CN112831461B - 一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物 - Google Patents

一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物，属于调节人多能干细胞向中胚层或滋养细胞分化的技术领域。前者方法包括：在BMP4存在的条件下，用含PKC抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成中胚层谱系。该方法在化学组份确定的培养条件下能大幅度提高多能干细胞分化为中胚层谱系，并使分化过程缩短一半时间。该方法提高了分化的稳定性，可在没有外源FGF2或内源性WNT的情况下仍保持胚层特异性分化。后者方法包括：用含PKC激活剂或DGK抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成滋养细胞谱系。该方法在自发分化平台中使用PKC激活剂和DGK抑制剂诱导干细胞以加速的方式分化为滋养细胞，而无需BMP4。

Description

一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及 药物
技术领域
本发明涉及调节人多能干细胞向中胚层或滋养细胞分化技术领域，具体而言，涉及一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物。
背景技术
人类多能干细胞(hPSC)可以分化为我们体内的所有细胞类型，并且是研究人类胚胎发育的重要模型***。hPSC分化产生的特定细胞类型在药物筛选等研究中起着重要作用。中胚层会产生诸如心肌细胞，平滑肌，骨骼和性腺等细胞类型，因此来自hPSC分化的中胚层衍生的细胞类型为再生和修复多种组织和药物筛选提供了材料。此外，hPSCs还可在体外分化为胚外细胞类型，如原始内胚层和滋养细胞。胚外细胞类型会产生胎盘，卵黄袋或脐带等组织，因此来自hPSC分化的胚外细胞类型可为体外受精，早期免疫***和药物筛选提供材料。
目前，尚未有报道研究PKC抑制剂在早期干细胞分化中的作用以及蛋白激酶C在早期滋养层分化中的作用。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法。
本发明的目的之二在于提供一种使用PKC激活剂或DGK抑制剂诱导干细胞分化成滋养细胞谱系的方法。
本发明的目的之三在于提供一种原料含有上述方法得到的中胚层谱系或滋养细胞谱系的药物。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法，包括以下步骤：
在BMP4存在的条件下，用含有PKC抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成中胚层谱系。
中胚层谱系包括中胚层细胞和内胚层前体细胞。
在可选的实施方式中，干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞中的至少一种。
本文中所述的人胚胎干细胞是未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
在可选的实施方式中，PKC抑制剂包括GF109203X、和/>中的至少一种。
在可选的实施方式中，GF109203X的浓度为2-5μM。
在可选的实施方式中，的浓度为2-5μM。
在可选的实施方式中，的浓度为2-5μM。
在可选的实施方式中，BMP4的浓度为5-100ng/mL。
在可选的实施方式中，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素。
在可选的实施方式中，诱导干细胞分化成中胚层的过程中，不使用外源FGF2或内源性WNT。
第二方面，本申请提供一种诱导干细胞分化成滋养细胞谱系的方法，包括以下步骤：用含有PKC激活剂或DGK抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成滋养细胞谱系。
在可选的实施方式中，PKC激活剂或DGK抑制剂于干细胞分化的第一天加入分化培养基中。
在可选的实施方式中，加入PKC激活剂后，干细胞至少在分化培养基中继续培养两天。或，加入DGK抑制剂后，干细胞至少在分化培养基中继续培养六天。
在可选的实施方式中，干细胞为人多能干细胞。
在可选的实施方式中，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞中的至少一种。
在可选的实施方式中，PKC激活剂包括TPA和Bryostatin 1中的至少一种。
在可选的实施方式中，TPA的处理浓度为25-500nM。
在可选的实施方式中，Bryostatin 1的处理浓度为25-500nM。
在可选的实施方式中，DGK抑制剂包括R59949。
在可选的实施方式中，R59949的处理浓度为0.5-10μM。
在可选的实施方式中，分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素。
