CN112840032A - 用于确定蛋白水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于评定样品中功能性蛋白S的水平的体外方法。本发明还提供了用于确定样品中功能性蛋白S的水平的试剂盒。还提供了一种基于对功能性蛋白S的水平的确定然后给药治疗剂的治疗法。

Description

用于确定蛋白水平的方法
技术领域
本发明涉及用于确定样品中蛋白S的水平，特别是用于确定功能性蛋白S的水平的体外测定。
背景技术
蛋白S是维生素K依赖性血浆蛋白，具有多种功能[1,2]。在人血浆中，它以两种形式循环，即游离蛋白(约30％)以及与补体调节剂C4b结合蛋白(C4BP)的复合物(约70％)[1,2]。游离蛋白S充当两种不同的抗凝蛋白的辅因子，即活化蛋白C(APC)和组织因子途径抑制剂α(TFPIα)[3-5]。对患有杂合蛋白S缺乏症的个体产生影响的静脉血栓形成的风险增加证明了蛋白S作为抗凝剂的生理重要性[6]。在婴儿患有纯合蛋白S缺乏症的罕见情况下，已有描述戏剧性的高凝状态。蛋白S敲除小鼠进一步证明了蛋白S的至关重要性，因为敲除可引致胚胎致死[7,8]。有趣的是，将蛋白S敲除与血友病A(FVIII敲除)或B(FIX敲除)结合使用时，小鼠没有明显的血栓形成或出血表型，证明蛋白S敲除的致死性是由于未受控的高凝作用引起的[9,10]。
APC与蛋白S一起调节活化因子V(FVa)和活化因子VIII(FVIIIa)的活性，它们分别是酶因子Xa(FXa)和因子IXa(FIXa)的辅因子[11,12]。在带负电荷的磷脂的表面上，FXa和FVa形成将凝血酶原活化为凝血酶的凝血酶原酶复合物，而FIXa和FVIIIa产生将FX活化为FXa的tenase复合物。tenase复合物和凝血酶原酶复合物是凝血传播阶段的关键组分，并且APC与蛋白S一起是重要的抗凝蛋白，可调节该阶段的活性。
蛋白S也已被鉴定为在FXa活性的调节中充当TFPIα的辅因子[5,13-16]。TFPIα是凝血的外源性途径的关键调节剂，因为它可抑制组织因子——因子VIIa(TF/FVIIa)复合物，当在存在FVII和FVIIa(FVII的活化形式)两者的情况下TF暴露于血液时，该复合物在血管损伤时形成[17-19]。TF/FVIIa活化FIX和FX两者，从而引发凝血反应。TFPIα结合并抑制新鲜活化的FXa，随后TFPIα/FXa复合物结合并抑制TF/FVIIa。在存在带负电荷的磷脂的情况下，TFPIα对FXa的抑制率会因蛋白S的存在而增强。TFPIα是一种包含三个Kunitz结构域的Kunitz型蛋白酶抑制剂——第一个结合并抑制FVIIa，第二个结合并抑制FXa，并且第三个结合蛋白S[17-19]。
最近，已鉴定出凝血因子V(FV)的剪接变体，其中从位于中央的大活化结构域B结构域中删除了702个氨基酸残基(残基756-1458)[20]。在位置709、1018和1545处由凝血酶或FXa介导的切割将FV活化为FVa的过程中，B结构域被切割掉，因此，在通过凝血酶或FXa切割后，短段FV剪接变体作为促凝剂具有完全活性。然而，重要的是，B结构域的截断引致位于B结构域的其余C-末端部分(残基1458-1545)中的TFPIα的带负电荷的高亲和力结合位点暴露。在TFPIα分子中，短段FV的结合位点位于第三Kunitz结构域之后的高度带正电荷的C-末端延伸部中[21-24]。血浆中存在的TFPIα(约0.2nM)或在血浆中存在的亚nM水平的短段FV(Kd<1nM)的高亲和力复合物中循环，或在与以约20nM存在的全长FV的低亲和力(Kd>10nM)相互作用的情况下循环。TFPIα与短段FV以及与全长FV的结合对于在循环中保持TFPIα很重要，因为否则它会由于其相对较低的分子量(40kDa)而在尿液中丢失[20]。
最近的研究表明，TFPIα与短段FV之间的相互作用不仅对于在循环中保持TFPIα很重要，而且还会影响TFPIα作为FXa抑制剂的功能[3,25]。短段FV本身仅微弱地刺激TFPIα的活性，但它强力支持蛋白S的TFPIα-辅因子活性。结果表明，短段FV和蛋白S充当协同的TFPIα辅因子。在具有纯化组分的模型***中，在存在短段FV(仅几nM)和带负电荷的磷脂囊泡的情况下，蛋白S是高度高效的，仅几nM即可产生最大的TFPIα辅因子活性[25]。相反，在不存在短段FV的情况下，甚至未达100nM的蛋白S也会产生同样高效的TFPIα辅因子活性。
遗传性或获得性蛋白S缺乏症是静脉血栓形成的危险因素，并且对蛋白S的分析是对患有静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的患者进行实验室评估的一部分[2]。蛋白S的APC辅因子功能的基于抗体的测定和测试可商购获得，并且通过这样的测定，百分之几的VTE患者被鉴定为缺乏蛋白S。为了鉴定蛋白减少，已证明对游离蛋白S的测定具有最高的预测价值[26]。
仍然需要鉴定用于确定蛋白S的水平，特别是用于确定功能性蛋白S的水平的新的和改进的方法。
发明内容
因此，本发明试图单独地或以任何组合的方式减轻、缓解或消除本领域中的上述一个或多个缺陷和缺点，并且通过提供根据所附专利权利要求的方法至少解决了上述问题。
本发明的第一方面提供了一种用于确定样品中功能性蛋白S的水平的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使从受试者获得的样品与TFPIα和以下一种或多种接触：短段FV；或短段FV变体；或功能上等效的FV变体；
(b)使所述样品与FXa接触；以及
(c)测量所述样品中FXa活性的水平
其中所述FXa活性的水平指示所述样品中功能性蛋白S的水平。
在一个实施方式中，所述方法由以上列出的步骤(a)至(c)组成。
本发明还提供了一种用于确定样品中游离(或非C4BP复合的)蛋白S的水平的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使从受试者获得的样品与TFPIα和以下一种或多种接触：短段FV；或短段FV变体；或功能上等效的FV变体；
(b)使所述样品与FXa接触；以及
(c)测量所述样品中FXa活性的水平
其中所述FXa活性的水平指示所述样品中所述游离(或非C4BP复合的)蛋白S的水平。
“FV”是指凝血因子V，其包括FV的至少部分活化的形式(FVa)，条件是FV被活化使得TFPIα协同辅因子活性得以保留。TFPIα协同辅因子活性将以部分活化的形式得以保留，其中B结构域的C-末端暴露。在完全活化的FVa中，整个B结构域被切割掉，因此FVa没有与TFPIα的相互作用，也没有辅因子活性。人类FV的序列在下面的SEQ ID NO:1中给出：
SEQ ID NO:1是成熟循环单链FV的全长序列。序列开头的斜体区段是对应于重链的部分(残基1-709)，并且序列结尾的普通字体(非粗体、斜体或带下划线)区段是轻链(残基1546-2196)。这些区段之间的粗体区段是B结构域(残基710-1545)。
Figure BDA0003003414200000031
Figure BDA0003003414200000041
“短段FV”(也称为“FV-756-1458”)是指FV的替代性剪接变体，引致FV的大活化结构域(B结构域)中的702个氨基酸残基(在残基756-1458之间)的框内缺失[20]。这引致在B结构域的其余C-末端部分中暴露酸性区域，该酸性区域构成了TFPIα的高亲和力结合位点[23]。
短段FV的示例性氨基酸序列在下面以SEQ ID NO:2给出。与FV相比，短段FV在702个氨基酸——氨基酸756-1458之间存在缺失。序列开头的斜体区段是对应于重链的部分(残基1-709)，并且序列结尾的普通字体(非粗体、斜体或带下划线)区段是轻链(残基1546-2196)。这些区段之间的区段(以粗体序列开头和结尾)是B结构域在缺失后的剩余部分。粗体和带下划线的区段对应于位置710-755，而随后的粗体和未带下划线的部分代表全长FV序列的1458-1545部分。
Figure BDA0003003414200000051
因此，在本发明的一个实施方式中，所述方法的短段FV具有上述SEQ ID NO:2的序列。
本文还描述了短段FV变体。一种短段FV变体是FV 810-1491(SEQ ID:No 3)，尽管其在B结构域中保留了结合TFPIα的酸性区域，但其缺乏TFPIα辅因子活性以及蛋白S。该突变体最初是在Toso和Camire的2004年的公开文件中的另一种上下文中描述的[29]。
序列开头的斜体区段是对应于重链的部分(残基1-709)，并且序列结尾的普通字体(非粗体、斜体或带下划线)区段是轻链(残基1546-2196)。这些区段之间的区段(以粗体序列开头和结尾)是B结构域在缺失后的剩余部分。粗体和带下划线的区段对应于位置710-810，而随后的粗体和未带下划线的部分表示全长FV序列的1491-1545部分。
Figure BDA0003003414200000061
与短段FV相比与蛋白S的TFPIα协同辅因子活性增加的另一种短段FV变体是FV709-1476(SEQ ID No:4)，其最初是在Marquette等人的1995年的另一种上下文中描述的[28]。
