CN112771066A - 可活化抗体及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了含有编码可活化结合多肽的合成多核苷酸的文库。本文还提供了可活化结合多肽和含有所述可活化结合多肽的多肽文库。本文还提供了制备和使用可活化多肽文库的载体、载体文库、细胞、试剂盒和方法。

Description

可活化抗体及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年2月2日提交的国际申请号PCT/CN2018/075065的优先权权益，所述国际申请以引用的方式整体并入本文。
采用ASCII文本文件进行的序列表提交
采用ASCII文本文件进行的以下提交的内容以引用的方式整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：695402000641SEQLIST.TXT，记录日期：2019年1月31日，大小：54KB)。
技术领域
本公开涉及可用于筛选和/或鉴定一种或多种精准/情形依赖性可活化结合多肽(例如可活化抗体)的多核苷酸和多核苷酸文库，以及可用于筛选和/或鉴定精准/情形依赖性可活化结合多肽(例如当呈活性形式时能够结合CTLA4或CD137的可活化抗体)的多肽和多肽文库，与它们相关的细胞、方法和试剂盒。
背景技术
可活化结合多肽展现“可活化”构象，以致相比于在一种或多种特异性蛋白酶存在下进行裂解之后，当未裂解时，所述可活化结合多肽中含有的抗原结合部分较不易于结合它的靶标。因此，这些可活化结合多肽提供仅能够在某些情形下(例如在富含蛋白酶的肿瘤微环境中)结合它们的靶标的抗原特异性结合蛋白。尽管已开发许多令人关注的可活化结合多肽，但开发所述蛋白质的过程是缓慢的，劳动密集的以及昂贵的。因此，存在对可用于鉴定用于可活化结合多肽的自阻断肽的改进方法和产品的需要。
本文引用的所有参考资料，包括专利申请、专利公布、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot/GenBank登录号，都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和单独地指出将每个单独的参考资料以引用的方式并入一样。
发明内容
为满足以上和其他需要，本文公开了例如可用于筛选和/或鉴定可活化结合多肽(即可活化抗体)的多核苷酸的文库。本公开至少部分地基于发现本文所述的多肽在活化之前显示显著改进的掩蔽效率，从而允许更好设计、筛选和/或鉴定具有优越治疗指数和安全性概况的可活化结合多肽(即可活化抗体)。本公开还至少部分地基于惊人地发现可成功构建和筛选本文所述的多核苷酸文库以鉴定可活化结合多肽(参见以下实施例1和实施例2)。本文公开了当呈活性形式而非呈非活性形式时结合人CTLA4(参见实施例3)或人CD137(参见实施例5)的精准/情形依赖性可活化结合多肽，即它们仅在裂解可裂解部分(CM)以移除第一肽(FP)(即掩蔽部分(MM)或自阻断肽)之后结合它们的靶标(当呈活性形式时)。本文所述的所发现的第一肽(FP)(例如掩蔽部分)能够高效掩蔽抗体活性和/或降低或完全抑制抗原结合，同时在一些实施方案中，没有化学不稳定残基甲硫氨酸和/或色氨酸。此外，使用本文所述的多核苷酸文库鉴定的可活化抗体在治疗多种癌症类型方面与它们的亲本抗体同样高效，同时甚至在易感动物(NOD小鼠，参见实施例4)中也具有显著降低的细胞毒性。
因此，在一个方面，本文提供了一种包含多核苷酸的文库，其中所述多核苷酸中的至少一者编码从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少十种、至少50种、至少100种、至少500种、至少1000种独特多肽，并且每种独特多肽从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，FP由包含根据式(XIV)：(NNK)mTGY(NNK)nTGY(NNK)o(SEQ ID NO:87)的核酸序列的多核苷酸序列编码，其中每个N都独立地是A、G、T或C，其中每个K都独立地是T或G，并且其中每个Y都独立地是T或C。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，m是6。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，m是2-5，例如2、3、4或5。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，n是6-8。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，n是6。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，o是1-2。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，o是2。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，FP还在它的N末端包含额外氨基酸序列。在一些实施方案中，额外氨基酸序列包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(urokinase-typeplasminogen activator，uPA)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶(Thrombin)、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D(CathepsinD)、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1(Caspase-1)、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，CM还在第一裂解位点的C末端包含第一接头(L1)。在一些实施方案中，L1包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，CM还包含第二裂解位点。在一些实施方案中，第二裂解位点在L1的C末端。在一些实施方案中，第二裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在一些实施方案中，第一裂解位点和第二裂解位点是不同的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，CM还在第二裂解位点的C末端包含第二接头(L2)。