CN112779324B - 用于单细胞检测和分析的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单细胞检测分析领域，公开了一种用于单细胞检测和分析的方法。该方法通过利用数字PCR仪实现一步法对样品进行单细胞分离、细胞裂解以及对其中的目标序列进行检测和分析，实现了数字PCR仪应用范围的扩大，使其能够用于微量细胞的检测，同时能够精准定量样品中每个单细胞内的目标基因，还能够实现对目标基因的表达水平的检测，并且还可以用于验证单细胞测序的结果。

Description

用于单细胞检测和分析的方法及其应用

技术领域

本发明涉及单细胞检测分析领域，具体涉及一种用于单细胞检测和分析的方法及其应用。

背景技术

单细胞分析技术是一种具有高灵敏度、高选择性、高时空分辨等特点的新型细胞研究技术，目前常见的单细胞分析技术有单细胞分离、单细胞测序等。单细胞分析技术由于灵敏度和准确度高，非常适用于生物学和医学检测。

数字PCR(dPCR)技术是一种基于微流控的核酸分子绝对定量技术，该技术通过将样品微滴化，将其中的目标核酸分子分配到微液滴中，每个微液滴中分配到的目标核酸分子数量为0-1个，并将每个微液滴作为一个反应单元进行PCR反应，对其中的核酸分子进行扩增，通过计算机软件对阳性微液滴的数量进行统计从而实现对样品中核酸分子的绝对定量。

dPCR与传统荧光定量PCR(qPCR)相比，所需样品量更少，并且dPCR是一种绝对定量的方法，其与qPCR相比对于Ct值的依赖性很小，尤其适用于样品中含量极少的稀有细胞检测分析，例如，肿瘤患者血液样品中循环肿瘤细胞(CTC)的检测、干细胞发育、早期胚胎发育、体外受精植入前筛查、肿瘤穿刺或激光微切割组织、新型稀少免疫亚群细胞等。但是dPCR一般用于检测已经分离出的核酸分子，其仍无法区分来自不同细胞中的核酸，也无法对单个细胞进行定性或定量检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的qPCR依赖于Ct值，且需求样品量较大，无法满足稀有细胞检测需要，而dPCR虽然对样品的需求量小，但是无法实现对单个细胞进行检测的问题，提供一种用于单细胞检测和分析的方法，该方法具有需要的样品量少、检测灵敏度高、准确度高，并且能够对单细胞个数进行准确定量，同时在单细胞水平对稀有细胞中的靶蛋白表达水平进行检测等优点。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于单细胞检测和分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将含细胞的样品、细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂引入数字PCR仪，在数字PCR仪的微滴生成仪中，含有细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂的细胞分离体系被包裹在微滴中，每个微滴中含有0-1个单细胞；然后在使细胞发生裂解的条件下进行裂解并对裂解产物中的目标序列进行扩增；再基于扩增结果进行统计分析；

其中，细胞分离体系中添加剂的浓度为0.5-25重量％。

本发明第二方面提供如上所述的方法在检测循环肿瘤细胞、验证单细胞测序结果、检测靶蛋白在细胞中的表达、检测单细胞中的基因突变中的应用。

通过上述技术方案，本发明提供的方法实现了样品(尤其是细胞含量少的样品)中单细胞的分离和检测，且该方法细胞包裹效率高、检测准确性高，不仅能够实现样品中单细胞基因分析(例如单细胞测序、基因突变检测等)，并且能够对样品细胞中的靶蛋白在表达水平进行检测(例如靶蛋白表达量分析、标志物检测等)，而且其高精准度的特点还使得本发明提供的方法能够应用于单细胞测序结果的验证，排除假阴性和假阳性结果，对测序结果进行初步筛选。

附图说明

图1是实施例1中采用荧光显微镜对HepG2-GFP细胞的单细胞分离情况观察结果；

图2是实施例1中HepG2-GFP单细胞经扩增16s rRNA基因后的分析结果；

图3是实施例1中H1975细胞系经单细胞分离后检测EGFR T790M突变的结果；

图4是实施例1中A549细胞系经单细胞分离后检测EGFR WT的结果；

图5是实施例1中H1975和A549混合细胞经单细胞分离后检测EGFR T790M突变的结果；

图6是实施例2中MCF-7A5和MCF-7B10以及二者的混合细胞中CD146基因表达的检测结果；

图7是实施例3中体系中不同浓度SDS对单细胞分离和检测结果的影响；

图8是实施例3中体系中不同浓度的甘油对细胞分散和包裹情况的影响；

图9是实施例3中体系中不同浓度的海藻糖对检测结果准确性的影响。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，将添加剂(例如海藻糖、甘油等)加入数字PCR体系中，能够一方面增加溶液的粘稠度，降低细胞的沉降速度，另一方面提高复杂体系中PCR扩增的效率，从而可以利用数字PCR仪进行单细胞分离。同时，在数字PCR体系中加入细胞裂解液，并在PCR程序之前加入细胞裂解程序，则可以利用数字PCR仪实现一步分离单细胞并对其中的基因及其表达情况进行检测和分析。