序列开头的斜体区段是对应于重链的部分(残基1-709)，并且序列结尾的普通字体(非粗体、斜体或带下划线)区段是轻链(残基1546-2196)。这些区段之间的区段(以粗体序列开头和结尾)是B结构域在缺失后的剩余部分(代表全长FV序列的1476-1545部分)。在该构造中，Ile 708突变为Thr并且Leu 1544突变为Thr。该突变体还具有引入的MluI限制酶位点，其编码氨基酸708、709和1477的连接(用Thr代替Ile708)。另外，该变体在位置1544-1545处具有引入的MluI位点，其引入点突变以Thr取代Leu1544。这是在FV-cDNA中引入Mlu1位点的结果[28]。
Figure BDA0003003414200000071
如上所述，在本发明的方法中还涵盖了变体的使用。“短段FV变体”是指短段FV的替代性剪接变体，其保留了对TFPIα的高结合亲和力以及与蛋白S的协同TFPIα辅因子活性的功能特征。此类变体的实例在说明书中给出。
术语“结合活性”和“结合亲和力”旨在表示多肽分子结合或不结合靶标的趋势。可以通过确定多肽及其靶标的解离常数(Kd)来定量结合亲和力。较低的Kd指示对靶标具有较高的亲和力。类似地，多肽与其靶标结合的特异性可以根据多肽对其靶标的比较解离常数(Kd)与相对于多肽和另一种非靶标分子的解离常数进行比较来定义。
该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接确定，并且可以通过诸如Caceci等人(Byte9:340-362,1984；其公开内容通过引用并入本文)所述的方法甚至针对复杂混合物进行计算。用于评估配体对靶标的结合能力的标准测定在本领域中是已知的，包括例如ELISA、免疫印迹(Western blots，蛋白印迹)、RIA和流式细胞术分析。多肽的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评定，诸如通过BiacoreTM***分析来评定。
可以进行竞争性结合测定，其中将多肽与靶标的结合和靶标与该靶标的另一已知配体(诸如另一多肽)的结合进行比较。发生50％抑制的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等效于Kd。Ki值永远不会小于Kd，因此可以方便地替换Ki的测量值以提供Kd的上限。
结合亲和力的替代性测量包括EC50或IC50。在本上下文中，EC50指示多肽达到其与固定量靶标的最大结合的50％时的浓度。IC50指示多肽抑制固定量竞争者与固定量靶标的最大结合的50％时的浓度。在这两种情况下，较低水平的EC50或IC50指示对靶标的亲和力较高。配体对其靶标的EC50和IC50值均可通过众所周知的方法来确定，例如ELISA。
因此，短段FV变体优选地能够与亲和力为其与另一非靶标分子结合的亲和力的至少两倍、10倍、50倍、100倍或更大倍的TFPIα结合。应当理解的是，与TFPIα的结合是经由短段FV变体的B结构域的C-末端区段。
因此，在一个实施方式中，“高结合亲和力”是指短段FV变体的Kd小于1nM。
“功能上等效的FV变体”是指FV的变体，其具有与短段FV等效的功能，即该变体对TFPIα具有高亲和力(与非变体FV相比)。结合亲和力如上文关于短段FV变体所定义。高亲和力可能是由于B结构域的C-末端部分中的酸性区域暴露所致，该酸性区域构成了TFPIα的高亲和力结合位点，如上文针对短段FV所述。另外，功能上等效的FV变体具有与蛋白S的协同TFPIα辅因子活性。
全长FV的变体的一个实例是这样的FV，其在Arg709和/或Arg1018处被切割，但由于Arg1545突变为Gln而未在1545处被切割，如在说明书中稍后更详细讨论的。
如上所述，“变体”包括保守或非保守性***、缺失和替换。例如，保守性替换是指同一通用类别中的氨基酸(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)被该类别中的另一种氨基酸取代。因此，保守性氨基酸替换和非保守性氨基酸替换的含义在本领域中是众所周知的。特别是包括保留对TFPIα具有高亲和力的功能特征的变体。
在一个实施方式中，变体的氨基酸序列与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段具有至少50％的同一性，例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。
可以使用合适的计算机程序——例如威斯康星大学遗传计算组(University ofWisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序——确定两个多肽之间的序列同一性百分比，并且应当理解，相对于序列已被最佳比对的多肽计算同一性百分比。
或者，可以使用Clustal W程序进行比对[36]。可以使用如下参数：快速成对比对参数：K-元组(字)大小；1,窗口大小；5,空隙罚分；3,顶部对角线的数量；5。评分方法：x百分比。多个比对参数：空隙开口罚分；10,空隙延伸罚分；0.05。评分矩阵：BLOSUM。
或者，可以使用BESTFIT程序确定局部序列比对。
如上所述在测定中使用的FV、短段FV或变体可以是人类的或衍生自其他物种，或者是人工的/合成的。
“FXa”(也称为“因子Xa”)是指活化的凝血因子X(FX)。所述方法中所使用的FXa可以是人类的或衍生自其他物种。替代地，FXa可以是人工的/合成的。示例性FX包括具有与UniProtKB数据库中的登录号P00742的序列相对应的序列的人类FX，或具有登录号P00743的牛FX。这些是FX的酶原形式，并且必须将其活化为活性酶FXa。替代地，FX可以来自另一非人类哺乳动物，如猴子、猪、小鼠或大鼠。
从受试者获得的样品中含有未知量的功能性蛋白S。
蛋白S是具有多种功能的维生素K依赖性血浆蛋白。在血浆中，蛋白S以游离蛋白和与C4BP复合这两种形式存在。游离蛋白S在凝血调节中是APC的辅因子。蛋白S也可在抑制FXa中充当组织因子途径抑制剂α(TFPIα)的辅因子。“功能性蛋白S的水平”包括这样的含义：在与短段FV或短段FV变体的协同作用中能够充当TFPIα的辅因子的蛋白S的水平。示例性蛋白S序列具有UniProtKB登录号P07225。
“功能性蛋白S”还包括游离蛋白S的含义，即未结合在复合物中的蛋白S。之前有表明，C4BP复合蛋白S在充当TFPIα的辅因子方面的能力也受到一定的限制[5]。然而，即使是这种情况，本发明人惊奇地发现，本发明的测定仅检测到由游离的非C4BP结合蛋白S部分刺激的TFPIα活性，如实例所示。尽管先前报告的经由蛋白S充当APC辅因子的能力来检测功能性蛋白S的水平的测定表明，功能性蛋白S的水平与健康状况对比蛋白S缺乏状态之间存在明显的相关性[35]，但该研究表明，在评定TFPIα而不是APC的活性时，该相关性很差，并且不适合医疗用途(例如诊断)，因为从缺乏蛋白S的个体获得的值与健康个体的值重叠。然而，如本文所证明并且基于TFPIα活性的量度，本发明的测定提供了对游离或功能性蛋白S的水平(其与患者的健康状况对比蛋白S缺乏状态密切相关)的量度，并且可以用于例如医疗诊断中。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定样品中游离蛋白S的水平的体外方法。在相同或替代性的实施方式中，本发明提供了一种用于确定样品中非C4BP结合蛋白S的水平的体外方法。
“水平”包括蛋白S(例如游离蛋白S，例如非C4BP复合蛋白S)的物理量的含义。例如，认为FXa活性通常与蛋白S的物理量(例如游离蛋白S的量，例如非C4BP复合蛋白S的量)密切相关。但是，在一些实施方式中，术语“水平”旨在表示“活性”，例如蛋白S在样品中的活性，而不是蛋白S的物理丰度。这是因为可以预期的是，在确定受试者是否具有足够的蛋白S活性用于正常功能或缺乏蛋白S活性时，认为重要的是归因于蛋白S库的实际活性量(例如游离蛋白S，例如非C4BP复合蛋白S)而不是游离蛋白S的物理量(例如非C4BP复合蛋白S)。例如，如本文所讨论的，在某些类型的蛋白S缺乏症中，样品中存在的蛋白S蛋白的实际量可能处在正常范围内，但是蛋白S(例如游离蛋白S，例如非C4BP复合蛋白S)的活性很低(例如通过本发明的方法确定)。因为在某些实施方式中，本发明确定了相关蛋白S库的总体活性，所以本发明的方法适用于诊断所有类型的蛋白S缺乏症(其引致蛋白S的TFPIα辅因子活性降低，例如就其TFPIα辅因子活性而言，蛋白S的丰度降低和/或蛋白S的功能降低)。认为，在不存在短段FV的情况下，蛋白S对TFPIα具有某些固有的辅因子活性。但是，蛋白S和短段FV的组合可协同增强蛋白S充当TFPIα的辅因子的能力。如本文所述，因为本发明检测蛋白S和短段FV协同增强TFPIα并随后抑制FXa活性的能力，所以在一些实施方式中，蛋白S的TFPIα辅因子活性是在存在短段FV的情况下被协同增强的辅因子活性。在有必要的情况下，为了特异性检测被短段FV协同增强的蛋白S的水平或活性，技术人员可理解如何进行适当的控制，例如通过在不存在短段FV的情况下运行本发明的方法(即如本文所述的步骤(a))进行适当的控制。这将给出蛋白S充当TFPIα辅因子的任何固有能力的基线量度，然后可以在存在短段FV的情况下从蛋白S充当TFPIα辅因子的能力中减去该基线量度。但是，因为蛋白S的固有活性很低，所以在试图确定受试者是否患有蛋白S缺乏症时，一般认为不需要考虑该活性。
但是，本发明不检测蛋白S充当APC辅因子的能力，因此不适合于检测APC辅因子活性中的功能缺陷。