在可选的实施方式中，分化过程中，分化培养基中还添加有滋养细胞诱导剂。
在可选的实施方式中，滋养细胞诱导剂包括BMP4、PD325901、Sb432542以及DAPT中的至少一种。
在可选的实施方式中，BMP4的处理浓度为10-100ng/mL。
在可选的实施方式中，PD325901的处理浓度为0.5-10μM。
在可选的实施方式中，Sb432542的处理浓度为5-20μM。
在可选的实施方式中，DAPT的处理浓度为1-10μM。
第三方面，本申请还提供一种药物，其原料含有上述方法得到的中胚层谱系或滋养细胞谱系。
本申请的有益效果包括：
本申请通过开拓性地在BMP4分化平台中使用PKC抑制剂促进多能干细胞分化成中胚层，促进早期中胚层标记物TBXT和MIXL1的表达，能大幅度提高多能干细胞分化为中胚层和内胚层前体细胞，并使分化过程缩短一半时间，同时还提高了分化的稳定性，为干细胞分化提供了新应用。通过该方法可以获得功能性中胚层细胞类型，可用于组织的再生和修复，如平滑肌细胞、肌肉、骨骼或性腺，并用于药物筛选。
此外，本申请采用具有清晰成分的方法来诱导hPSC分化为滋养细胞，其中所使用的试剂不含动物来源的成分。开拓性地使用PKC激活和DGK抑制来诱导hPSC分化为滋养细胞，描述了PKC活化是任何其他滋养细胞诱导的平台下游的主要作用机制，并发现了干细胞分化的新应用。另外，通过该方法获得的滋养细胞还可表达成熟滋养细胞的标志物，这为指导人类多能干细胞的早期命运决定提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1至图6为实施例1中的各测试结果图；
图7至图10为实施例2中的各测试结果图；
图11至图13为实施例3中的各测试结果图；
图14至图16为实施例4中的各测试结果图；
图17至图18为实施例7中的各测试结果图；
图19至图28为对比例1中的各测试结果图；
图29至图34为实施例8中的各测试结果图；
图35至图37为实施例9中的各测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物进行具体说明。
本申请提出的使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法，包括以下步骤：
在BMP4存在的条件下，用含有PKC抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成中胚层谱系。中胚层谱系包括中胚层细胞和内胚层前体细胞。
其中，干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞中的至少一种。也即可以仅为人胚胎干细胞，也可仅为人诱导的多能干细胞，还可以同时以人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞进行分化。
上述BMP4作为中胚层诱导剂，其与PKC抑制剂尤其是GF109203X联用，可代替FGF2作为人类胚胎干细胞中早期中胚层细胞诱导的诱导剂。可参考地，BMP4的浓度可以为5-100ng/mL，如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL或100ng/mL等。
在可选的实施方式中，PKC抑制剂例如可包括GF109203X、和/>中的至少一种，优选为GF109203X。
可参照地，GF109203X的浓度可以为2-5μM，如2μM、3μM、4μM或5μM等。的浓度可以为2-5μM，如2μM、3μM、4μM或5μM等。/>的浓度也可以为2-5μM，如2μM、3μM、4μM或5μM等。
在可选的实施方式中，本申请中所涉及的分化培养基的成分可包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素。上述各成分在分化培养基中的含量可以分别为：L-抗坏血酸-2-磷酸镁64mg/L、硒酸钠13.6μg/L、转铁蛋白10mg/L以及胰岛素20mg/L。具体的，上述分化培养基可以为E6培养基，该培养基可理解成E8培养基不含FGF2和TGFβ。
在较佳的实施方式中，本申请提供的诱导干细胞分化成中胚层的过程中，不使用外源FGF2或内源性WNT。也即，PKC抑制剂尤其是GF109203X促进人类胚胎干细胞H1向中胚层的分化，无需FGF2途径激活。并且，PKC抑制剂尤其是GF109203X促进人类胚胎干细胞H1向中胚层的分化，无需内源性WNT。
在可选的实施方式中，本申请所涉及的使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法可以但不限于参照以下步骤：
将hPSC培养至10-20％的细胞密度(该密度为开始分化前的密度)后，在BMP4存在下使用PKC抑制剂GF109203X诱导hPSC分化为中胚层。2天后，可通过免疫染色或FACS检测TBXT阳性细胞的形成(也即可在分化的第三天，测量TBXT阳性细胞)。
