CN112782332A - 一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的hplc检测方法 - Google Patents
一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的hplc检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，所述HPLC检测方法包括：以含有抗坏血酸的醋酸铵‑甲醇溶液为溶剂溶解所述对乙酰氨基酚药品，得到供试品溶液；再以所述醋酸铵‑甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中对氨基酚杂质的含量。本发明提供的HPLC检测方法在预处理待测样品时，在溶剂醋酸铵‑甲醇溶液中加入了抗坏血酸，使得对氨基酚杂质稳定，不会被氧化降解，样品溶液无需临用现制，而且消除了对氨基酚杂质在溶液配制环节中即发生损失的缺点，该检测方法满足***适用性要求，且检测灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法。
背景技术
对乙酰氨基酚具有解热镇痛作用，因此广泛应用于复方感冒药中，另外还可作为治疗关节痛、神经痛及偏头痛、癌性痛及手术后的止痛药物。对氨基酚为对乙酰氨基酚的工艺杂质和降解杂质，因此无论是在生产还是存储过程中均可能产生。对氨基酚具有高毒性且能致突变，其在药品中的限度较严格，一般要求不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1％。
对氨基酚的检测目前主要有电化学法、薄层色谱(TLC)法和高效液相色谱(HPLC)法。电化学法干扰因素多，专属性较差，容易产生较大的测量误差。TLC法的灵敏度低，无法进行准确定量测定。HPLC法，灵敏度高，精密度和准确度高，是目前被采用的主流方法。
中国药典2020版，英国药典2020版，美国药典43版等国内外权威药典均在对乙酰氨基酚原料药及其制剂各论中设置了杂质检查项，用以监测对氨基酚杂质的含量，采用的均为HPLC法。但因对氨基酚杂质的化学性质不稳定，它在溶液中会被快速氧化降解成其他物质从而影响测定结果。为了解决这个问题，各药典均要求溶液临用现制，但这会对工作效率造成影响，特别是样品量较大时，检验员必须守在仪器旁边持续地进行溶液配制操作。而且“临用现制”也不能完全解决问题，在样品与溶液接触时，溶液中的氧气不可避免地会与对氨基酚杂质发生反应，即使在配制完成后立刻进样，在溶液的配制过程中对氨基酚已经发生了一定程度的降解，特别是需要进行复杂的前处理而且溶液配制时间较长的品种。
另外，国内部分复方感冒药仍未设置对氨基酚杂质的检查项，不利于药品质量的监管，也亟需一种易于操作并且准确的测定方法。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供适用于对乙酰氨基酚类药品中对氨基酚杂质检测的HPLC方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，所述检测方法包括：
以含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液为溶剂溶解所述对乙酰氨基酚药品，得到供试品溶液；再以所述醋酸铵-甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中对氨基酚杂质的含量。
本发明提供的HPLC检测方法在预处理待测样品时，在溶剂醋酸铵-甲醇溶液中加入了抗坏血酸，使得对氨基酚杂质稳定，不会被氧化降解，样品溶液无需临用现制，而且消除了对氨基酚杂质在溶液配制环节中即发生损失的缺点，该检测方法满足***适用性要求，且检测灵敏度较高。
作为本发明优选的技术方案，所述供试品溶液中含有质量浓度为0.001～0.1mg/mL的抗坏血酸，例如可以是0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL或0.1mg/mL等。
优选地，所述供试品溶液中对乙酰氨基酚的浓度为1～5mg/mL，例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5mg/mL等。
优选地，所述供试品溶液中对氨基酚杂质的浓度为1～5μg/mL，例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5mg/mL等。
其中，所述对氨基酚杂质的浓度为1～5μg/mL，是指最终测试得到的对氨基酚杂质的浓度，可先根据标定或者预估的对氨基酚杂质的含量来确定样品的稀释倍数，使得最终测试得到的对氨基酚杂质的浓度在此范围内，若是所测浓度明显不在此范围，则需要对样品重新进行稀释后检测。
本发明中，供试品溶液的色谱图中如有与对氨基酚保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含对氨基酚不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1％。
优选地，所述醋酸铵-甲醇溶液由醋酸铵溶液和甲醇混合得到。
优选地，所述醋酸铵溶液与甲醇的体积比为(85～91):(15～9)，例如可以是85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10或91:9等。
