CN112779265B - 一种对植物特定基因进行饱和碱基编辑的育种方法 - Google Patents
一种对植物特定基因进行饱和碱基编辑的育种方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种对特定基因进行饱和碱基编辑的植物育种方法,包括如下步骤:1)选定一个待编辑基因;2)设计靶向待编辑基因的蛋白编码区及基因表达调控区的靶点,3)根据设计的靶点利用单碱基编辑CRISPR***制备构建体;4)利用步骤3)中的构建体制备转基因作物,作为一代植株;5)筛选步骤4)中的一代植株或其后代中基因组纯合编辑的植株作为亲本育种。本发明通过向导RNA指导的Cas单碱基编辑融合蛋白对植物(例如作物植物)基因组中选定基因中所有或多个靶序列进行碱基编辑以获得不同表型后代的方法及通过此方法获得的植物后代及等位基因。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言,涉及一种对特定基因进行饱和碱基编辑的植物育种方法及其使用的载体。
背景技术
高效快速的作物育种及改良需要利用新的遗传突变,如果这些突变能够相对容易的引入已有的优良栽培品种中,将大大加速育种的过程。基于大量野生种及栽培种的 基因型和表型连锁分析表明,单核苷酸差异是作物表型差异的一个主要原因。在重要 基因中的单核苷酸差异会导致氨基酸替换或翻译提前终止,有可能改变作物的表型, 使其具有更优良的生产潜力。在基因组编辑技术出现之前,获得新的遗传资源的方法 主要是通过鉴定稀有自发突变,通过物理、化学等方法诱导突变,或与野生种杂交引 入突变,但是这些方法需要耗费大量的时间及人力物力,获得的遗传资源需要通过杂 交及多代连续回交的方法引入已有的品种之中。近年来发展的基因组编辑技术,尤其 是CRISPR/Cas9技术可以通过切割靶标DNA并由同源重组(HR)修复引入特定位点碱 基的替换,但是这种方法受限于植物中DNA双链断裂后同源重组修复的频率极低以及 难以提供大量的DNA修复的模板,目前无法大规模应用于作物基因单碱基替换,限制 了其在作物育种中的应用。随着Cas9碱基替换***的出现,利用CRISPR/Cas9***可 以高效的在植物中引入单核苷酸替换,利用此***获得影响作用农艺性状的重要基因 的大量等位基因,并观察这些等位基因对作物相关性状的影响,可以为作物育种提供 大量的新遗传资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,如何有效的进行基于单碱基替换的作物育种。
本发明提供一种植物育种方法,包括如下步骤:
1)选定一个待编辑基因;
2)设计靶向待编辑基因的蛋白编码区及基因表达调控区的靶点,
3)根据设计的靶点利用单碱基编辑CRISPR***制备构建体;
4)利用步骤3)中的构建体制备转基因作物,作为一代植株;
5)筛选步骤4)中的一代植株或其后代中基因组纯合编辑的植株作为亲本育种。
进一步,所述步骤2)中,在设计时需排除可能同时靶向基因组其他位置序列的 靶点,并根据使用的Cas9核酸酶的类型选择PAM序列。
进一步,所述步骤1)中的待编辑基因为IPA1基因,所述IPA1基因为水稻基因组 中核苷酸序列为序列1所示的DNA。
进一步,所述步骤3)中的构建体为如下A1)、A3)或A3):
A1)所述构建体为表达gRNA的构建体T1,所述gRNA的靶位点为序列4所示的DNA;
所述构建体T1为重组pnCas9-PBE载体;
A2)所述构建体为表达gRNA的构建体T2,所述gRNA的靶位点为序列5所示的DNA;
所述构建体T2为重组pnCas9-PBE载体;
A3)所述构建体为表达gRNA的构建体T3,所述gRNA的靶位点为序列6所示的DNA;
所述构建体T3为重组pnCas9-PBE载体。
其中,所述A1)中的gRNA的序列为序列7;
所述A2)中的gRNA的序列为序列8;
所述A3)中的gRNA的序列为序列9。
其中,A1)所述构建体T1含有编码序列为序列10的gRNA的编码基因;
A2)所述构建体T2含有编码序列为序列11的gRNA的编码基因;
A2)所述构建体T3含有编码序列为序列12的gRNA的编码基因。
其中,所述A1)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列10所示的DNA 并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体;
所述A2)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列11所示的DNA并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体;
所述A3)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列12所示的DNA并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体。
所述植物为双子叶植物,如水稻。
利用A1)编辑的植物为水稻,与未编辑的受体植物相比,所述A1编辑后的水稻 的分蘖数更多、株高较低;
利用A2)编辑的植物为水稻,与未编辑的受体植物相比,所述A2编辑后的水稻 的单穗谷粒数更多,株高相近;
利用A3)编辑的植物为水稻,与未编辑的受体植物相比,所述A3编辑后的水稻 的分蘖数更多,株高相近。
本发明还要求保护上述任一构建体,包括构建体A1)、A2)和A3)。
本发明还要求保护利用所述的构建体编辑水稻产生的突变基因和/或及IPA1基因的等位基因。
本发明还要求保护所述的方法和/或构建体在育种中的应用。
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言,本发明涉及在植物材料中通过对某一个特定基因的多个靶点分别进行碱基替换编辑获得突变群体,并从中筛选出具有不同 表型后代的方法。更具体而言,本发明涉及一种通过向导RNA指导的Cas单碱基编辑 融合蛋白对植物(例如作物植物)基因组中选定基因中所有或多个靶序列进行碱基编辑 以获得不同表型后代的方法及通过此方法获得的植物后代及等位基因。
附图说明
图1为通过本发明所述方法产生的几个编辑植株的整株表型;
图2为通过本发明所述方法产生的几个编辑植株的穗部表型;
图3为IPA1基因模型示意图,及实施例中三个示例gRNA靶点位置;
图4为通过PCR-琼脂糖凝胶电泳方法检测T-DNA分离情况的电泳图;
图5为PCR后测序的测序结果图;
