变为其他氨基酸残基的密码子;(C)不引起编码目的蛋白的任何现有氨基酸残基的密码子向终止密码子的突变;(2)从步骤(1)得到的多株重组微生物中筛选得到定向性状改变的重组微生物;
所述方法中,密码子的突变引起氨基酸残基的突变,从而引起定向性状的改变。
当设计多个gRNA时,其靶序列可分别位于所述编码基因编码区的不同区间。
所述方法中,所述微生物具体可为酵母,更具体可为酿酒酵母,例如酿酒酵母BY4741菌株。所述方法中,所述目的蛋白具体可为Spt15蛋白,如SEQ ID No.4所示,其编码基因如SEQ ID No.3所示。所述方法中,所述定向性状改变具体可为胁迫耐受性增强。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
所述方法中,当目的蛋白为Spt15蛋白时,所述gRNA具体可为如下16种gRNA的任意组合:靶序列为SEQ ID No.5的gRNA1、靶序列为SEQ ID No.6的gRNA2、靶序列为SEQ IDNo.7的gRNA3、靶序列为SEQ ID No.8的gRNA4、靶序列为SEQ ID No.9的gRNA5、靶序列为SEQID No.10的gRNA6、靶序列为SEQ ID No.11的gRNA7、靶序列为SEQ ID No.12的gRNA8、靶序列为SEQ ID No.13的gRNA9、靶序列为SEQ ID No.14的gRNA10、靶序列为SEQ ID No.15的gRNA11、靶序列为SEQ ID No.16的gRNA12、靶序列为SEQ ID No.17的gRNA13、靶序列为SEQID No.18的gRNA14、靶序列为SEQ ID No.19的gRNA15和靶序列为SEQ ID No.20的gRNA16。
本发明还保护所述方法在微生物育种中的应用。所述微生物育种的目的具体可为筛选胁迫耐受性提高的微生物。所述微生物具体可为酵母,更具体可为酿酒酵母,例如酿酒酵母BY4741菌株。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
本发明还保护所述方法制备得到的重组微生物。在本发明的实施例中,采用所述方法共获得36种重组酿酒酵母菌株,并从中筛选得到其中21种高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性增强的重组酿酒酵母菌株。
第七方面,本发明保护一种制备酿酒酵母重组菌的方法,为方法1-方法16中的任一种或多种的组合;所述方法1包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.5;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第5位由C突变为A且第6位由C突变为T;所述方法2包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQID No.6;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第16位由C突变为T;所述方法3包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.7;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第24位由G突变为A且第25位由G突变为A;所述方法4包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.8;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(a)自5’端第58位由C突变为T且第59位由C突变为T;(b)自5’端第59位由C突变为G;所述方法5包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.9;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(c)自5’端第77位由G突变为C且第78位由G突变为A;(d)自5’端第78位由G突变为C;所述方法6包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.10;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(e)自5’端第113位由C突变为T;(f)自5’端第113位由C突变为G;所述方法7包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.11;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第168位由C突变为G;所述方法8包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.12;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第194位由C突变为T;所述方法9包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.13;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第211位由G突变为C且第213位由G突变为A;所述方法10包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.14;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(g)自5’端第301位由G突变为C且第304位由G突变为A;(h)自5’端第304位由G突变为C;所述方法11包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ IDNo.15;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第419位由C突变为G;所述方法12包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.16;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第448位由G突变为C;所述方法13包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.17;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第505位由C突变为G;所述方法14包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.18;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第574位由G突变为A且第579位由G突变为A;所述方法15包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ IDNo.19;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第640位由C突变为T;所述方法16包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.20;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(i)自5’端第713位由G突变为A;(j)自5’端第713位由G突变为C。