本发明第一方面提供一种用于单细胞检测和分析的方法，所述方法包括以下步骤：

将含细胞的样品、细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂引入数字PCR仪，在数字PCR仪的微滴生成仪中，含有细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂的细胞分离体系被包裹在微滴中，每个微滴中含有0-1个单细胞；然后在使细胞发生裂解的条件下进行裂解并对裂解产物中的目标序列进行扩增；再基于扩增结果进行统计分析；

其中，所述细胞分离体系中细胞裂解剂的浓度为0.008-0.5重量％，添加剂的浓度为0.5-25重量％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述单细胞分离体系中的添加剂选自海藻糖和/或甘油。

优选地，所述添加剂选自海藻糖，且所述海藻糖在所述细胞分离体系中的浓度为0.5-1重量％。

优选地，所述添加剂选自甘油，且所述甘油在所述细胞分离体系中的浓度为15-25体积％。

更优选地，所述添加剂选自海藻糖和甘油，且所述海藻糖在所述细胞分离体系中的浓度为0.5-1重量％，所述甘油在所述细胞分离体系中的浓度为15-25体积％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述细胞裂解剂选自十二烷基硫酸钠。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述PCR试剂包括：目标序列的引物和/或探针、ddPCR Supermix和水。

本发明提供的方法中采用的ddPCR Supermix是指数字PCR所需用的酶、缓冲液等物质，可以为任意本领域现有的酶、缓冲液按照比例自行调配，也可以是直接购买的相关商购产品。

为了进一步提高本发明提供的方法的准确性，优选地，所述水为无核酸酶的灭菌水。

本发明的发明人在研究的过程中发现，上述方法中，细胞裂解剂的用量对于该方法至关重要。若细胞裂解剂用量太小，则在单细胞分离后裂解效果差，目标基因无法从细胞中释放出来，从而使得扩增结果偏小；若细胞裂解剂用量太大，则无法顺利形成微滴，使得后续程序无法进行。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述细胞裂解剂选自在所述细胞分离体系中的终浓度为0.01-0.15重量％的十二烷基硫酸钠。

本发明的发明人在研究的过程中发现，本发明提供的方法特别适用于样品中细胞数量稀少时使用，当样品中细胞数为5个及以上时即可检出。但是当细胞数量过多时，由于扩增序列的拷贝数过高，导致无法分辨阳性微滴(即含有细胞的微滴)。因此，样品中的细胞数量对于本发明提供的方法十分重要。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述含细胞的样品中的细胞数为5-1000个。优选为10-1000个，更优选为500-1000个。

本发明提供的方法中，通过在PCR程序之前加入裂解的程序，使得微滴中分离获得的单细胞裂解，从而释放出目标基因，以便后续对其进行扩增和分析。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述裂解的条件包括：温度80-90℃，时间30-90min。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述裂解在数字PCR仪中进行。

本发明的发明人在研究的过程中发现，本发明提供的方法不仅可以对分离获得的单细胞中的目标基因进行检测和分析，还能用于检测目标基因的表达情况。具体地，通过检测目标基因对应的mRNA在细胞中的含量，从而能够获知该基因在该细胞中的表达情况。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括：检测目标序列表达量。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法中采用的PCR试剂中的引物和/或探针为所述目标序列对应的mRNA的引物和/或探针。

本发明第二方面提供如上所述的方法在(非诊断目的地)检测循环肿瘤细胞、验证单细胞测序结果、检测靶蛋白在细胞中的表达、检测单细胞中的基因突变中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中采用的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。ddPCR supermix购自Bio-Rad公司，货号1864021。SDS(粉末)购自Amresco公司，货号2232C155。海藻糖(粉末)购自Sigma公司，货号：T9531。甘油购自北京化工厂公司。