在一些实施方案中，L2包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，CM还在第一裂解位点的N末端包含接头。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，由文库中的一种或多种多核苷酸编码的多肽包含含有根据式(III)：EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的第一肽(FP)和可裂解部分(CM)，其中X1是A、D、I、N、P或Y，X2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码包含根据式(III)的氨基酸序列的多肽。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，多肽包含选自由SEQ ID NO:25-46组成的组的氨基酸序列。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，TBM包含抗体轻链可变区。在一些实施方案中，TBM还在轻链可变区的C末端包含重链可变区。在一些实施方案中，文库还包含编码一种或多种抗体重链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区形成能够在不存在掩蔽部分(MM)下结合靶标的抗原结合位点。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，TBM包含抗体重链可变区。在一些实施方案中，TBM还在重链可变区的C末端包含轻链可变区。在一些实施方案中，文库还包含编码一种或多种抗体轻链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区形成能够在不存在掩蔽部分(MM)下结合靶标的抗原结合位点。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，多核苷酸中的编码多肽的至少一者处于载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体或展示载体。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，多核苷酸中的编码多肽的至少一者处于细胞中。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本公开的其他方面涉及一种产生可活化抗体的方法，所述方法包括在适于产生所述可活化抗体的条件下培养本文所述的任何细胞。在一些实施方案中，方法还包括回收由细胞产生的可活化抗体。在一些实施方案中，方法还包括测试可活化抗体在可溶的同时维持可活化表型的能力。
本公开的其他方面涉及一种使用本文所述的任何文库来筛选结合靶标的可活化抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在使CM裂解之前使文库的表达产物与所述靶标接触，b)在使CM裂解之后使文库的表达产物与所述靶标接触，和c)分离表达产物中的在使CM裂解之后结合所述靶标，但在使CM裂解之前不结合所述靶标的一者或多者。此处还提供了一种使用本文所述的任何文库来筛选结合靶标的可活化抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在使CM裂解之前使文库的表达产物与所述靶标接触，b)在使CM裂解之后使文库的表达产物与所述靶标接触，和c)分离表达产物中的在使CM裂解之后结合所述靶标，但相较于在使CM裂解之后的结合亲和力，在使CM裂解之前对所述靶标的结合亲和力降低的一者或多者。在一些实施方案中，如果在使CM裂解之前表达产物的KD是在使CM裂解之后所述表达产物的KD的至少2倍(例如至少5倍、至少10倍、至少15倍或更高)，那么分离所述表达产物。在一些实施方案中，CM包含至少第一蛋白酶裂解位点，所述第一蛋白酶裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在一些实施方案中，靶标是CTLA4、CD137、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、OX40、CD3、CD19、CD20、CD40、CD95、CD120a、BTLA、VISTA、ICOS、BCMA、Her1、Her2、Her3和/或B7-H4。在一些实施方案中，靶标是CTLA4或CD137。
本公开的其他方面涉及一种由本文所述的任何文库的一种或多种多核苷酸编码的多肽，或一种具有由本文所述的任何文库的一种或多种多核苷酸编码的多肽的文库。
本公开的其他方面涉及一种包含本文所述的任何文库的试剂盒。
本公开的其他方面涉及一种包含抗原结合结构域的文库，其中所述抗原结合结构域中的至少一者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少十者、至少50者、至少100者、至少1000者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的独特多肽，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，抗原结合结构域中的每一者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的独特多肽，其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，TBM包含抗体轻链可变区，并且抗原结合结构域还包含抗体重链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，TBM包含抗体重链可变区，并且抗原结合结构域还包含抗体轻链可变区。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)中的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，文库中的抗原结合结构域中的每一者展示在噬菌体或细胞(例如酵母细胞)上。