所述Spt15基因为SEQ ID No.3所示的DNA分子或与SEQ ID No.3来源相同且具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
所述方法为提高酿酒酵母菌株胁迫耐受性的方法。所述方法得到的酿酒酵母重组菌与酿酒酵母受体菌相比,高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性提高。
本发明还保护所述方法在酿酒酵母育种中的应用。所述育种的目的具体可为筛选胁迫耐受性提高的酿酒酵母。所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母BY4741菌株。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
本发明还保护所述方法制备得到的酿酒酵母重组菌。
第八方面,本发明保护一种获得使微生物定向性状改变的突变体蛋白的方法,包括如下步骤:(1)以受体微生物中的目的蛋白的编码基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到多株重组微生物;每株重组微生物具有一种突变形式;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用1个或多个gRNA,gRNA的设计原则包括如下(A)、(B)和(C):(A)靶序列位于所述编码基因编码区;(B)引起编码目的蛋白的至少一个现有氨基酸残基的密码子突变为其他氨基酸残基的密码子;(C)不引起编码目的蛋白的任何现有氨基酸残基的密码子向终止密码子的突变;(2)从步骤(1)得到的多株重组微生物中筛选得到定向性状改变的重组微生物;(3)对步骤(2)得到的重组微生物中的目的蛋白的编码基因对应的突变基因进行测序,得到突变体蛋白的序列;
所述方法中,密码子的突变引起氨基酸残基的突变,从而引起定向性状的改变。
当设计多个gRNA时,其靶序列可分别位于所述编码基因编码区的不同区间。
所述方法中,所述微生物具体可为酵母,更具体可为酿酒酵母,例如酿酒酵母BY4741菌株。所述方法中,所述目的蛋白具体可为Spt15蛋白,如SEQ ID No.4所示,其编码基因如SEQ ID No.3所示。所述方法中,所述定向性状改变具体可为胁迫耐受性增强。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
所述方法中,当目的蛋白为Spt15蛋白时,所述gRNA具体可为如下16种gRNA的任意组合:靶序列为SEQ ID No.5的gRNA1、靶序列为SEQ ID No.6的gRNA2、靶序列为SEQ IDNo.7的gRNA3、靶序列为SEQ ID No.8的gRNA4、靶序列为SEQ ID No.9的gRNA5、靶序列为SEQID No.10的gRNA6、靶序列为SEQ ID No.11的gRNA7、靶序列为SEQ ID No.12的gRNA8、靶序列为SEQ ID No.13的gRNA9、靶序列为SEQ ID No.14的gRNA10、靶序列为SEQ ID No.15的gRNA11、靶序列为SEQ ID No.16的gRNA12、靶序列为SEQ ID No.17的gRNA13、靶序列为SEQID No.18的gRNA14、靶序列为SEQ ID No.19的gRNA15和靶序列为SEQ ID No.20的gRNA16。
本发明还保护所述方法在微生物育种中的应用。所述微生物育种的目的具体可为筛选可使微生物胁迫耐受性提高的突变体蛋白。所述微生物具体可为酵母,更具体可为酿酒酵母,例如酿酒酵母BY4741菌株。所述胁迫耐受性具体可为高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性。
本发明还保护所述方法得到的突变体蛋白。在本发明的实施例中,采用第八方面所述方法以Spt15蛋白为对象,共获得21种突变体蛋白,具体为第一方面中所示的突变体蛋白。
以上任一所述胞苷脱氨酶碱基编辑***具体由胞苷脱氨酶碱基编辑器和gRNA表达载体组成。所述胞苷脱氨酶碱基编辑器具体可为质粒pRS315e_pGal-nCas9(D10A)-PmCDA1。
本发明方法首次应用胞苷脱氨酶碱基编辑技术定点突变酿酒酵母基因组上的全局转录调控因子Spt15,扩大了转录因子Spt15的突变范围,实现了转录因子Spt15的精确突变,获得了36株突变体;在高糖高渗、高温和乙醇胁迫条件下成功且高效地筛选到14株、18株和19株耐受性明显提高的菌株,其中14株菌株在这三种胁迫下均是抗性菌株。同时,本发明的方法也可以用于其他蛋白突变及突变菌株的构建。本发明可解决实际工业发酵中酵母细胞胁迫耐受性不足的缺陷。本发明的方法操作简单方便,选育效率高,为今后耐性机制研究和菌株分子改造与应用奠定了良好基础。
附图说明
图1为gRNA设计思路。
图2为pRS423-gRNA(pCAS)质粒图谱。
图3为URA3和ADE1基因编辑情况统计结果。(A)基因URA3和ADE1靶位点的突变,小写字母表示突变后的碱基,带有氨基酸序列的是野生型N20和PAM序列;(B)基因ADE1和URA3的细胞存活率;(C)基因URA3和ADE1传代编辑的突变率。
图4为高糖高渗胁迫条件下发酵数据的主成分分析;使用生物重复(2个平行)的方法;所有菌株分4批进行发酵评价,包括第一批(圆圈)、第二批(三角)、第三批(方框)、第四批(菱形);耐受性菌株用向上箭头表示,敏感性菌株用向下箭头表示。
图5为本发明实施例中高温胁迫条件下发酵数据的主成分分析;使用生物重复(2个平行)的方法;所有菌株分4批进行发酵评价,包括第一批(圆圈)、第二批(三角)、第三批(方框)、第四批(菱形);耐受性菌株用向上箭头表示,敏感性菌株用向下箭头表示。
图6为本发明实施例中乙醇胁迫条件下发酵数据的主成分分析;;使用生物重复(2个平行)的方法;所有菌株分4批进行发酵评价,包括第一批(圆圈)、第二批(三角)、第三批(方框)、第四批(菱形);耐受性菌株用向上箭头表示,敏感性菌株用向下箭头表示。
图7为胁迫耐受突变体的蛋白结构比对分析。左侧是野生型蛋白结构,右侧是突变体蛋白结构。圆圈圈中的是突变的氨基酸。
图8为显著差异表达基因的数量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
质粒pCAS:Addgene,质粒编号:#60847。
pRS423质粒:记载于Christianson TW,Sikorski RS,Dante M,Shero JH,HieterP.Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors.Gene,1992,110(1):119-122.;公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
重组酶ClonExpress II:南京诺唯赞生物科技有限公司,货号:C112-02。
Zymo Research Frozen-EZ Yeast TransformationⅡKitTM酵母转化试剂盒:博奥瑞京(北京)科技发展有限公司,货号:T2001。
胞苷脱氨酶质粒pRS315e_pGal-nCas9(D10A)-PmCDA1:Addgene,质粒编号:#79617。
pRS315质粒记载于文献:Sikorski,R.S.,and Hieter,P.(1989).A systemofshuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulationof DNA in Saccharomyces cerevisiae.Genetics 122,19-27.;公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