优选地，所述醋酸铵溶液中醋酸铵的摩尔浓度为0.03～0.07mol/L，例如可以是0.03mol/L、0.035mol/L、0.04mol/L、0.045mol/L、0.05mol/L、0.055mol/L、0.06mol/L、0.065mol/L或0.07mol/L等。
作为本发明优选的技术方案，所述HPLC检测方法使用C18色谱柱进行检测。
本发明中所用的色谱柱为C18色谱柱，能够对样品中的物质进行分离，使得图谱中对氨基酚峰、对乙酰氨基酚峰以及相邻峰的分离度较高。本发明中所用的色谱柱规格可以是Zorbax SB-C18色谱柱或Shim-pack Scepter C18色谱柱，其规格可以为4.6mm×250mm，粒径为5μm左右。
优选地，所述HPLC检测方法使用的检测器为紫外检测器和/或二极管阵列检测器。
优选地，所述检测器的检测波长可以是230nm、231nm或232nm等，优选为231nm。
优选地，所述HPLC检测方法采用外标法检测对氨基酚杂质的含量。
优选地，所述外标法使用的对照品溶液中对氨基酚的浓度为2～2.5μg/mL，例如可以是2μg/mL、2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/m或2.5μg/mL等，优选为2.5μg/mL。
作为本发明优选的技术方案，所述HPLC检测方法的检测时间为8～15min，例如可以是8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min等。
作为本发明优选的技术方案，所述HPLC检测方法包括如下步骤：
(1)将摩尔浓度为0.03～0.07mol/L的醋酸铵溶液与甲醇以(85～91):(15～9)的体积比混合，得到醋酸铵-甲醇溶液；
所述醋酸铵-甲醇溶液加入抗坏血酸后，再用于溶解对乙酰氨基酚药品，得到供试品溶液，所得供试品溶液中含有质量浓度为0.001～0.1mg/mL的抗坏血酸，对乙酰氨基酚的浓度为1～5mg/mL，对氨基酚杂质的浓度为1～5μg/mL；
并制备对照品溶液，所述对照品溶液中对氨基酚的浓度为2.5μg/mL；
(2)再以所述醋酸铵-甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪在231nm的检测波长下检测所述供试品溶液中对氨基酚杂质的含量。
示例性地，本发明所述的HPLC检测方法可以采用如下步骤进行：
(1)溶液准备：
溶剂：在0.05mol/L醋酸铵溶液-甲醇(体积比为88:12)中加入抗坏血酸，溶解并稀释后定容至1000mL，其中抗坏血酸的浓度为0.01mg/mL；
流动相：以0.05mol/L醋酸铵溶液-甲醇(体积比为88:12)为流动相；
供试品溶液：取待测样品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释，制成每1mL中约含对乙酰氨基酚2.5mg的溶液，滤过；
对照品溶液：取对氨基酚对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含2.5μg的溶液；
灵敏度溶液：精密量取对照品溶液1mL，置10mL量瓶中，用供试品溶液稀释至刻度，摇匀；
(2)上机检测：
精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至对乙酰氨基酚峰出峰完整；
检测柱为C18色谱柱，柱温为30℃，检测波长为231nm；进样体积为10μL；
记录谱图后，按外标法计算对氨基酚的含量。
第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的HPLC检测方法在药品筛选或药品质量控制中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
为了解决对氨基酚杂质的氧化降解问题，本发明建立的方法使用了一种具有抗氧化作用的溶剂，抗坏血酸在很低的浓度下即可实现保护作用，而且优于其他常用的抗氧化剂，可以保护对氨基酚杂质在12～24小时内稳定，样品溶液无需临用现制，而且消除了对氨基酚杂质在溶液配制环节中即发生损失的缺点；
同时，在本发明限定的浓度范围内，抗坏血酸不会对测定过程产生任何干扰，可以保持色谱图基线平滑，并且在设定的波长下采集的图谱，溶剂峰后不出现干扰色谱峰，在检测对氨基酚杂质的同时，还适用于检测药品中的其他有关物质。
附图说明
图1为实施例1中供试品溶液中含有0.001mg/mL抗坏血酸时所得HPLC检测图谱。
图2为实施例6中供试品溶液中含有1mg/mL抗坏血酸时所得HPLC检测图谱。
图3为实施例7中供试品溶液中含有0.1mg/mL抗坏血酸时所得HPLC检测图谱。
图4为对比例2中供试品溶液中含有0.01mg/mL硫代硫酸钠时所得HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
本实施例中提供一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，所述HPLC检测方法具体包括如下步骤：
(1)溶液配制：
a、溶剂：将摩尔浓度为0.05mol/L醋酸铵溶液和甲醇混合，两者的体积比为88:12，再加入抗坏血酸1mg，溶解并稀释至1000mL，得到抗坏血酸浓度为0.001mg/mL的溶剂；
b、流动相：摩尔浓度为0.05mol/L醋酸铵溶液和甲醇按体积比为88:12混合；