因此，在一些实施方式中，活性具体是指蛋白S(例如游离蛋白S，例如非C4BP复合蛋白S)的TFPIα辅因子活性。在这些情况下，本发明的方法适用于检测和诊断受试者的这样的蛋白S缺乏症——其中所述缺乏症至少引致TFPIα辅因子活性的缺乏症(例如，伴随或不伴随APC辅因子活性的缺乏症)，但不适用于诊断这样的蛋白S缺乏症——其中所述缺乏症仅是蛋白S的APC辅因子活性的缺乏症。虽然本发明没有描述仅由TFPIα辅因子活性的蛋白S缺乏症引起的疾病，但如果需要的话，结合诸如[35]中描述的APC辅因子活性测定能够区分此两者。
然后，技术人员将理解，本发明的本方法可以用于检测蛋白S丰度的整体降低(I型缺乏症)，因为蛋白S的降低会引致TFPIα辅因子活性的降低；并且还可以用于检测TFPIα辅因子活性的特异性缺乏症，而与蛋白丰度无关。
在一些实施方式中，活性包括蛋白S充当TFPIα辅因子的活性的含义。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种用于确定蛋白S活性(例如是游离蛋白S活性，例如非C4BP复合蛋白S活性，例如其中所述活性是样品中蛋白S的TFPIα辅因子活性)的水平的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使从受试者获得的样品与TFPIα和以下一种或多种接触：短段FV；或短段FV变体；或功能上等效的FV变体；
(b)使所述样品与FXa接触；以及
(c)测量所述样品中FXa活性的水平
其中所述FXa活性的水平指示所述样品中游离(或非C4BP复合)蛋白S活性的水平。
因此，在一些实施方式中，通篇使用的术语“水平”可以理解为是指“活性”。例如，在诊断方法中，可以将本发明在测试样品中确定的蛋白S活性与对照蛋白S活性水平、或与从一个或多个健康对照样品获得的蛋白S活性水平进行比较。
“TFPIα”(也称为“TFPI alpha”或“TFPI”)是指组织因子途径抑制剂α。TFPIα是凝血外源性途径初始步骤的重要调节剂[17,19]。响应于血管损伤和组织因子(TF)暴露于血液组分，该途径被活化。示例性的TFPIα序列是UniProtK登录号P10646的序列，如以下在SEQID NO:5中所给出的。
>sp|P10646-2|TFPI1_人类组织因子途径抑制剂的同种型βOS＝智人OX＝9606GN＝TFPI
MIYTMKKVHALWASVCLLLNLAPAPLNADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRDNANRIIKTTLQQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGFQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFVTKEGTNDGWKNAAHIYQVFLNAFCIHASMFFLGLDSISCLC
SEQ ID NO:5
在本发明的第一方面的一个实施方式中，所述方法的步骤(a)还包括使所述样品与能够允许蛋白组装的底物接触。
“能够允许蛋白组装的底物”包括与不存在所述底物的情况相比使得参与反应的蛋白能够更容易组装的任何底物。因此，与液相中反应的反应速率相比，底物将提高反应速率。
在一个实施方式中，这是这样一种底物，其允许所述方法中涉及的蛋白在底物表面上组装，例如，如果所述方法中的蛋白对表面具有亲和力。这种组装允许蛋白-蛋白相互作用并增加所述方法内反应的效率。
能够允许蛋白组装的底物可以是磷脂囊泡。反应中的蛋白对带负电荷的磷脂膜具有亲和力，这提高了反应速率。
在一个实施方式中，步骤(a)还包括钙或等效物。等效物包括例如其他二价阳离子，诸如镁。钙或等效物的功能是使蛋白保持正确的构象和活性，此外，它对于蛋白与磷脂的相互作用也很重要。任选地，钙存在的浓度介于0.1至30mM之间，任选地介于0.1至10mM之间。在一个实施方式中，钙存在的浓度介于1至2mM之间。
所述方法的步骤可以按顺序执行，即步骤(a)，然后是步骤(b)，然后是步骤(c)。还应当理解，步骤可以以另一顺序执行，例如步骤(b)在步骤(a)之前。还应当理解，步骤中的任何两个或全部三个可以是同时进行的。例如，在一个实施方式中，步骤(a)和步骤(b)同时进行，然后进行步骤(c)。在另一实施方式中，步骤(a)、(b)和(c)全部同时发生。
因此，在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤或由以下步骤组成：
(d)提供基于功能性蛋白S的标准曲线；以及
(e)将步骤(c)的测量值与步骤(d)的所述标准曲线进行比较。
关于步骤(a)、(b)和(c)，如上所述，应当理解，所述方法的步骤可以以任何顺序执行，尽管步骤(e)取决于已经执行过的步骤(c)和(d)。
在一个实施方式中，步骤(d)的所述标准曲线是使用从健康个体获得的血浆样品生成的。可以在将这些样品用作标准之前将它们合并。还可以单独分析它们，以确定功能性蛋白S活性的正常范围。
“健康个体”包括未患有已知的与蛋白S相关的疾病且具有正常水平的蛋白S的人类受试者。
替代地，使用已知量的纯化蛋白S或包含确定量蛋白S的培养基溶液生成标准曲线。
作为进一步的替代方案，可以使用缺乏蛋白S的血浆(任选地用已知量的蛋白S重构)生成标准曲线。
任选地，使用与测试样品相同的方案生成标准曲线。因此，在所述方法中，以相同的时间量并使用相同浓度的底物执行步骤。
应当理解，可以将步骤(d)的标准曲线与步骤(c)的结果进行比较，以确定样品中功能性蛋白S的水平是否处在正常范围内。
蛋白S是TFPI的辅因子并且可增强TFPI活性。TFPI本身是FXa活性的抑制剂。因此，认为，样品内的功能性蛋白S或蛋白S活性的水平与FXa活性的水平呈反相关。在本发明的一个实施方式中，所测量的所述FXa活性的水平指示对FXa的抑制，即所进行的测量是测量由于TFPIα的抑制而引起的FXa活性的损失。对FXa的抑制水平指示所述样品中功能性蛋白S的水平，例如指示样品中蛋白S(例如游离蛋白S，例如非C4BP复合蛋白S)活性的水平。
“对FXa抑制的水平”包括FXa活性降低的含义。FXa抑制指示功能性蛋白S，因为短段FV和蛋白S充当协同的TFPIα辅因子，支持TFPIα作为FXa抑制剂的活性。因此，随着蛋白S的水平或活性增加，对FXa抑制的水平也增加。因此，在本上下文中，蛋白S的“功能”是作为具有短段FV(和短段FV变体)的协同的TFPIα辅因子。
本领域技术人员将理解，如本文所公开的，可以多种不同的方式测量FXa抑制。FXa活性的水平可以通过例如低分子量合成底物来测量，该底物在FX切割它时会改变颜色。底物转化率与当时的FXa实际浓度直接相关。因此，对于这样的方法，执行的读数将是吸收率。合成底物也可以使用荧光读数。
FXa的水平也可以使用其天然底物凝血酶原来测量。替代地，对抑制的或活性的FXa具有特异性的抗体或其他结合分子可以用于区分活化的FXa和抑制的FXa。
在一个实施方式中，所述方法不涉及凝血酶生成测定(TGA)。技术人员将理解术语TGA是什么意思，以及哪些测定属于术语TGA的范畴。认为，短段FV在被添加到TGA***中时具有促凝作用，这与蛋白S对TFPIα活性的任何作用是分不开的。因此，认为TGA与本发明的方法不相容。
在本发明的一个实施方式中，所述样品是血浆。任选地，所述样品是柠檬酸化血浆。柠檬酸化血浆是指钙被螯合，因此无法进行凝血。在替代性实施方式中，可以使用含有其他凝血抑制剂的血浆。替代性样品的实例包括含有EDTA或Li-肝素或凝血酶抑制剂(诸如水蛭素或低分子量合成凝血酶抑制剂)的血浆。
在本发明的一个实施方式中，所述样品具有高稀释因子，例如其中所述稀释因子介于1/10至1/2000之间，任选地所述稀释因子介于1/25至1/800之间，并且作为进一步任选的实施方式，所述稀释因子为大约1/50至1/400。例如，所述稀释因子可以是1/50、1/100、1/200或1/400。1/X的稀释因子是指样品以1:X的比例存在，其中X是稀释底物的浓度。当在所述方法中使用短段FV变体FV-709-1476时，可以使用较高的稀释因子，高达约1/1000至1/2000。另一方面，在蛋白S缺乏的样品中，可能需要低稀释度(诸如1/10稀释度)来获得足够的蛋白S效果。
本方法的一个特殊且出乎意料的优点是，蛋白S与短段FV之间的协同辅因子活性意味着可以使用低浓度的蛋白S进行测定。所述方法可以检测蛋白S的低至几nM的浓度，而游离蛋白S的血浆浓度约为100nM。
如上所述，这允许相对较高地稀释所述方法中所使用的血浆样品。这引致从血浆中稀释潜在的干扰或抑制因素，因此最小化或消除了这些底物/干扰因素对所述方法的任何作用或影响。如本文所述，为了进一步最小化潜在的凝血活化，可以使用凝血酶抑制剂。
在一些实施方式中，稀释底物是缓冲剂，因此在缓冲剂中稀释所述方法的样品。任选地，所述缓冲剂具有介于7至8之间的pKa并且与Ca2+相容。
示例性缓冲剂包括HNBSACa2+缓冲剂和BSA缓冲剂。HNBSACa2+是基于Hepes(例如10至50mM)的缓冲盐水(≈0.15M NaCl)，而BSA是样品被高度稀释时用作载体蛋白的牛血清白蛋白。一种替代性缓冲剂选项是用BSA和Ca2+缓冲为pH约为7.4的Tris-HCl盐水。可以在本发明的方法中使用的其他示例性缓冲剂包括MOPS、Trizma、TES、Tricine。示例性缓冲剂配方包括盐水和Ca2+和BSA或等效的蛋白载体——例如卵清蛋白、胶质、人白蛋白、PEG(聚乙二醇)变体或类似物，以最小化蛋白吸附。
