CN112843177A - 高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，所述高金线兰提取物为高金线兰醇提物、高金线兰多糖或斑叶兰苷单体化合物中的至少一种。实验结果显示，本发明的高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物均具有良好的体内镇痛活性，对化学刺激和热刺激导致的急性或慢性疼痛均有显著抑制作用，可有效减少小鼠腹腔注射醋酸诱发的扭体次数，延长小鼠疼痛反应时间；提高热甩尾实验中小鼠痛阈值。上述结果提示高金线兰提取物可以用于临床上多种疼痛，尤其是炎症疼痛的药物治疗，或制备成缓解疼痛的保健品。

Description

高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用。
背景技术
疼痛是在人体受到各种伤害性刺激时所产生的感觉，常伴随许多疾病和创伤。军队在参与战争军事行动和执行多样化应急任务日趋增多，行动中出现伤员后，选用镇痛强、副作用小的镇痛药物，不仅能确保伤员的生命安全，还能减少伤员的痛苦，避免机体产生强烈的应激反应。目前临床应用最多的镇痛方式为药物镇痛，常用的镇痛药物主要为非甾体类与阿片类镇痛药物，虽然在临床上都取得了较好的疗效，但均有不同程度的不良反应。因此，寻找和开发新型、安全有效的镇痛药物一直以来都是疼痛治疗中的重要任务。
“北有冬虫草，南有金线莲”。金线莲是闽台特色中草药，来源于兰科(Orchidaceae)开唇兰属Anoectochilus Blume植物花叶开唇兰A.roxburghii，全草入药，具有清热凉血、祛风利湿、解毒等功效。金线莲主要含有内酯苷类(如金线莲苷)、多糖类和黄酮类活性成分，多用于治疗高血压、糖尿病、肝炎和肿瘤等症(张红艳，潘馨.金线莲化学成分及药理活性研究进展.海峡药学,2009,21,82-84)，疗效甚佳，因此金线莲在民间素有“药王”、“金草”等盛誉。作为药食两用植物，金线莲需求量极大，野生资源趋于枯竭，所以市场出现了很多混淆品和伪品。尤其是一些植株形态与金线莲相似的近缘种，如浙江金线兰、兴仁金线莲、南丹金线兰等，在民间常与金线莲混用，严重影响其临床药效及安全性。
根据既往的高效液相检测方法认为这些易混淆品种均含有金线莲的主要成分金线莲苷(3-(R)-3-β-d-Glucopyranosyloxybutanolide，kinsenoside)，但通过优化的检测方法发现，部分混淆品和伪品中所含的主要成分为斑叶兰苷(3-(S)-3-β-d-Glucopyranosyloxybutanolide，gooderoside A)，即金线莲苷异构体(Wu YB,Peng MC,Zhang C,Wu JG,Ye BZ,Yi J,Wu JZ,Zheng CJ.Quantitative determination of multi-class bioactive constituents for quality assessment of ten Anoectochilus,fourGoodyera and one Ludisia species in China.Chinese Herbal Medicines,2020,4,430-439)。金线莲苷和斑叶兰苷互为差向异构体，仅内酯苷元羟基构型不同，极性极为相近。主要化学成分不同，则药效也不尽相同，民间易混淆品种与金线莲混用入药的合理性也必然遭受质疑。2018年，在云南金线莲商品调查及产地跟踪调查过程中发现的一种植物形态与金线莲非常相似的开唇兰属植物(民间亦作金线莲使用)，鉴定为高金线兰Anoectochilus elatus Lindl.，虽然该种植株形态与金线莲较为相似，但花较大，倒置；花的唇瓣前部与基部***行，唇瓣裂片类三角形，可明显区别于金线莲。目前，已成功实现高金线兰的组织培养，解决了资源问题。高金线兰在中国属首次发现，为国内新记录种(郑丽香，田怀珍，吴锦忠，许宝玲，郑承剑，黄泽豪，吴岩斌.中国兰科植物一新记录种--高金线兰.中国现代中药,2018,20(1):14-16)。前期研究表明，高金线兰的主要化学成分为斑叶兰苷，而不是金线莲苷。且有学者发现虽然金线莲苷具有保肝、降糖和降血脂等多种生物活性，但其异构体斑叶兰苷则没有活性(Xiang M,Liu T,Tan W,Ren H,Li H,Liu J,Cao H,Cheng Q,Liu X,Zhu H,Tuo Y,Wang J,Zhang Y.Effects of kinsenoside,a potentialimmunosuppressive drug for autoimmune hepatitis,on dendritic cells/CD8+Tcells communication in mice.Hepatology.2016,64(6):2135-2150)。至今亦未有关于斑叶兰苷和高金线兰提取物的药理活性报道。