图6为通过本发明所述方法产生的几个编辑植株的表型统计数据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技 术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、 细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广 泛使用的术语和常规步骤。例如,本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为 本领域技术人员熟知,并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook,J.,Fritsch, E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold SpringHarbor,1989(下文称为“Sambrook”)。 同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用,指的是包括Cas9蛋白或其 片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白) 的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其 相关***)基因组编辑***的组分,能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列 形成DNA双链断裂(DSB)。
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解,这些实施例仅用于说明本发明,其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然,可以对本 发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质,因此,这些改动和变化同样在本 申请要求保护的范围内。
水稻品种中花11,属于粳型常规稻品种,用ZH11表示。
中花11中的IPA1基因序列如序列表中的序列1所示。编码IPA1蛋白的开放 阅读框如序列表中的序列2所示。IPA1的蛋白序列如序列表中的序列3所示。
本方法中使用的CRISPR单碱基替换载体pnCas9-PBE记载于如下文献:Zong,Yuan,Yanpeng Wang,Chao Li,Rui Zhang,Kunling Chen,Yidong Ran,Jin-Long Qiu,Daowen Wang,and Caixia Gao.Precise base editing in rice,wheat and maize witha Cas9-cytidine deaminase fusion.Nature biotechnology 35,no. 5(2017):438;农杆菌EHA105在文献Hood,E.E.;Gelvin,S.B.;Melchers,L.S. &Hoekema,A.(1993)."NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants".TransgenicResearch.2:208–218.doi:10.1007/BF01977351中公 开,公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1.靶点的选择
根据spCas9的PAM序列NGG找出IPA1基因编码区及表达调控区的所有可编辑 靶点后,使用BLAST检索水稻基因组DNA排除可能靶向基因组其他位置的靶点。部 分靶点序列如表1所示。
表1.靶向IPA1不同位置的靶点
实施例2.构建体的制备
根据表1中的序列,分别设计T1、T2、T3对应的gRNA及其编码序列,如表2 所示。
1)以序列13和序列14为引物,将退火后形成的退火产物(所述退火产物为 带有粘性末端的DNA)与经过限制性内切酶BsaI酶切后的pnCas9-PBE载体连接, 得到构建体-T1,所述构建体-T1为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***T1对 应的gRNA的编码序列并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体。
2)以序列15和序列16为引物,将退火后形成的退火产物(所述退火产物为 带有粘性末端的DNA)与经过限制性内切酶BsaI酶切后的pnCas9-PBE载体连接, 得到构建体-T2,所述构建体-T2为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***T2对 应的gRNA的编码序列并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体。
3)以序列17和序列18为引物,将退火后形成的退火产物(所述退火产物为 带有粘性末端的DNA)与经过限制性内切酶BsaI酶切后的pnCas9-PBE载体连接, 得到构建体-T3,所述构建体-T3为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***T3对 应的gRNA的编码序列并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体。
实施例3.转基因水稻的制备
将实施例2中制备的构建体-T1导入农杆菌EHA105中,得到农杆菌-T1,使用 农杆菌-T1转染中花11(ZH11)水稻的愈伤组织,得到T1当代水稻群体。所述T1 当代水稻群体的生长情况如图1和图2中的244对应的照片所示。
将实施例2中制备的构建体-T2导入农杆菌EHA105中,得到农杆菌-T2,使用 农杆菌-T2转染中花11(ZH11)水稻的愈伤组织,得到T2当代水稻群体。所述T2 当代水稻群体的生长情况如图1和图2中的280对应的照片所示。
将实施例2中制备的构建体-T3导入农杆菌EHA105中,得到农杆菌-T3,使用 农杆菌-T3转染中花11(ZH11)水稻的愈伤组织,得到T3当代水稻群体。所述T3 当代水稻群体的生长情况如图1和图2中的504对应的照片所示。
图1为编辑后的植株的整株表型,图2为编辑后的植株的穗部表型,图1和图 2中的ZH11表示未经过农杆菌转染的中花11,比较中花11、T1当代水稻群体、T2 当代水稻群体和T3当代水稻群体的生长表型,可以看出:与中花11相比,T1当代 水稻群体的分蘖数更多、株高较低;与中花11相比,T2当代水稻群体的单穗谷粒 数更多,株高相近;与中花11相比T3当代水稻群体的分蘖数更多,株高相近。
4.转基因当代材料的基因型鉴定
使用CTAB法提取步骤3中构建的水稻单株叶片DNA,通过PCR扩增T-DNA中靶 点周边序列(使用CBE-F和CBE-R的引物对,CBE-F:TTGGGTAACGCCAGGGTTTT;CBE-R:CACGCTGCAAACATGAGACG),并使用测序引物OSU3-F进行测序(OsU3-F:ggtacgttggaaaccacgtga)获知单株中靶点信息。根据靶点所在位置设计引物扩增 基因组DNA并测序可知基因组DNA的编辑情况。
T1当代水稻群体的测序结果如图5中上图所示,表示其中用于编码IPA1的蛋 白中第224位氨基酸的密码子由CAA变成TAA。
T2当代水稻群体的测序结果如图5中中图所示,表示其中用于编码IPA1的蛋 白中第280位氨基酸的密码子由CTC变成TTC。
T3当代水稻群体的测序结果如图5中下图所示,表示其中用于编码IPA1的蛋 白中的核苷酸的第502位和第504位核苷酸均由C变成T。
5.转基因第二代材料的鉴定