具体的，可以是：在E8培养基中培养人胚胎干细胞H1，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代(也即该密度为传代前的密度)。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6至1:12(如1：6、1：8、1：10或1：12等)的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，与BMP4和PKC抑制剂一起换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)，分别以20ng/mL和5μM的浓度开始分化。每天添加新鲜E6培养基。
值得说明的是，上述所提的E6和E8培养基可参照本申请所公开的成分得到，也可参照现有技术中相关培养基的成分进行配制，在此不做过多赘述。
通过上述方法可获得功能性中胚层细胞类型，可用于组织的再生和修复，如平滑肌细胞、肌肉、骨骼或性腺，并用于药物筛选。对应地，本申请还提供了一种药物，其原料含有上述方法得到的中胚层谱系。
本申请提出的诱导干细胞分化成滋养细胞谱系的方法，包括以下步骤：
用含有PKC激活剂或DGK抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成滋养细胞谱系。
其中，干细胞为人多能干细胞。可参考地，人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞中的至少一种，也即可以仅为人胚胎干细胞，也可仅为人诱导的多能干细胞，还可以同时以人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞进行分化。
在可选的实施方式中，PKC激活剂于干细胞分化的第一天加入分化培养基中。可参考地，加入PKC激活剂后，干细胞至少在分化培养基中继续培养两天。
在可选的实施方式中，PKC激活剂例如可包括TPA和Bryostatin 1中的至少一种。
其中，TPA及Bryostatin 1的处理浓度均可分别为25-500nM，如25nM、50nM、100Nm、200nM、300nM、400nM或500nM等。
在可选的实施方式中，DGK抑制剂于干细胞分化的第一天加入分化培养基中。可参考地，加入DGK抑制剂后，干细胞至少在分化培养基中继续培养六天。
在可选的实施方式中，DGK抑制剂可包括(为)R59949。R59949的处理浓度可以为0.5-10μM，如0.5μM、1μM、2μM、5μM或10μM等。
在可选的实施方式中，本申请中所涉及的分化培养基的成分可DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素。上述各成分在分化培养基中的含量可以分别为：L-抗坏血酸-2-磷酸镁64mg/L、硒酸钠13.6μg/L、转铁蛋白10mg/L以及胰岛素20mg/L。具体的，上述分化培养基可以为E6培养基，该培养基可理解成E8培养基不含FGF2和TGFβ。
本申请上述分化过程中，分化培养基中还可添加有滋养细胞诱导剂。
在可选的实施方式中，滋养细胞诱导剂包括BMP4、PD325901、Sb432542以及DAPT中的至少一种。
其中，BMP4的处理浓度可以为10-100ng/mL，如10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL或100ng/mL等。
PD325901的处理浓度可以为0.5-10μM，如0.5μM、1μM、2μM、5μM、8μM或10μM等。
Sb432542的处理浓度可以为5-20μM，如5μM、8μM、10μM、15μM或20μM等。
DAPT的处理浓度可以为1-10μM，如1μM、2μM、5μM、8μM或10μM等。
在可选的实施方式中，本申请所涉及的诱导干细胞分化成滋养细胞谱系的方法可以但不限于参照以下步骤：
将hPSC培养至10-20％的细胞密度后，使用PKC调节剂诱导hPSC分化为滋养细胞。从第一天开始就使用分化培养基进行分化，处理2天后(优选在分化的第二天)，可以通过qPCR检测信号标记，例如TROP2和CGB。
具体的，可以是：在E8培养基中培养人胚胎干细胞，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代(也即该密度为传代前的密度)。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，最后抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6-1:12(如1：6、1：8、1：10或1：12等)的密度传代至预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上一天后，换成E6培养基(E8培养基不含FGF2与TGFβ)并加入50nM的TPA或Bryostatin1开始分化。期间每天添加新鲜分化培养基，并在分化的第2天测量滋养细胞标志物水平。
