CN112795695B - 用于检测新冠病毒的荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒及检测方法，其包括新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针，新冠内参为所述特异性引物中的一对引物的靶序列，内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团互不相同。本发明的用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒中，新冠内参为特异性引物中的一对引物的靶序列，同时具有不同荧光报告基团的内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针具有部分共用的特异性引物，通过分析内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针的荧光信号，能够减少假阴性的结果，既能够增加单次检测的靶点数目，提高检测灵敏度，同时也可提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，亦被称为2019-nCoV)属于β属的冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形直径60nm～140nm，基因特征与SARS具有明显的区别，且相比于SARS具有更高的感染能力。世界卫生组织于2020年2月11日将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”(Corona Virus Disease 2019)，中文译名为“2019冠状病毒病”，其名称解释为：CO代表冠状(Corona)，VI代表病毒(Virus)，D代表疾病(Disease)，19则因为疾病爆发于2019年。与此同时，国际病毒分类委员会声明，将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”(Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2)，并认定这种病毒是SARS冠状病毒的姊妹病毒。对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARSr-CoV和MERSr-CoV的研究，病毒对紫外线和热敏感，56℃30分钟、***、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯己定不能有效灭活病毒。
基于流行病学调查，COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是，重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。新型冠状病毒主要的传播途径还是呼吸道飞沫传播和接触传播，气溶胶等传播途径尚待进一步明确。通过流行病学调查显示，病例多可以追踪到与确诊的病例有过近距离密切接触的情况。各个年龄段的人都可能被感染，被感染的主要是成年人，其中老年人和体弱多病的人似乎更容易被感染。发病早期外周血白细胞总数正常或减少，淋巴细胞计数减少，部分患者可出现肝酶、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酶和肌红蛋白增高，部分危重者可见肌钙蛋白增高，多数患者C反应蛋白(CRP)和血沉升高，降钙素原正常，严重者D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少，重型、危重型患者常有炎症因子升高。临床分型分为“轻型、普通型、重型和危重型”，将“肺部影像学显示24～48小时内病灶明显进展＞50％者”按重型管理。如何快速确诊疑似病例，以及如何有效监控疾病进程，将为治疗COVID-19的重点。
据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中规定，目前确诊COVID-19的方法为使用实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性，或病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源。聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基础研究和临床实践，尤其是实时荧光PCR技术，在临床上基因定性与定量分析中更是扩展了基因检测的范围。目前临床常用的荧光PCR仪，主要提供4种或5种荧光通道，一般检测利用一个荧光通道作为内参，其余3种或4种荧光通道用于检测待测标本。但是，目前用于新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒的灵敏度和准确性仍然较低。
发明内容
基于此，有必要提供一种灵敏度和准确性较高的用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒。
一种用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒，包括新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针；
所述特异性引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20所示的探针，所述第一检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:31所示的探针，所述第二检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:33所示的探针；
所述新冠内参的核苷酸序列为所述特异性引物中的一对引物的靶序列，所述内参检测探针用于检测所述新冠内参；所述内参检测探针的5’端连接有内参荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述第一检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述第二检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团互不相同。
在其中一个实施例中，所述新冠内参的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述内参检测探针包括SEQ ID NO:21。
在其中一个实施例中，所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。
在其中一个实施例中，所述内参荧光报告基团为CY5，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第二荧光报告基团为HEX。
在其中一个实施例中，还包括序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的公共引物。
在其中一个实施例中，还包括序列如SEQ ID NO:37所示的流感内参、序列如SEQID NO:38和SEQ ID NO:39所示的流感扩增引物和序列如SEQ ID NO:40所示的流感检测探针，所述流感检测探针的5’端连接有流感荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，所述流感荧光报告基团与所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团不相同。
在其中一个实施例中，所述流感荧光报告基团为Texas Red。
在其中一个实施例中，还包括PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的新冠病毒检测方法，其使用上述荧光PCR检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：将待测样品和所述新冠内参、所述特异性引物、所述内参检测探针、所述第一检测探针和所述第二检测探针混合，进行荧光PCR反应，根据所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团的荧光信号得到检测结果；