酿酒酵母BY4741a菌株(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0;pdc1::URA3):记载于文献:Zhang G,Lin Y,Qi X,Li L,Wang Q,Ma Y.TALENs-assistedmultiplex editing for accelerated geenome evolution to improve yeastphenotypes.ACS Synthetic Biology,2015,4(10):1101-1111.;公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
酿酒酵母BY4741菌株(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0):EUROSCARF。
-Leu-His Minus Media:北京泛基诺科技有限公司,货号:YGM003A-6。
SC Complete Medium:北京泛基诺科技有限公司,货号:YGM003A-1。
实施例1、利用胞苷脱氨酶碱基编辑对基因编码区进行定点突变的方法
本实施例针对酿酒酵母内源基因URA3、ADE1和SPT15进行基因编辑
URA3基因如SEQ ID No.1所示。
ADE1基因如SEQ ID No.2所示。
SPT15基因如SEQ ID No.3所示,其编码的蛋白质如SEQ ID No.4所示。
一、靶位点的选择
利用ATUM gRNADesign Tool网站(https://www.atum.bio/eCommerce/cas9/input)检索内源基因URA3、ADE1和SPT15候选碱基编辑靶位点,从而找到相应的gRNA序列,设计思路见图1。在ATUM网站搜索URA3、ADE1和SPT15基因编码区的所有gRNA序列,手动查找位于PAM前13到20位窗口。当进行引入终止密码子的碱基编辑时,在PAM前13到20位窗口内查找三联密码子CAA\CAG\CGA\CCA,当C被CBE碱基编辑突变为T时,从而产生终止密码子TAA\TAG\TGA\CCA。当进行氨基酸突变的目的不是产生终止密码子,而是改变蛋白功能时,在PAM前13到20位窗口内查找含有碱基C的三联体密码子(除CAA\CAG\CGA\CCA之外),当C被CBE碱基编辑突变为T时,密码子突变导致所编码的氨基酸发生突变。经过检索,共选择URA3基因的两个靶位点、ADE1基因的两个靶位点和SPT15基因的24个靶位点进行后续实验。
二、gRNA质粒的构建
1、gRNA表达盒的扩增
以含有gRNA表达盒的质粒pCAS为模板,以XmaI-F和BamHI-R为引物进行PCR扩增;回收PCR扩增产物,得到gRNA表达盒。
XmaI-F(正向引物):5’-cccccgggtctttgaaaagataatgtat-3’;
BamHI-R(反向引物):5’-cgggatcctatccactagacagaagttt-3’。
2、将pRS423质粒用XmaI和BamHI进行双酶切后,用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收酶切产物。
3、pRS423-gRNA(pCAS)质粒的构建
用重组酶ClonExpress II把步骤1制备的gRNA表达盒和步骤2回收的载体pRS423酶切产物连接环化后,立即置于冰水浴,转化大肠杆菌感受态DH-5α,筛选阳性克隆,得到pRS423-gRNA(pCAS)质粒(质粒图谱见图2)。
4、gRNA表达质粒的构建
设计用于构建gRNA表达质粒的正反向引物,每条引物长度均为40bp,包括20bp同源臂和N20(gRNA)。表1中的每对引物中,大写字母表示特异性靶向靶基因的gRNA,小写字母表示20bp同源臂;S-NGG-CBE-为构建SPT15靶位点gRNA表达质粒的引物。
表1
以pRS423-gRNA(pCAS)质粒为模板,分别采用上述引物对进行反向PCR,回收产物,将产物利用重组酶ClonExpress II环化后,立即置于冰水浴,转化大肠杆菌感受态DH-5α,筛选阳性克隆,得到gRNA表达质粒(测序验证正确)。共得到用于编辑URA3的2种gRNA表达质粒、用于编辑ADE1的2种gRNA表达质粒和用于碱基SPT15的24种gRNA表达质粒。
三、基因编辑
1、利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation Ⅱ KitTM酵母转化试剂盒把1微克胞苷脱氨酶质粒pRS315e_pGal-nCas9(D10A)-PmCDA1和步骤二制备的1微克gRNA表达质粒转化进酿酒酵母(编辑URA3的质粒转入酿酒酵母BY4741a菌株,编辑ADE1和SPT15的质粒转入酿酒酵母BY4741菌株),获得含有双质粒的克隆。
2、将步骤1得到的克隆接种至含20g/L葡萄糖的SD-His-Leu培养基(-Leu-HisMinus Media 8g/L,20g/L琼脂粉,NaOH调节pH值至约5.0)活化,在30℃、250r/min条件下培养24h生长到饱和;以OD600为0.3的起始接种量接种到含20g/L棉子糖的SD-His-Leu培养基再次活化,在30℃、250r/min条件下培养24h生长到饱和;取0.9OD600细胞用无菌水洗2次,接种到含10g/L棉子糖和20g/L半乳糖的SD-His-Leu培养基诱导编辑,每24h转接一代。5代后进行后续突变细胞的筛选和统计。
(1)URA3突变细胞的筛选
取0.3OD600细胞连续稀释10倍涂布SD-His-Leu+1.5g/L 5-FOA筛选平板。如果基因URA3被编辑,即破坏的URA3菌株可以在筛选平板上出现单菌落,挑取单克隆进行PCR测序验证,测序引物是URA3-testF和URA3-testR,并统计细胞的突变率。
URA3-testF(正向引物):5’-cattacgaatgcacacggtg-3’;
URA3-testR(反向引物):5’-caaatatgcttcccagcctg-3’。
(2)ADE1突变细胞的筛选
取0.3OD600细胞连续稀释10倍涂布SD-His-Leu+5mg/LAde筛选平板,ADE1基因破坏的菌株在该平板上会变红,挑取单菌落进行PCR测序验证,测序引物是ADE1-testF和ADE1-testR,统计平板上的单克隆数,并计算细胞的突变率。
ADE1-testF(正向引物):5’-tcgtatctctgcatatgacg-3’;
ADE1-testR(反向引物):5’-ggagtacagttttacagcca-3’。
(3)Spt15突变菌株的筛选
编辑后的细胞连续稀释涂布含20g/L葡萄糖的SD-His-Leu平板,随机挑取平板上的单克隆进行菌落PCR,然后PCR产物进行Sanger测序,测序引物是SPT15-F-wz、SPT15-R-wz。与原始SPT15序列比对,检测突变情况。
SPT15-F-wz(正向引物):5’-tttagactgctctgcggaaga-3’;
SPT15-R-wz(反向引物):5’-gagacgatccaccagatatgc-3’。
3、编辑***的毒性检测
取编辑细胞连续稀释10倍,分别涂布于下列两种平板:1)含20g/L葡萄糖的SD-His-Leu平板;2)含10g/L棉子糖和20g/L半乳糖的SD-His-Leu平板,统计平板上的克隆数,计算细胞的存活率。
URA3和ADE1基因编辑的统计结果见图3。结果显示,基因URA3和ADE1在靶位点发生C>T的点突变,产生早期终止密码子TAG和TAA,URA3编辑效率和细胞存活率最高分别是8.8%和95.3%,ADE1编辑效率和细胞存活率最高分别是53.1%和82.8%。上述结果表明,可使用该基因编辑***对酿酒酵母进行基因编辑。
转录因子Spt15基因编辑的结果显示在靶位点发生C>T、C>G和C>A突变,共得到36株Spt15突变体。36株Spt15突变体的具体信息见表2(表2中,基因突变位点以SEQ ID No.3作为突变前序列进行描述,蛋白突变位是以SEQ ID No.4为突变前序列进行描述)。