仅在印度民间有将高金线兰用于治疗虫、蛇咬伤的相关报道(Sherif N A,Kumar T S,Rao M V.In vitro regeneration by callusculture of Anoectochilus elatus Lindley,an endangered terrestrial jewelorchid.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant,2016,52(1):72-80)。但至今未见有关高金线兰及其提取物和单体化合物斑叶兰苷用于镇痛方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，所述高金线兰提取物为高金线兰醇提物、高金线兰多糖或斑叶兰苷单体化合物中的至少一种。
所述斑叶兰苷(gooderoside A)单体化合物的结构如下所示：
Figure BDA0002950066320000021
所述高金线兰醇提物的制备方法包括以下步骤：
将高金线兰用浓度为40～95％的乙醇水溶液回流提取(乙醇与高金线兰的料液比为30:1)，提取液经减压浓缩至无醇味的浸膏，得到高金线兰醇提物。
所述高金线兰醇提物中斑叶兰苷含量>50％。
所述高金线兰多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)提取：高金线兰经乙醇水提取后的药材残渣晾干至无醇味，用水加热煮沸提取2～3次，每次溶媒用量约为生药量的8～10倍，每次提取时间为1～2小时，合并提取液；
(2)醇沉：将上述提取液进行浓缩至原体积1/4为止，放至冷却，缓慢加入95％乙醇，调整提取液中乙醇浓度至80％，放置4℃冰箱过夜，抽吸过滤，沉淀用无水乙醇与丙酮反复洗至滤液为淡黄色；
(3)纯化：将上述沉淀物按8mg/ml比例溶于水后离心，取上清液包扎于3500KD即用型透析袋内，将透析袋置于流水中过夜，再将透析袋用双蒸水清洗2-4次，每次1小时，收集透析袋内水溶液，减压浓缩，干燥得高金线兰多糖。
所述高金线兰多糖含量大于或等于90％。
所述高金线兰多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和***糖组成，其摩尔比分别为1:0.14:5.19:0.75:0.13:0.46。
所述斑叶兰苷单体化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)提取：将高金线兰醇提物即浸膏充分混悬于水(浸膏与水的料液比为10:3)中，超声1～60min，离心取上清液；沉淀物重复混悬于水中，超声1～60min，滤取上清液；重复至少3次，合并上清液；
(2)干燥：将上述合并上清液经冷冻干燥即得斑叶兰苷单体化合物。
所述治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的疼痛尤其指的是炎症疼痛。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明采用醋酸致小鼠扭体、小鼠热甩尾和小鼠***舔足模型(Zheng CJ,Huang BK,Han T,Zhang QY,Zhang H,Rahman K,Qin LP.Antinociceptive activities ofthe liposoluble fraction from Vitex negundo seeds.Pharmaceutical Biology,2010,48,651-658)，观察高金线兰提取物灌胃给药的镇痛作用。实验结果显示，本发明的高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物均具有良好的体内镇痛活性，对化学刺激和热刺激导致的急性或慢性疼痛均有显著抑制作用，可有效减少小鼠腹腔注射醋酸诱发的扭体次数，延长小鼠疼痛反应时间；提高热甩尾实验中小鼠痛阈值；且高金线兰的醇提物和斑叶兰苷单体化合物可显著减少小鼠足底注射***所致II相舔足时间，该作用并不能被纳洛酮拮抗，表明其无***受体激动剂样成瘾性等副作用。上述结果提示高金线兰提取物(包括高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物)可以用于临床上多种疼痛，尤其是炎症疼痛的药物治疗，或制备成缓解疼痛的保健品。
本发明为寻求新的治疗或缓解疼痛药物和保健品提供了一种新的来源。
附图说明
图1是斑叶兰苷(gooderoside A单体化合物的化学结构示意图。
图2是高金线兰醇提物的HPLC色谱图。
图3是单糖对照品和高金线兰多糖的单糖组成HPLC色谱图(A.单糖对照品，1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.***糖；B.高金线兰多糖；1.甘露糖；2.鼠李糖；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.***糖)。
