CN112843246A - 含cbx3的l-精氨基氨酸化聚胺类聚合物基因载体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂新辅料、生物制剂新剂型和基因载体技术领域，具体涉及一种含有靶头蛋白CBX3的聚氨基胺类聚合物复合物基因载体及其制备方法和应用。该复合物复合物基因载体引入了CBX3靶头蛋白，具有良好膜透性和细胞内环境还原敏感性，以及CBX3靶头蛋白能够专属性定位在常染色质的靶向效应。载体主链的二硫键和胍基具有在细胞内环境的还原敏感性及具有较好的膜透过性，同时又引入了CBX3靶头蛋白能够专属性地定位于常染色质区域，上调基因的表达，将CBX3靶头蛋白与目的基因结合，使得该复合物载体具有良好的细胞内还原敏感性同时具有专属定位于常染色质的靶向效应，促进基因的表达，为基因治疗开辟了新的方向。

Description

含CBX3的L-精氨基氨酸化聚胺类聚合物基因载体的制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料、生物制剂新剂型和基因载体技术领域，具体涉及一种含有靶头蛋白CBX3的聚胺类聚合物复合物基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗作为一种新兴的肿瘤治疗手段，近20年来，获得了医药领域专家的广泛青睐，成为了抗肿瘤药物研发的重要组成部分。基因治疗技术已经从导入期进入到成长期，具有以下明显优势：(1)能够针对疾病发生、发展的原因治疗，有望实现疾病的根本治愈；(2)基于核苷酸的互补配对原则，具有一定的天然靶向性；(3)和传统化学药物相比，具有较低的毒副作用。
基因治疗作为一种处于成长期的应用技术，有多种实施技术路线，如此多的技术路线有着不同的原理，这就意味着很难用一种通用载体实现基因治疗药物的体内传递。
基因治疗，即机体内引入高表达外源性基因，通过纠正或补偿靶细胞原有的缺陷基因，使细胞正常表达，从而达到治疗疾病目的的治疗手段。近年来基因治疗已取得了举世瞩目的成就，但作为一种处于成长期的治疗手段仍面临着诸多亟待解决的问题。就其实施方案而言，仍缺乏性能高效、质量稳定的外源基因递送载体。
基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具备高转染效率的优点，却存在很大的安全隐患，高免疫原性可引起机体免疫原性，并且存在激活原癌基因引发肿瘤的风险。非病毒载体的优势在于免疫原性低，生产制备简单，对基因材料要求限制少等。
非病毒载体分为聚合物和脂质体两大类，前者包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚氨基酸、树枝状大分子等；后者以阳离子脂质体为代表。这些载体的共同特点是都带有大量正电荷，通过静电吸附作用携带基因物质。聚乙烯亚胺是一种转染效率高且被广泛应用的基因载体材料，但由于它不可降解，毒性大等原因抑制了其在体内的应用。近年来，生物可降解的聚阳离子材料渐渐引起了研究者的关注。相比不可降解的聚合物材料，多肽及其衍生物类材料由于其类蛋白质的组成，具有低毒低富集，生物相容性好的特点，有望成为理想的基因载体。因此，开发质量可控，能够携带外源基因跨膜、入核，高效表达目的基因，无免疫原性，且易于工业化生产的非病毒类基因载体，已经成为基因治疗领域的研究热点。
随着分子生物学技术的迅猛发展和人类对肿瘤发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。而对体内特定细胞类型的基因转染是基因治疗可以成功的关键因素。近年来，肿瘤微环境中的非肿瘤细胞成分，如肿瘤相关成纤维细胞，血管内皮细胞，肿瘤相关巨噬细胞逐渐引起了人们的关注。针对肿瘤***的基因治疗，阻碍***对肿瘤发生发展的促进作用，从而达到辅助常规治疗办法的手段是一种很有应用前景的策略。
因此，亟需开发一种高效、低毒、制备简易且具备靶向作用的基因载体复合物。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于一种含有靶头蛋白CBX3的聚胺类聚合物复合物基因载体，该复合物复合物基因载体引入了CBX3靶头蛋白，具有良好膜透性和细胞内环境还原敏感性，以及CBX3靶头蛋白能够专属性定位在常染色质的靶向效应。载体主链的二硫键和胍基，具有在细胞内环境的还原敏感性及具有较好的膜透过性，同时又引入了CBX3靶头蛋白(异染色质蛋白3)，是真核细胞中的一个旁系同源物，能够专属性地定位于常染色质区域，上调基因的表达，将CBX3靶头蛋白与目的基因结合，使得该复合物载体具有良好的细胞内还原敏感性同时具有专属定位于常染色质的靶向效应，促进基因的表达，为基因治疗开辟了新的方向。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案。
一种具有常染色质靶向功能的基因载体复合物，含有靶头蛋白和二硫键的胍基化聚氨基胺类基础载体，所述的靶头蛋白为CBX3。
所述的具有常染色质靶向功能的基因载体复合物的制备方法具体包括以下步骤。
步骤1、胍基化含二硫键的聚氨基胺类载体聚合物ARG-CBA的制备：通过具有双丙烯酰结构的CBA同含有伯氨基的胍基化试剂L-精氨酸ARG进行麦克尔加成聚合制得聚合物，CBA同胍基试剂L-精氨酸的麦克尔加成聚合反应方程式如下：
Figure BDA0002902916850000021