表2
实施例2、Spt15突变菌株的发酵性能评价
待测菌株:实施例1中制备的36株Spt15突变菌株、对照菌株。
对照菌株是将1微克pRS423质粒和1微克pRS315质粒转化进酿酒酵母菌株BY4741得到的。
将待测菌株接种于含有20mL种子培养基(-Leu-His Minus Media 8g/L,葡萄糖20g/L)的50mL摇瓶中,在30℃、250r/min条件下培养24小时,取起始OD600约为0.4的种子液转接到装有50mL发酵培养基的100mL摇瓶中,在不同胁迫条件(高糖高渗、高温、乙醇)下220r/min发酵60小时,分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h和60h的时间点取样1mL,利用酶标仪和高效液相色谱仪(HPLC)检测菌株的生长和代谢情况(发酵液中乙醇含量和葡萄糖残留量)。
高糖高渗胁迫条件使用的发酵培养基:SC Complete Medium 8g/L,葡萄糖250g/L。高糖高渗胁迫条件下的培养温度:30℃。
高温胁迫条件使用的发酵培养基:SC Complete Medium 8g/L,葡萄糖20g/L。高温渗胁迫条件下的培养温度:40℃。
乙醇胁迫条件使用的发酵培养基:SC Complete Medium 8g/L,葡萄糖20g/L,8%(v/v)乙醇。乙醇胁迫条件下的培养温度:30℃。
HPLC检测条件如下:高效液相色谱仪为美国Agilent 1200,色谱柱选用美国菲罗门公司OOD-0223-KO(100×7.8mm),样品进样量为5μL,流动相为5mM的硫酸溶液,流速为0.6mL/min,检测器为示差检测器,检测时间为10min,色谱柱温55℃。
为了更加直观清楚地展示对照菌株和突变菌株的胁迫发酵能力,采用主成分分析(Principal ComponentAnalysis,PCA)评价菌株对高糖高渗、高温和高乙醇发酵过程(0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h和60h)中葡萄糖消耗和乙醇产生的影响。结果如图4-图6所示。第一和第二主成分分别占总变异的75.72%(PC1)和17.63%(PC2),基本上,耐受性降低和提高的菌株分别分布在对照菌株的左右两侧。
图4结果显示,36株突变菌株与对照菌株相比,在高糖胁迫下,共有14株耐受菌(分别是表2中编号为1、3、5、8、9、10、13、17、18、22、27、33、35、36的菌株)和9株敏感菌(分别是表2中编号为2、4、12、16、19、21、24、28、34的菌株),其中耐受菌占38.9%。
图5结果显示,36株突变菌株与对照菌株相比,在高温胁迫下,共有18株耐受菌(分别是表2中编号为1、3、5、6、7、8、9、10、11、13、17、18、22、25、27、33、35、36的菌株)和15株敏感菌(分别是表2中编号为2、4、12、15、16、19、20、21、23、24、26、28、30、32、34的菌株),其中耐受菌占50.0%。
图6结果显示,36株突变菌株与对照菌株相比,在乙醇胁迫下,共有19株耐受菌(分别是表2中编号为1、3、5、7、8、9、10、13、14、15、17、18、22、25、27、31、33、35、36的菌株)和17株敏感菌(分别是表2中编号为2、4、6、11、12、16、19、20、21、23、24、26、28、29、30、32、34的菌株),其中耐受菌占52.8%。
在这三种胁迫条件下,有14株突变体均表现为耐受性提高,分别是表2中编号为1、3、5、8、9、10、13、17、18、22、27、33、35、36的菌株。
胁迫耐受和敏感突变株与对照菌株相比在指数生长期乙醇积累量、细胞生长量、葡萄糖消耗量的变化倍数统计结果分别见表3和表4。需要注意一点是,表3和表4是基于单个发酵时间点的分析结果,而图4、图5和图6是基于所有发酵时间点的分析结果,比单个发酵时间的分析结果更能反映菌株的胁迫耐受性变化情况。
表3
表4
实施例3、显著胁迫耐受Spt15突变体的蛋白结构比对分析
为了研究胁迫耐受性显著提高的Spt15突变中突变氨基酸对蛋白结构的影响,对上述实施例筛选得到的突变体22(A140G)、27(P169A)、35(R238K)进行Spt15突变蛋白结构比对分析。
首先利用在线分析工具MutFunc(http://mutfunc.com)分析,发现A140G突变会影响Spt15和Brf1的相互作用,而P169A和R238K会影响蛋白保守区域。进而利用Maestro10.6分析Spt15突变体与DNA以及与其他转录因子的相互作用。以酿酒酵母野生型Spt15蛋白结构(PDB:1RM1)作为模板,来模拟突变菌株的蛋白结构。首先,准备蛋白,对原始蛋白结构进行优化,去水,加氢,补齐侧链,能量最小化;其次是突变;然后能量最小化,为了节省时间,采用fasta参数,仅分析该突变对附近5埃范围内的残基受到的影响;最后RMSD分析,计算突变前后蛋白中每个残基的结构变化。
结果如图7显示,A140G突变位于Spt15的β折叠,P169A突变和R238K突变位于Spt15的无规卷曲上。A140G会改变附近氨基酸R137的空间结构,R137是Spt15和Brf1互作的保守氨基酸之一。Brf1是RNA聚合酶III转录起始因子TFIIIB的三个亚基之一,与TATA结合蛋白(TBP)和TFIIIC结合,招募RNA聚合酶III作为启动子。因此,A140G可能通过影响Spt15与Brf1的相互作用,进而影响转录起始。P169A和R238K这两个突变都会改变R171的空间结构。R171与L172邻近,是保守氨基酸,对蛋白质结构的稳定性起作用。因此,P169A和R238K这两个突变可能通过影响Spt15蛋白的稳定性,从而影响Spt15参与的基因转录,改变酿酒酵母菌株的胁迫耐受性。
实施例4、转录组分析
为了研究胁迫耐受性显著提高的Spt15突变对转录组的全局调控情况,将突变体22(A140G)、27(P169A)、35(R238K)这3株胁迫耐受突变株和对照菌株BY4741分别在正常条件(30℃,20g/L葡萄糖)、高渗和高温条件下进行培养至对数生长期,进行转录组测序。
首先,在正式检测前将突变体22(A140G)、27(P169A)、35(R238K)这3株胁迫耐受突变株在SD培养基中连续传代培养丢质粒。连续传代15代,每代培养12h,涂布SD平板,在30℃培养约48h,出现明显可见的单克隆,挑取单克隆PCR测序验证Spt15表达盒的突变情况,测序引物是LYF-SCC4-F和LYF-PEA2-R。
LYF-SCC4-F(正向引物):5’-actccaccatctcaaacgtg-3’;
LYF-PEA2-R(反向引物):5’-caagttcaccttcctctgtag-3’。
转录组样品准备:挑取单菌落接种至3mL SD培养基培养约24h,以起始OD600≈0.4转接至50mL SD培养基培养约24h,然后转接至胁迫条件和无胁迫条件下培养,每株突变体两个平行。取样时间分别为:30℃条件下培养9h,40℃条件下培养15h,250g/L葡萄糖胁迫下培养21h。
