CN112807488B - 具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方法与应用 - Google Patents

具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方法与应用。所述具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层，为在基材表面原位生长的离子吸附型二氧化锰涂层；所述二氧化锰涂层以高锰酸钾为锰源，以盐酸为还原剂，以氯化钾为稳定剂，采用水热反应法得到；其中二氧化锰的晶型为水钠锰矿型。

Description

具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方法与应用，属于生物医用技术领域。
背景技术
随着人口老龄化进程的加速，以及交通事故、疾病、自然灾害等造成的骨损伤事故的增多，人工骨植入材料的需求量日益增加。在植入体植入人体之后，纤连蛋白等蛋白质在植入体表面的吸附，能促进成骨细胞的黏附，增殖和分化等行为，提高骨整合能力。目前研究者一般通过调控植入体表面的形貌或化学组成等因素，从而提高植入体的纤连蛋白吸附量和促成骨分化能力。但在生理环境中，离子先于蛋白质吸附在材料表面。因此，骨植入材料表面吸附的离子，会影响后续的蛋白质吸附和细胞行为，研究一种能调控吸附离子浓度的表面具有重要意义。
二氧化锰(MnO2)是一种价格低且易于制备的过渡金属氧化物材料。其中，水钠锰矿型MnO2表面富含Mn空位，使其带有结构负电荷，能有效吸附金属离子。且其片层状结构的比表面积大，可进一步促进金属离子的吸附与固定。相对于单价的钠和钾离子，二价的钙和镁离子更易吸附于MnO2的表面。此外，Mn2+是人体内一种重要的微量元素，直接参与软骨和骨基质所需糖蛋白的合成，促进骨骼的修复与再生。因此，在植入体表面制备具有离子吸附功能的MnO2涂层，有望用于调控生理环境中钙和镁离子在其表面的吸附行为，从而促进植入体表面纤连蛋白吸附，为研究开发新型廉价的促成骨分化生物涂层提供可能。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术中所存在的缺陷，提供一种具有促成骨分化功能的离子吸附型MnO2涂层及其制备方法与应用。
第一方面，本发明提供的具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层，所述二氧化锰涂层为在基材表面原位生长的离子吸附型二氧化锰涂层；所述二氧化锰涂层以高锰酸钾为锰源，以盐酸为还原剂，以氯化钾为稳定剂，采用水热反应法得到；其中二氧化锰的晶型为水钠锰矿型。
较佳地，所述基材包括医用金属或医用合金材料，优选为纯钛、钛合金、不锈钢或钴铬钼合金中至少一种。
较佳地，所述高锰酸钾的浓度为0.001～0.01mol/L。
较佳地，所述盐酸的浓度为高锰酸钾浓度的1～5倍。
较佳地，所述氯化钾的浓度为高锰酸钾浓度的1～5倍。
较佳地，水热反应温度为80～150℃，保温时间为1～24h。
更优选地，水热反应温度为100～120℃，保温时间为8-15h。
本发明的制备方法具有成本低、操作简单、可重复性好、适合规模化生产等优点。
本发明还提供上述任一项所述的制备方法获得的具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层。
较佳地，所述二氧化锰涂层对钙离子的吸附量为0.5～12.0μg/cm2。
较佳地，所述二氧化锰涂层对镁离子的吸附量为0.1～5.0μg/cm2。
第三方面，本发明还涉及具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层的应用。具体说，是涉及一种通过调控钙和镁离子在材料表面吸附行为，从而促进纤连蛋白吸附和前成骨细胞成骨分化的二氧化锰涂层的应用。
本发明提供的二氧化锰涂层能有效吸附生理环境中的钙和镁离子，从而提高纤连蛋白的吸附量，促进前成骨细胞的碱性磷酸酶分泌和细胞外基质矿化，并上调成骨分化相关基因的表达，表现出良好的促成骨分化能力，是一种潜在的生物医用材料，可用于硬组织修复与替换生物材料的研究与开发。
附图说明
图1为5M100-Ti(水热反应温度为100℃，所用高锰酸钾浓度为0.005M)和5M120-Ti(水热反应温度为120℃，所用高锰酸钾浓度为0.005M)两种MnO2涂层的XRD谱图。
图2为5M100-Ti和5M120-Ti两种MnO2涂层的SEM照片，其中图A为5M100-Ti涂层×3000倍的SEM照片，图B为5M100-Ti×30000倍的SEM照片；图C为5M120-Ti涂层×3000倍的SEM照片，图D为5M120-Ti×30000倍的SEM照片。