当未检测到所述第二荧光报告基团的荧光信号时，检测结果为阴性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值＜38时，检测结果为阳性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥38且＜40，同时比所述内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值小2～3时，检测结果为阳性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥40，且小于所述内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值，同时比所述第一荧光报告基团的荧光信号的Cq值大2～3时，检测结果为阳性。
在其中一个实施例中，所述新冠内参的添加量为3～7cpies/μL。
为了提高荧光PCR的检测灵敏度，通常会选择拓展检测靶点范围，即在一次PCR反应中使用多对特异性引物和对应的探针同时检测多个靶点。但是，靶点数量增加后荧光PCR反应容易出现假阴性的问题，例如因Cq值异常增大而将结果误判为阴性。本发明的用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒中，新冠内参为特异性引物中的一对引物的靶序列，同时具有不同荧光报告基团的内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针具有部分共用的特异性引物，从而使一个待测片段被一个以上荧光通道检测，待测序列可以作为内参使用，通过分析内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针的荧光信号，能够更准确地对Cq值较大的情况进行判断，减少假阴性的结果。如此，既能够增加单次检测的靶点数目，提高检测的灵敏度，同时也可以进一步提高检测的准确性。
附图说明
图1为实施例1的两种荧光PCR检测试剂盒的扩增曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒，包括新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针。特异性引物包括核苷酸序列为SEQID NO:1～SEQ ID NO:20所示的探针，第一检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:22～SEQID NO:31所示的探针，第二检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:33所示的探针。新冠内参的核苷酸序列为特异性引物中的一对引物的靶序列，内参检测探针用于检测新冠内参。内参检测探针的5’端连接有内参荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；第一检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；第二检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。内参荧光报告基团、第一荧光报告基团和第二荧光报告基团互不相同。序列信息如下表1所示。
表1
为了提高荧光PCR的检测灵敏度，通常会选择拓展检测靶点范围，即在一次PCR反应中使用多对特异性引物和对应的探针同时检测多个靶点。但是，靶点数量增加后荧光PCR反应容易出现假阴性的问题，例如因Cq值异常增大而将结果误判为阴性。本发明的用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒中，新冠内参为特异性引物中的一对引物的靶序列，同时具有不同荧光报告基团的内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针具有部分共用的特异性引物，从而使一个待测片段被一个以上荧光通道检测，待测序列可以作为内参使用，通过分析内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针的荧光信号，能够更准确地对Cq值较大的情况进行判断，减少假阴性的结果。如此，既能够增加单次检测的靶点数目，提高检测的灵敏度，同时也可以进一步提高检测的准确性。
在一个具体示例中，新冠内参的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，该序列为特异性引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的靶序列，内参检测探针包括SEQ ID NO:21。
SEQ ID NO:34：
TCCCATCTGGTAAAGTTGAGGGTTGTATGGTACAAGTAACTTGTGGTACAACTACACTTAACGGTCTTTGGCTTGATGACGTAGTTTACTGTCCAAGACATGTGATCTGCACCTCTGAAGACATGCTTAACCCTAATTATGAAGATTTACTCATTCGTAAGTCTAATCATAATTTCTTGGTACAGGC
在一个具体示例中，内参荧光报告基团、第一荧光报告基团和第二荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、TexasRed、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。可以理解，内参荧光报告基团、第一荧光报告基团和第二荧光报告基团可以根据不同荧光PCR仪提供的荧光通道进行选择调整，以便于分别检测其荧光信号。
在一个具体示例中，内参荧光报告基团为CY5，第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为HEX，如上表1所示。如此，内参荧光报告基团可通过CY5通道进行检测，第一荧光报告基团可通过FAM通道进行检测，第二荧光报告基团可通过HEX通道进行检测。
在一个具体示例中，荧光PCR检测试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36所示的公共引物。
SEQ ID NO:35：F：GGAGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO:36：R：GAGGAGTTGGATGCTGGATGG
在一个具体示例中，荧光PCR检测试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:37所示的流感内参、序列如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的流感扩增引物和序列如SEQ ID NO:40所示的流感检测探针，流感检测探针的5’端连接有流感荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，流感荧光报告基团与内参荧光报告基团、第一荧光报告基团和第二荧光报告基团不相同。如此，进一步使用流感序列作为内参，通过检测其荧光信号有助于更准确地判断样本的检测结果。
SEQ ID NO:37：
TCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGT
SEQ ID NO:38：FLU-F:GGAGTGAGTACGGTGTGCTCTAACCGAGGTCGAAACGTA
SEQ ID NO:39：FLU-R:GAGTTGGATGCTGGATGGACGCTGCAGTCCTCGCTCACT
SEQ ID NO:40：TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGAT
可以理解，流感荧光报告基团也可选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。在一个具体示例中，流感荧光报告基团为Texas Red，荧光淬灭基团为BHQ2。
在一个具体示例中，该荧光PCR检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。可以理解，PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶等也可以直接以PCR预混液(PCR Mix)的形式提供，从而简化实验操作。