c、供试品溶液：以1.2637g氨酚麻美干混悬剂(其标定的对乙酰氨基酚的含量为0.080g/g)为待测样品，加10mL溶剂溶解，并定量稀释制成每1mL中约含对乙酰氨基酚2.5mg的溶液，滤过；
d、对照品溶液：取25.03mg对氨基酚对照品，加10mL溶剂(即含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液)溶解并定量稀释，制成每1mL中含2.5μg对氨基酚样品的对照品溶液。
(2)上机检测：采用高效液相色谱仪(美国Waters公司，e2695-2998)进行检测，其紫外检测器的检测波长为231nm；
进样体积为10μL，色谱柱为Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)；
所得检测图谱如图1所示，由图可知，在4min左右出现对氨基酚的峰，且所得图谱基线平滑，无干扰峰，因此所得检测浓度较为准确。
实施例2
本实施例中提供一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，所述HPLC检测方法具体包括如下步骤：
(1)溶液配制：
a、溶剂：将摩尔浓度为0.07mol/L醋酸铵溶液和甲醇混合，两者的体积比为85:15，再加入抗坏血酸溶解并稀释至1000mL，得到抗坏血酸浓度为0.01mg/mL的溶剂；
b、流动相：摩尔浓度为0.07mol/L醋酸铵溶液和甲醇按体积比为85:15混合；
c、供试品溶液：以1.2637g氨酚麻美干混悬剂(其标定的对乙酰氨基酚的含量为0.080g/g)为待测样品，加10mL溶剂溶解，并定量稀释制成每1mL中约含对乙酰氨基酚2.5mg的溶液，滤过；
d、对照品溶液：取25.03mg对氨基酚对照品，加10mL溶剂(即含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液)溶解并定量稀释，制成每1mL中含2.5μg对氨基酚样品的对照品溶液。
(2)上机检测：采用高效液相色谱仪(美国Waters公司，e2695-2998)进行检测，其紫外检测器的检测波长为231nm；
进样体积为10μL，色谱柱为Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)。
实施例3
本实施例中提供一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，所述HPLC检测方法具体包括如下步骤：
(1)溶液配制：
a、溶剂：将摩尔浓度为0.03mol/L醋酸铵溶液和甲醇混合，两者的体积比为91:9，再加入抗坏血酸溶解并稀释至1000mL，得到抗坏血酸浓度为0.01mg/mL的溶剂；
b、流动相：摩尔浓度为0.03mol/L醋酸铵溶液和甲醇按体积比为91:9混合；
c、供试品溶液：以1.2637g氨酚麻美干混悬剂(其标定的对乙酰氨基酚的含量为0.080g/g)为待测样品，加10mL溶剂溶解，并定量稀释制成每1mL中约含对乙酰氨基酚2.5mg的溶液，滤过；
d、对照品溶液：取20mg对氨基酚对照品，加10mL溶剂(即含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液)溶解并定量稀释，制成每1mL中含2μg对氨基酚样品的对照品溶液。
(2)上机检测：采用高效液相色谱仪(美国Waters公司，e2695-2998)进行检测，其紫外检测器的检测波长为231nm；
进样体积为10μL，色谱柱为Shim-pack Scepter C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)。
实施例4
与实施例1的区别在于，本实施例中，所述溶剂中抗坏血酸的浓度为0.01mg/mL；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
实施例5
与实施例1的区别在于，本实施例中，所述溶剂中抗坏血酸的浓度为0.005mg/mL；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
实施例6
与实施例1的区别在于，本实施例中，所述溶剂中抗坏血酸的浓度为1mg/mL；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
实施例7
与实施例1的区别在于，本实施例中，所述溶剂中抗坏血酸的浓度为0.1mg/mL；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
实施例8
与实施例4的区别在于，本实施例中，所用的色谱柱为Shim-pack Scepter C18(4.6mm×250mm，粒径5μm)；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
对比例1
与实施例4的区别在于，本实施例中，不添加抗坏血酸；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
对比例2
与实施例4的区别在于，本实施例中，将抗坏血酸替换为硫代硫酸钠；其余步骤及参数与实施例1保持一致；
方法评价
本发明中，实施例与对比例中分别对同一种供试品进行了检测，且在供试品溶液配制的第0、1、2、3、6、12、18和24小时分别进行了检测，所得实施例1、实施例4和实施例8得到的检测图谱中对氨基酚的峰面积如表1所示；