图3为两种MnO2涂层(5M100-Ti和5M120-Ti)的钙离子(图A)和镁离子(图B)吸附量。
图4为Ti基材和两种MnO2涂层(5M100-Ti和5M120-Ti)在去离子水(含纤连蛋白)和钙/镁离子混合溶液(含纤连蛋白)中纤连蛋白的吸附量。
图5为前成骨细胞MC3T3-E1在Ti基材和两种MnO2涂层(5M100-Ti和5M120-Ti)表面的细胞增殖(图A)，碱性磷酸酶活性(图B)和细胞外基质矿化(图C)。
图6为前成骨细胞MC3T3-E1在Ti基材和两种MnO2涂层(5M100-Ti和5M120-Ti)表面的成骨分化相关基因表达。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
以下具体示出本发明具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层及其制备方法。
本发明提供的具有促成骨分化功能的涂层，是指在基材表面原位生长的离子吸附型MnO2涂层，MnO2的晶型为水钠锰矿型。相比于其他晶型的MnO2材料，具有片层结构的水钠锰矿型MnO2比表面积大，阳离子交换容量高，吸附金属离子的能力尤为突出，利于钙和镁离子在涂层表面的固定，以及后续蛋白吸附和成骨细胞分化。本发明基材可采用包括纯钛、钛合金、不锈钢或钴铬钼合金等常用的医用金属或医用合金材料。这样的基体材料可以提供较好的加工性能和力学性能。
所述二氧化锰涂层可以高锰酸钾为锰源，以盐酸为还原剂，以氯化钾为稳定剂，采用水热反应法得到。本发明采用操作简单、可规模化生产的水热反应法，在基材表面原位生长具有优异离子吸附功能的MnO2涂层，以提高骨植入的成骨分化能力。
在本发明的一些具体示例中，将基材置于高锰酸钾、氯化钾和盐酸的混合溶液中，采用水热反应法，以高锰酸钾为锰原，在反应液中，高锰酸钾的浓度为0.001～0.01mol/L，以盐酸为还原剂，以氯化钾为稳定剂，于80～150℃水热反应1～24h。盐酸浓度可为高锰酸钾浓度的1～5倍。一些实施方式中，氯化钾浓度可为高锰酸钾浓度的1～5倍。优选地，水热反应温度为100～120℃，保温时间为8～15h。本发明中制备得到的是水钠锰矿型二氧化锰，在水热过程中，若反应温度过高或反应时间过长，水钠锰矿型二氧化锰的片层结构会坍塌，从而转变为其他形式的二氧化锰，如α-二氧化锰。本发明中采用氯化钾为稳定剂，钾离子能平衡水钠锰矿的结构负电荷，稳定水钠锰矿型的片层结构，保证MnO2材料较大的比表面积，利于阳离子吸附。
使用上述方法获得的二氧化锰涂层具有良好的结晶度，呈现纳米片聚集而成的微米花球状结构。一些实施方式中，微米花球状结构的尺寸可为0.5～3μm。本发明中水钠锰矿涂层的生长机理为：在涂层生长初期，高锰酸钾能与钛基体发生氧化还原反应(4MnO4 -+3Ti+4H+→4MnO2+3TiO2+2H2O)，从而保证二氧化锰涂层能原位生长于钛基体之上。在涂层生长后期，高锰酸钾可与盐酸发生氧化还原反应(2MnO4 -+8H++6Cl-→2MnO2+3Cl2+4H2O)，或在水热温度范围内自分解(2MnO4 -→MnO4 2-+MnO2+O2)，从而形成片层结构的MnO2涂层。而中国专利201711370891.X中形貌调控机理为磷酸根吸附在水钠锰矿表面(特别是片层结构的边缘)，实现MnO2的定向生长；若无磷酸根或磷酸根浓度较低时，即得到花球状片层结构。
本发明还公开了具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层的应用。由于本发明制备的二氧化锰涂层具有良好的钙镁离子吸附能力，在生理环境中，离子先于蛋白质吸附在材料表面，纤连蛋白易于与钙和镁等二价离子结合，且植入材料表面的钙离子位点能促进纤连蛋白的吸附，从而利于细胞的黏附和成骨分化。一些实施方式中，所述二氧化锰涂层对钙离子的吸附量可为0.5～12.0μg/cm2。又，所述二氧化锰涂层对镁离子的吸附量为0.1～5.0μg/cm2。这些吸附的钙和镁离子作为正电荷位点，能促进带负电荷的纤连蛋白在材料表面的吸附。成骨细胞能特异性识别吸附在材料表面的纤连蛋白，从而促进细胞在材料表面的成骨分化。
本发明中主要利用水钠锰矿型二氧化锰的吸附性能，其促进成分化功能是在吸附钙镁离子之后实现的，可看作是吸附功能的拓展应用。二氧化锰的吸附性能与其结构负电荷和涂层相对表面积呈现正相关。钾离子能平衡二氧化锰的结构负电荷，涂层中钾离子含量越高，说明材料中需要平衡的负电荷越多，利于后续涂层与钙和镁离子交换吸附。而涂层的相对表面积越大，吸附位点暴露得越多，涂层的吸附能力越强。