或者，在E8培养基中培养人胚胎干细胞H1，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟。抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6-1:12的密度传代到预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上一天后，换成E6培养基(E8培养基不含FGF2与TGFβ)，并以1μM的浓度添加DGK抑制剂R59949以促使细胞分化。每天添加新鲜E6培养基。在第6天检测滋养细胞标志物水平。
值得说明的是，上述所提的E6和E8培养基可参照本申请所公开的成分得到，也可参照现有技术中相关培养基的成分进行配制，在此不做过多赘述。
通过上述方法可获得的滋养细胞谱系可为早期免疫***和药物筛选提供材料。对应地，本申请还提供了一种药物，其原料含有上述方法得到的滋养细胞谱系。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
为了研究不同的PKC抑制剂在中胚层早期分化中的作用，在分化的第一阶段，我们选择了GF109203X，和/>这三种PKC抑制剂以及BMP4。
具体实现如下：在E8培养基中培养人胚胎干细胞H1，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤2次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞贴壁生长在平板上的1天后，与BMP4和PKC抑制剂一起换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)，分别以20ng/mL和5μM的浓度开始分化(分化前细胞密度为10-20％)。每天添加新鲜E6培养基。在分化的第一天和第二天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期中胚层标志物的水平。
请参照图1至图6，图1代表PKC抑制剂GF109203X对BMP4分化下早期中胚层的标志基因MIXL1和TBXT基因表达的影响。分别以5μM和20ng/mL的浓度添加GF109203X和BMP4。图中，mock代表E6培养基+BMP4，GFX代表在mock的基础上添加PKC抑制剂GF109203X，下同。
图2代表在添加BMP4和GF109203X诱导干细胞分化2天后，通过免疫染色分析了TBXT阳性细胞的比例。该图中，对于Hoechst组和TBXT组，灰色代表阳性细胞。
图3代表在添加BMP4和GF109203X以诱导干细胞分化2天后，通过流式细胞术分析了TBXT阳性细胞的比例。
图4代表添加BMP4和诱导干细胞分化2天后，通过免疫染色分析了TBXT阳性细胞的比例。以5μM的浓度添加/>该图中，对于Hoechst组和TBXT组，灰色代表阳性细胞。
图5代表PKC抑制剂对BMP4分化一天后WNT3基因表达的影响。
图6代表使用5μM PKC抑制剂及20ng/mL BMP4分化对早期中胚层的标志基因WNT3、MIXL1和TBXT表达的影响。该图中，矩形颜色越深代表对应基因的表达量越高。
结果显示，仅在24小时后，GF109203X，和/>即可提高早期中胚层标记基因MIXL1和TBXT的表达水平。TBXT是中胚层早期分化的特异性标志物，GF109203X和不同程度地增加TBXT阳性细胞的比例，表明PKC抑制剂可诱导干细胞分化为中胚层早期谱系。GF109203X可以添加到BMP4诱导分化中，以促进WNT途径并加速人胚干细胞的中胚层早期分化。
实施例2
GF109203X促进人类胚胎干细胞H1向中胚层的分化，而无需FGF2途径激活。
将人类胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70-80％。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第三次除去DPBS-EDTA，并用含有5μM Rock抑制剂的E8培养基重悬细胞后，以1:6的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板，加入含有20ng/ml BMP4，100ng/mL FGF2和5μM PKC抑制剂的E6培养基(E8培养基不含FGF2和TGFβ)并开始分化。每天添加新鲜E6培养基。在分化的第一天和第二天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期中胚层标志物的水平。
请参照图7至图10，图7表示PKC抑制剂GF109203X对BMP4或BMP4+FGF2分化下的MIXL1和TBXT基因表达的影响，MIXL1和TBXT是早期中胚层的标志物。其中，mock代表E6培养基+BMP4，GFX代表在mock的基础上添加GFX(PKC抑制剂GF109203X)，FGF2代表在mock的基础上添加FGF2,FGF2+GFX代表在mock的基础上添加FGF2+GFX。分别以5μM、20ng/mL和100ng/mL的浓度添加GF109203X、BMP4和FGF2。
图8表示在添加BMP4/GF109203X(图中以GFX表示)或BMP4/FGF2/GF109203X以诱导干细胞分化后2天，通过流式细胞术分析TBXT阳性细胞的比例。