转录组数据分析:总RNA的提取是在杭州联川生物公司(中国,浙江)进行的。以S.cerevisiae S288c基因组为参考基因组,从NCBI的RefSeq下载(序列组装版本R64,RefSeq组装登录号:GCF_000146045.2)包括16条染色体和1条线粒体染色体。每个文库平均产生17.8±0.4百万个cleaned reads,平均mapping率为63.4±4.0%,大约是参考基因组覆盖度的140倍(总大小为12.17Mb)。用Bowtie(版本2.2.3)将cleaned reads与参考转录组进行比对。根据基因的长度计算每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(RPKM),并将reads数映射到该基因,然后用RSEM从映射中估计转录本定量。一般用FPKM来表示基因的表达值,先后对测序深度和基因长度进行校正(参考文献:TRAPNELL C,WILLIAMS B A,PERTEA G,et al.Transcript assembly and quantification by RNA-Seqreveals unannotated transcripts and isoform switching during celldifferentiation[J].Nat Biotechnol,2010,28(5):511-5.)。在相同培养或胁迫条件下,比较Spt15突变株与野生菌株之间的基因表达差异。使用DEseq2执行差异表达基因分析,突变体菌株的基因表达水平大于等于对照菌株2倍时(P≤0.05),视为显著差异表达基因(SDEGs)。与Spt15野生型相比,A140G、P169A和R238K导致显著表达上调的基因数在202个至452个之间,显著表达下调的基因数在97个至404个之间(图8)。
利用FunSpec(http://funspec.med.utoronto.ca/)对SDEGs进行功能注释,分析在胁迫条件下Spt15突变造成的显著基因转录对哪些途径产生了影响。
与正常条件相比,Spt15突变株与野生菌株之间的差异表达基因功能分析如下:对于突变体22(A140G),在高渗胁迫下,上调基因和下调基因对多条途径产生影响,上调基因调控蛋白(重)折叠、蛋氨酸生物合成、细胞氨基酸生物合成、重头蛋白折叠和硫酸盐同化过程,下调基因调控细胞***,细胞周期、细胞细胞壁组织、DNA复制、蛋白激酶活性、减数***和有丝***。在高温胁迫下,上调基因调控RNA聚合酶II转录起始前复合物的组装,下调基因调控生物过程、胁迫反应和嘌呤代谢过程。突变体A140G中差异表达基因生物功能注析具体信息见表5。
表5
表注:k:给定类别中输入簇的基因数;f:给定类别的基因总数。
在突变体27(P169A)中,与正常条件相比,在高渗和高温胁迫下,上调基因调控生物过程。高渗胁迫下,下调基因调控细胞质***和跨膜运输,在高温胁迫下,下调基因调控糖原生物合成、柠檬酸代谢过程和海藻糖生物合成,这与文献中(AUESUKAREE C,DAMNERNSAWAD A,KRUATRACHUE M,et al.Genome-wide identification ofgenesinvolved in tolerance to various environmental stresses inSaccharomycescerevisiae[J].Journal of applied genetics,2009,50(3):301-10.)报道的在高温胁迫下海藻糖的积累不一致,可能是菌株中主要通过转录调控其他生物过程来产生耐受性。突变体27(P169A)中差异表达基因生物功能注析具体信息见表6。
表6
表注:k:给定类别中输入簇的基因数;f:给定类别的基因总数。
突变体35(R238K)中,正常条件下差异表达基因调控多条途径,与之相比,高渗胁迫下,上调基因调控跨膜运输和铁离子稳态,下调基因调控细胞周期、细胞***、细胞细胞壁组织和蛋白磷酸化。高温胁迫下,上调基因未影响任何生物途径,下调基因调控生物过程、铁细胞运输、铁离子稳态、己糖代谢过程、胁迫反应和嘌呤碱基代谢过程。突变体R238K中差异表达基因生物功能注析具体信息见表7。
表7
表注:k:给定类别中输入簇的基因数;f:给定类别的基因总数。
综上,通过比较正常条件与胁迫条件中差异表达基因参与的调控途径,发现蛋白折叠、蛋白重折叠、重头合成蛋白折叠、硫酸盐同化过程、氨基酸生物合成、RNA聚合酶II转录起始前复合物的组装、核糖体生物合成、蛋氨酸生物合成、硫酸盐同化等生物过程,这些途径受到上调基因的调控对细胞抵御胁迫环境有促进作用,所以突变体通过上调或下调这些重要途径而产生不同的表型。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种基因定点突变方法及其胁迫抗性育种应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 597
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
atggagggca cagttaagcc gctaaaggca ttatccgcca agtacaattt tttactcttc 60
gaagacagaa aatttgctga cattggtaat acagtcaaat tgcagtactc tgcgggtgta 120
tacagaatag cagaatgggc agacattacg aatgcacacg gtgtggtggg cccaggtatt 180
gttagcggtt tgaagcaggc ggcggaagaa gtaacaaagg aacctagagg ccttttgatg 240
ttagcagaat tgtcatgcaa gggctcccta gctactggag aatatactaa gggtactgtt 300
gacattgcga agagcgacaa agattttgtt atcggcttta ttgctcaaag agacatgggt 360
ggaagagatg aaggttacga ttggttgatt atgacacccg gtgtgggttt agatgacaag 420
ggagacgcat tgggtcaaca gtatagaacc gtggatgatg tggtctctac aggatctgac 480
attattattg ttggaagagg actatttgca aagggaaggg atgctaaggt agagggtgaa 540
cgttacagaa aagcaggctg ggaagcatat ttgagaagat gcggccagca aaactaa 597
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
atgtcaatta cgaagactga actggacggt atattgccat tggtggccag aggtaaagtt 60
agagacatat atgaggtaga cgctggtacg ttgctgtttg ttgctacgga tcgtatctct 120
gcatatgacg ttattatgga aaacagcatt cctgaaaagg ggatcctatt gaccaaactg 180
tcagagttct ggttcaagtt cctgtccaac gatgttcgta atcatttggt cgacatcgcc 240
ccaggtaaga ctattttcga ttatctacct gcaaaattga gcgaaccaaa gtacaaaacg 300
caactagaag accgctctct attggttcac aaacataaac taattccatt ggaagtaatt 360
gtcagaggct acatcaccgg atctgcttgg aaagagtacg taaaaacagg tactgtgcat 420
ggtttgaaac aacctcaagg acttaaagaa tctcaagagt tcccagaacc aatcttcacc 480
ccatcgacca aggctgaaca aggtgaacat gacgaaaaca tctctcctgc ccaggccgct 540
gagctggtgg gtgaagattt gtcacgtaga gtggcagaac tggctgtaaa actgtactcc 600