本发明提供的水钠锰矿型MnO2涂层，能有效吸附生理环境中的钙和镁离子，从而提高纤连蛋白的吸附量，促进前成骨细胞的碱性磷酸酶分泌和细胞外基质矿化，并上调成骨分化相关基因的表达，具备良好的促成骨分化能力。且本发明的制备方法具有成本低、操作简单、可重复性好、适合规模化生产等优点。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
水热反应法制备MnO2涂层
将砂纸打磨光滑的钛片置于高锰酸钾，氯化钾和盐酸的混合溶液中，采用水热反应法，在钛片表面原位生长MnO2涂层。
其中离子混合液体积为60mL，所用高锰酸钾浓度为0.005M，氯化钾浓度为0.015M，盐酸浓度为0.02M。水热反应时间为12h，水热反应温度分别为100和120℃。根据所用高锰酸钾浓度和水热反应温度，将所得涂层标记为5M100-Ti(所用高锰酸钾浓度为0.005M，水热反应温度为100℃)和5M120-Ti(所用高锰酸钾浓度为0.005M，水热反应温度为120℃)。
对涂层进行物相分析。如图1所示，5M100-Ti和5M120-Ti涂层皆为水钠锰矿型MnO2(JCPDS 80-1098)。其中5M120-Ti涂层中MnO2的结晶度高于5M100-Ti涂层中MnO2的结晶度。
由如图2所示的SEM扫描图片可知，5M100-Ti和5M120-Ti涂层表面皆为纳米片层聚集而成的微米花球状结构，其中5M120-Ti涂层中的微米花球状结构的尺寸更大。
表1为氮气吸附法测定的材料相对表面积，其中，MnO2涂层的相对表面积显著高于Ti基体，5M120-Ti涂层的相对表面积较5M100-Ti的更大。
表1材料的相对表面积
相对表面积(cm<sup>2</sup>/cm<sup>2</sup>)
Ti 26
5M100-Ti 215
5M120-Ti 263
实施例2
MnO2涂层的钙和镁离子吸附量检测
将样品浸没于氯化钙(1.8mM)和氯化镁(0.8mM)的混合溶液中，所用溶液体积为5mL，吸附时间为24h。采用光电子能谱检测吸附前后涂层的K/Mn比例。采用电感耦合等离子发射光谱技术检测吸附后溶液中钙和镁离子的浓度，并计算5M100-Ti和5M120-Ti涂层样品的钙(镁)离子吸附量。
由表2可知，5M120-Ti中可被交换的钾离子含量较5M100-Ti更高，说明5M120-Ti涂层的吸附能力更强。由吸附前后K/Mn比例变化可知，5M120-Ti涂层被交换的钾离子量更多。
表2涂层吸附前后K/Mn比例变化
K/Mn(％，吸附前) K/Mn(％，吸附后) ΔK/Mn(％)
5M100-Ti 10.8 2.7 8.1
5M120-Ti 12.7 3.2 9.5
如图3所示，5M100-Ti和5M120-Ti涂层样品能有效吸附钙和镁离子，且5M120-Ti涂层样品具备更优的钙和镁离子吸附能力。5M120-Ti涂层制备时的水热反应温度更高，MnO2在Ti基体上的生长更快，所需平衡的负电荷更多，可交换的钾离子含量更高。与此同时，5M120-Ti涂层表面的状片层结构更为丰富，相对表面积大。因此，5M120-Ti的吸附性能较5M100-Ti更强。
实施例3
BCA(bicinchoninic acid)法检测样品的纤连蛋白吸附量
将样品浸没于含40μg/mL纤连蛋白的去离子水或钙镁离子混合溶液(其中氯化钙为1.8mM，氯化镁为0.8mM)中，所用体积为1mL。吸附4h后，收集上清液。取50μL上清液，并加入200μL BCA工作液，混匀。在37℃环境中孵育2h，通过酶标仪在562nm处测定溶液的OD值。根据蛋白标准品的浓度及相应OD值绘制标准曲线，根据标准方程计算上清液中总蛋白浓度。样品纤连蛋白吸附量为吸附前后溶液中纤连蛋白浓度的变化量。
如图4所示，在有无钙/镁离子存在时，样品对纤连蛋白吸附量皆为5M100-Ti＞5M100-Ti＞Ti。其中，Ti基材在去离子水溶液中对纤连蛋白的吸附量大于其在钙/镁离子混合溶液中对纤连蛋白的吸附量。5M100-Ti或5M100-Ti涂层样品在钙/镁离子混合溶液中对纤连蛋白的吸附量大于其在去离子水溶液中对纤连蛋白的吸附量。说明钙/镁离子参与到了纤连蛋白吸附于材料表面的过程，且样品对于钙和镁离子的吸附能力越强，样品在钙/镁离子混合溶液中对纤连蛋白吸附量的提升越明显。
实施例4
MnO2涂层的促成骨分化性能检测
采用小鼠前成骨细胞MC3T3-E1进行细胞增殖、碱性磷酸酶活性、细胞外基质矿化和成骨分化相关基因表达实验。
(1)细胞增殖
