CN116103322A - 一种增强植物抵御灰霉菌侵染的功能基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种增强植物对灰葡萄孢菌耐受的功能基因及应用，属于生物工程技术领域。一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的应用，将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因转入植物中，所述植物为拟南芥，拟南芥中的ATCHiC‑OE为过量表达载体。植物表现为对灰葡萄孢菌胁迫耐受性状。本发明植物增强对灰葡萄孢菌胁迫耐受的功能基因可为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗病性和耐病性增强的植物种子。

Description

一种增强植物抵御灰霉菌侵染的功能基因及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用该基因作为正调控因子增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的应用。
背景技术
植物在生长、发育过程中面临着来自生态环境中各种各样的威胁，很多伤害来源于病原性真菌、细菌以及病毒等微生物。植物所受伤害严重会对植物的正常生长成熟产生影响，从而造成农作物的品质和产量上的损失，使农业生产面临严峻的困境。
灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea, B.cinerea）引起的一种可危害蔬菜、果树及花卉等多种植物的重要病害。灰葡萄孢菌能侵染包括拟南芥在内的240多种植物，是研究腐生型真菌的一种非常重要的模式真菌。灰葡萄孢菌产生的孢子量非常大，长期使用单一化学药剂产生的抗药性问题也非常突出，因此化学防治比较困难，常造成瓜果蔬菜的巨大经济损失，是一种广泛存在的危害农业生产的重要病菌。
拟南芥作为一种经典的模式植物，拟南芥全基因组已测序完成，被广泛应用于植物遗传学、作物生物学、发育生物学和分子生物学等研究领域。此外拟南芥具有结构简单、生长周期较短、繁殖系数高、生活力强、自花授粉和易于转化的特点，将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件，表现出其他生物无法比拟的优越性。利用模式生物拟南芥研究植物响应灰葡萄孢菌胁迫的机理将对农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一,也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。大部分基因的功能研究还尚不清楚，目前已发现了一些调控抵御病菌侵染的功能基因，如： MEB2、THE1、GLE1、RPS2、RPS5、RPS6、RPM1、RPP4、RPP7、RPW8、CPR30、BON1、EDS4等。
根据拟南芥数据库公布的基因组序列， ATCHiC(AT4G19810)是拟南芥几丁质酶18家族的成员，根据氨基酸序列特征， ATCHiC又可归属于Ⅴ型几丁质酶。植物几丁质酶主要分布在种子、茎及叶中，其蛋白分子量大多在20-40 kDa之间，并且大多数以单体形式存在，对热稳定，抗蛋白酶的水解。现已证明几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一，有大量报道表明，几丁质酶在植物中的表达受生物和非生物胁迫诱导。对于 ATCHiC基因目前仅有研究发现 ATCHiC基因可能在防御和发育调节中发挥作用，然而对其在调控植物防御过程中的具体作用的研究十分有限。
探讨新的病害防治方法和途径，如利用分子和基因工程的手段，发掘抗灰霉病的相关基因并研究抗病机制，快速培育抗病蔬菜品种对生产中防治灰霉病具有重要的理论及实践意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因，本发明的第二个目的提供所述功能基因作为正调控因子在调控植物抵御灰葡萄孢菌侵染的应用。
一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因转入植物中，所述植物为拟南芥，所述拟南芥中的 ATCHiC-OE为过量表达载体。
将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现对灰葡萄孢菌耐受性状。