aagtgcaaag attatgctaa ggagaagggc atcatcatcg cagacactaa attcgaattc 660
ggtattgacg aaaagaccaa tgaaattatt ctagtggacg aggtgctaac gccagactcc 720
tctagattct ggaacggtgc ctcttataag gtaggagaat cccaagattc ttacgataag 780
caatttttaa gagactggct tactgctaat aagttgaacg gtgttaacgg cgtcaaaatg 840
ccccaagaca ttgtcgacag gacaagggcc aaatatatag aggcttatga aacattgaca 900
gggtctaaat ggtctcacta a 921
<210> 3
<211> 723
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 3
atggccgatg aggaacgttt aaaggagttt aaagaggcaa acaagatagt gtttgatcca 60
aataccagac aagtatggga aaaccagaat cgagatggta caaaaccagc aactactttc 120
cagagtgaag aggacataaa aagagctgcc ccagaatctg aaaaagacac ctccgccaca 180
tcaggtattg ttccaacact acaaaacatt gtggcaactg tgactttggg gtgcaggtta 240
gatctgaaaa cagttgcgct acatgcccgt aatgcagaat ataaccccaa gcgttttgct 300
gctgtcatca tgcgtattag agagccaaaa actacagctt taatttttgc ctcagggaaa 360
atggttgtta ccggtgcaaa aagtgaggat gactcaaagc tggccagtag aaaatatgca 420
agaattatcc aaaaaatcgg gtttgctgct aaattcacag acttcaaaat acaaaatatt 480
gtcggttcgt gtgacgttaa attccctata cgtctagaag ggttagcatt cagtcatggt 540
actttctcct cctatgagcc agaattgttt cctggtttga tctatagaat ggtgaagccg 600
aaaattgtgt tgttaatttt tgtttcagga aagattgttc ttactggtgc aaagcaaagg 660
gaagaaattt accaagcttt tgaagctata taccctgtgc taagtgaatt tagaaaaatg 720
tga 723
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
Met Ala Asp Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Lys Glu Ala Asn Lys Ile
1 5 10 15
Val Phe Asp Pro Asn Thr Arg Gln Val Trp Glu Asn Gln Asn Arg Asp
20 25 30
Gly Thr Lys Pro Ala Thr Thr Phe Gln Ser Glu Glu Asp Ile Lys Arg
35 40 45
Ala Ala Pro Glu Ser Glu Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ser Gly Ile Val
50 55 60
Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val Ala Thr Val Thr Leu Gly Cys Arg Leu
65 70 75 80
Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro
85 90 95
Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Lys Thr Thr
100 105 110
Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser
115 120 125
Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala Ser Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln
130 135 140
Lys Ile Gly Phe Ala Ala Lys Phe Thr Asp Phe Lys Ile Gln Asn Ile
145 150 155 160
Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala
165 170 175
Phe Ser His Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly
180 185 190
Leu Ile Tyr Arg Met Val Lys Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Val
195 200 205
Ser Gly Lys Ile Val Leu Thr Gly Ala Lys Gln Arg Glu Glu Ile Tyr
210 215 220
Gln Ala Phe Glu Ala Ile Tyr Pro Val Leu Ser Glu Phe Arg Lys Met
225 230 235 240
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccgatgag gaacgtttaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtttaaag gagtttaaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcctttaaa cgttcctcat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccaaatacc agacaagtat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcccatactt gtctggtatt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactactttc cagagtgaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaagacacct ccgccacatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccaacacta caaaacattg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccacaatgt tttgtagtgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgacagcagc aaaacgcttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaagaatta tccaaaaaat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tagcagcaaa cccgattttt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aattccctat acgtctagaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atcaaaccag gaaacaattc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcttactggt gcaaagcaaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttctaaattc acttagcaca 20