图9表示PKC抑制剂GF109203X对早期中胚层标志物BMP4+FGF2或BMP4+FGF2+PD0173074(图中以PD173表示，下同)分化下WNT3、MIXL1和TBXT基因表达的影响。以100nM的浓度添加PD0173074。
图10表示在添加BMP4+FGF2和GF109203X(GFX)、PD0173074(PD173)或两者诱导干细胞分化后2天，通过免疫染色分析了TBXT阳性细胞的比例。其中，mock代表E6培养基+BMP4+FGF2，GFX代表在mock的基础上添加GFX，PD173代表在mock的基础上添加PD173,PD173+GFX代表在mock的基础上添加PD173+GFX。该图中，对于Hoechst组和TBXT组，灰色代表阳性细胞。
结果表明，即使在存在FGFR抑制剂PD0173974的情况下，仅在24小时后，GF109203X即可提高早期中胚层标记基因MIXL1和TBXT的表达水平。FGF2途径抑制剂PD0173074以100nM使用。TBXT是中胚层早期分化的特异性标志物，即使在存在PD0173074的情况下，GF109203X也会增加TBXT阳性细胞的比例，这表明PKC抑制剂可以诱导干细胞绕过FGF2途径活化而分化为早期中胚层谱系。也即GF109203X与BMP4结合，可以代替FGF2作为人类胚胎干细胞中早期中胚层细胞诱导的诱导剂。
实施例3
GF109203X促进人类胚胎干细胞H1向中胚层的分化，而无需内源性WNT。
将人类胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70-80％。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μMRock抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，培养基换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)并加入20ng/mL BMP4和5μM PKC抑制剂开始分化。每天添加新鲜E6培养基。在分化的第1天和第2天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期中胚层标志物的水平。
请参照图11至图13，图11表示PKC抑制剂GF109203X(GFX)对BMP4或BMP4+IWP-2(IWP2)分化下的WNT3、MIXL1和TBXT基因表达的影响，这是早期中胚层的标志。分别以5μM、20ng/mL和2.5μM的浓度添加GF109203X、BMP4和IWP-2。
图12表示通过免疫染色分析，经过6个小时的分化后，GF109203X(GFX)可以在BMP4诱导下促进β-catenin核定位。该图中，对于Hoechst组和np-βcat组，灰色代表阳性细胞。
图13表示分化6小时后，在信号强度下定量BMP4和BMP4+GF109203X(GFX)诱导下β-catenin的核定位。
结果表明GF109203X可以绕过WNT途径，并促进人胚胎干细胞中β-catenin的核定位。说明GF109203X可提高中胚层早期标志物的表达水平。
实施例4
GF109203X促进人类胚胎干细胞H1向内胚层的分化。
将人类胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70-80％。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μMRock抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，培养基换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)并加入100ng/mL Activin A、20ng/mL BMP4、100ng/mL FGF2和5μM PKC抑制剂开始分化。此后每天添加新鲜E6培养基和100ng/mL Activin A。在分化的第4天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期内胚层标志物的水平。结果表明GF109203X可提高内胚层早期标志物的表达水平。
请参照图14至图16，图14代表在内胚层细胞分化的早期，即第0天至第1天，通常可以用Acivin A+BMP4+FGF2诱导胚胎干细胞向原条细胞(PS)分化，PS细胞可在Activin+LDN193189+IWP2的条件下诱导形成特异性内胚层细胞(DE，DE是人体呼吸道和消化器官的前体)。结果发现，相比于Acivin A+BMP4+FGF2，PKC抑制剂GF109203X联合Acivin A+BMP4+FGF2能够在分化的第2天至第3天显著提高SOX17的表达，这是早期内胚层的生物标志物。分别以5μM、100ng/mL、20ng/mL、100nM和2.5μM的浓度添加GF109203X、Activin A、BMP4、LDN193189和IWP-2。
图15代表通过定量PCR分析，经过2-3天的分化后，GF109203X(GFX)可以促进H9和H1细胞系向DE分化。