从转基因当代具有各靶点T-DNA的植株中,通过上述基因测序的方法鉴定出基 因组编辑的材料(即T1当代水稻群体、T2当代水稻群体、T3当代水稻群体)。收 集T1当代水稻群体、T2当代水稻群体和T3当代水稻群体的种子并种植,分别得到 T1二代水稻群体、T2二代水稻群体和T3二代水稻群体,分别选取T1二代水稻植 株、T2二代水稻植株和T3二代水稻植株,以T1当代水稻DNA为对照,通过PCR- 琼脂糖凝胶电泳方法检测T-DNA分离情况。分别提取T1二代水稻植株、T2二代水稻 植株和T3二代水稻植株的叶片DNA,以CBE-F和CBE-R为引物,进行电泳检测,电 泳结果如图4所示,图4中编号1表示对照,编号2-16表示T1二代水稻植株,编 号17到32表示T2二代水稻植株,编号33到48表示T3二代水稻植株。从图4中 可以看出,编号为2、5、7、9、11植株为T-DNA分离的T1二代水稻植株,编号为 22、24、25、27、28、29、32植株为T-DNA分离的T2二代水稻植株,编号为33、 37、39、40、45、48植株为T-DNA分离的T3二代水稻植株。
6.纯合编辑材料的表型鉴定
选取纯合型的编辑植株继续种植一代,并详细统计表型信息。通过比对基因型 信息和表型信息,鉴定出可对表型产生影响的新等位基因,及这些等位基因对表型 影响的方向和程度。具体步骤如下:
将步骤5中得到的T-DNA分离的T1二代水稻植株进行测序,将测序结果为纯合 型编辑植株的T1二代水稻群体(其中,纯合型编辑植株是指在gRNA靶向的基因组 序列发生了编辑,并且两条同源染色体上的编辑完全相同)的种子种植,得到T1 种植一代水稻(5株),记录T1种植一代水稻的株高、分蘖情况、单穗谷粒数、单 穗一级枝数、单穗二级枝数(图6中用224Gin-Stop表示),并与中花11比较, 结果如图6所示。
将步骤5中得到的T-DNA分离的T2二代水稻植株进行测序,将测序结果为纯合 型编辑植株的T2二代水稻群体的种子种植,得到T2种植一代水稻(7株),记录 T2种植一代水稻的株高、分蘖情况、单穗谷粒数、单穗一级枝数、单穗二级枝数(图 6中用280Leu-Phe表示),并与中花11比较,结果如图6所示。
将步骤5中得到的T-DNA分离的T3二代水稻植株进行测序,将测序结果为纯合 型编辑植株的T3二代水稻群体的种子种植,得到T3种植一代水稻(6株),记录 T3种植一代水稻的株高、分蘖情况、单穗谷粒数、单穗一级枝数、单穗二级枝数(图 6中用-504C-T表示),并与中花11比较,结果如图6所示。
结合图1、图2和图6可以看出:使用T1靶点编辑可获得IPA1的功能缺失突 变体,获得分蘖数增加的植株,可用于改良分蘖数过少的已有水稻品种,使其分蘖 数增加从而增加产量;使用T2靶点编辑的植株具有穗部增大的表型,可用于改良 已有水稻品种的穗部表型;使用T3靶点编辑的植株具有分蘖适量增加但穗部稍微 减少的表型,可用于改良已有的结实率较低的水稻品种,使其穗部稍微减小增加结 实率,但分蘖数增加从而增加产量。通过对IPA1的多个位点进行碱基替换编辑可 获得一系列连续表型的后代植株,这些类型的编辑可以快速的通过CRISPR的方法 引入已有水稻品种中,针对各地区独特的气候、光照及环境条件对当地的水稻品种 进行特异性改良。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨 和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发 明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 一种对植物特定基因进行饱和碱基编辑的育种方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10247
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gtaaccattt tagttatttt ttaccgtatt aacctcgtgc cgtaaccatc ttagttttca 60
aatcatacca ttttttctcg ctgaccacgg tagccatgat atcattgggt agaggtaact 120
tctaccaaag caatagtgaa tgtgtaccat ggagagaagc caaagccgtg cacgccggag 180
aaaattgatg ttatgccatc gtcggaaagg gatttcgcta aaatatcata acacatttag 240
gattcaataa aatggtactc tcaaatagga tcaacacgcc gcaatgacat ttctttcctt 300
cttaatttaa tgatttttca tgtttgcttt ggcaaagcta accaaatgcc cttcttcctc 360
ttgatccctt tttttgtctc attgatgaga gctcgacgaa gtagtagcac caccatggct 420
agggaagagg tcgtaaatca aagatatcat gcccgcgcgc tcgtcgatag ccgcaacagg 480
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gtggtacaac cctcgcacaa gagcgaacga agatcgccgg ccttggtctc cactacctcc 600
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ctgccctgtc catcgccgcc actcgcaacc acaccaagat gtgaagcatc cgttgtctgg 720
acctccatgg ccacgccaac gcaaacaccc ttgtccaata cttttcaata gtgtcgccac 780
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taaactatta gattggctag ctataatagt aagctccaaa tcatctatag ccaatataat 1260
agccaattca tacaatagtt gcttactata ctattaatac ctggtcccac caatcacaca 1320
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tctcttcctt tattttttta aagagtaaat ttcataaaac tacagatact ttgcatgatc 1440
tatcacaaaa ctacagattt tagaactagt ttcacaaaac tacagattta atgtgttcgt 1500
ttatcacaaa actacatgta ctttgaacac tatatcacaa aactacagat ttaagaactt 1560
gtttcacaaa actacaggtt tagtatcttc atttttcaca aaactacaaa tttaatatct 1620
tcatttatca caaaactaca gattcagtgt ctccattctc ataaaactac acgttttaat 1680