图4是高金线兰提取物对醋酸致小鼠扭体次数的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。
图5是高金线兰提取物对醋酸致小鼠扭体潜伏期的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。
图6是高金线兰提取物对热甩尾小鼠痛阈值的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。
图7是高金线兰提取物对***致小鼠I相舔足时间的影响示意图，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；MOR，***；ANT，纳洛酮；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。
图8是高金线兰提取物对***致小鼠II相舔足时间的影响示意图，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；MOR，***；ANT，纳洛酮；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
高金线兰提取物的制备
1)高金线兰醇提物的制备：
将100g高金线兰药材(组培苗通过申请人实验室自主培养获得)用95％乙醇水溶液3L按常规回流提取(乙醇与高金线兰的料液比为30:1)，提取液经减压浓缩至无醇味的浸膏，得高金线兰醇提物20g，经液相分析该高金线兰醇提物中斑叶兰苷(金线莲苷异构体)含量为59％，如图2所示，图2是高金线兰醇提物的HPLC色谱图。从图中可以看出，高金线兰醇提物色谱峰较少，所含杂质不多，主要成分以斑叶兰苷为主。
2)高金线兰多糖的制备：
(1)提取：高金线兰经乙醇水提取后的药材残渣晾干至无醇味，用水加热煮沸提取2～3次，每次溶媒用量约为生药量的8～10倍，每次提取时间为1～2小时，合并提取液；
(2)醇沉：将上述提取液进行浓缩至原体积1/4为止，放至冷却，缓慢加入95％乙醇，调整提取液中乙醇浓度至80％，放置4℃冰箱过夜，抽吸过滤，沉淀用无水乙醇与丙酮反复洗至滤液为淡黄色；
(3)纯化：将上述沉淀物按8mg/ml比例溶于水后离心，取上清液包扎于3500KD即用型透析袋内，将透析袋置于流水中过夜，再将透析袋用双蒸水清洗2-4次，每次1小时，收集透析袋内水溶液，减压浓缩，干燥得高金线兰多糖。
苯酚硫酸法测得高金线兰多糖含量为90％，高效液相法测得单体组成主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和***糖组成，其摩尔比分别为1:0.14:5.19:0.75:0.13:0.46，如图3所示，图3是单糖对照品和高金线兰多糖的单糖组成HPLC色谱图(A.单糖对照品，1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.***糖；B.高金线兰多糖；1.甘露糖；2.鼠李糖；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.***糖)。从图中可以看出，高金线兰多糖的单糖组成主要有葡萄糖、甘露糖和半乳糖，仅含有少量的***糖、鼠李糖和木糖，其摩尔比分别为5.19:1:0.75:0.46:0.14:0.13。
3)斑叶兰苷单体化合物的制备：
(1)提取：将高金线兰醇提物即浸膏充分混悬于水(浸膏与水的料液比为10:3)中，超声30min，离心取上清液；沉淀物重复混悬于水中，超声30min，滤取上清液；重复3次，合并上清液；
(2)干燥：将上述合并上清液经过夜0℃以下冷冻干燥即得斑叶兰苷单体化合物，HPLC-ELSD检测含量>95％。结合1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC以及NOESY等波谱数据(Zhang Y,Xia Y,Lai Y,Tang F,Luo Z,Xue Y,Yao G,Zhang Y,ZhangJ.Efficient synthesis of kinsenoside and goodyeroside a by a chemo-enzymaticapproach.Molecules,2014Oct 22；19(10):16950-8)，鉴定斑叶兰苷单体化合物的化学结构如图1所示，图1是斑叶兰苷(gooderoside A单体化合物的化学结构示意图。
实施例2
高金线兰提取物的镇痛药效学实验
2.1.醋酸致小鼠扭体试验
2.1.1造模与分组
选取80只健康ICR鼠，随机分为8组，每组10只，分别为空白组、阳性药(吲哚美辛)组、高金线兰多糖高中低剂量三组、高金线兰醇提物高中低剂量三组。
2.1.2剂量与给药
各组小鼠每天灌服药物0.1mL/10g，阳性药组灌5mg/kg吲哚美辛溶液，实验组高中低剂量组分别灌胃25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，空白组灌胃等体积生理盐水，共计7d。