采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(10000个细胞/mL)种植在样品表面。在37℃、5％CO2细胞培养箱中分别培养1、4和7天后，弃去培养液。每孔分别加入1mL新鲜培养液和0.1mL CCK-8溶液。37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养3h后，小心将各孔溶液吸出并加入96孔板中。利用酶标仪在450nm处测量各孔的OD值。
(2)碱性磷酸酶活性
采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(50000个细胞/mL)种植在样品表面。在37℃、5％CO2细胞培养箱中分别培养7和14天后，弃去培养液。每孔分别加入300μL 0.1％Triton X-100(PBS稀释)。用枪头反复吸取吹打样品表面后，将孔内液体和泡沫一起吸取至EP管内离心(10000转，5min)。配制显色底物溶液和标准品工作液(0.5mM)，参考表1使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μL。借助摇床(50rpm/min)混匀液体后，37℃孵育10min。每孔加入100μL终止液，利用酶标仪在405nm处测定吸光度。将总蛋白浓度归一化后，得到ALP定量结果。
表3空白对照孔、标准品孔和样品孔的设置说明
空白对照 标准品 样品
检测缓冲液 50μL 100-x -
显色底物 50μL - 50
样品 - - 50
标准品工作液 - x -
(3)细胞外基质矿化
采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(50000个细胞/mL)种植在样品表面。在37℃、5％CO2细胞培养箱中分别培养14和21天后，弃去培养液。每孔分别加入1mL 4％多聚甲醛溶液，4℃孵育15min。弃去上清液，PBS洗涤3次后，每孔加入500μL茜素红染液，室温孵育20min。弃去上清液，PBS洗涤3次后，每孔加入500μL10％氯化十六烷基吡啶溶液，室温孵育15min。利用酶标仪在590nm处测定OD值。
(4)成骨分化相关基因表达
采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。将MC3T3-E1细胞分别消化、计数、配制成浓度为250000个/mL的细胞悬液。取2mL细胞悬液种植在各孔材料表面。静置6h后，弃上清，换成骨诱导液。并置于37℃，5％CO2培养箱中培养7d。采用qPCR法检测MC3T3–E1细胞成骨分化相关基因表达。
由图5可知，MC3T3-E1前成骨细胞在5M100-Ti和5M120-Ti涂层表面的增殖行为与其在Ti基体表面的增殖行为无明显差异，说明研制的具备良好的生物相容性。5M100-Ti和5M120-Ti涂层样品促进MC3T3-E1前成骨细胞分化(碱性磷酸酶活性)和细胞外基质矿化的能力明显优于Ti基材对照组。且5M120-Ti涂层样品促进MC3T3-E1前成骨细胞分化和矿化能力优于5M100-Ti涂层样品。
由图6可知，5M100-Ti和5M120-Ti涂层样品促进细胞成骨分化相关基因(Col1,Opn,Bmp2和Runx2)表达的能力明显优于Ti基材对照组。且5M120-Ti涂层样品促进细胞成骨分化相关基因(Col1,Opn,Bmp2和Runx2)表达的能力优于5M100-Ti涂层样品。

Claims (5)

1.一种具有促成骨分化功能的离子吸附型二氧化锰涂层的制备方法，其特征在于，将基材置于高锰酸钾、氯化钾和盐酸的混合溶液中并采用水热反应法在基材表面原位生长离子吸附型二氧化锰涂层；所述水热反应法以高锰酸钾为锰源，以盐酸为还原剂，以氯化钾为稳定剂；其中二氧化锰的晶型为水钠锰矿型；
所述高锰酸钾的浓度为0.001～0.01mol/L，所述盐酸的浓度为高锰酸钾浓度的1～5倍；
所述水热反应温度为80～150℃，保温时间为1～24 h；
所述二氧化锰涂层通过调控钙离子和镁离子在其表面的吸附，促进纤维蛋白吸附和成骨细胞成骨分化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基材包括医用金属或医用合金材料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基材为纯钛、钛合金、不锈钢或钴铬钼合金中至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钾的浓度为高锰酸钾浓度的1～5倍。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，水热反应温度为100～120℃，保温时间为8～15h。
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