aatgctaaaa ctattattaa aacgtatagt tttatgagaa tggagacact gaatctgtag 1740
ttttgtgata aatgaagaca ctaaatgtgt agcattgtta taaacgaata cactaaatct 1800
atatttttgt gaaacaagtt cttaaatatg tagttttgtc atagattgta caaagtacct 1860
gtagttttgt gataaaacga agacactaaa tctgtagttt tgtgataaat tgtacaaaaa 1920
tacctgtagt tttgtgaaat ttactctttt ttaaaatatg tttatagctg gcttaggcca 1980
tttaaagtgc aaggacgtgg cgtgtggcaa tgtagagcca cgtaggcaag tcgcttgcgt 2040
ggaggagaga ggggagtggg gaccgttccc aacccagctt cgtgtgacca agtttggcca 2100
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ttccgtctct ttcctctctc ttctctctcc ccctctcctg gaggagagag aggagaagag 3060
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ggcggagggg gcaagaacaa ggggaagggc gtggccgcgg cggcgccacc gccgccgccg 3420
ccgccgccgc ggtgccaggt ggaggggtgc ggcgcggatc tgagcgggat caagaactac 3480
tactgccgcc acaaggtgtg cttcatgcat tccaaggctc cccgcgtcgt cgtcgccggc 3540
ctcgagcagc gcttctgcca gcagtgcagc aggtcactct ctcactcacc tcgccattgc 3600
tgatgtcacc actgcttttg ctttgctttg cttgctctcc ctcctctttc acctatctct 3660
cttgtttatt tgcttcttgt tcttgtttag tgctagtaca tgtgttgtta ttgttgtgcc 3720
gttttgtctt ttgggttatt gtgttgttgt tactactcgt tttactatag gtttttaagg 3780
tttatgagca cggccaccac attagatgca ctgtcaagtg gtgtgtgtgg gacctttcct 3840
gctaaaacaa gctgatttca actctctgaa acttcctgca tttcatctat ttttatcttt 3900
gattgtgttg ggagtactac actagtagtg ttaatatttt gactggtgct tatgagattt 3960
ttaagttggt aggttgatga ggaaaatact cctttatatg gttgagtgat gtgacttgcc 4020
tgtctgcctg cctgcctgcc gctttgcata agattcctct gtgttagtaa gagccactgt 4080
ttatttgtac tggtgcttac tctacttagt taattagcca ttagctataa aattccgttg 4140
atgttgcaag cttagcaatg gccacggtaa gaatgggaga gagaagttgg ctaaagctgt 4200
tgctttgtag tttgtactat atatgtgtct ttgtgttgca agatatgcaa ctcctactat 4260
gctgtgactt gagctcaagg ttttcagtta tctatagatc cttactacta ctgagcatac 4320
taccacttct gtatggtagc atatggtagc atagtccaag ttccaacgcc tcgccagttg 4380
ttcataatct atactaccac ttctgtgcat ttgttacttt tatttaatag tttgtctcat 4440
tagctgacaa gcatatgcct gttttgatat ctgcccctct tgtaatagtc tatggatagc 4500
ttggactgtt tgatgcttta attttttact agcaacactt agggcccctt tgaaatggag 4560
gattagcaaa ggaattttgg aggattcatt ttcctaagga ttttttccta tagagccctt 4620
tgattcatag aaagaggata ggaaaacttc cgtaggattg cattcctatg atcaattcca 4680
taggaaaata agcaagaggt tagacctctt gtgaaacttt cctttgttga gtgtatcttg 4740
tggtataatc aaagggctct tctctccatt tcatgtgttt tcaattcctg taggattgga 4800
aaaacataca acttcaattc ctacgttttt cctattccta tgtttttcct atcctgcgtt 4860
tcaaaggggc ccttaaggat gaagggaagt aagagaaaca tactagagaa tatgtagtag 4920
tatttctaca ttccatattt gtagcactag cccacaaata tctttgcctt gtacttactt 4980
cataccagtt cccccctttt cagagcaaac caacaatttc tgttgcctta tatatctagt 5040
gtcttcgtac taatatatct gttccaaaat gtacctgtcc aaattcatag ctagaaatag 5100
ctttatttag gacggaagta ataactgttg ttagagactt ggttcagact tttggttatg 5160
ttgaggctac tatcatttcc tttacgggcc aaattactac aaatgagaat tcataaaaat 5220
gtcaagattt tatgattgtt gtagctttat ttaggacgga ggtagtaatt gttgttagag 5280
acttggttca gacttttggt tacgttgaag ctactatcat ttcctttatg gtcaaattac 5340
taacaatgag tattcataaa aatgtcaaga ttttataatt gagctgtgcc agtgctaagt 5400