因此，在一个实施方式中，本发明的方法能够检测蛋白S的低水平(或活性)，例如功能性蛋白S的低水平(或活性)，例如游离蛋白S的低水平(或活性)，例如蛋白非C4BP复合蛋白S的低水平(或活性)。就物理丰度而言，低水平是指样品中蛋白S的水平在稀释后的样品中可以在0.1至5nM之间的范围内，并且任选地，稀释后的样品中的蛋白S的水平小于3nM。
在未稀释的样品中，存在的蛋白S的水平可以介于10至1000nM之间，例如在未稀释的样品中蛋白S的水平可以为大约100nM。在人血浆样品中，极少数情况下游离蛋白S可以高达200至300nM。如上所述，未稀释的样品应稀释至0.1至5nM之间的蛋白S范围。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括使所述样品与C4BP接触。任选地，这发生在所述方法的步骤(a)中。
C4BP是指补体调节剂C4b结合蛋白。在血浆中，C4BP以与蛋白S复合的形式循环，血浆中大约30％的蛋白S以游离蛋白S的形式存在，而其余部分与C4BP结合。将添加到所述测定/方法中的C4BP与蛋白S解离，以暴露C4BP的β链的蛋白S结合位点。这使得在所述方法中C4BP能够与蛋白S结合。
C4BP由两种类型的亚基构成，七个α链通过二硫键彼此连接并与单个β链连接。蛋白S结合位点在β链上。示例性的α链基因具有登录号P04003，而示例性的β链登录号为P20851。
在本发明的一个实施方式中，步骤(b)还包括在存在FXa的情况下使所述样品与能够发出可测量信号的组分接触。本领域技术人员将理解，这样的组分可以用于测量FXa活性的水平，任选地用于测量FXa抑制。
在一个实施方式中，在存在FXa的情况下发出的所述可测量信号是荧光或色彩。
例如，所述可测量的组分可以是低分子量合成底物，该底物在FXa切割它时会改变颜色，即该底物是显色底物。这样的底物也被称为“FXa底物”。底物转化率与当时的FXa实际浓度直接相关。在另一实施方式中，合成底物也可以使用荧光读数。这些底物可以是附着在小肽上的有色或荧光基团。FXa切割肽并释放有色或荧光基团，然后测量所得的颜色或荧光。当该基团仍然被附着时，它没有颜色或荧光。
FXa的水平也可以用其他底物(例如天然底物凝血酶原)测量。
在替代性实施方式中，对抑制或活性的FXa具有特异性的抗体或其他结合分子可以用于区分活性的FXa和抑制的FXa。
在本发明的一个实施方式中，所述可测量的组分是S2765，其是具有下式的化合物：Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl。
替代地，所述可测量组分可以选自由以下各项组成的组：
(i)S-2222(Bz-IIe-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl)
(ii)CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH
(iii)Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC
(iv)Boc-Leu-GLy-Arg-AMC
(v)甲氧羰基-D-Nle-Gly-Arg-pNA
(vi)Tos-Gly-Pro-Lys-pNA
(vii)Z-Lys-SBzl·HCl
(viii)Mes-D-LGR-ANSN(C2H5)2
任选地，这些组分可以乙酸盐的形式存在。
在一个实施方式中，所述能够发出可测量信号的组分的浓度介于0.1至2mM之间。优选地，所述浓度介于0.3至1mM之间，并且更优选地所述浓度为0.8mM。
在优选的实施方式中，所述组分是S2765，其存在于以上给出的浓度范围内。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤(a)和/或步骤(b)中使所述样品与凝血酶抑制剂接触。优选地，所述与凝血酶抑制剂的接触发生在所述方法的步骤(a)中。
“凝血酶抑制剂”是指能够抑制酶凝血酶(因子IIa)的物质。这样的物质通过抑制凝血酶来充当抗凝剂。
用于本文公开的方法的凝血酶抑制剂可以是二价、单价或变构凝血酶抑制剂。二价抑制剂结合凝血酶的活性位点和外位点1，而单价抑制剂仅结合活性位点。二价凝血酶抑制剂的实例包括：水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定。单价凝血酶抑制剂的实例包括：阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、Pefabloc和达比加群。变构抑制剂包括DNA适体、苯并呋喃二聚体，苯并呋喃三聚体、聚合木质素和硫酸化β-O4木质素(SbO4L)。
在一个实施方式中，凝血酶抑制剂是水蛭素或Pefa-block(也称为“Pefabloc”)。
在一个实施方式中，所述方法中使用的所述短段FV变体或FV变体是对凝血酶活化具有抗性的变体。
例如，这样的变体包括短段FV变体和FV变体，其中凝血酶切割位点从精氨酸(R)突变为谷氨酰胺(Q)。特别地，这样的突变体可以在位置709和1545附近突变，从而影响切割位点。
一个示例性突变体是短段FVQQ，其具有突变为Gln的位置Arg709和位置Arg1545(编号为全长FV)两者。该突变体对凝血酶切割具有抗性，因为切割位置均已突变[25]。
另一个示例性突变体是短段FVRQ(也称为短段FV1545Q)，其中Arg1545突变为Gln(Q)，但位置709未突变并且是Arg。因此，该突变体可以在Arg709处被切割，但在Gln1545处不被切割(因为该位置对凝血酶切割具有抗性)。因此，突变体保留了TFPIα辅因子功能所需的酸性区(B结构域的酸性C-末端部分)。另一个示例性突变体是短段FVQR，其可在1545处被切割。因此，该突变体在切割后将失去TFPI辅因子功能。该突变体仍可在测定中使用，因为它在测定之前或测定期间没有被切割。
因此，在一个实施方式中，突变体短段FV选自短段FVQQ、短段FVRQ和短段FVQR。
如已经描述的，短段FV突变体的其他实例包括FV-709-1476和FV-810-1491。
称为FV-709-1476的短段FV变体的序列在上文中以SEQ ID NO:4给出。
短段FV变体“FV-810-1491”缺失氨基酸811至1490。该突变体结合TFPIα但与蛋白S无协同辅因子活性[29]。这表明并非所有的短段FV变体都可用于构建测定。
与短段FV相比，FV-709-1476具有增强的协同TFPIα-辅因子活性，而有趣的是FV-810-1491与蛋白S几乎没有或完全没有协同辅因子活性(例如，参见本申请的实例的图9至图11)。因此，在FV 810-1491中缺失但在短段FV和FV 709-1476两者中均存在的序列似乎对短段FV和FV-709-1476的协同辅因子活性很重要。该序列对应于全长FV(EFNPLVIVGLSKDG)中的残基1477-1490，并且对于与蛋白S的协同TFPIα辅因子活性很重要。
因此，在一个实施方式中，在所述方法中使用的突变体是FV-709-1476(SEQ IDNO:4)。
在要求保护的方法的一个实施方式中，短段FV变体或FV变体是具有协同或增强的辅因子活性的变体。“协同或增强的辅因子活性”是指当不存在蛋白S时，短段FV变体或FV变体表现出很低的TFPIα辅因子活性，因此对FXa的抑制水平也很低。但是，当存在蛋白S时，短段FV变体或FV变体作为协同TFPIα辅因子与蛋白S相互作用，以使FXa失活，从而引致较高水平的FXa抑制。因此，不存在短段FV或短段FV变体的蛋白S的TFPIα辅因子活性低得多，必须添加浓度高得多的蛋白S才能获得高效的TFPIα辅因子活性。
保留协同辅因子活性的变体在酸性区域之前具有足够的序列以保留活性。这样的变体可以是FV或短段FV变体。FV-709-1476是具有协同辅因子活性的变体的实例，而FV-810-1491不具有协同辅因子活性。与FV-810-1491突变体相比，FV709-1476突变体在FV-810-1491的酸性区域开始的1491位点的N-末端多出14个氨基酸。这14个残基如上所述是EFNPLVIVGLSKDG(位置1477-1490)。
因此，在一个实施方式中，短段FV变体或FV变体是保留B结构域的酸性C-末端区域的变体。
在本发明方法的一个实施方式中，FV变体是这样的变体，其能够在位置709和1018处被凝血酶切割和/或不能在位置1545处被凝血酶切割。
这种突变体的一个实例被称为FV-1545Q。这是一个全长FV变体，在Arg1545处突变为Gln。位置709和1018处的凝血酶切割位点是完整的且对凝血酶敏感。未切割形式的此突变体(FV-1545Q)与全长FV相似，并且本身没有或只有很少的协同辅因子活性。但是，在位置709和1018处用凝血酶切割后，FV暴露出酸性区域，因为Arg1545突变为Gln(Q)，所以该酸性区域仍然附着。凝血酶切割的FV-1545Q是高效的辅因子[35]。
在所描述的本发明的一个实施方式中，所述方法对蛋白S的游离形式具有特异性。“对蛋白S的游离形式具有特异性”是指所述方法能够确定游离蛋白S的水平，而不是确定总蛋白S的水平。由此包括非C4BP复合S蛋白的水平的含义。所述方法未检测到任何报告的与C4BP复合时可以作为S蛋白的特性的TFPIα活性。
在一个实施方式中，所述方法能够检测蛋白S缺乏症。
蛋白S缺乏症包括低于蛋白S的正常或健康身体水平、或低于功能性蛋白S活性的正常水平的含义。技术人员将理解什么被认为是S蛋白的正常或健康水平，以及什么被认为是S蛋白的缺乏或不健康水平。