2.1.3观测指标
末次给药30min后，各组均腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2mL/只。观察扭体反应(腹部内凹，躯体与后腿伸张，臀部抬高，蠕行)动物数、首次扭体出现的时间及20min内小鼠的扭体次数。
2.2.小鼠热甩尾试验
2.2.1造模与分组
选取80只健康ICR鼠，随机分为8组，每组10只，分别为空白组、阳性药(吲哚美辛)组、高金线兰多糖高中低剂量三组、高金线兰醇提物高中低剂量三组。
2.2.2剂量与给药
各组小鼠每天灌服药物0.1mL/10g，阳性药组灌5mg/kg吲哚美辛溶液，实验组高中低剂量组分别灌胃25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，空白组灌胃等体积生理盐水。
2.2.3观测指标
将小鼠尾部下部垂直浸入55℃恒温水浴锅中，以尾回缩出水面的潜伏期为测痛指标，给药前间隔5min测2次以其均值为基础痛阈，给药后再测两侧，取其均值为给药后痛阈。分别测量给药当天的痛阈提高率。
2.3.***致小鼠舔足试验
2.3.1造模与分组
选取140只健康ICR鼠，随机分为14组，每组10只，分别为空白组、阳性药组、阳性药+拮抗剂组，高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物高中低剂量各三组，以及斑叶兰苷单体化合物高剂量+拮抗剂组。
2.3.2剂量与给药
阳性药组尾静脉注射5mg/kg***，阳性药+拮抗剂组注射5mg/kg+0.4mg/kg纳洛酮，实验组高中低剂量组分别灌胃25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，空白组灌胃等体积生理盐水，斑叶兰苷单体化合物高剂量+纳洛酮组灌胃斑叶兰苷单体化合物100mg/kg+尾静脉注射纳洛酮0.4mg/kg，给药体积为1ml/100g每日，共计7天。
2.3.3观测指标
末次给药30min后，于右后足皮下注射2.5％***溶液(0.92％甲醛)30μL，立即置于透明容器内；观察并记录小鼠分别在0～5min(Ⅰ相反应)和15～30min(Ⅱ相反应)2个不同阶段的舔(咬)足时间，以该时间作为动物疼痛反应强度的指标。
2.4实验结果
采用SPSS 22.0对两组数据进行两样本t检验统计学分析，P<0.05时认为差异有统计学意义。
2.4.1高金线兰提取物对醋酸致小鼠扭体次数和潜伏期的影响
如图4所示，图4是高金线兰提取物对醋酸致小鼠扭体次数的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。从图中可以看出，给药7d后，高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物给药组都能够剂量依赖性的抑制腹腔注射醋酸后诱导的小鼠扭体次数，均与模型组有显著性差异(p<0.05)。高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物的高剂量组小鼠的扭体次数分别为5.4±2.8、4.4±2.8和4.2±2.9，均与阳性对照药吲哚美辛组的扭体次数(4.1±1.9)相当。各给药组小鼠的首次扭体出现时间(潜伏期)也都明显延长，与模型组均有显著性差异(p<0.05)(如图5所示，图5是高金线兰提取物对醋酸致小鼠扭体潜伏期的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。)，从图中可以看出，其中斑叶兰苷单体化合物高剂量组与阳性药组的潜伏期时间(分钟)相当，分别为6.0±2.7和6.2±2.3。
2.4.2高金线兰提取物对热甩尾小鼠痛阈值的影响
如图6所示，图6是高金线兰提取物对热甩尾小鼠痛阈值的影响，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；COX，吲哚美辛；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。从图中可以看出，给药当天测定给药后小鼠痛阈值的提高率，可以看出高金线兰醇提物、高金线兰多糖高剂量组以及斑叶兰苷单体化合物中剂量组均可显著提高小鼠痛阈值，与空白对照组均有显著性差异(p<0.05)。高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物高剂量组对小鼠痛阈值的提高率分别为20.0％、16.1％和22.1％，阳性药组为30.9％。
2.4.3高金线兰提取物对***致小鼠舔足时间的影响