gtgtcactat ctgatgccat aatgcatcat tataaaagcc agatggacca ttagctttta 5460
tgtgtaggac acctgccgtc caattagatg gataaccatc tagtgtttgt gtactgttat 5520
tttaagcccg acatctcaca actccatgaa tgattacagt cttcctttca catggtgtcc 5580
ttttgttgtg ttaggaatag cattttttat ttatgggtgt aattatgaaa ggcactagga 5640
gagttgctgc tttatcttga tgggatttgt agtaatacca tctttaggat gacaagaaat 5700
cttgttctga gttagcatgg gctgcctttt gacctgagct acggtttgct atgtttggct 5760
tgcatcatgc agatctatta ggataataag catataaaag ttgcttgcat tgtgcattgc 5820
ttgttttacc ttgattcatg taggagtaat ttgctcgcca tgcctcgttt tgctttctga 5880
gtcaacagcc aaatttagat gatgtacctt ctgttgcttc aaaaactcag tcactgcaca 5940
gcagcagtgg ataggattca gaatcaatct atccatgatt ctctgttcac ataatatgac 6000
aggttccacc tgctgcctga atttgaccaa ggaaaacgca gctgccgcag acgccttgca 6060
ggtcataatg agcgccggag gaggccgcaa acccctttgg catcacgcta cggtcgacta 6120
gctgcatctg ttggtggtat catcagaggc tcttgttttc tttgcatctt gtgtgtttgt 6180
tggtaactac tggttgcatt cgctgatgtg ttgtttgttg cgattcttga tccagaagag 6240
catcgcaggt tcagaagctt tacgttggat ttctcctacc caagggttcc aagcagcgta 6300
aggaatgcat ggccagcaat tcaaccaggc gatcggatct ccggtggtat ccagtggcac 6360
aggaacgtag ctcctcatgg tcactctagt gcagtggcgg gatatggtgc caacacatac 6420
agcggccaag gtagctcttc ttcagggcca ccggtgttcg ctggcccaaa tctccctcca 6480
ggtggatgtc tcgcaggggt cggtgccgcc accgactcga gctgtgctct ctctcttctg 6540
tcaacccagc catgggatac tactacccac agtgccgctg ccagccacaa ccaggctgca 6600
gccatgtcca ctaccaccag ctttgatggc aatcctgtgg caccctccgc catggcgggt 6660
agctacatgg caccaagccc ctggacaggt tctcggggcc atgagggtgg tggtcggagc 6720
gtggcgcacc agctaccaca tgaagtctca cttgatgagg tgcaccctgg tcctagccat 6780
catgcccact tctccggtga gcttgagctt gctctgcagg ggaacggtcc agccccagca 6840
ccacgcatcg atcctgggtc cggcagcacc ttcgaccaaa ccagcaacac gatggattgg 6900
tctctgtaga ggctgttcca gctgccatcg atctgtcgtc ccgcaaggcg agtcatggaa 6960
ctgaagaacc tcatgctgcc tgcccttatt ttgtgttcaa attttccttt ccagtatgga 7020
aaggaaattc taaggtgact ggcgattaat ctccctgtga tgaataataa tgcgcgccct 7080
tgaactcaat taattgctgt gccgcatcca tctatgtaac tctccatgaa tttttaagta 7140
tcagtgttaa tgctgtattg tcgaggactt ctgctcgata tgttatttct cttatgttgt 7200
tcatcatgaa tctttttctg cttattattc tggtgccggg ttgtccttac cacagaagat 7260
tcagtttcgg ttggcgagag taaacacctt ccctggttgt gacaaaagct ccaacctttt 7320
cacttctcgg cctgtatttg atcttcccct tctgacgctg ttatactact tttaagcctg 7380
tatgtttcca gccttccagg tgaagggcca tactgaagag aaaacatgct ttcagggttt 7440
gatgcattgt gtactttaca agtgtactta agattttgta caatttatat atgtacctgc 7500
tctgctgctg agtattgtag gaaagaatca gttcgaaggg cgtgtgttca tgtaaagtga 7560
gaccacatgc acagcgtgga tttgcagcat gctctctgca ccagtggtgt tctgttgatg 7620
cctttgatgg gctggctgag gtgagaggag gatgatccat gttggcagct tcttcactct 7680
gaaaaataaa agagaagaaa tgttcagatt tgcagacaag tggagagcag tgatatattc 7740
tacaataaaa cattaccacc ttgcttttct gtgatgatag atactccatg gaattttgca 7800
tcaagcatct cttgttttcc agccactgtt tgctgggttg ttgcttcaat ttcgtcccaa 7860
ttgattggtc acctttggtt gtgacttgag agcactgagc actgaaactt ttgctgtcag 7920
caggcaatgc acctcatcca tgtcacgaca gagggagaga gcccacataa atggccaaag 7980