因此，将认识到的是，所描述的方法适用于鉴定受试者是否为蛋白S缺乏症的患者。蛋白S缺乏症包括I型蛋白S缺乏症和II型蛋白S缺乏症。即，在一些实施方式中，本发明提供了一种诊断受试者患有蛋白S缺乏症的方法。
I型蛋白S缺乏症是蛋白S水平降低的缺乏症。技术人员(例如临床医生)知道特定的阈值，低于所述特定的阈值就认为受试者患有蛋白S缺乏症。I型具有特别低的游离蛋白S(因为C4BP尽可能多地结合)，这使得本发明非常有用。总蛋白S的测定可测量游离和复合的(与C4BP结合)蛋白S两者，并且具有较低的预测值。
II型蛋白S缺乏症的特征在于蛋白S的功能缺陷。因此，II型蛋白S缺乏症患者可以具有正常水平的蛋白S，但蛋白S的功能较低。认为，在这些情况下，蛋白S缺乏症可能是蛋白S的TFPIα辅因子活性的缺乏症；蛋白S的APC辅因子活性的缺乏症；或蛋白S的TFPIα辅因子活性和蛋白S的APC辅因子活性两者的缺乏症。
因为本发明确定了游离蛋白S活性的水平，而不是例如直接确定游离蛋白S蛋白的量，所以本发明能够检测到降低至以下量的蛋白S缺乏症：a)减少的蛋白S量(即I型蛋白S缺乏症)；和/或b)适当量的蛋白S蛋白，但是其中蛋白S作为TFPIα-辅因子的活性很低或不存在。因此，所述方法能够鉴定患有I型蛋白S缺乏症的患者。所述方法能够鉴定患有TFPIα-辅因子活性缺乏的II型蛋白S缺乏症的患者。所述方法不适用于检测仅表现为APC辅因子活性缺乏的缺乏症。
从理论上讲，可能存在II型蛋白S缺乏症的情况，其特征在于对TFPIα的辅因子活性很低。因此，在一个实施方式中，所述方法可以能够鉴定TFPIα辅因子活性缺乏的II型蛋白S缺乏症。
III型蛋白S缺乏症的特征在于总蛋白S水平正常，但与蛋白S活性降低有关的游离蛋白S的水平很低。因为本发明可检测仅与蛋白S的游离库相关而不与复合蛋白S相关的蛋白S活性，所以本发明也适用于检测III型蛋白S缺乏症。
蛋白S缺乏症可以是杂合或纯合蛋白S缺乏症。大多数患者是杂合性的，而只记载有极少数情况的重病儿童患有纯合性缺乏症。
在一个实施方式中，蛋白S缺乏症可以是获得性的。获得性缺乏症可以通过例如自身抗体引起。因为本发明仅检测游离蛋白S的水平或活性，所以认为本发明不检测与自身抗体结合的蛋白S的活性水平，因此适用于检测由抗蛋白S自身抗体的存在引起的蛋白S缺乏症。获得性缺乏症也可能是由于例如肝病或维生素K缺乏症引起的。由自身抗体引起的蛋白S缺乏状态的一个实例是在病毒感染后可能发生的疾病，其中抗体与蛋白S形成交叉反应。一种这样的被描述为具有蛋白S缺乏症的病毒感染是水痘病毒感染。AIDS也与低蛋白S水平有关。抗磷脂抗体综合症(狼疮抗凝剂)也与获得性蛋白S缺乏症有关。
肝病与蛋白S缺乏症有关，因为大部分蛋白S是在肝脏中产生的。维生素K缺乏症与蛋白S缺乏症有关，因为维生素K是合成正确的蛋白S所必需的。蛋白S是维生素K依赖性蛋白，其含有修饰的氨基酸γ-羧基谷氨酸。妊娠也与游离蛋白S的水平降低有关，并且用本发明的方法测量孕妇的样品可能是令人感兴趣的。
在一个实施方式中，所述受试者是人。
在一个实施方式中，所述受试者是接受华法林治疗的患者。
在一个实施方式中，所述受试者是被诊断患有或疑似患有静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的患者。替代地，所述受试者是被诊断为患有或疑似患有由针对蛋白S的自身抗体引起的HIV感染、AIDS或低蛋白水平的患者。在一个实施方式中，所述患者患有维生素K缺乏症或肝病。在一个实施方式中，所述受试者妊娠。
在本发明方法的一个实施方式中，短段FV或短段FV变体或FV变体的浓度介于0.5至20nM之间，任选地其中所述浓度为2nM。
在本发明方法的一个实施方式中，步骤(a)在37℃下进行1至15分钟，任选地其中所述时间为10分钟。优选地，所述时间小于10分钟。
任选地，步骤(c)可以进行10至30分钟，例如步骤(c)可以进行大约15分钟。
在本发明的一个实施方式中，所述方法中TFPIα与FXa的比率为大约1:1。
在本发明方法的一个实施方式中，FXa的浓度介于0.1至1nM之间。在任选的实施方式中，FXa的浓度介于0.2至0.6nM之间。任选地，FXa的浓度为0.3nM。
在本发明方法的一个实施方式中，TFPIα的浓度介于0.1至1nM之间。在任选的实施方式中，TFPIα的浓度介于0.2至0.6nM之间。任选地，TFPIα的浓度为0.3nM。
本领域技术人员将认识到，本发明的方法可以与确定总蛋白S水平的方法结合进行。
总蛋白S可以通过本领域技术人员已知的多种测定法来测量。这样的测定法包括使用针对蛋白S的抗体的测定法，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫放射测定(IRMA)、Laurell电免疫测定和放射免疫测定(RIA)。总蛋白S测定的另一个实例是自动化仪器中基于乳胶的凝集测定。
本发明的第二方面是一种治疗方法，其包括使用根据第一方面所述的方法鉴定患有蛋白S缺乏症的受试者，并向所述受试者施用治疗剂。
在本发明第二方面的一个实施方式中，向所述受试者施用的治疗剂是抗凝疗法。抗凝疗法的实例是技术人员已知的，并且包括华法林和FXa抑制剂或凝血酶抑制剂。
FXa抑制剂包括直接(例如，利伐沙班、阿哌沙班和依度沙班)和间接(例如，磺达肝癸钠)FXa抑制剂两者。
凝血酶抑制剂的实例在说明书中已在上面概述。
根据本发明的第三方面，提供了一种用于确定样品中功能性蛋白S的水平的试剂盒。本发明的试剂盒可以包括执行根据本发明所述的方法所需的任何组分。在一个实施方式中，所述试剂盒包括以下两种或更多种：
TFPIα、FXa、磷脂囊泡、FXa底物(例如S2765)和选自以下的FV：短段FV或短段FV变体或功能上等效的FV变体。
任选地，所述试剂盒包括TFPIα、FXa、磷脂囊泡和FXa底物(例如S2765)中的所有，以及短段FV或短段FV变体或功能上等效的FV变体中的一个(如上面关于第一方面所述)。
所述试剂盒还可以包括一种或多种用于检测蛋白S的APC辅因子活性的组分，例如可以包括抗TFPIα抗体。例如，在一个实施方式中，所述试剂盒包括：抗TFPIα抗体；以及以下中的任何一个或多个：TFPIα、FXa、磷脂囊泡、FXa底物(例如S2765)和选自以下的FV：短段FV或短段FV变体或功能上等效的FV变体。
在一个实施方式中，所述试剂盒至少包括抗TFPIα抗体和a)选自以下的FV：短段FV或短段FV变体或功能上等效的FV变体，和/或b)FXa。
根据本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，其适于使用根据本发明第一方面所述的方法确定样品中功能性蛋白S的水平。
本发明还提供了一种用于治疗患有蛋白S缺乏症的受试者的治疗剂，其中已经使用根据本发明(例如根据本发明第一方面)所述的方法鉴定了蛋白S缺乏症。在一些实施方式中，所述治疗剂是抗凝剂，如本文所述。
本发明还提供了治疗剂在制备用于治疗蛋白S缺乏症的药物中的用途，其中已经根据本发明的方法(例如根据本发明第一方面的方法)鉴定了蛋白S缺乏症。在一些实施方式中，所述治疗剂是抗凝剂，如本文所述。
本发明还提供了一种诊断患有蛋白S缺乏症的受试者的方法，其中已经根据本发明的方法(例如根据根据本发明第一方面的方法)鉴定了蛋白S缺乏症。
如上所述，所述方法能够特异性检测蛋白S的TFPIα辅因子活性。有鉴于此，可以结合执行单独的测定法来检测蛋白S的APC辅因子活性，从而确定：
a)是否两种辅因子活性均缺乏——这种情况预期会发生在蛋白S的物理丰度很低的I型缺乏症中；发生在游离蛋白S的丰度很低的III型缺乏症中；以及如果蛋白S的TFPIα辅因子活性和APC辅因子活性均缺乏，则可以预期会发生在II型缺乏症中；或者
b)是否仅影响蛋白S的TFPIα辅因子活性或APC辅因子活性中的一个。预期在I型和III型缺乏症中不会出现这种情况。
可以结合确定样品中蛋白S的APC辅因子活性的方法来执行本发明的任何方法。
因此，本发明还提供了一种诊断受试者缺乏蛋白S的TFPIα辅因子活性、缺乏蛋白S的APC辅因子活性、或缺乏蛋白S的TFPIα辅因子活性和APC辅因子活性两者的方法，其中所述方法包括：
a)确定蛋白S的TFPIα辅因子活性的水平，其中所述确定是根据本文所述的本发明方法来执行的，例如包括以下步骤或由以下步骤组成：
(i)使从受试者获得的样品与TFPIα和以下一种或多种接触：短段FV；或短段FV变体；或功能上等效的FV变体；
(ii)使所述样品与FXa接触；以及
(iii)测量所述样品中FXa活性的水平
其中所述FXa活性的水平指示所述样品中功能性蛋白S的水平；以及
b)确定所述样品中APC辅因子活性的水平。
通过将两种活性的水平与对照水平进行比较，可以确定缺乏辅因子活性中的仅一种还是两种。一旦知道了该信息，就可以采取合适的治疗策略来减轻所述缺乏症中的一个或两个。例如，如果受试者仅具有蛋白S的TFPIα辅因子活性缺乏症，则可以采取合适的治疗策略。
替代地，如果仅缺乏蛋白S的APC辅因子活性，则可以采取合适的治疗策略。
针对TFPIα辅因子活性缺乏症和APC辅因子缺乏症的适当治疗可以是相同的。
如果两种辅因子功能均受到影响，则两种治疗选项都可能是适当的。
用上述治疗法治疗受试者的方法——其中已经确定该受试者(使用本发明的方法)患有以下缺乏症：a)仅缺乏蛋白S的TFPIα辅因子活性；b)仅缺乏蛋白S的APC辅因子活性；或c)缺乏蛋白S的TFPIα辅因子活性和蛋白S的APC辅因子活性——也被包括在本发明中。