以下实施例中，未作特殊说明的情况下，所采用的SDS均为使用SDS(粉末)和无核酸酶的灭菌水配制成的0.3重量％溶液；未做特殊说明的情况下，所采用的海藻糖均为使用海藻糖(粉末)和无核酸酶的灭菌水配制成的8重量％溶液。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的方法单细胞分离的效果。

(一)HepG2-GFP细胞单细胞分离及验证

本实施例中采用具有GFP标记的HepG2细胞进行单细胞分离实验。其构建方法为：将穿梭质粒(PCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-PURO，购自优宝生物公司)与慢病毒包装试剂盒(Lenti-vpak packaging kit，购自OriGen×e公司，货号TR30037)中的包装质粒按照试剂盒说明共转染293T细胞(购自中国科学院上海细胞库)，在37℃，5％CO₂条件下培养48h后收集病毒液(浓度为10⁸/ml)。将HepG2细胞细胞悬液(浓度为4×10⁵/ml)加入在6孔板中，每孔细胞数约为4×10⁵，在37℃，5％CO₂条件下培养过夜，每孔加入100μL病毒液，而后在37℃，5％CO₂条件下共培养24h后传代，补加嘌呤霉素，嘌呤霉素的用量使得其在工作液中的浓度为1μg/mL。培养一周后筛选出稳转株细胞，采用DMEM完全培养基扩大培养备用。

按照表1中的成分和用量配制单细胞分离体系，而后利用数字PCR仪(Bio-Rad公司QX200型号)进行单细胞分离，并对其进行16S rRNA扩增(扩增程序详见表2)。采用荧光显微镜(Zeiss公司Axio Observer A1型号)对产生的微滴中细胞包裹情况进行观察(结果如图1所示，其中图1A为明场观察结果，图1B为荧光观察结果，图1C为明场与荧光合并后观察的结果)。通过图1可以看出，采用本发明提供的方法，能够实现利用数字PCR仪将单细胞包裹在微滴中，从而成功实现单细胞的分离，每个微滴中的细胞数为0-1个。

表1中采用的HepG2-GFP 16S rRNA引物和探针序列分别为：

正向引物：5'-GTTCGTTTGTTCAACGATTAA-3'

反向引物：5'-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3'

探针：FAM-CTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA-TAMRA

表1中16S rRNA引物/探针Mix中的引物终浓度为500nM，探针终浓度为250nM。

表1中的细胞悬液设置12个梯度，其中的细胞数分别为10、50、100、200、300、400、600、800、1000、2000、2500、3000。该细胞悬液采用100％甘油配制。

表1HepG2-GFP单细胞分离体系

*体系中海藻糖的终浓度为0.8重量％

**体系中SDS的终浓度为0.015重量％

表2数字PCR扩增程序

*当目标序列为DNA时，则细胞裂解后跳过逆转录程序，直接进行酶激活程序。

利用微滴读取仪(Bio-Rad公司QX200型号)采用QuantaSoft软件对获得的微滴进行检测和分析，结果显示，当体系中投入10、50、100、200、300、400、600、800、1000个细胞时，阳性微滴数分别是6、26、48、107、159、269、422、504、808，包裹率分别为60％、52％、48％、53.5％、53％、67.25％、70.33％、63％、80.8％。但是当细胞数达到2000以上时，微滴读取仪无法辨别阳性微滴(图2)。

(二)H1975和A549单细胞分离及验证

本实施例中采用的H1975细胞系和A549细胞系均购自中国科学院上海细胞库。

H1975是一株EGFR T790M阳性突变细胞，而A549是EGFR无突变细胞。按照表3中的成分和用量配制单细胞分离体系，分别对H1975、A549以及二者的混合细胞样品进行单细胞分离，并通过检测EGFR T790M的突变率量化验证混合细胞样品中H1975和A549的比例。

表3中采用的细胞悬液分别为细胞数为10、100、500、1000的H1975细胞悬液；细胞数为10、100、500、1000的A549细胞悬液；以及，细胞数为10、100、500、1000的H1975和A549数量按1:1配制的混合细胞悬液。该细胞悬液采用100％甘油配制。

表3中采用的EGFR T790M/WT引物/探针Mix中引物和探针的序列分别为：

EGFR T790M正向引物：5'-GCCTGCTGGGCATCTG-3'

EGFR T790M反向引物：5'-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3'