aggacacata cagtggcact gatgcagtca ttgcaacata attgacatca tgctaaacag 8040
tggtgtaacc atatgttagc tagcctgtga tcagcaaaca gtgattatgg atcttaatgt 8100
cacatgcaag atttgacaca gttgtaaaac catcattgca ttgaagatag atcccagcaa 8160
caggtgtatg atgtattgct agaatgaatc aaaaatatca gtgccatcct aaacacagta 8220
ctaccaactt gaacagttat caccgtgatt ggaaaacaga aatgtataat tgctttggcg 8280
ccatctgctt atcattatca tatgtcgcag atcacttgtt ccattgacac gactcttttt 8340
cactgtgagg agaggcacct tgatttggac ttttcaagag ctgtagcaag ggctcctttg 8400
aagccttcta catggaggag cagagcatac catatgcaga actgtaaact cttcctgaag 8460
ctttccagtt ccacccttgt agctttaagc tgccgcaaga gaattatcat ttctaacatt 8520
gagatgtgat actgaaatgt gaaaggtgat tcgcagtata ggtcccaaaa tatcgtttac 8580
agcaacttgc aaatcctgca tgatacagtt aattcatcaa aatattagac cattagtact 8640
acagtctaca aatacccctt aactgaacat gtatgataag gacaagattc tgaagctcca 8700
gtgcatcagg aatccaacgc agtatgcaaa tcattactga acaagattcc tgcacttaca 8760
gaatcatcac ctgttgtaac aaggaccatt ctttgttgcc ccagacacag cgaattaatg 8820
gtcatcttca tttggcccag gacattcatt tgccaatgct tctgctgatt catactgaaa 8880
aggggacaat gcgtccaatt ttaaaagcat ggaagatgct ataaaagatc accctattta 8940
aaatgcagag aaaaccaaag atccaacatg atatggtaat cacagattcc caacagtaat 9000
gccgtccagt aggcagtagg ggcatgcaca taaacactag tactatgtag agctgaagct 9060
tatttccaga atgaagctga ccttgcaacc gcaataaagg caatagtagt gttcatcgcg 9120
cagcttagcc aatatatttt gcaaatcctg caagaataaa cacaggtcaa tctcgtcctt 9180
tcagcaaaat ttgcagtctt gcataagatt tctcagataa aaaaggaagt ctagacaaga 9240
atatgaagga aagaatgtgc aaacataagt atattcataa ttcaaagttc gagctatttc 9300
cattgtcaca acataatatg tgtaaccaat agctggtaag catttacggt tagcccttca 9360
taggaaccaa ataggcacgg aggcaattgc gttactaata ccagttatca tgctcgtcac 9420
aatggaaaat tgtgatgaaa tgcctaaggt cctatgcaat atatccttta tttctatata 9480
gttacaaccc actagcagca tttatttcta aaaagctgct ccacatttac tcatgtcagc 9540
agcacatttg aaccattgga tcaatcgttc cgtgttgata aattgttgga tccccattat 9600
ctttgacagg cctacataca ttggaccatt agcttgccta cagaaagaaa taacaaggcc 9660
caaacttggt cacgtcccag ttgttacatc tgctctgcaa tcatattgca caggttccaa 9720
ccaagcagca acgcttcctg gtcatcatcc ctcgcatcct catgtgtatg tgttcagtct 9780
gtaccattga aacttttcta ttggtacagt actttgtcat atattaatta tcctttaatt 9840
gttctgtaca atcagaacct aagataggtg ctagttcagt tattggtgtt gtgggtatgg 9900
tcctggaatc attcactaac tatgcttaaa atttgtttga cgaaagccag agtgatgtta 9960
tgatactgtc gtcaattttc acctagaaag atgccaacca cacttgcttg ctcgttgcag 10020
atttagaact acgtaaagac ggtgcactgc tatatatctg aaaatatgtt atcaagtatc 10080
tttgcaggaa tattcttctt ctgtgcatga cttccaagtg gttaatcatt attttcacat 10140
gtttcatata gcatgtaatg aactaaaaac atatattatt ttattatata tctaattgca 10200
aattacgtta ggacgatgat gttttttgcc gttattgaac acaaaag 10247
<210> 2
<211> 1257
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atggagatgg ccagtggagg aggcgccgcc gccgccgccg gcggcggagt aggcggcagc 60
ggcggcggtg gtggtggagg ggacgagcac cgccagctgc acggtctcaa gttcggcaag 120
aagatctact tcgaggacgc cgccgcggca gcaggcggcg gcggcactgg cagtggcagt 180
ggcagcgcga gcgccgcgcc gccgtcctcg tcttccaagg cggcgggtgg tggacgcggc 240
ggagggggca agaacaaggg gaagggcgtg gccgcggcgg cgccaccgcc gccgccgccg 300