表1
由上表可知，实施例1、4和8中提供的供试品溶液在12小时内均稳定(变化率小于2％)，而实施例1在24小时内变化率为9.4％，实施例2和实施例3都能在24小时内稳定；
对比例1未加抗坏血酸，配制完后立即测试，与实施例1的供试品溶液比较，对氨基酚即出现了10.7％的损失；
此外，实施例6、实施例7和对比例2所得的图谱如图2～图4所示；
其中，实施例6(如图2)中在含抗坏血酸1mg/mL时，在对氨基酚右侧出现干扰峰，影响积分，说明供试品溶液中需注意抗坏血酸的添加量，其添加量不易过高，否则会出现干扰峰进而影响实验结果；实施例7(如图3)中在含抗坏血酸0.1mg/mL时，溶剂峰后无干扰峰；对比例2(如图4)中当样品溶液中含有硫代硫酸钠0.01mg/mL时，在对氨基酚峰附近出现干扰色谱峰。
实施例1～8和对比例1～2在第12小时检测得到的对氨基酚的浓度如下表2所示；
表2
如上表所示，本发明提供的方法在第12小时检测得到的对氨基酚的浓度均在2μg/mL以上，说明溶液中对氨基酚杂质较为稳定，变化率较小；且由实施例4与对比例2比较可知，本发明中的抗氧化剂选用抗坏血酸，其抗氧化效果较好；此外，本发明中还测试了当样品溶液中含有硫代硫酸钠1mg/mL时，放置24小时的对氨基酚浓度，发现对氨基酚杂质仍降解了4.7％；而样品溶液中含有抗坏血酸0.005mg/mL时，浓度比硫代硫酸钠低200倍，放置24小时对氨基酚杂质仍稳定，变化率小于0.8％，
而实施例4与实施例6比较可知，当样品溶液中抗坏血酸浓度较高时，其检测得到的样品杂质浓度较高，一方面可能是因为对氨基酚杂质更为稳定，另一方面也可能是由于检测图谱中出现杂峰，在统计过程中出现误差导致结果偏大。
综上所述，本发明提供的对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，可以保护对氨基酚杂质在12～24小时内稳定，样品溶液无需临用现制，也克服了对氨基酚杂质在溶液配制环节中即发生损失的缺点。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种对乙酰氨基酚药品中对氨基酚杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法包括：
以含有抗坏血酸的醋酸铵-甲醇溶液为溶剂溶解所述对乙酰氨基酚药品，得到供试品溶液；
再以所述醋酸铵-甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中对氨基酚杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中含有质量浓度为0.001～0.1mg/mL的抗坏血酸；
优选地，所述供试品溶液中对乙酰氨基酚的浓度为1～5mg/mL；
优选地，所述供试品溶液中对氨基酚杂质的浓度为1～5μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述醋酸铵-甲醇溶液由醋酸铵溶液和甲醇混合得到；
优选地，所述醋酸铵溶液与甲醇的体积比为(85～91):(15～9)；
优选地，所述醋酸铵溶液中醋酸铵的摩尔浓度为0.03～0.07mol/L。
4.根据权利要求1～3任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法使用C18色谱柱进行检测。
5.根据权利要求1～4任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法使用的检测器为紫外检测器和/或二极管阵列检测器；
优选地，所述检测器的检测波长为230～232nm，优选为231nm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法采用外标法检测对氨基酚杂质的含量。
7.根据权利要求6所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述外标法使用的对照品溶液中对氨基酚的浓度为2～2.5μg/mL，优选为2.5μg/mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法的检测柱温为28～32℃，优选为30℃；
优选地，所述HPLC检测方法的检测时间为8～15min。
9.根据权利要求1～8任一项所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法包括如下步骤：
(1)将摩尔浓度为0.03～0.07mol/L的醋酸铵溶液与甲醇以(85～91):(15～9)的体积比混合，得到醋酸铵-甲醇溶液；
所述醋酸铵-甲醇溶液加入抗坏血酸后，再用于溶解对乙酰氨基酚药品，得到供试品溶液，所得供试品溶液中含有质量浓度为0.001～0.1mg/mL的抗坏血酸，对乙酰氨基酚的浓度为1～5mg/mL，对氨基酚杂质的浓度为1～5μg/mL；
并制备对照品溶液，所述对照品溶液中对氨基酚的浓度为2.5μg/mL；
(2)再以所述醋酸铵-甲醇溶液为流动相，使用高效液相色谱仪在231nm的检测波长下检测所述供试品溶液中对氨基酚杂质的含量。
10.如权利要求1～9任一项所述的HPLC检测方法在药品筛选或药品质量控制中的应用。
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