本发明中将植物中的上述植物抗病相关蛋白编码基因 ATCHiC过量表达所采用的方法是利用基因工程技术构建 35S: ATCHiC过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为对灰葡萄孢菌耐受。将 ATCHiC基因构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上一种增强启动子或者诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，所使用的载体进行加工，使其具有抗性的抗生素标记物（如卡那霉素）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物如:水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、草坪草或苜宿等。通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法将携带有 ATCHiC基因的表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.根据拟南芥数据库公布的基因组序列， ATCHiC是拟南芥几丁质酶家族中的一员，申请人发现 ATCHiC基因过量表达后在灰葡萄孢菌胁迫处理下植株表现为对灰葡萄孢菌胁迫耐受，这表明该 ATCHiC基因响应灰葡萄孢菌胁迫的调控。
对该基因功能的进一步研究结果表明， ATCHiC基因过表达植株体内灰葡萄孢菌丝定殖量、过氧化氢（H2O2）与野生型植株相比较低，这说明过量表达 ATCHiC能提高拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性，表现为对灰葡萄孢菌胁迫耐受。
2.本发明所述的 ATCHiC基因过量表达后能增强植物对灰葡萄孢菌胁迫耐受，它为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗病性和耐病性增强的植物种子。
附图说明
图1为 ATCHiC基因在野生型拟南芥中被灰葡萄孢菌胁迫诱导表达图。
图2为 ATCHiC过表达植株的筛选及其mRNA表达水平图。
图3为 ATCHiC基因过表达植株与野生型植株（WT）土培4周后的莲座叶经灰葡萄孢菌菌盘处理24h后的比较照片图。
图4为T-DNA***位点示意图。
图5为 atchic突变体中 ATCHiC基因的转录水平鉴定图。
图6为 atchic突变体与野生型植株（WT）土培4周后的莲座叶经灰葡萄孢菌菌盘处理24 h后的比较照片图。
图7为水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯前体（ACC）诱导下WT植株 ATCHiC基因表达情况图，该实验以水作为对照组。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因转入植物中，所述植物为拟南芥，拟南芥中的 ATCHiC-OE为过量表达载体。
将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现对灰葡萄孢菌耐受性状。
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1培育对灰葡萄孢菌耐受拟南芥
1、确定 ATCHiC基因是否参与植物对灰葡萄孢菌胁迫响应
分别提取了不同时间点灰葡萄孢菌胁迫处理的野生型（WT）拟南芥的RNA并反转录成为cDNA，利用实时定量PCR技术进行 ATCHiC基因的转录水平的分析，发现 ATCHiC基因表达水平相对于对照组被灰葡萄孢菌胁迫显著诱导，该结果表明 ATCHiC是作为正调控因子来响应灰葡萄孢菌胁迫，参见图1。
2、 ATCHiC基因过量表达转基因株系 ATCHiC-OE1、 OE2的获得
为验证该基因在植物灰葡萄孢菌胁迫调控中的功能，构建 ATCHiC基因过量表达载体（ 35S: ATCHiC）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在MS培养基上正常培养两周，提取植株总RNA，反转录合成cDNA，以合成的cDNA为模板，进行PCR，扩增出足够量的目的产物，见图2中A。再以PCR产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将PCR产物与载体pCAMBIA1301进行酶切回收。再将回收纯化好的目的DNA片段和载体用T4 DNA连接酶连接过夜。将上述连接液转入DH5α中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌GV3101。电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗（卡那霉素，庆大霉素）的LB培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（卡那霉素，庆大霉素）的LB培养液中扩培并使用载体引物进行PCR鉴定，见图2中B。PCR扩增片段大小与目的基因一致后，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得 ATCHiC基因过表达转基因株系,见图2中C。其中，