EGFR T790M探针：FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB

EGFR WT探针：VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB

表2中采用的EGFR T790M/WT引物/探针Mix中引物和探针的终浓度分别为500nM和250nM。

表3H1975和A549单细胞分离体系

试剂	体积(μL)
		海藻糖*	2
ddPCR supermix	8.4
		EGFR T790M/WT引物/探针Mix	1
细胞悬液	4
		SDS**	1
水	3.6

*体系中海藻糖的终浓度为0.8重量％

**体系中的SDS终浓度为0.015重量％

采用表2中的扩增程序，利用微滴读取仪(Bio-Rad公司QX200型号)采用QuantaSoft软件对获得的微滴进行检测和分析。通过检测阳性微滴数和EGFR T790M的突变频率观察单细胞的包裹效率。结果如下：

1、H1975单细胞分离结果：当体系中投入10个细胞时，FAM通道，即EGFR T790M突变的检测通道共生成14208个微滴，其中3个微滴为阳性微滴；VIC通道，即EGFR WT的检测通道共生成14208个微滴，其中1个为阳性微滴(图3A)。由此可见，10个细胞中能够检测到信号的共计4个细胞，即有4个细胞被成功包裹进微滴中，包裹效率是40％。以此类推，当体系中投入100、500、1000个细胞时，阳性微滴数分别是37、469、762，包裹率分别为37％、93.8％、76.2％。可见，当细胞在500个左右时，细胞的包裹效率最高。从突变频率的检测结果来看，H1975细胞系T790M的突变频率均在79％左右(图3B)，这与该细胞系该位点的突变频率(79.5％)一致，也进一步说明，基于微滴包裹的单细胞的基因检测结果是可信的。

2、A549单细胞分离结果：无论体系中投入多少细胞，FAM通道，即EGFR T790M突变的检测通道都没有检测到阳性微滴，这与预期一致，因为A549细胞系是没有EGFR T790M位点突变的。当体系中投入10个细胞时，VIC通道，即EGFR WT的检测通道共生成13374个微滴，其中3个为阳性微滴。也就是说，10个细胞中能够检测到信号的共计3个细胞，即有3个细胞被成功包裹进微滴中，包裹效率是30％。以此类推，当体系中投入100、500、1000个细胞时，阳性微滴数分别是47、311、806，包裹率分别为47％、62.2％、80.6％(图4)。结合H1975的结果，H1975和A549的包裹效率基本相近，体系中的细胞在100个以下时，包裹效率在40％左右；细胞数在100个以上到1000个细胞之间时，包裹效率明显提高。

3、混合细胞单细胞分离结果：通过检测EGFR T790M的拷贝数和突变频率进一步与以上纯细胞系的包裹情况进行验证。结果表明，当体系中投入10、100、500、1000个细胞时，阳性微滴数分别为6、64、424、849，包裹率分别为60％、64％、84.8％、84.9％。从突变频率的检测结果来看，H1975细胞系T790M的突变频率分别为53％、41.2％、40.4％、39.5％(图5)。理论上来讲，H1975细胞系与A549细胞系1:1混合，H1975的突变频率应该为40％左右。由此可见，当细胞数在100个以上时，突变频率更接近于理论值；细胞数越少，由于包裹的随机性，检测到的突变值会有虚高的情况。

由上述(一)和(二)两部分实验的结果可以获知，采用本发明提供的方法能够实现采用数字PCR仪一步完成单细胞分离和其中目标基因(目标序列)的检测，该方法尤其适用于样品中细胞数在10-1000之间时的单细胞分离和检测，而且对于不同种类的细胞，该方法的单细胞包裹效率没有显著变化，说明该方法能够稳定适用于不同的细胞使用。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的方法在表达层面对单细胞进行分离和检测的效果。

本实施例中采用MCF-7A5和MCF-7B10细胞系进行实验，其构建方法参见Zeng Q,LiW,Lu D,et al.CD146,an epithelial-mesenchymal transitioninducer,is associatedwith triple-negative breast cancer.Proc Natl Acad Sci U S A.2012,109(4):1127-1132。这两个细胞系改造自乳腺癌细胞MCF-7，能够稳定表达CD146，其中，MCF-7A5是CD146高表达细胞系，MCF-7B10是中量表达CD146的细胞系。

按照表4中的成分和用量配制单细胞分离体系。

表4中采用的逆转录酶购自Bio-Rad公司，货号1864021。其浓度为40U/μL。

表4中采用的引物/探针Mix中引物终浓度为500nM，探针终浓度为250nM。其中包含的引物和探针序列如下：

CD146正向引物：5'-CTCTTCCTGGAGCTGGTCAA-3'