本公开的其他方面涉及一种包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽的抗体轻链，其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区。本公开的其他方面涉及一种包含重链和轻链的抗体，其中所述轻链是本文所述的任何抗体轻链。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)中的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
本公开的其他方面涉及一种包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽的抗体重链，其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体重链可变区。本公开的其他方面涉及一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链是本文所述的任何抗体重链。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(XIII)中的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
本公开的其他方面涉及一种包含至少一种展示在它的表面上的多肽的细胞，其中所述至少多肽从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
本公开的其他方面涉及一种可活化抗体，所述可活化抗体包含：多肽，所述多肽从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中当所述CM未被裂解时，所述MM抑制所述可活化抗体与人CTLA4的结合；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)和/或抗体重链可变区(VH)；并且其中当所述CM被裂解时，所述可活化抗体通过所述VH和所述VL结合人CTLA4。在一些实施方案中，TBM包含VL，并且可活化抗体还包含VH。在一些实施方案中，TBM包含VH，并且可活化抗体还包含VL。在一些实施方案中，TBM从N末端至C末端包含VH和VL或VL和VH。在一些实施方案中，CM包含至少第一蛋白酶裂解位点，并且以一种或多种选自由以下组成的组的蛋白酶加以裂解：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，MM包含选自由SEQ ID NO:72-78组成的组的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VL包含含有SEQID NO:62的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ IDNO:64的氨基酸序列的HVR-L3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，m是3-10。
本公开的其他方面涉及一种可活化抗体，所述可活化抗体包含：多肽，所述多肽从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中当所述CM未被裂解时，所述MM抑制所述可活化抗体与人CD137的结合；其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)和/或抗体重链可变区(VH)；并且其中当所述CM被裂解时，所述可活化抗体通过所述VH和所述VL结合人CD137。在一些实施方案中，TBM包含VL，并且可活化抗体还包含VH。在一些实施方案中，TBM包含VH，并且可活化抗体还包含VL。在一些实施方案中，TBM从N末端至C末端包含VH和VL或VL和VH。在一些实施方案中，CM包含至少第一蛋白酶裂解位点，并且以一种或多种选自由以下组成的组的蛋白酶加以裂解：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，MM包含选自由SEQ ID NO:79-85以及88-94组成的组的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VL包含含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，m是3-10。
本公开的其他方面涉及一种编码本文所述的任何可活化抗体的多核苷酸。在其他方面，本公开涉及一种包含本文所述的任何多核苷酸(例如编码可活化抗体的多核苷酸)的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体和/或展示载体。在其他方面，本公开涉及一种包含本文所述的任何多核苷酸和/或载体(例如编码可活化抗体的多核苷酸和/或载体)的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在其他方面，本公开涉及一种制备可活化抗体的方法，所述方法包括在适于产生所述抗体或可活化抗体的条件下培养本文所述的任何宿主细胞。在一些实施方案中，方法还包括回收由细胞产生的抗体或可活化抗体。
本公开的其他方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症或延迟所述癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的由一种或多种来自本文所述的任何文库的多核苷酸编码的多肽和/或本文所述的任何可活化抗体(例如针对人CTLA4的可活化抗体或针对人CD137的可活化抗体)。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用有效量的至少一种额外治疗剂。在一些实施方案中，至少一种额外治疗剂选自由病毒基因疗法、免疫检查点抑制剂、靶向疗法、放射疗法和化学疗法组成的组。在一些实施方案中，至少一种额外治疗剂选自由以下组成的组：泊马莱斯特(pomalyst)、雷利米德(revlimid)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、DNA烷基化含铂衍生物顺铂(cisplatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、抗CD137抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗DR5抗体、抗CD1d抗体、抗TIM3抗体、抗SLAMF7抗体、抗KIR受体抗体、抗OX40抗体、抗HER2抗体、抗ErbB-2抗体、抗EGFR抗体、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕母单抗(pembrolizumab)、放射疗法、单次剂量放射、分次放射、局灶性放射、全器官放射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受体、继承性转移的T细胞、抗癌疫苗和溶瘤性病毒。