引物1：
F 5' GAGAACACGGGGGACGGTACCATGTCTTCAACAAAACTCATATCGC 3'；
引物2：
R 5' CCTAGGTGCGGCCGCCTCGAGTTAAACCTTCTGTATAGTTCTGGTGGTTG 3'。
3、 ATCHiC过表达转基因植株转录水平鉴定及与野生型植株的抗病性比较
利用定量PCR对 ATCHiC过表达转基因植株进行了转录水平的鉴定，最终选择OE1和OE2进行下一步实验，参见图2中D。将野生型(WT)与 ATCHiC-OE1和 OE2同时播种营养土中，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）培养4周。将长势大小相同的莲座叶用1 %的次氯酸钠消毒后置于干净且铺有适当湿润滤纸的保鲜盒中，使用打孔器在打出直径0.5 cm的菌盘，小心放置在叶片上。24小时后，观察到：与野生型WT相比，过表达植株 ATCHiC-OE1和 OE2的叶片对灰葡萄孢菌表现为耐受表型，参见图3中A。利用定量PCR检测叶片灰葡萄孢菌丝含量， ATCHiC过表达叶片内灰葡萄孢菌丝定殖量比WT少，参见图3中B。利用DAB染色法对叶片进行染色，观察叶片H2O2积累情况， ATCHiC过表达叶片染色程度比WT更浅，H2O2积累更少，参见图3中C。DAB染色灰度分析见图3中D。这些结果表明对 ATCHiC过表达植株对灰葡萄孢菌侵染比WT更为耐受。
实施例2 ATCHiC突变体的获得
1、突变体生物信息确定及转录水平鉴定
参见图4，为了进一步研究基因在植物响应灰葡萄孢菌胁迫中作用，从美国拟南芥种质资源库获取了两个 ATCHiC基因功能缺失突变体，分别命名为 atchic-1、 atchic-2，其种子编号分别为SALK_061610和SALK_204213。参见图4，由于该种子为T-DNA***突变，通过特异引物进行PCR扩增并测序，测序结果在NCBI数据库Blast比对，综合分析得出T-DNA***位点信息。参见图5，利用定量PCR，对 atchic-1和 atchic-2突变体材料进行转录水平鉴定，发现这两个突变体中 ATCHiC基因的表达水平均显著低于野生型（WT）。
2、突变体植株与野生型植株的抗病性比较
将野生型(WT)与 atchic-1和 atchic-2同时播种营养土中，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）培养4周。将长势大小相同的莲座叶用1 %的次氯酸钠消毒后置于干净且铺有适当湿润滤纸的保鲜盒中，使用打孔器在打出直径0.5 cm的菌盘，小心放置在叶片上。24小时后，观察到：与野生型WT相比，突变体植株 atchic-1和 atchic-2的叶片对灰葡萄孢菌表现为敏感表型，参见图6中A。利用定量PCR检测叶片灰葡萄孢菌丝含量， atchic突变体叶片内灰葡萄孢菌丝定殖量比WT多，参见图6中B。利用DAB染色法对叶片进行染色，观察叶片H2O2积累情况， atchic突变体叶片染色程度比WT更深，H2O2积累更多，参见图6中C。DAB染色灰度分析见图6中D。这些结果表明对 atchic突变体植株对灰葡萄孢菌侵染比WT更为敏感。
3、野生型植株中 ATCHiC基因激素信号通路分析
植物激素在植物抗病过程中起着至关重要的作用，其中水杨酸（SA），茉莉酸（JA）和乙烯（ET）作用尤为突出。为了研究 ATCHiC基因在抗病过程中经过的信号通路，选取SA、JA、ET三种激素分别对野生型WT进行喷洒诱导。参见图7，以0h、3h、6h、9h、12h为时间点采集样品，提取RNA并反转录成为cDNA，利用实时定量PCR技术进行 ATCHiC基因的转录水平的分析，发现 ATCHiC基因表达水平相对于对照组被SA显著诱导，该结果表明 ATCHiC可能是通过参与SA信号通路响应灰葡萄孢菌胁迫。

Claims (3)

1.一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因，其特征在于：所述功能基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的应用，其特征在于：将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因转入植物中，所述植物为拟南芥，所述拟南芥中的ATCHiC-OE为过量表达载体。
3.根据权利要求2所述的一种增强植物抵御灰葡萄孢菌侵染的功能基因的应用，其特征在于：将所述DNA序列表SEQ ID No：l所示的功能基因通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现对灰葡萄孢菌耐受性状。
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