n为18-30，聚合物分子量为7.8-15.1KDa，聚合物纯化后，通过冷冻干燥的方法收取。
步骤2、CBX3靶头蛋白与目的基因复合物的制备：采用自组装室温孵育法制备CBX3/目的基因复合物，具体步骤为在模拟生理条件下的缓冲液中，按照CBX3/目的基因不同比例制备，pH范围为6.8-8.2，室温静置孵育20-30分钟，即可得到CBX3/目的基因复合物。
步骤3、CBX3/目的基因/ARG-CBA复合物基因载体的制备：采用自组装室温孵育法制备基因载体复合物，具体步骤为在室温条件下，将步骤1制得的聚合物ARG-CBA与步骤 2制得的CBX3/目的基因按照不同的质量比(N/P比)，在缓冲溶液中室温静置孵育5-30分钟,即得CBX3/目的基因/ARG-CBA。
进一步地，步骤1中聚合物的纯化采用透析方法进行纯化，透析袋的截留分子量(MWCO)为1000。
进一步地，步骤2中CBX3与目的基因质量比为1：50-1：10000。
进一步地，所述的目的基因包括pDNA质粒、siRNA片段、microRNA片段中的一种或两种以上的任意组合。
进一步地，步骤3中步骤1制得的聚合物ARG-CBA与步骤2制得的CBX3/目的基因质量比为12：1-48：1。
进一步地，步骤3中所述的缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液为主，还包括其他各种模拟生理条件的缓冲溶液，如磷酸盐缓冲溶液，枸橼酸缓冲液，无血清的细胞培养液，pH范围为6.8-8.2。
所述的具有常染色质靶向功能的基因载体复合物在制备基因治疗药物中的应用。
所述的具有常染色质靶向功能的基因载体复合物和药学上可接受的赋形剂混合，制备临床可接受的注射剂，包括局部注射剂，静脉注射剂。
与现有技术比，本发明具有以下有益效果。
本发明提供了一种具有常染色质靶向功能的胍基化聚氨基胺类基因载体复合物CBX3/目的基因片段/ARG-CBA，胍基化聚氨基胺类聚合物在生理条件下能够和含有CBX3 的目的基因片段(cDNA，microRNA，siRNA，质粒DNA，反义寡核苷酸等)形成复合物，由于其主链富含氨基和胍基官能团能够高效率的透过生物膜，主链中二硫键的存在使其具有胞内还原敏感性，此外CBX3靶头蛋白能够专属性地定位在常染色质区域，因此该类聚合物具有细胞内还原敏感性，及良好的核定位效应，成为新一代具有精确靶向核定位的复合物载体，用于基因治疗过程。
本发明提供了一种具有常染色质靶向功能的胍基化聚氨基胺类基因载体复合物CBX3/目的基因片段/ARG-CBA，CBX3/目的基因/ARG-CBA除含有能够响应细胞内还原环境的二硫键，和胍基化试剂能够保留其还原敏感性，除此之外又引入了CBX3靶头蛋白，CBX3靶头蛋白能够专属性地定位于常染色质区域，促进基因的表达，最终制备出聚合物基因载体具有良好精准的核定位效应，对未来在基因治疗的应用有重大的意义。
附图说明
图1为制备的ARG-CBA聚合物的结构表征。
图2为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒的体外转染效率。
图3为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的pSliencer TM 4.1CMV-FANCF-shRNA质粒的体外目的基因抑制效率。
图4为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的FANCF-shRNA片段的体外目的基因抑制效率。
图5为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的328-microRNA片段的体外转染效率。
图6为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的pcDNA3.1-EGFP-cDNA、pSliencer TM 4.1CMV-FANCF-shRNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响。
图7为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的FANCF-shRNA、328-microRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响。
图8为ARG-CBA聚合物包载含CBX3的pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒所形成的复合物细胞内靶向核定位效应。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1ARG-CBA聚合物的制备方法。
取0.11gL-精氨酸胍基试剂，0.105gCBA，置于50ml圆底烧瓶中，加入2.5ml水和6mlDMF作溶剂，45-60℃，避光，并在氮气保护、磁力搅拌条件下反应3天；TLC监测反应进程，于72小时后加入约10％过量的L-精氨酸胍基试剂(0.013g)，继续反应24小时；停止反应，用4mol/L盐酸调体系pH为2-5，收集整个反应体系溶液，移入透析袋，透析纯化反应产物，透析介质为蒸馏水，透析袋截留分子量(MWCO)为1000，透析三天，并且每天至少更换一次透析介质；收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿中，冻干收集聚合物产品，结构表征通过核磁共振氢谱(1HNMR)检测所得，结果如图1所示。凝胶渗透色谱(GPC) 测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为：7975,21123。多分散系数(PDI) 为：1.51。