图16代表通过流式细胞术分析，经过2-3天的分化后，GF109203X(GFX)可以促进H9细胞系向DE分化，且能够得到几乎100％的SOX17阳性DE细胞。
结果表明GF109203X可以促进人胚胎干细胞系(H1和H9)向内胚层细胞分化。
实施例5
本实施例提供了一种使用PKC抑制剂诱导人诱导多能干细胞分化成中胚层谱系的方法：
在E8培养基中培养人诱导多能干细胞(iPSC，如NL-1或NL-4)，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤2次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:10的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，与BMP4和GF109203X一起换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)，分别以20ng/mL和2μM的浓度开始分化。每天添加新鲜E6培养基。在分化的第一天和第二天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期中胚层标志物的水平。
实施例6
本实施例提供了一种使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法：
在E8培养基中培养人胚胎干细胞H1，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤2次，然后在室温下孵育5分钟，第3次抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:12的密度传代，加入预先包被Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，与BMP4和GF109203X一起换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)，分别以20ng/mL和4μM的浓度开始分化。每天添加新鲜E6培养基。在分化的第一天和第二天通过qPCR，免疫荧光和流式细胞术(除非另有说明)测量分化细胞的早期中胚层标志物的水平。
实施例7
本实施例提供了一种使用PKC激活剂促进人类胚胎干细胞向滋养细胞的分化的方法：
为了研究不同PKC激活在滋养细胞分化中的作用，我们选择了TPA，Bryostatin 1这两种PKC激活剂对hPSCs的分化。具体如下：在E8培养基中培养人胚胎干细胞，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，最后抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6-1:12的密度传代至预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上1天后，换成E6培养基(E8培养基不含FGF2与TGFβ)并加入50nM的TPA或Bryostatin 1开始分化。期间每天添加新鲜分化培养基，并在分化的第3天测量滋养细胞标志物(TROP2和CGB)水平以及原始内胚层标志物(SOX17和GATA6)水平，如图17和图18所示。
其中，图17表示PKC激活剂TPA在分化第3天对原始内胚层标志物(SOX17和GATA6)和滋养细胞标志物(TROP2和CGB)的基因表达的影响。以50nM的浓度添加TPA。NANOG为干细胞干性的生物标志物，其表达水平越高，则表示细胞的干性越高；反之，其表达水平越低，则表示细胞的干性越低，即细胞发生了分化。
图18表示PKC激活剂Bryostatin 1在分化第2-10天对原始内胚层标志物(SOX17和GATA6)和滋养细胞标志物(TROP2和CGB)的基因表达的影响。以50nM的浓度添加Bryostatin1。NANOG为干细胞干性的生物标志物，其表达水平越高，则表示细胞的干性越高；反之，其表达水平越低，则表示细胞的干性越低，即细胞发生了分化。mock代表E6培养基+BMP4，GFX代表在mock的基础上添加GFX(PKC抑制剂GF109203X)，下同。
图17和图18的结果显示：TPA和Bryostatin 1可以提高3天后原始内胚层标记基因SOX17和GATA6以及滋养层标记基因TROP2和CGB的表达水平。PKC抑制剂GF109203X抑制TPA和Bryostatin 1促进滋养细胞特异性标志物TROP2和CGB的表达，PKC激活剂可以诱导干细胞分化为滋养细胞谱系。说明TPA和Bryostatin 1对PKC的激活促进了分化为胚外细胞类型的分化，例如人类胚胎干细胞的原始内胚层和滋养细胞。
对比例1
本对比例提供了一种使用PKC抑制剂GF109203X抑制人类多能干细胞H1、H9和NL4向任何其他途径促进的滋养细胞的分化的方法：