CD146反向引物：5'-GTGCTGTTGGCTCTGGTATG-3'

CD146探针：FAM-TGGCCTCAGCACTTCCACTGCCA-BHQ1

GAPDH正向引物：5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCA-3'

GAPDH反向引物：5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'

GAPDH探针：VIC-CGCCAGCCGAGCCACATCGC-BHQ1

表4中采用的细胞悬液为细胞数为10、100、500的MCF-7A5细胞悬液；细胞数为10、100、500的MCF-7B10细胞悬液；以及，细胞数为10、100、500的MCF-7A5和MCF-7B10按照细胞数1:1配制的混合细胞悬液。该细胞悬液采用100％甘油配制。

表4用于MCF-7A5和MCF-7B10中CD146表达检测的PCR体系

试剂	体积(μL)
		海藻糖*	2.2
ddPCR supermix	5
		逆转录酶	4
300mM DTT	1
		引物/探针Mix	5
细胞悬液	4
		SDS	终浓度0.015重量％
水	补足至22μL

*体系中海藻糖的终浓度为0.8重量％

采用表2中的扩增程序，利用微滴读取仪(Bio-Rad公司QX200型号)采用QuantaSoft软件对获得的微滴进行检测和分析，用CD146的拷贝数除以GAPDH的拷贝数得到比率(Ratio)，从而验证该***在进行基因表达水平检测时的准确性。

结果显示：体系中加入10、100、500个不同数量的MCF-7A5细胞，最终计算得到的Ratio分别为3、3.9、3.7。当体系中加入10、100、500个不同数量的MCF-7B10细胞时，最终计算得到的Ratio分别为0.29、0.36、0.459(图6)。由此可知，该体系不但能够稳定地检测到体系中10个细胞的基因表达水平，而且能够通过比值区分表达丰度不同的基因的表达水平。通过上述比率，还可以获知高表达CD146的MCF-7A5细胞中，CD146的表达量大概是内参GAPDH表达量的3倍左右；而低表达CD146的MCF-7B10细胞中，CD146的表达量比内参GAPDH的表达量低，大概是GAPDH表达量的0.3倍左右。将MCF-7A5和MCF-7B10按照1:1的数量比进行混合，计算得到的比值分别是1.8、2、2.6，大致在A5和B10表达量的中间值上下(图6)。

由上述结果可以看出，本发明提供的方法能够准确检测单细胞中目标基因表达情况，而且对于样品中的稀有细胞(含量极少的细胞，例如样品中低至仅有10个的细胞)中的目标基因表达情况也能准确稳定地检测。

实施例3

本实施例用于说明体系中SDS和添加剂的浓度对本发明提供的方法准确性的影响。

(一)体系中SDS浓度对单细胞分离和检测结果的影响

采用实施例1(一)中的方法进行单细胞分离实验，不同之处在于，体系中的细胞数固定为1000个，SDS的终浓度分别采用0、0.001重量％、0.01重量％、0.15重量％和1.5重量％。按照表1中的单细胞分离体系进行实验，体系的总体积为20μL，SDS的不同浓度梯度通过调整SDS溶液和水的加入量实现。

对含有不同浓度的SDS的体系中阳性微滴和总微滴的数目进行分析，结果显示：如图7所示，每个浓度梯度中左侧为阳性微滴数，右侧为总微滴数。当体系中SDS浓度为0时，液滴总数是15625个，阳性微滴数为0，即细胞没有被裂解时无法被检出。当SDS的浓度为0.001重量％时，液滴总数是15064个，但阳性微滴数仍然为0，可能的原因是SDS的浓度太低，不能充***解细胞，目标基因没有被释放和扩增，导致检测不出阳性信号。当SDS的浓度为0.01重量％时，液滴总数是11755个，阳性微滴数是922，也就是1000个细胞有922个细胞被成功包裹并检出，包裹效率为92.2％。当SDS的浓度为0.15重量％时，液滴总数是11453个，阳性微滴数是745，包裹效率为74.5％。但当SDS的浓度为1.5重量％时，从微滴生成仪中取出样品时，肉眼即可观察到液滴数的减少，经微滴读取仪分析后，发现几乎没有完整的微滴生成，这表明SDS的浓度过高会导致液滴无法顺利生成，从而使得后续的检测无法进行。