本说明书中对显然先前公开的文献的列举或论述不必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。
附图说明
现在，将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例：
图1作为TFPIα辅因子的蛋白S对FXa的抑制作用。在存在不同浓度的蛋白S(上)或血浆稀释液(下)的情况下，将短段FV(2nM)与FXa(0.3nM)、25uM PL(20/20/60:PS/PE/PC)、TFPIα(0.25nM)一起温育。监测底物(S-2765)的转化持续900秒，曲线斜率逐渐降低指示FXa酰胺分解活性受到抑制。
图2作为TFPIα辅因子的蛋白S对抑制FXa的特异性。按照方法和图1图例中的描述进行TFPIα介导的FXa活性抑制。在该实验中，以1/100稀释度测试了正常血浆和缺乏蛋白S的血浆的混合物。在该稀释度下，正常血浆产生最大的FXa抑制作用，而缺乏蛋白S的血浆则没有活性。随着正常血浆/缺乏蛋白S的血浆比率的增加，观察到剂量依赖性作用。
图3C4BP与蛋白S的结合引致TFPIα-辅因子活性丧失。在存在短段FV链(2nM)和蛋白S(5nM)的情况下，TFPIα(0.25nM)的TFPIα介导的FXa(0.3nM)抑制作用最大，引致低吸收率曲线。添加浓度增加的C4BP(以高亲和力与蛋白S结合)引致蛋白S的辅因子活性的剂量依赖性丧失，在3.13nM C4BP下，蛋白S的许多辅因子作用消失，而在6.25nM下，辅因子活性被完全阻断。
图4缺乏蛋白S的血浆几乎不含TFPIα-辅因子活性。在存在来自对照(E、F、G和H)或缺乏蛋白S的个体(A、B、C和D)的短段FV(2nM)和血浆稀释液的情况下，用合成底物S-2765监测TFPIα(0.25nM)对FXa的抑制。
图5血浆S中蛋白的TFPIα辅因子活性的标准曲线的实例。在存在作为蛋白S的来源的正常血浆的不同稀释液的情况下，监测TFPIα加短段FV对FXa的抑制900秒。最终吸收率用于构建标准曲线，其中100％表示1/200稀释度，50％表示1/400稀释度等。
图6缺乏蛋白S的患者和对照的血浆中的功能性蛋白S的水平。来自对照和患有蛋白S缺乏症的个体的血浆蛋白S的TFPIα辅因子活性的测定结果表明，在患有蛋白S缺乏症的个体(左)和没有蛋白S缺乏症的个体(右)之间，蛋白S值具有良好的区分性。
图7游离蛋白S的旧测试与新功能测定之间的相关性。将新测试的结果与先前在免疫学游离蛋白S测定中确定的结果进行比较。
图8总蛋白S的旧测试与新功能测定之间的相关性。将新测试的结果与先前在免疫学总蛋白S测定中确定的结果进行比较。
图9示出了FV短和短段FV变体的比较。FV变体的浓度各不相同，而蛋白S(3nM)、TFPIα(0.25nM)和FXa(0.3nM)是恒定的。此处绘制的值是900秒后达到的吸收率。
图10示出了三个突变体的底物发展的时间曲线。FV变体的浓度为1nM，FXa(0.3nM)和TFPIα(0.25nM)与FV变体浓度一样是恒定的。蛋白S的浓度是变化的。
图11示出了使用血浆稀释液作为蛋白S来源的短段FV和FV 709-1476的比较。
图12示出了短段FV、短段FV1545Q、凝血酶切割的短段FV1545Q和凝血酶切割的FV-1545Q的蛋白S滴定，全部使用TFPIα。
具体实施方式
实例
实例1–功能性蛋白S的测定
概述
在存在短段FV、蛋白S和带负电荷的磷脂囊泡的情况下，适时地通过合成底物S2765监测TFPIα介导的FXa抑制。稀释的血浆用作蛋白S的来源，并且使用血浆稀释液构建标准曲线。
材料与方法
患者-实验室中提供了先前表征的来自不同的缺乏蛋白S的家庭的单个柠檬酸化血浆样品(n＝36)[26]。也有四名患者接受了华法林治疗并伴有其他遗传性抗凝蛋白缺乏症；三种蛋白C缺乏症和一种抗凝血酶缺乏症。自90年代收集以来，样品一直储存在-80℃的温度下。将选自没有蛋白S缺乏症或血栓形成史的健康家庭成员的样本(n＝37)作为对照。总蛋白和游离蛋白S的血浆浓度值可从已发表的研究中获得[26]。先前描述了确定样品中游离蛋白和总蛋白S的方法[27]。从健康个体收集的柠檬酸化血浆库用于创建标准曲线，将库中的功能性蛋白S浓度设置为100％。
材料-人类FXa来自血液技术股份有限公司(Hematologic Technologies,Inc(HTI))；缺乏蛋白S的血浆来自酶研究实验室(Emzyme Research Laboratories)；在真核细胞中表达的TFPIα是来自日本化学血清疗法研究所(Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute)的T Hamuro博士的馈赠。如前所述表达和纯化短段FV[25]-FV709-1476[28]并且用类似的技术表达和纯化FV-810[29]。磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)来自Avanti Polar Lipids。如前所述，使用LiposoFast碱性挤出机(Armatis，德国)制备磷脂囊泡[30]。在2天内使用磷脂囊泡。合成底物S2765由意大利米兰的Chromogenix有限公司提供。如所述纯化不含结合蛋白S的C4BP[31]。
蛋白S介导的TFPIα-辅因子活性测定–该测定基于TFPIα在纯化***中使用我们先前描述的技术对FXa的抑制作用[25]。在该测定中，将短段FV(终浓度2nM)与磷脂(20:20:60的PS:PE:PC，25uM)、TFPIα(终浓度0.25nM)、在HNBSACa2+缓冲剂中稀释的血浆(25Hepes，0.15M NaCl，5mM CaCl2 pH 7.7，包含0.5mg/ml牛血清白蛋白和5单位/ml的水蛭素)(作为蛋白S的来源)一起在37℃下温育10分钟。通过添加S2765(0.8mM)和FXa(0.3nM)引发反应，然后在Tecan Infinite 200***中在405nM下监测吸收率15分钟。每个实验中给出的浓度均为最终浓度。
C4BP抑制蛋白S起到TFPIα辅因子的作用。为了研究游离的和C4BP结合的蛋白S两者是否充当TFPIα辅因子，在包含5nM蛋白S的FXa抑制测定中添加了浓度增加的纯化C4BP(0-50nM)。
结果
在存在带负电荷的磷脂囊泡、短段FV和纯化蛋白S或稀释的合并血浆的情况下，适时地跟踪TFPIα对FXa的抑制作用(图1)。在不存在蛋白S或血浆的情况下，吸收率曲线几乎是线性的，这表明在单独存在短段FV的情况下，TFPIα对FXa的抑制作用非常小。添加浓度增加的蛋白S可以对FXa产生剂量依赖性抑制，其中在1.25nM蛋白S下抑制作用为50％，而在5nM下抑制作用最大。类似地，测定中包括稀释的血浆而不是蛋白S产生了剂量依赖性抑制，其中在1/50稀释下观察到最大抑制，而在1/200下观察到约50％的抑制作用。测定中蛋白S的TFPIα-辅因子作用取决于短段FV的存在，并且在不存在添加的短段FV的情况下，蛋白S(高达10nM)和血浆(高达1/100稀释)均不会对FXa抑制产生任何刺激。
该测定对蛋白S具有特异性，因为添加缺乏蛋白S的血浆并没有刺激FXa抑制(图2)。正常的和缺乏蛋白S的血浆的混合物以1/100稀释度包含在测定中。增加正常的/缺乏蛋白S的血浆的比率会引致剂量依赖性的FXa抑制作用增加，并且在3:7的比率下观察到接近50％的抑制作用，这为如图1所示的1/200稀释的正常血浆的测定提供了大致相同量的蛋白S。
为了研究游离的和C4BP复合形式的蛋白是否都作为TFPIα辅因子具有活性，在含有5nM蛋白S的反应中包括浓度增加的C4BP(0-50nM)(图3)。在不添加C4BP的情况下，蛋白S介导的FXa抑制刺激最大。添加浓度增加的C4BP产生剂量依赖性的吸收率增加，表明蛋白STFPIα-辅因子活性受阻，并且在6.25nM C4BP下未观察到蛋白S的作用。这表明蛋白S和C4BP的1:1的化学计量复合物的形成引致TFPIα-辅因子活性丧失。
在该测定中测试了队列的36名患有已知遗传性蛋白S缺乏症的患者和37名年龄和性别相匹配的健康对照(从先前的家庭研究中鉴定出)。图4例示了来自四个缺乏蛋白S的个体和四个健康对照的吸收率读数。将待测血浆稀释到1/50、1/100、1/200和1/400，以覆盖蛋白S的正常浓度至蛋白S缺乏症中低蛋白S水平的范围。
利用稀释的血浆作为蛋白S来源进行测定后900秒的最终读数用于构建标准曲线，以定量作为TFPIα辅因子的蛋白S活性(图5)。由于1/200稀释产生约50％的抑制作用，故将其设定为100％。因此，1/400读数对应于50％，而1/100稀释对应于200％。最佳吸收率读数范围在0.1至0.25之间，并且由于患者和对照均在几种稀释度下进行分析，因此有可能获得该范围内的读数。
缺乏蛋白S的个体和对照的测试结果如图6所示。患者与对照之间的功能性蛋白S值存在差异。患者和对照的平均±SD值分别为35±20和120±25。患者的值介于8至83之间，而对照的值介于85至186之间。两种测定之间的相关性很高，其中r值为0.93，斜率为0.82，并且Y截距为-4.6。这表明该测定正在测量游离形式的蛋白S的活性。
功能性蛋白S值也与总蛋白S值相关(图8)。相关性(r值为0.88)低于与游离蛋白S的相关性。斜率为0.44并且Y截距为46。这些结果与以下结论一致：协同的TFPIα-辅因子活性仅与蛋白S的游离形式有关。