将人类胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70-80％开始传代。首先用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，最后抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6-1:12的密度传代至预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上后1天，换成E6培养基(E8培养基不含FGF2及TGFβ)并加入20ng/ml BMP4，1μM PD0325901，10μM SB431542或5μM DAPT和PKC抑制剂一起开始分化。每天添加新鲜的分化培养基。在第6天通过qPCR和免疫荧光检测分化细胞的滋养层标志物水平(TPA分化的细胞在第3天检测)，如图19-28所示。
其中，图19表示PKC抑制剂GF109203X对在BMP4分化下的滋养层细胞标志物TROP2和CGB基因表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入GF109203X(5μM)，BMP4(20ng/ml)，LDN193189(100nM)(以LDN表示)，FGF2(100ng/ml)，TGFβ(2ng/ml)和Jagged-1(1μM)(以JAG1表示，下同)。
图20表示PKC抑制剂GF109203X对在PD0325901条件下滋养细胞的标志基因TROP2和CGB表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入GF109203X(5μM)，LDN193189(100nM)，FGF2(100ng/ml)，PD0325901(1μM)，TGFβ(2ng/ml)和Jagged-1(1μM)。
图21表示PKC抑制剂GF109203X对在SB431542条件下滋养细胞的标志基因TROP2和CGB的基因表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入GF109203X(5μM)，LDN193189(100nM)，FGF2(100ng/ml)，TGFβ(2ng/ml)，SB431542(10μM)和Jagged-1(1μM)。
图22表示PKC抑制剂GF109203X对在DAPT条件下滋养细胞的标志基因TROP2和CGB表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入GF109203X(5μM)，LDN193189(100nM)，FGF2(100ng/ml)，TGFβ(2ng/ml)，DAPT(5μM)和Jagged-1(1μM)。
图23表示PKC抑制剂GF109203X对在TPA条件下滋养细胞的标志基因TROP2和CGB表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入TPA(50nM)，GF109203X(5μM)，LDN193189(100nM)，FGF2(100ng/ml)，TGFβ(2ng/ml)和Jagged-1(1μM)。
图24表示PKC抑制剂GF109203X和对BMP4诱导的滋养细胞标志基因TROP2和CGB表达的影响。分化条件为在分化培养基中加入GF109203X(5μM)，/>(5μM)和BMP4(20ng/ml)。
图25表示PKC抑制剂对BMP4诱导的滋养细胞标志蛋白TROP2和CGB表达的影响，其中Phase为没有任何染料或者抗体的情况下的白场，Hoechst为细胞核染料，细胞核会被染成蓝色(在本图中，由于图片修改为黑白背景，则细胞核为浅色)，下同。
图26表示GF109203X和LDN193189对BMP4诱导的滋养细胞标志蛋白TROP2和CGB蛋白表达的影响。
图27表示PKC抑制剂GF109203X对在BMP4诱导的滋养细胞标志基因TROP2，GATA3，GATA2，KRT18，CDX2，ELF5，ITGA6，CGB，CSH1，CSH2，GCM1，HLAG和ITGA5表达的影响。
图28表示PKC抑制剂GF109203X对BMP4诱导的滋养细胞标志基因TROP2，GATA3，CDX2，CGB和HLAG表达的影响。
图19-28结果显示：GF109203X在任何已知诱导剂促进的6天后均能抑制滋养细胞标记基因TROP2和CGB的表达水平。GF109203X和在BMP4诱导的滋养细胞分化过程中抑制了TROP2/CGB阳性细胞的比例，表明PKC抑制剂可损害干细胞分化为滋养细胞谱系。
实施例8
PKC-δ敲除损害人胚胎干细胞H1的滋养细胞分化：
将人类胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换新鲜培养基，细胞密度达到70-80％开始传代。首先用DPBS-EDTA洗涤2次，然后在室温下孵育5分钟，最后抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1:6-1:12的密度传代至预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上的1天后，换成E6培养基(E8培养基不含FGF2和TGFβ)并加入BMP4开始分化，并测量PRKCD基因的表达水平，每天添加新鲜分化培养基。在第一天进行qPCR时，检测分化细胞的滋养层标记物TROP2的水平。其结果如图29至34所示。