(二)添加剂浓度对检测结果准确性的影响

1、采用HepG2-GFP细胞进行单细胞分离检测，方法和所用的细胞与实施例1(一)中相同。不同之处在于，体系中的细胞数固定为1000个，体系中的甘油终浓度分别采用0、10体积％、15体积％、20体积％、25体积％、30体积％。按照表1中的单细胞分离体系进行实验，体系的总体积为20μL，甘油的不同浓度梯度通过调整配制细胞悬液采用的100％甘油用量和体系中水的加入量实现。

镜下观察含有不同浓度的甘油的体系中的细胞包裹情况进行观察，结果如图8所示(其中A.未加甘油；B.10体积％甘油；C.15体积％甘油；D.20体积％甘油；E.25体积％甘油)。从图8的结果中可以很明显看出，当体系中没有甘油或甘油浓度为10％时，液滴中包裹的细胞呈现不稳定不均一的情况，包裹多个细胞的情况较多；当甘油的浓度在15-25体积％时，液滴中包裹的细胞几乎都是单个的，说明细胞的分散情况得到改善；但当甘油的浓度达到30体积％时，肉眼可见油包水的液滴数明显减少。这说明，当体系中的甘油终浓度在15-25体积％时，细胞分散情况和包裹效率达到最优，而体系中甘油浓度过低会导致细胞分散较差，无法实现单细胞分离的目的，并且由于微滴中可能包裹多个细胞从而降低单细胞检测的准确性；甘油浓度过高则会影响微滴的生成，从而对后续检测产生影响。

2、采用H1975细胞进行单细胞分离和突变检测，方法和所用的细胞与实施例2(二)中相同。不同之处在于，体系中的细胞数固定为1000个，海藻糖的终浓度为0、0.25重量％、0.5重量％、0.8重量％、1重量％和1.5重量％。按照表1中的单细胞分离体系进行实验，体系的总体积为20μL，海藻糖的不同浓度梯度通过调整海藻糖溶液和水的加入量实现。

检测EGFR T790M和野生型(WT)基因的数量，通过将检测的基因突变频率与理论突变频率相对比，确定不同浓度海藻糖对结果准确性的影响。结果表明：如图9所示，当体系中海藻糖浓度为0时，H1975细胞经单细胞分离和扩增后，检测到的突变率为50％，这与H1975细胞理论突变率79.5％相差较大(H1975细胞理论突变率参见Jiang XW,et al.Evaluationof EGFR mutations in NSCLC with highly sensitive droplet digital PCRassays.Mol Med Rep.2019,20(1):593-603.)。当体系中海藻糖浓度为0.25重量％时，检测的突变频率为60％，相较体系中无海藻糖时更加接近理论突变率，说明海藻糖的加入提高了本发明提供的方法的准确性。当体系中海藻糖浓度为0.5重量％、0.8重量％、1重量％和1.5重量％时，检测的突变频率分别为76.6％、78％、77.9％和70.8％，进一步接近理论突变频率，说明体系中海藻糖的浓度为0.5重量％-1.5重量％时检测获得的结果最为准确。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于单细胞检测和分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将含细胞的样品、细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂引入数字PCR仪，在数字PCR仪的微滴生成仪中，含有细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂的细胞分离体系被包裹在微滴中，每个微滴中含有0-1个单细胞；然后在使细胞发生裂解的条件下进行裂解并对裂解产物中的目标序列进行扩增，所述使细胞发生裂解的条件包括：温度80-90℃，时间30-90min；再基于扩增结果进行统计分析；

其中，所述细胞裂解剂在所述细胞分离体系中的终浓度为0.01-0.15重量％；

所述含细胞的样品中的细胞数为5-1000个；

所述添加剂选自海藻糖和甘油，且所述海藻糖在所述细胞分离体系中的浓度为0.5-1重量％，所述甘油在所述细胞分离体系中的浓度为15-25体积％；

所述细胞裂解剂选自十二烷基硫酸钠；

所述PCR试剂包括：目标序列的引物和/或探针、ddPCR Supermix和水。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水为无核酸酶的灭菌水。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：检测目标序列的表达量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法中采用的PCR试剂中的引物和/或探针为所述目标序列对应的mRNA的引物和/或探针。

5.权利要求1-4中任意一项所述的方法在非诊断目的地检测循环肿瘤细胞、验证单细胞测序结果、检测靶蛋白在细胞中的表达、检测单细胞中的基因突变中的应用。

Images