Claims (10)
1.突变体蛋白,为将Spt15蛋白进行如下(a1)至(a20)中任意一种突变得到的蛋白质:
(a1)自N端第140位氨基酸残基由A突变为G;
(a2)自N端第169位氨基酸残基由P突变为A;
(a3)自N端第238位氨基酸残基由R突变为K;
(a4)自N端第2位氨基酸残基由A突变为D;
(a5)自N端第6位氨基酸残基由R突变为C;
(a6)自N端第9位氨基酸残基由E突变为K;
(a7)自N端第26位氨基酸残基由W突变为S;
(a8)自N端第26位氨基酸残基由W突变为C;
(a9)自N端第38位氨基酸残基由T突变为I;
(a10)自N端第56位氨基酸残基由D突变为E;
(a11)自N端第101位氨基酸残基由A突变为P且第102位氨基酸残基由V突变为I;
(a12)自N端第102位氨基酸残基由V突变为L;
(a13)自N端第214位氨基酸残基由L突变为F;
(a14)自N端第238位氨基酸残基由R突变为T;
(a15)自N端第20位氨基酸残基由P突变为L;
(a16)自N端第150位氨基酸残基由A突变为P;
(a17)自N端第38位氨基酸残基由T突变为S;
(a18)自N端第65位氨基酸残基由P突变为L;
(a19)自N端第71位氨基酸残基由V突变为L;
(a20)自N端第192位氨基酸残基由G突变为S;
所述Spt15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.编码权利要求1中所述突变体蛋白的多核苷酸。
3.具有编码权利要求1中所述突变体蛋白多核苷酸的表达盒。
4.具有编码权利要求1中所述突变体蛋白多核苷酸的重组载体。
5.具有编码权利要求1中所述突变体蛋白多核苷酸的重组微生物。
6.权利要求1所述的突变体蛋白或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物在酿酒酵母育种中的应用。
7.一种提高酿酒酵母的胁迫耐受性的方法,为如下方法1-方法20中的任一种;
所述方法1为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白的第140位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基G的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法2为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第169位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基A的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法3为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第238位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基K的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法4为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第2位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基D的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法5为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第6位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基C的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法6为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第9位氨基酸残基E的密码子突变为编码氨基酸残基K的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法7为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第26位氨基酸残基W的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法8为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第26位氨基酸残基W的密码子突变为编码氨基酸残基C的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法9为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第38位氨基酸残基T的密码子突变为编码氨基酸残基I的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法10为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第56位氨基酸残基D的密码子突变为编码氨基酸残基E的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法11为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第101位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基P的密码子,将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第102位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基I的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法12为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第102位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法13为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第214位氨基酸残基L的密码子突变为编码氨基酸残基F的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法14为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第238位氨基酸残基R的密码子突变为编码氨基酸残基T的密码子,从而提高酿酒酵母的高糖高渗胁迫耐受性和/或高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法15为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第20位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法16为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第150位氨基酸残基A的密码子突变为编码氨基酸残基P的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性和/或乙醇胁迫耐受性;