其中，图29表示BMP4对PRKCD基因表达的影响。
图30表示TPA对PRKCD和TROP2基因表达的影响。
图31表示敲除PRKCD基因对H1细胞中PKC-δ蛋白表达的影响。
图32表示TPA对PRKCD敲除细胞系中原始内胚层和滋养细胞标志物SOX17，GATA6，TROP2和CGB的基因表达的影响。
图33表示BMP4对PRKCD敲除细胞系中原始内胚层和滋养细胞标志物CGB基因表达的影响。
图34表示BMP4对PRKCD敲除细胞系中原始内胚层和滋养细胞标志物CGB蛋白表达的影响。
图29-34结果显示：PRKCD的表达水平增加。PRKCD基因敲除削弱了原始内胚层标记SOX17和GATA6以及滋养层标记TROP2和CGB中TPA的分化。PRKCD基因敲除损害了滋养细胞标志物CGB中BMP4的分化。也即PRKCD控制着人胚胎干细胞向原始内胚层细胞和滋养层细胞的分化。
实施例9
抑制DGK可促进人胚胎干细胞H1向滋养细胞的分化：
为了研究不同信号通路在滋养细胞分化中的作用，我们使用DGK抑制剂阻断DGK功能来验证其在滋养层细胞分化中的可用性。具体操作如下：在E8培养基中培养人胚胎干细胞H1，每天更换新鲜培养基，当细胞密度达到70-80％时进行传代。首先用DPBS-EDTA洗涤2次，然后在室温下孵育5分钟。抽吸DPBS-EDTA，并添加含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基。重悬细胞后，以1：6-1：12的密度传代到预先涂有Matrigel的12孔板。细胞粘附在平板上1天后，换成E6培养基(E8培养基-FGF2-TGFβ)，并以1μM的浓度添加DGK抑制剂R59949以促使细胞分化。每天添加新鲜E6培养基。在第6天检测滋养细胞标志物水平。其结果如图35-37所示。
其中，图35表示分化1天后，BMP4和BMP4+GF109203X对DGK亚型的基因表达的影响。
图36表示分化1天后，BMP4和BMP4+GF109203X对DGKA基因表达的影响。
图37表示分化6天后，DGK抑制剂R59949对滋养细胞的标志物TROP2和CGB的基因表达的影响。
图35-37结果表明：DGK抑制剂R59949在6天后能增加滋养细胞标记基因TROP2和CGB的表达水平。TROP2和CGB是滋养细胞的特异性标志物，DGK抑制剂可以诱导干细胞分化为滋养细胞。
综上所述，本申请通过开拓性地在BMP4分化平台中使用PKC抑制剂促进多能干细胞分化成中胚层，促进早期中胚层标记物TBXT和MIXL1的表达，能大幅度提高多能干细胞分化为中胚层和内胚层前体细胞，并使分化过程缩短一半时间，同时还提高了分化的稳定性，为干细胞分化提供了新应用。通过该方法可以获得功能性中胚层细胞类型，可用于组织的再生和修复，如平滑肌细胞、肌肉、骨骼或性腺，并用于药物筛选。此外，本申请采用具有清晰成分的方法来诱导hPSC分化为滋养细胞，其中所使用的试剂不含动物来源的成分。开拓性地使用PKC激活和DGK抑制来诱导hPSC分化为滋养细胞，描述了PKC活化是任何其他滋养细胞诱导的平台下游的主要作用机制，并发现了干细胞分化的新应用。另外，通过该方法获得的滋养细胞还可表达成熟滋养细胞的标志物，这为指导人类多能干细胞的早期命运决定提供了新思路。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种使用PKC抑制剂诱导干细胞分化成中胚层谱系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在BMP4存在的条件下，用含有PKC抑制剂的分化培养基诱导干细胞分化成中胚层谱系；
所述中胚层谱系包括中胚层细胞和内胚层前体细胞，
所述干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞中的至少一种，
其中所述人胚胎干细胞是未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞，
所述PKC抑制剂选自GF109203X、和/>中的至少一种,
诱导干细胞分化成中胚层的过程中，不使用外源FGF2和内源性WNT。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GF109203X的浓度为2-5μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的浓度为2-5μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的浓度为2-5μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BMP4的浓度为5-100ng/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基的成分包括DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素。
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