CN112779207A - 一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，该方法包括：(1)摇瓶培养筛选：将活化后的亲本灵芝菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出生物活性指标与亲本相当的摇瓶发酵液备用；(2)平板培养筛选：将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液复接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；(3)摇瓶培养验证：将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株。应用本发明的方法可有效解决灵芝菌株在液态培养的传代过程中导致的菌种退化，菌种活力弱，菌种质量差的问题，为灵芝菌株的液态规模化可持续性发酵生产提供了菌种保障。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种选育技术领域，具体的说涉及一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法。
背景技术
灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国名贵的药用真菌之一。始载于汉代《神农本草经》，具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。近年来，灵芝得到国内和国外许多学者的深入研究。现阶段获取灵芝活性成分材料的方法有三种，一是野外子实体或人工栽培的子实体，二是灵芝孢子，三是发酵菌丝体和发酵液。与人工栽培灵芝相比，通过发酵技术生产灵芝活性物质具有菌丝增殖速度快，不受季节影响、生产周期短、活性成分含量相对稳定等特点，现已成为获取质量稳定的灵芝活性物质的一种新型而重要的技术手段，得到了国内外学者们的广泛关注。
近年来，灵芝液态深层发酵研究大多集中在发酵培养基，发酵条件优化和发酵产物特性及成分的分析等方面，注重于提高灵芝多糖等活性物质的产量，对适用于液态发酵专用灵芝菌株的研究较少。目前，灵芝液态发酵用菌株多是通过自然选育的，许多灵芝菌株的性状不稳定，在经过几代传代培养后容易退化、老化，使得这些灵芝菌株的优质性状很难长久保持。
因此，目前迫切需要一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，该方法包括如下步骤：
(1)摇瓶培养筛选：
将活化后的亲本菌株的灵芝菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出生物活性指标与亲本相当的摇瓶发酵液备用；
其中，摇瓶培养基的配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8；
(2)平板培养筛选：
将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液反接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；
其中，平板培养基的配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8，琼脂10-20；或使用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)平板；
生长速度是指灵芝菌丝体长满平板所用的时间；
(3)摇瓶培养验证：
将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株；
其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8；
传代稳定是指每传一次的菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率的波动范围在10％以内；
其中上述步骤(1)、(2)、(3)中的生物活性指标均包括菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率。
其中亲本菌株来源：选择传代次数少于3次的保藏灵芝菌株。其中，灵芝保藏菌株来自于组织分离获得的原始灵芝菌株，传代次数少于3次(包括3次)。
具体的说，本发明的液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养筛选：
将活化后的灵芝亲本菌株的菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出菌丝体得率和底物葡萄糖利用率高的摇瓶发酵液备用；
其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉4，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁2；
(2)平板培养筛选：
将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液反接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；
其中，平板培养基使用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)；
生长速度是指灵芝菌丝体长满平板所用的时间；
(3)摇瓶培养验证：
将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株；
其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉4，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁2；
传代稳定指标是指每传一次的菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率的波动范围在10％以内；
其中上述步骤(1)、(2)、(3)中的生物活性指标均包括菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率。
本发明液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，优点在于通过该方法复壮的灵芝菌株，菌丝体得率和底物葡萄糖利用率稳定且与亲本相当，连续传代10次波动范围小于10％。
本发明的有益效果：
本发明的液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，可有效解决灵芝菌株在液态培养的传代过程中导致的菌种退化，菌种活力弱，菌种质量差的问题，提高灵芝菌株液态发酵的菌丝体得率，底物利用率，产物得率，降低污染率，为灵芝菌株的液态规模化可持续性发酵生产提供了菌种保障。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，该方法包括如下步骤：
(1)摇瓶培养筛选：
将活化后的灵芝亲本菌株的菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出菌丝体得率和底物葡萄糖利用率高的摇瓶发酵液备用；
其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉4，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁2；
(2)平板培养筛选：
将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液反接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；
其中，平板培养基使用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)；
生长速度是指灵芝菌丝体长满平板所用的时间；
生物活性指标包括菌丝体干重得率和底物葡萄糖利用率稳定；
(3)摇瓶培养验证：
将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标(菌丝体干重得率和底物葡萄糖利用率)与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株；
其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖20，酵母粉4，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁2；
传代稳定指标是指每传一次的菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率的波动范围在10％以内。
实施例1
亲本灵芝菌株：Ganoderma lucidum G0119(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏编号：HunongLingzhi No.1)，已在[Biotechnology and BioprocessEngineering 2014年第19卷第4期727-732]公开。
通过该方法复壮后的灵芝菌株，如表1结果所示，复壮前菌丝体干重得率(15.12±0.21)g/L，底物利用率(64.62±2.02)％，平板生长速度(6.39±0.30)mm/d，复壮后菌丝体干重得率(15.40±0.18)g/L，底物利用率(66.11±1.60)％，平板生长速度(6.42±0.21)mm/d。复壮前后菌丝体得率和底物葡萄糖利用率稳定，连续传代12次波动范围小于8％。
实施例2
亲本灵芝菌株：G.lucidum G0017(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏编号：G.lucidum G0017)，已在[International Journal of MedicinalMushrooms 2021年第23卷第3期43-53]公开。
通过该方法复壮的灵芝菌株，如表1结果所示，复壮前菌丝体干重得率(13.28±0.26)g/L，底物利用率(73.33±2.21)％，平板生长速度(5.89±0.08)mm/d，复壮后菌丝体干重得率(14.02±0.24)g/L，底物利用率(78.05±2.32)％，平板生长速度(5.99±0.06)mm/d。复壮前后菌丝体得率和底物葡萄糖利用率稳定，连续传代14次波动范围小于9％。
实施例3
亲本灵芝菌株：G.lucidum(由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，保藏编号longzhi no.2)，已在[食用菌学报2020年第27卷第2期84-91]公开。
通过该方法复壮的灵芝菌株，如表1结果所示，复壮前菌丝体干重得率(12.25±0.12)g/L，底物利用率(73.33±2.2)％，平板生长速度(5.53±0.30)mm/d，复壮后菌丝体干重得率(12.98±0.24)g/L，底物利用率(77.65±2.38)％，平板生长速度(5.73±0.18)mm/d。复壮前后菌丝体得率和底物葡萄糖利用率稳定，连续传代11次波动范围小于7％。
实施例1-3中，灵芝菌株复壮前后的生物活性指标的比较见如下表1：
表1实施例中复壮前后结果比较
Claims (3)
1.一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)摇瓶培养筛选：
将活化后的亲本菌株的灵芝菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出生物活性指标与亲本相当的摇瓶发酵液备用；
(2)平板培养筛选：
将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液反接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；
(3)摇瓶培养验证：
将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株。
2.根据权利要求1所述的液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，其中，步骤(1)和步骤(3)中摇瓶培养基的配方如下：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8；单位：g/L；步骤(2)中平板培养基的配方如下：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8，琼脂10-20；或使用马铃薯葡萄糖琼脂平板；单位：g/L。
3.根据权利要求1所述的液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，其中所述的生物活性指标包括菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率；所述的生长速度是指灵芝菌丝体长满平板所用的时间；所述的传代稳定是指每传一次的菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率的波动范围在10％以内。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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