所述方法17为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第38位氨基酸残基T的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的高温胁迫耐受性;
所述方法18为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第65位氨基酸残基P的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性;
所述方法19为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第71位氨基酸残基V的密码子突变为编码氨基酸残基L的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性;
所述方法20为:将酿酒酵母基因组中编码Spt15蛋白第192位氨基酸残基G的密码子突变为编码氨基酸残基S的密码子,从而提高酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性;
所述Spt15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
8.一种制备酿酒酵母重组菌的方法,为方法1-方法16中的任一种;
所述方法1包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.5;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第5位由C突变为A且第6位由C突变为T;
所述方法2包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.6;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第16位由C突变为T;
所述方法3包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.7;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第24位由G突变为A且第25位由G突变为A;
所述方法4包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.8;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第58位由C突变为T且第59位由C突变为T;
所述方法5包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.9;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(c)自5’端第77位由G突变为C且第78位由G突变为A;(d)自5’端第78位由G突变为C;
所述方法6包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.10;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(e)自5’端第113位由C突变为T;(f)自5’端第113位由C突变为G;
所述方法7包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.11;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第168位由C突变为G;
所述方法8包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.12;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第194位由C突变为T;
所述方法9包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.13;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第211位由G突变为C且第213位由G突变为A;
所述方法10包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.14;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(g)自5’端第301位由G突变为C且第304位由G突变为A;(h)自5’端第304位由G突变为C;
所述方法11包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.15;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第419位由C突变为G;
所述方法12包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.16;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第448位由G突变为C;
所述方法13包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.17;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第505位由C突变为G;
所述方法14包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.18;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第574位由G突变为A且第579位由G突变为A;
所述方法15包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.19;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下突变:自5’端第640位由C突变为T;
所述方法16包括如下步骤:以酿酒酵母受体菌中的Spt15基因为对象,采用胞苷脱氨酶碱基编辑***引入突变,得到酿酒酵母重组菌;所述胞苷脱氨酶碱基编辑***采用特异gRNA,其靶序列为SEQ ID No.20;与所述酿酒酵母受体菌相比,酿酒酵母重组菌的Spt15基因发生了如下任一种突变:(i)自5’端第713位由G突变为A;(j)自5’端第713位由G突变为C;
所述Spt15基因为SEQ ID No.3所示的DNA分子。
9.权利要求8所述方法在酿酒酵母育种中的应用。
10.权利要求8所述方法制备得到的酿酒酵母重组菌。
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