ccgccgcggt gccaggtgga ggggtgcggc gcggatctga gcgggatcaa gaactactac 360
tgccgccaca aggtgtgctt catgcattcc aaggctcccc gcgtcgtcgt cgccggcctc 420
gagcagcgct tctgccagca gtgcagcagg ttccacctgc tgcctgaatt tgaccaagga 480
aaacgcagct gccgcagacg ccttgcaggt cataatgagc gccggaggag gccgcaaacc 540
cctttggcat cacgctacgg tcgactagct gcatctgttg gtgaagagca tcgcaggttc 600
agaagcttta cgttggattt ctcctaccca agggttccaa gcagcgtaag gaatgcatgg 660
ccagcaattc aaccaggcga tcggatctcc ggtggtatcc agtggcacag gaacgtagct 720
cctcatggtc actctagtgc agtggcggga tatggtgcca acacatacag cggccaaggt 780
agctcttctt cagggccacc ggtgttcgct ggcccaaatc tccctccagg tggatgtctc 840
gcaggggtcg gtgccgccac cgactcgagc tgtgctctct ctcttctgtc aacccagcca 900
tgggatacta ctacccacag tgccgctgcc agccacaacc aggctgcagc catgtccact 960
accaccagct ttgatggcaa tcctgtggca ccctccgcca tggcgggtag ctacatggca 1020
ccaagcccct ggacaggttc tcggggccat gagggtggtg gtcggagcgt ggcgcaccag 1080
ctaccacatg aagtctcact tgatgaggtg caccctggtc ctagccatca tgcccacttc 1140
tccggtgagc ttgagcttgc tctgcagggg aacggtccag ccccagcacc acgcatcgat 1200
cctgggtccg gcagcacctt cgaccaaacc agcaacacga tggattggtc tctgtag 1257
<210> 3
<211> 418
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 3
Met Glu Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly
1 5 10 15
Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Glu His Arg Gln
20 25 30
Leu His Gly Leu Lys Phe Gly Lys Lys Ile Tyr Phe Glu Asp Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Ser
50 55 60
Ala Ala Pro Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Ala Gly Gly Gly Arg Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Lys Asn Lys Gly Lys Gly Val Ala Ala Ala Ala Pro Pro
85 90 95
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Cys Gln Val Glu Gly Cys Gly Ala Asp
100 105 110
Leu Ser Gly Ile Lys Asn Tyr Tyr Cys Arg His Lys Val Cys Phe Met
115 120 125
His Ser Lys Ala Pro Arg Val Val Val Ala Gly Leu Glu Gln Arg Phe
130 135 140
Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Leu Leu Pro Glu Phe Asp Gln Gly
145 150 155 160
Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu Ala Gly His Asn Glu Arg Arg Arg
165 170 175
Arg Pro Gln Thr Pro Leu Ala Ser Arg Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Ser
180 185 190
Val Gly Glu Glu His Arg Arg Phe Arg Ser Phe Thr Leu Asp Phe Ser
195 200 205
Tyr Pro Arg Val Pro Ser Ser Val Arg Asn Ala Trp Pro Ala Ile Gln
210 215 220
Pro Gly Asp Arg Ile Ser Gly Gly Ile Gln Trp His Arg Asn Val Ala
225 230 235 240
Pro His Gly His Ser Ser Ala Val Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Thr Tyr
245 250 255
Ser Gly Gln Gly Ser Ser Ser Ser Gly Pro Pro Val Phe Ala Gly Pro
260 265 270
Asn Leu Pro Pro Gly Gly Cys Leu Ala Gly Val Gly Ala Ala Thr Asp
275 280 285
Ser Ser Cys Ala Leu Ser Leu Leu Ser Thr Gln Pro Trp Asp Thr Thr
290 295 300
Thr His Ser Ala Ala Ala Ser His Asn Gln Ala Ala Ala Met Ser Thr
305 310 315 320
Thr Thr Ser Phe Asp Gly Asn Pro Val Ala Pro Ser Ala Met Ala Gly
325 330 335
Ser Tyr Met Ala Pro Ser Pro Trp Thr Gly Ser Arg Gly His Glu Gly
340 345 350
Gly Gly Arg Ser Val Ala His Gln Leu Pro His Glu Val Ser Leu Asp
355 360 365