如图7所示，图7是高金线兰提取物对***致小鼠I相舔足时间的影响示意图，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；MOR，***；ANT，纳洛酮；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。从图中可以看出，在I相反应中，模型组小鼠舔足时间(秒)为55.5±8.9，除阳性对照***外(24.4±6.4)，仅斑叶兰苷单体化合物高剂量组(45.4±9.3)可显著减少小鼠舔足时间，与模型组存在显著性差异(p<0.05)。而在II相反应中，如图8所示，图8是高金线兰提取物对***致小鼠II相舔足时间的影响示意图，其中vs空白对照组，*p<0.05，**p<0.01(CON，空白组；MOR，***；ANT，纳洛酮；PS，多糖；EE，醇提物；GA，斑叶兰苷；L/M/H，低/中/高)。从图中可以看出，模型组小鼠舔足时间(秒)为138.9±23.7，高金线兰醇提物中、高剂量组与斑叶兰苷单体化合物低、中、高剂量组均可有效减少小鼠舔足时间，并呈剂量依赖关系，与模型组存在显著性差异(p<0.05)。其中，除***组外(36.9±15.1)，斑叶兰苷单体化合物高剂量组效果最佳(80.1±31.1)。纳洛酮单独给药对小鼠舔足时间无明显影响(140.2±25.3)，但纳洛酮与***联合给药(143.3±29.1)可显著拮抗***的镇痛活性，但是纳洛酮与斑叶兰苷单体化合物联合给药(95.3±29.6)不能拮抗斑叶兰苷的镇痛活性，表明斑叶兰苷单体化合物不是通过阿片受体发挥镇痛作用，提示其可能无***受体激动剂样成瘾性等副作用，安全性较好。
鉴于上述药效实验结果，本发明的高金线兰提取物(包括高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物)具有良好的体内镇痛活性，对化学刺激和热刺激导致的急性或慢性疼痛均有显著抑制作用，提示高金线兰提取物(包括高金线兰醇提物、高金线兰多糖、斑叶兰苷单体化合物)可以用于临床上多种疼痛，尤其是炎症疼痛的药物治疗，或制备成缓解疼痛的保健品。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (8)

1.高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰提取物为高金线兰醇提物、高金线兰多糖或斑叶兰苷单体化合物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述斑叶兰苷单体化合物的结构如下所示：
Figure FDA0002950066310000011
3.根据权利要求1所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰醇提物的制备方法包括以下步骤：
将高金线兰用浓度为40～95％的乙醇水溶液回流提取，提取液经减压浓缩至无醇味的浸膏，得到高金线兰醇提物。
4.根据权利要求3所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰醇提物中斑叶兰苷含量>50％。
5.根据权利要求3所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)提取：高金线兰经乙醇水提取后的药材残渣晾干至无醇味，用水加热煮沸提取2～3次，每次溶媒用量约为生药量的8～10倍，每次提取时间为1～2小时，合并提取液；
(2)醇沉：将上述提取液进行浓缩至原体积1/4为止，放至冷却，缓慢加入95％乙醇，调整提取液中乙醇浓度至80％，放置4℃冰箱过夜，抽吸过滤，沉淀用无水乙醇与丙酮反复洗至滤液为淡黄色；
(3)纯化：将上述沉淀物按8mg/ml比例溶于水后离心，取上清液包扎于3500KD即用型透析袋内，将透析袋置于流水中过夜，再将透析袋用双蒸水清洗2-4次，每次1小时，收集透析袋内水溶液，减压浓缩，干燥得高金线兰多糖。
6.根据权利要求5所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰多糖含量大于或等于90％。
7.根据权利要求5所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述高金线兰多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和***糖组成，其摩尔比分别为1:0.14:5.19:0.75:0.13:0.46。
8.根据权利要求3所述的高金线兰提取物在制备治疗或缓解疼痛的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述斑叶兰苷单体化合物的制备方法包括以下步骤：
(1)提取：将高金线兰醇提物即浸膏充分混悬于水中，超声1～60min，离心取上清液；沉淀物重复混悬于水中，超声1～60min，滤取上清液；重复至少3次，合并上清液；
(2)干燥：将上述合并上清液经冷冻干燥即得斑叶兰苷单体化合物。
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