缺乏蛋白S的案例中有四例接受了华法林治疗。他们的功能性蛋白S值的平均±SD为10.9±4％；范围为8.0-16.6％，与游离蛋白S测定的结果非常吻合(8.9±4％；范围3.2-12.9)。对四名患有其他遗传性抗凝缺乏症的患者(三种蛋白C缺乏症和一种抗凝血酶缺乏症)进行了测试，以阐明华法林治疗对无蛋白S异常案例的影响。这些案例的平均±SD功能性蛋白S值为63.0±23％；范围为34.3-98.9，而平均±SD游离蛋白S值为39.5±19.6％；范围为22.6-67.7％。这表明，在华法林治疗的案例中，TFPIα功能测试也可如游离蛋白S测定那样高效地检测蛋白S缺乏症[26]。
为了评估新测试的内部测定变异，对一例正常案例和一例蛋白S缺乏案例进行了九次分析。正常案例的平均±SD为85.4±4.3％；范围为77.2-92.4％。蛋白S缺乏案例的对应值为47.8±5.4％；范围为40.0-53.7％。因此，具有正常蛋白S水平的样品的内部测定变异系数为5.1％，而对于蛋白S缺乏症的样品，其内部测定变异系数为10.6％。
讨论
维生素K依赖性蛋白S是一种多功能血浆蛋白[2]。作为血液凝固的几种反应的抗凝调节剂，它很重要。作为APC的辅因子，它控制tenase(FVIIIa)和凝血酶原(FVa)复合物中的辅因子的活性。此外，它还充当TFPIα的辅因子，调节游离[2,15,32]。最近的观察表明，短段FV刺激S蛋白的TFPIα辅因子活性，并且短段FV和S蛋白协同作用已增加了复杂性，但也为设计作为TFPIα辅因子的血浆S蛋白的功能测试提供了机会[3,25]。现在我们报告这种功能性蛋白S测定的形成和表征，其基于TFPIα在存在短段FV、血浆样品中的蛋白S和带负电荷的磷脂囊泡的情况下对FXa的抑制率。
蛋白S的协同TFPIα辅因子活性严格限于蛋白S的游离形式。这与蛋白S上C4BP的结合位点位于蛋白S的SHBG样区域(还已知该区域与TFPIα相互作用)一致[1,2,16,33]。蛋白S的APC辅因子活性也优先由蛋白S的游离形式表达，并且蛋白S中的几个区域(包括Gla结构域、TSR、EGF结构域和SHBG样区域)被证明是对于APC辅因子的活性很重要。由于TFPIα介导的FXa抑制反应发生在带负电荷的磷脂上，因此预期蛋白S的Gla结构域对于蛋白S的TFPIα辅因子活性很重要。这与几种非蛋白S缺乏接收华法林治疗的患者的低功能性蛋白S水平一致。
C4BP以高亲和力结合蛋白质S，这解释了为什么蛋白S的血浆水平降低(例如遗传性S缺乏症)优先反映在游离蛋白S的降低水平上。因此，游离蛋白S的测定要优于那些用于总蛋白S诊断蛋白S缺乏症[26]。但是，游离蛋白S的测定不能检测功能性蛋白S缺乏症。已证明对蛋白S的APC辅因子活性的测定可检测出蛋白S的ACP辅因子活性具有功能缺陷的案例，即所谓的II型蛋白S缺乏症。现在描述的作为TFPIα辅因子的蛋白S的功能的测定不仅适用于检测游离蛋白S的水平，还适用于检测其作为TFPIα辅因子的功能活性以及具有TFPIα辅因子功能缺陷的II型案例。最近，描述了另一种蛋白S作为TFPIα辅因子的功能测定法[34]。该测定法是基于TF引发的凝血酶生成测定，其中将固定量的TFPIα添加到缺乏蛋白S和患者血浆的混合物中。该测定法与我们现在描述的测定法在概念上有所不同，因为它没有利用蛋白S与短段FV之间的协同TFPIα-辅因子活性，因为在测定中任何固有短段FV的量都太低。作者发现，该测定法检测到大多数蛋白S缺乏症的案例，但与总蛋白和游离蛋白S的相关性相对较低。
现在所描述的测定法对蛋白S具有特异性，如缺乏蛋白S缺乏血浆的TFPIα-辅因子活性所证明的。该测定法需要低浓度(<3nM)的蛋白S，并且在存在2nM短段FV的情况下，1/100稀释的正常血浆可产生最大的TFPIα-辅因子活性。在不添加短段FV的情况下，在这样的稀释的血浆中几乎没有或完全没有TFPIα-辅因子活性。为了从蛋白S缺乏症患者的血浆中检测到非常低的蛋白S水平，可以使用较低的稀释因子(1/25或1/50)。在新的测定法中测试了来自先前表征的蛋白S缺乏家庭的血浆，并将结果与通过免疫学测试确定的游离蛋白和总蛋白S的浓度进行比较。新功能测定的结果与游离蛋白S的浓度密切相关，r值为0.92。相关线的Y轴截距接近0，且该线的斜率略低于1。与总蛋白S的相关性略低，其中r值为0.88。有趣的是，Y轴截距约为46％，并且该线的斜率为0.44。高截距与显示TFPIα-辅因子测定法对游离蛋白S特异的结果一致。
这项新的功能测试可准确检测出蛋白S缺乏症案例，并在有蛋白S缺乏症的案例和没有蛋白S缺乏症的案例之间实现了良好的区分。在四种情况下，该值非常接近较低的正常值。这四例来自游离蛋白S水平相对较高的缺乏蛋白S的案例的家庭。一个这样的家庭在先前的公开文件中被称为18号家庭，并且其中两个边缘案例来自该家庭[26]。其他两个边缘案例来自其他两个具有相似表型的家庭。
总之，我们现在描述血浆蛋白S的TFPIα-辅因子活性的新测试，该测试利用了蛋白S与短段FV之间最近描述的协同作用。该测试对游离蛋白S的TFPIα-辅因子活性具有特异性，可区分具有遗传性蛋白S缺乏症的案例与具有正常蛋白S水平和活性的案例。此外，该测试应能够检测到缺乏TFPIα-辅因子活性的II型蛋白S缺乏症。此类患者尚待鉴定。
实例2–FV变体和短段FV变体的特性
我们已经根据功能活性表征了几种短段FV变体。两个这样的突变体称为FV-709-1476和FV-810-1491(如本文所述)。与短段FV(也称为FV-756-1458)相比，FV-709-1476具有增强的协同TFPIα-辅因子活性，而有趣的是FV-810-1491不具有与蛋白S的协同辅因子活性。
这在图9中进行了例示，其中FV变体的浓度变化，而蛋白质S(3nM)、TFPIα(0.25nM)和FXa(0.3nM)浓度恒定。此处绘制的值是900秒后达到的吸收率。FV-709-1476的效率略高于短段FV，而FV-810-1491的效率较低。
图10示出了具有三个突变体的底物发展的时间曲线。在该实验中，FV变体的浓度为1nM。FXa(0.3nM)和TFPIα(0.25nM)浓度与FV变体浓度一样恒定。蛋白S的浓度是变化的。图10示出了FV-709-1476效率较高，因为添加的蛋白S具有较强的刺激作用。在整个实验过程中，这一直是一个一致的发现。特别值得注意的是缺乏蛋白S与FV-810-1491的作用，表明该突变体与蛋白S没有协同作用。
图11示出了使用血浆稀释液作为蛋白S来源进行的类似比较。图11示出了从900秒点开始的吸收率。图11示出了与短段FV变体相比，FV-709-1476变体可以稀释血浆大约两倍，因此说明FV-709-1476变体具有较高的活性。
图12示出了变体短段FV1545Q的活性(由于用Gln(Q)取代了Arg(R)，因此对1545位处的凝血酶切割具有抗性)。在图12所示的时间过程中，很明显，该变体与短段FV基本相似，此外，在将突变体与凝血酶温育后仍保留了活性。短段FV1545Q突变体将在Arg709处被切割，但B结构域的酸性C-末端部分仍会附着，因此该突变体保留了协同辅因子活性。
图12所示的另一个变体是全长FV变体(图的底部，在图12的第二页上)，其在Arg1545处也突变为Gln，称为FV-1545Q[35]。位置709和1018处的凝血酶切割位点是完整的且对凝血酶敏感。这种未切割形式的突变体(FV-1545Q)与全长FV相似，并且本身没有或只有很少的协同辅因子活性[25]。但是，在用凝血酶切割后(在709和1018处)，FV暴露了仍然附着的酸性区域，因为Arg1545突变为Gln(Q)。从时间曲线可以明显看出，凝血酶切割的FV-1545Q与其他变体的效率相同。
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36.Thompson等人.(1994)CLUSTAL W：通过序列加权、特定位置的空隙罚分和权重矩阵选择提高逐步进行多序列比对的灵敏度(CLUSTAL W:improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice).《核酸研究(Nuc.Acid Res.)》22:4673-4680
37.Caceci.M.S.&Cacheris.W.P.(1984)将曲线拟合到数据(Fitting curves todata).字节9:340-362

Claims (53)

1.一种用于确定样品中功能性蛋白S的水平的体外方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
(a)使从受试者获得的样品与TFPIα和以下一种或多种接触：短段FV；或短段FV变体；或功能上等效的FV变体；
(b)使所述样品与FXa接触；以及
(c)测量所述样品中FXa活性的水平
其中所述FXa活性的水平指示所述样品中功能性蛋白S的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性蛋白S的水平是所述样品中蛋白S的活性水平，任选地其中所述活性是所述蛋白S充当TFPIα的辅因子的能力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性蛋白S的水平是所述样品中功能性蛋白S的量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述功能性蛋白S是所述样品中的游离蛋白S。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述功能性蛋白S是所述样品中的非C4BP复合蛋白S。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够允许蛋白组装的底物接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述能够允许蛋白组装的底物是磷脂囊泡。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(a)还包括钙。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括以下步骤或由以下步骤组成：