本发明一实施例的非疾病的诊断和治疗目的的新冠病毒检测方法，使用上述荧光PCR检测试剂盒，具体包括以下步骤：将待测样品和新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针混合，进行荧光PCR反应，根据内参荧光报告基团、第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的荧光信号得到检测结果；
当未检测到第二荧光报告基团的荧光信号时，检测结果为阴性；当第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值＜38时，检测结果为阳性；当第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥38且＜40，同时比内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值小2～3时，检测结果为阳性；当第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥40，且小于内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值，同时比第一荧光报告基团的荧光信号的Cq值大2～3时，检测结果为阳性。
可以理解，新冠病毒检测方法具有多种非疾病和治疗目的的应用场景，例如对已死亡人体或动物体样本进行检测，或者对环境样本进行检测等，例如对冷冻食物进行检测，获得的直接结果用于判断冷冻食物是否含有新冠病毒。
在一个具体示例中，新冠内参的添加量为3～7cpies/μL。
在一个具体示例中，上述荧光PCR反应的反应程序为：93℃～97℃预变性1～3分钟，93℃～97℃变性8～12秒，56℃～60℃退火18～22秒，70℃～74℃延伸28～32秒，72℃～74℃收集荧光4～6秒，共45～55个循环。
以下为具体实施例。
实施例1
制备荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒主要包括两步法RT-qPCR预混液HiScript IIIRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、2×Taq PCR Master Mix、2×NovoStart SYBRqPCR SuperMix Plus染料、新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针、第二检测探针、公共引物、流感内参、流感扩增引物和流感检测探针。其中，相关引物和探针均由上海生工合成，其序列见表1。由于SYBR荧光染料的激发波长与淬灭波长与FAM探针的相差无几，所以在此处可加入SYBR GREEN荧光染料，通过FAM通道收集SYBR GREEN的荧光信号。
将表1的十对用于扩增新冠片段的特异性引物的上下游引物都稀释至10μM，上下游引物各取10μL进行混合，将混合之后的引物浓度稀释成1/300μM。
提取新冠阳性样本的RNA，将新冠阳性样本RNA逆转录为cDNA，上样体系为RNA样本3μL，逆转录酶10μL，加入混合之后的特异性引物1μL，公共引物的上下游引物各1μL，补足水至总体系为20μL，逆转录程序为50℃，30分钟。
配置2400copies/μL的流感内参模板5μL和800copies/μL的新冠内参A(SEQ IDNO:34)5μL，配置5X的Texas Red探针工作液，5X的Cy5探针工作液，5X的Hex探针工作液，5X的FAM探针工作液，补足水至总体积为50μL的内参工作液。
取5μL内参工作液上样，保证20μL的上样总体积里流感内参模板的总拷贝数为300拷贝，新冠内参A的总拷贝数为100拷贝，保证Texas Red探针、Cy5探针、Hex探针和FAM探针的浓度为1X。
实验管1：取5μL内参工作液加入到PCR反应体系中，取新冠阳性样本的cDNA 3μL加入到PCR反应体系当中，2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10μL，取2μL混合之后的特异性引物加入到PCR反应体系当中，加水补足总体系为20μL。
实验管2：取maccura生物公司的新冠检测试剂盒中的酶反应液8.5μL，酶混合液1.5μL，取新冠阳性样本的cDNA 3μL加入到PCR反应体系中，加水补足总体系为20μL。
PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性10秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，73℃收集荧光5秒，共50个循环。检测TexasR通道、CY5通道、Hex通道、Fam通道的荧光信号，各通道检测目标如表2所示。
表2
实验结果如图1所示，扩增曲线a(FAM通道)为maccura新冠检测试剂盒的扩增曲线，扩增曲线b(FAM通道)为本发明的荧光PCR检测试剂盒的检测曲线。由图1可以看出，扩增曲线b比扩增曲线a大概提前了6个循环左右。可见，与maccura试剂盒相比，本发明的荧光PCR检测试剂盒在确保正常扩增的同时，大大提高了检测的灵敏度。
进一步根据CY5通道、Hex通道、Fam通道的扩增曲线判断检测结果，如下表3所示，通过分析内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针的荧光信号，能够更准确地对Cq值较大的情况进行判断，减少假阴性的结果。
表3
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖南中医药大学
<120> 用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒及检测方法
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggagtgagta cggtgtgctt tcagactgtt tgcgcgta 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagttggatg ctggatggca gcaatacgaa gatgtcca 38
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggaggagtga gtacggtgtg ccagacaatt atataaccac t 41
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaggagttgg atgctggatg gtcattagag ataatagatg g 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaggagtga gtacggtgtg ccagcaagaa ctgtgtatga t 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaggagttgg atgctggatg gataaacttt ataaamgagt gt 42
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggaggagtga gtacggtgtg cggacattgc tgctaatact g 41
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaggagttgg atgctggatg gcttggctat gtcagtcata g 41
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taacggtctt tggcttgatg ac 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtaatcat cttcagtacc ata 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgacgctaca gttgttttac tgg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgttatgatg tcagcaccac ctg 23
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taacggtctt tggcttgatg ac 22