Glu Val His Pro Gly Pro Ser His His Ala His Phe Ser Gly Glu Leu
370 375 380
Glu Leu Ala Leu Gln Gly Asn Gly Pro Ala Pro Ala Pro Arg Ile Asp
385 390 395 400
Pro Gly Ser Gly Ser Thr Phe Asp Gln Thr Ser Asn Thr Met Asp Trp
405 410 415
Ser Leu
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcaattca accaggcgat cgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggatgtc tcgcaggggt cgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacgctgcc atggccgccc tgg 23
<210> 7
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcaauuca accaggcgau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 8
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gguggauguc ucgcaggggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 9
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcacgcugcc auggccgccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 10
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagcaattca accaggcgat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttt 106
<210> 11
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtggatgtc tcgcaggggt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttt 106
<210> 12
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcacgctgcc atggccgccc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttt 106
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcgcagcaa ttcaaccagg cgat 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacatcgcc tggttgaatt gctg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcgggtgga tgtctcgcag gggt 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaacacccct gcgagacatc cacc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggcggcacgc tgccatggcc gccc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaacgggcgg ccatggcagc gtgc 24
Claims (3)
1.一种植物育种方法,其特征在于,所述植物育种为培育产量更高的水稻,包括如下步骤:
1)选定一个待编辑基因IPA1基因,所述IPA1基因为水稻基因组中核苷酸序列为序列1所示的DNA;
2)设计靶向待编辑基因的蛋白编码区及基因表达调控区的靶点,在设计时需排除可能同时靶向基因组其他位置序列的靶点,并根据使用的Cas9核酸酶的类型选择PAM序列;
3)根据设计的靶点利用单碱基编辑CRISPR***制备构建体,所述构建体为如下A1)、A2)或A3):
A1)所述构建体为表达gRNA的构建体T1,所述gRNA的靶位点为序列4所示的DNA;
所述构建体T1为重组pnCas9-PBE载体,所述gRNA的序列为序列7,所述构建体T1含有编码序列为序列10的gRNA的编码基因;
A2)所述构建体为表达gRNA的构建体T2,所述gRNA的靶位点为序列5所示的DNA;
所述构建体T2为重组pnCas9-PBE载体,所述gRNA的序列为序列8,所述构建体T2含有编码序列为序列11的gRNA的编码基因;
A3)所述构建体为表达gRNA的构建体T3,所述gRNA的靶位点为序列6所示的DNA,所述gRNA的序列为序列9,所述构建体T3含有编码序列为序列12的gRNA的编码基因;
4)利用步骤3)中的构建体制备转基因作物,作为一代植株;
5)筛选步骤4)中的一代植株或其后代中基因组纯合编辑的植株作为亲本育种,其中,利用构建体T1编辑的水稻分蘖数更多、株高较低;利用构建体T2编辑的水稻单穗谷粒数更多、株高相近;利用构建体T3编辑的水稻分蘖数更多、株高相近。
2.根据权利要求1所述的植物育种方法,其特征在于,
所述A1)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列10所示的DNA并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体;
所述A2)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列11所示的DNA并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体;
所述A3)为在pnCas9-PBE载体BsaI识别位点处***序列12所示的DNA并保持pnCas9-PBE载体其他部分的序列不变的重组载体。
3.权利要求1-2中任一所述的构建体在植物育种中的应用,所述植物育种为培育产量更高的植物。
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CN201911093561.XA CN112779265B (zh) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | 一种对植物特定基因进行饱和碱基编辑的育种方法 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Family Cites Families (4)
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