(d)提供基于功能性蛋白S的标准曲线；以及
(e)将步骤(c)的测量值与步骤(d)的所述标准曲线进行比较。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用从健康个体获得的血浆样品，或者使用已知量的纯化蛋白S，或者使用包含限定量的蛋白S的培养基溶液，来生成所述标准曲线。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所测量的所述FXa活性的水平指示对FXa的抑制，并且其中对FXa的抑制水平指示所述样品中功能性蛋白S的水平，任选地指示所述样品中功能性蛋白S活性的水平。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血浆，任选地其中所述样品是柠檬酸化血浆。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品具有高稀释因子，例如其中所述稀释因子介于1/10至1/2000之间，任选地其中所述稀释因子介于1/50至1/400之间。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与C4BP接触。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括在存在FXa的情况下使所述样品与能够发出可测量信号的组分接触。
16.根据权利要求11所述的方法，其中，在存在FXa的情况下发出的所述可测量信号是荧光或色彩，任选地其中所述组分选自：S2765、S-2222。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述能够发出可测量信号的组分是S2765，并且S2765的浓度介于0.1至2mM之间，优选地介于0.3至1mM之间，优选地其中S2765的浓度为0.8mM。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)还包括使所述样品与凝血酶抑制剂接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述凝血酶抑制剂是水蛭素或Pefa-block。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短段FV变体或FV变体是对凝血酶活化具有抗性的变体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述FV短变体或FV变体包含从精氨酸突变为谷氨酰胺的凝血酶切割位点，任选地其中所述短段FV变体选自短段FVQQ、短段FVRQ和短段FVQR。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短段FV变体或FV变体是具有增强或协同的TFPIα辅因子活性的变体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述短段FV变体是FV-709-1476。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短段FV变体或FV变体是保留B结构域的酸性C-末端区域的变体。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FV变体或短段FV变体能够在位置709和1018处被凝血酶切割和/或不能在位置1545处被凝血酶切割。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述FV变体是FV-1545Q。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法对蛋白S的游离形式具有特异性。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法能够检测蛋白S缺乏症。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于鉴定所述受试者是否为蛋白S缺乏症患者。
30.一种诊断受试者患有蛋白S缺乏症的方法，其中所述方法包括根据权利要求1至29中任一项所述的方法确定蛋白S的水平，任选地确定蛋白S活性的水平。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是I型蛋白S缺乏症。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是II型蛋白S缺乏症。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是TFPIα辅因子活性不良的II型蛋白S缺乏症。
34.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是III型蛋白S缺乏症。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是杂合或纯合蛋白S缺乏症。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述蛋白S缺乏症是获得性的。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是接受华法林治疗的患者。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是被诊断患有或疑似患有静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的患者。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法能够检测低水平的蛋白S，例如其中在稀释的样品中蛋白S的水平介于0.1至5nM之间，任选地其中在稀释的样品中蛋白S的水平<3nM。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短段FV或短段FV变体或FV变体的浓度介于0.5至20nM之间，任选地其中所述浓度为2nM。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)在37℃下进行1至15分钟，任选地其中所述时间为10分钟。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)进行10至30分钟，任选地其中所述时间为15分钟。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在缓冲剂中稀释所述样品，任选地其中所述缓冲剂具有介于7至8之间的pKa并且与Ca2+相容。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述缓冲剂是HNBSACa2+缓冲剂或BSA缓冲剂。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中TFPIα与FXa的比率为大约1:1。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中FXa的浓度介于0.1至1nM之间，任选地其中所述浓度介于0.2至0.6nM之间，任选地其中所述浓度为0.3nM。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与确定总蛋白S水平的方法结合进行。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不包括凝血酶生成测定。
49.一种治疗方法，包括使用根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定患有蛋白S缺乏症的受试者，并且向所述受试者施用治疗剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述治疗剂是抗凝疗法。
51.一种用于治疗患有蛋白S缺乏症的受试者的治疗剂，其中已根据权利要求30至50中任一项所述的将所述受试者诊断为患有蛋白S缺乏症，任选地其中所述治疗剂为抗凝剂。
52.一种用于确定样品中功能性蛋白S的水平的试剂盒，其包括以下两种或更多种：短段FV(或短段FV变体；或功能上等效的FV变体)；TFPIα；FXa；磷脂囊泡；以及FXa底物，任选地其中所述FXa底物是S2765。
53.一种试剂盒，用于使用根据权利要求1至50中任一项所述的方法确定样品中功能性蛋白S的水平，或者用于根据权利要求51所述的用途。
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