实施例2CBX3/目的基因/ARG-CBA基因载体复合物的制备。
(1)制备CBX3/目的基因复合物。
pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒、pSliencer TM 4.1CMV-FANCF-shRNA质粒、FANCF-shRNA、328-microRNA，用50mM，pH为7.4的HEPES缓冲溶液稀释至 0.016mg/ml,CBX3粉末用去离子水配制成浓度为5×10-3μg/μl的储备液，将浓度为5×10-3μg/μl的CBX3储备液用HEPES稀释至不同浓度，然后按照CBX3与质粒基因的质量比为 1:50-1:10000混合，混合液在EP管中涡旋5秒，并在室温条件下静置孵育10-30min，即可得到不同比例的CBX3/pDNA复合物。
(2)制备CBX3/目的基因/ARG-CBA基因载体复合物。
如实施例1所述的聚合物基因载体，以0.9mg/ml溶解在HEPES缓冲液中，并以1： 1的比例用HEPES缓冲液稀释，取0.5ml的ARG-CBA聚合物载体溶液，加入如实施例2 (1)项下所述的比例为1：500的CBX3/目的基因复合物溶液，混合液在EP管中涡旋5 秒，pH范围为6.8-8.2，并在室温条件下孵育10-30min，即得ARG-CBA/目的基因质量比为 48/1、24/1、12/1的CBX3/目的基因/ARG-CBA载体复合物。动态光散射(DLS)法测定复合物粒径和Zeta电位，见表1，表1为实验三次测定粒径和Zeta电位的平均值。
表1为ARG-CBA、目的基因和CBX3形成复合物的粒径和Zeta电位。
Figure BDA0002902916850000051
实施例2中所述的对于不同基因片段和聚合物载体所形成的复合物，其粒径和Zeta 电位测定结果表明：几种复合物粒径均在纳米级别，Zeta电位均是阳性，具备了一般阳离子聚合物基因载体的物理化学性质。
实施例3CBX3/目的基因/ARG-CBA基因载体的体外转染效率评价。
(1)载体包载含CBX3的pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒的体外转染效率研究。
按照实施例2所述方法制备不同N/P值(1/12、1/24、1/48)的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清(BSA)；转染后48小时，利用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达情况，并由流式细胞仪软件确定转染效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000和PEI作为对照，结果如图2 所示。
(2)载体包载含CBX3的pSliencer TM 4.1CMV-FANCF-shRNA质粒的体外转染效率研究。
按照实施例2所述方法制备不同N/P值(1/12、1/24、1/48)的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清(BSA)；转染后48小时，利用免疫荧光检测FANCF基因表达的情况，利用流式细胞仪评价绿色荧光强度，间接评价FANCF的沉默效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000和 PEI作为对照，结果如图3所示。
(3)载体包载含CBX3的FANCF-shRNA片段的体外转染效率研究。
按照实施例2所述方法制备不同N/P值(1/12、1/24、1/48)的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清(BSA)；转染后48小时，利用免疫荧光检测FANCF基因表达的情况，利用流式细胞仪评价绿色荧光强度，间接评价FANCF的沉默效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000和 PEI作为对照，结果如图4所示。
(4)载体包载含CBX3的328-microRNA片段的体外转染效率研究。
按照实施例2所述方法制备不同N/P值(1/12、1/24、1/48)的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清(BSA)；转染后48小时，利用Realtime-PCR检测328-microRNA的表达情况。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000和PEI作为对照，结果如图5所示。
实施例4CBX3/目的基因/ARG-CBA基因载体的体外细胞毒性评价。
按实施例2所述方法制备不同N/P值(1/12、1/24、1/48)的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清 (BSA)，继续培养24小时；之后弃去含复合物的培养基，采用经典的MTT法测定细胞活力，以未经复合物处理的细胞活力作为100％，并以Lipo2000和PEI作为对照载体。结果如图6-7所示。