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgatgcaatc atgactaggt gtctagc 27
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttggtgtttg ttctatgact gacatagc 28
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agaaagtgaa ctcgtaatcg gagctgt 27
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acactgtaga ggaggcaaag acagtgctta 30
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acacttatga atgtcttgac actc 24
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tccagcacat atatctacta ttggtg 26
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acactgtaga ggaggcaaag acagtgctta 30
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tccagcacat atatctacta ttggtg 26
<210> 34
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcccatctgg taaagttgag ggttgtatgg tacaagtaac ttgtggtaca actacactta 60
acggtctttg gcttgatgac gtagtttact gtccaagaca tgtgatctgc acctctgaag 120
acatgcttaa ccctaattat gaagatttac tcattcgtaa gtctaatcat aatttcttgg 180
tacaggc 187
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggaggagtga gtacggtgtg c 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaggagttgg atgctggatg g 21
<210> 37
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctaaccgag gtcgaaacgt acgttctttc tatcatcccg tcaggccccc tcaaagccga 60
gatcgcgcag agactggaaa gtgtctttgc aggaaagaac acagatcttg aggctctcat 120
ggaatggcta aagacaagac caatcttgtc acctctgact aagggaattt taggatttgt 180
gttcacgctc accgtgccca gtgagcgagg actgcagcgt 220
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggagtgagta cggtgtgctc taaccgaggt cgaaacgta 39
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gagttggatg ctggatggac gctgcagtcc tcgctcact 39
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcaggccccc tcaaagccga gat 23
Claims (9)
1.一种用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针；
所述特异性引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20所示的引物，所述第一检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:31所示的探针，所述第二检测探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:33所示的探针；所述新冠内参的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述内参检测探针包括SEQ IDNO:21；
所述新冠内参的核苷酸序列为所述特异性引物中的一对引物的靶序列，所述内参检测探针用于检测所述新冠内参；所述内参检测探针的5’端连接有内参荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述第一检测探针的5’端连接有第一荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述第二检测探针的5’端连接有第二荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团互不相同。
2.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGB。
3.根据权利要求2所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参荧光报告基团为CY5，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第二荧光报告基团为HEX。
4.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的公共引物。
5.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括序列如SEQ ID NO:37所示的流感内参、序列如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的流感扩增引物和序列如SEQ ID NO:40所示的流感检测探针，所述流感检测探针的5’端连接有流感荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，所述流感荧光报告基团与所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团不相同。
6.根据权利要求5所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述流感荧光报告基团为Texas Red。
7.根据权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
8.一种非疾病的诊断和治疗目的的新冠病毒检测方法，其特征在于，使用权利要求1～7任一项所述的荧光PCR检测试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：将待测样品和所述新冠内参、所述特异性引物、所述内参检测探针、所述第一检测探针和所述第二检测探针混合，进行荧光PCR反应，根据所述内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团的荧光信号得到检测结果；
当未检测到所述第二荧光报告基团的荧光信号时，检测结果为阴性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值＜38时，检测结果为阳性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥38且＜40，同时比所述内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值小2～3时，检测结果为阳性；当所述第二荧光报告基团的荧光信号的Cq值≥40，且小于所述内参荧光报告基团的荧光信号的Cq值，同时比所述第一荧光报告基团的荧光信号的Cq值大2～3时，检测结果为阳性。
9.根据权利要求8所述的新冠病毒检测方法，其特征在于，所述新冠内参的添加量为3～7cpies/μL。
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