按照实施实实例2项下所述，图6表示三种聚合物包载含CBX3的pcDNA3.1- EGFP-cDNA、pSliencer TM 4.1CMV-FANCF-shRNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响；图7表示三种聚合物包载含CBX3的FANCF-shRNA、328-microRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响。
结果表明，CBX3/目的基因/ARG-CBA基因载体，对pDNA质粒，siRNA片段， micro-RNA片段均具有较高的体外转染效率及较低的毒性。
实施例5CBX3/pDNA/ARG-CBA载体的靶向性核定位效应。
2μg pcDNA3.1-EGFP与1μl DAPI(5mg/mL)在37℃水浴中孵育1h，加入1ml含有1×PBS和无水乙醇的溶液，乙醇的终浓度为70％，转染前12000转/分钟离心10min，弃去上清液加入100μl1×PBS缓冲液溶解沉淀备用。然后将染色的pDNA与CBX3在 HEPES缓冲液中室温静置孵育20-30分钟，制备成CBX3/pDNA复合物备用。MCF10A细胞以2×105个/孔的密度接种在专用于共聚焦成像的小皿中，RPMI1640完全培养基、 37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养约24h，待细胞融合率达90％左右，1×PBS洗一次，换成1ml上述方法制备的含有DAPI蓝色荧光标记的外源基因/载体复合物(ARG- CBA，PEI；N/P比仍为1/48)，按照上述实施例2制备的复合物，在完全培养基中继续培养 4h，1×PBS洗一次，加入1ml含有1μl Nuclear-IDGreen nucleolar核仁染料的完全培养基，37℃水浴15min，1×PBS洗三次，荧光显微镜成像，自动曝光，放大倍数为400×，分别采集绿色和蓝色荧光图像，最后用荧光显微镜分析软件将图像叠加。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000和PEI作为对照，结果如图8所示。图8所示CBX3/pDNA/ARG-CBA 的N/P为1/24；Lipo和PEI在推荐浓度下使用。比例尺为50μm。NC：只加入pDNA，而未加入聚合物载体。pDNA用DAPI染成蓝色，细胞核仁被特异性染料染成绿色。叠加的图像在最后一行显示。结果表明，含有CBX3/pDNA/ARG-CBA基因载体对于pDNA具有良好的靶向核定位效应，达到了预期构建更理想的基因载体的目标。

Claims (9)

1.一种具有常染色质靶向功能的基因载体复合物，其特征在于，所述的基因载体复合物含有靶头蛋白和二硫键的胍基化聚氨基胺类基础载体，所述的靶头蛋白为CBX3。
2.如权利要求1所述的基因载体复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、胍基化含二硫键的聚氨基胺类载体聚合物ARG-CBA的制备：通过具有双丙烯酰结构的CBA同含有伯氨基的胍基化试剂L-精氨酸ARG进行麦克尔加成聚合制得聚合物，CBA同胍基试剂L-精氨酸的麦克尔加成聚合反应方程式如下：
Figure FDA0002902916840000011
n为18-30，聚合物分子量为7.8-15.1KDa，聚合物纯化后，通过冷冻干燥的方法收取；
步骤2、CBX3靶头蛋白与目的基因复合物的制备：采用自组装室温孵育法制备CBX3/目的基因复合物，具体步骤为在模拟生理条件下的缓冲液中，按照CBX3/目的基因不同比例制备，pH范围为6.8-8.2，室温静置孵育20-30分钟，即可得到CBX3/目的基因复合物；
步骤3、CBX3/目的基因/ARG-CBA复合物基因载体的制备：采用自组装室温孵育法制备基因载体复合物，具体步骤为在室温条件下，将步骤1制得的聚合物ARG-CBA与步骤2制得的CBX3/目的基因按照不同的质量比，在缓冲溶液中室温静置孵育5-30分钟，即得CBX3/目的基因/ARG-CBA。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中聚合物的纯化采用透析方法进行纯化，透析袋的截留分子量MWCO为1000。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中CBX3与目的基因质量比为1：50-1：10000。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的目的基因包括pDNA质粒、siRNA片段、microRNA片段中的一种或两种以上的任意组合。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中步骤1制得的聚合物ARG-CBA与步骤2制得的CBX3/目的基因质量比为12：1-48：1。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲溶液、枸橼酸缓冲液或无血清的细胞培养液，pH为6.8-8.2。
8.如权利要求1所述的基因载体复合物在制备基因治疗药物中的应用。
9.如权利要求1所述的基因载体复合物和药学上可接受的赋形剂混合，制备临床可接受的注射剂，包括局部注射剂和静脉注射剂。
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