应了解，以上以及本文中所述的各种实施方案的性质中的一者、一些或全部可加以组合以形成本公开的其他实施方案。本公开的这些和其他方面将变得为本领域技术人员显而易知。本公开的这些和其他实施方案通过随后具体实施方式来进一步描述。
附图说明
图1显示使用靶标抗体的在酵母表面上展示的Fab片段进行的对自阻断肽的一示例性选择过程的示意图。
图2显示使用靶标抗体的在酵母表面上展示的scFv片段进行的对自阻断肽的一示例性选择过程的示意图。
图3A-图3B显示靶向CTLA4的Fab和scFv在酵母上的功能性展示，如通过流式细胞计量术所测定。图3A显示靶向CTLA4的Fab在酵母的表面上的功能性展示。图3B显示靶向CTLA4的scFv在酵母的表面上的功能性展示。
图4显示对靶向人CTLA4的可活化抗体的一示例性选择过程。使展示融合蛋白的酵母文库经受若干轮基于FACS的筛选。
图5A-图5B显示示例性CTLA4可活化抗体克隆的CTLA4结合亲和力，如通过流式细胞计量术所测定。图5A显示相较于靶标抗体的不具有掩蔽肽的scFv片段，呈scFv形式的CTLA4可活化抗体克隆的结合亲和力，包括CTLA4可活化抗体克隆B13287的掩蔽肽保持完整的情况，或掩蔽肽由TEV蛋白酶裂解的情况。图5B显示相较于靶标抗体的不具有掩蔽肽的Fab片段，呈Fab形式的CTLA4可活化抗体克隆的CTLA4结合亲和力，包括CTLA4可活化抗体克隆B13189的掩蔽肽保持完整的情况，或掩蔽肽由TEV蛋白酶裂解的情况。
图6A-图6B显示相较于亲本抗体TY21580，示例性CTLA4可活化抗体TY22401、TY22403、TY22402和TY22404的掩蔽效率。图6A显示相较于亲本抗体TY21580，所指示可活化抗体的缔合和解离曲线，如通过ForteBio***所测定。图6B显示相较于亲本抗体TY21580，结合的可活化抗体的相对比率的图。
图7A-图7C显示针对重组人CTLA4-Fc的示例性CTLA4可活化抗体的掩蔽效率，如通过ELISA所测定。图7A显示指示相较于亲本抗体TY21580，CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402、TY22403、TY22404与重组人CTLA4-Fc的结合的第一批ELISA数据。图7B显示指示相较于亲本抗体TY21580，CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402、TY22403、TY22404与重组人CTLA4-Fc的结合的第二批ELISA数据。图7C显示相较于亲本抗体TY21580，CTLA4可活化抗体TY22563、TY22564、TY22565、TY22566与重组人CTLA4-Fc的结合。
图8A-图8B显示在移除掩蔽肽后，CTLA4可活化抗体TY22404的活性。图8A显示不进行处理，用蛋白酶uPA处理，或用5或10单位的蛋白酶MMP-9处理的可活化抗体TY22404的SDS-PAGE结果。图8B显示相较于亲本抗体TY21580，不进行处理，用蛋白酶uPA处理，或用蛋白酶MMP-9处理的可活化抗体TY22404的结合，通过ELISA所测定。
图9A-图9C显示在加速应激条件下，示例性可活化抗体的尺寸排阻色谱(SEC)概况。图9A显示相较于对照条件，在六个冷冻和解冻循环之后，可活化抗体TY22402的SEC概况。图9B显示相较于对照条件，在50℃下七天之后，可活化抗体TY22402的SEC概况。图9C显示相较于对照条件，在50℃下七天之后，在40℃下储存多达28天之后，或在六个冷冻和解冻循环之后，示例性可活化抗体的SEC主峰面积的百分比。
图10显示在约8mg/mL下或在>150mg/mL下储存之后，可活化抗体TY22401和TY22402的SEC主峰面积的百分比。
图11显示在pH 3.7下孵育30分钟或在pH 3.7下孵育1小时的未处理可活化抗体TY21580、TY22401、TY22402和TY22566的掩蔽效率，如通过ForteBio***所测定。
图12A-图12B显示由同种型对照抗体、亲本抗体TY21580或示例性CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402或TY22404达成的人外周血液单核细胞(PBMC)活化，如通过ELISA所测量。图12A显示对从用同种型对照抗体、亲本抗体TY21580和示例性CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402或TY22404刺激的CD3经致敏人PBMC进行的IL-2分泌的影响。图12B显示对从用同种型对照抗体、亲本抗体TY21580和示例性CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402或TY22404刺激的CD3经致敏人PBMC进行的IFNγ分泌的影响。
图13显示同种型对照抗体、亲本抗体TY21580或示例性可活化抗体TY22401、TY21580或TY22404对短暂过度表达人CTLA4的HEK293F细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，如通过ADCC报告基因测定所测定。
图14A-图14B显示亲本抗体TY21580、同种型对照抗体或示例性CTLA4可活化抗体TY22401、TY22402或TY22566在MC38同种同基因小鼠结肠直肠肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。图14A显示携带经MC38建立肿瘤的雌性C57BL/6小鼠的不同治疗组的肿瘤生长曲线。数据点代表组平均值；误差棒代表SEM。图14B显示用TY21580、TY22401、TY22402和TY22566治疗的组的单个肿瘤生长曲线。
图15显示同种型对照抗体、亲本抗体TY21580或三种可活化抗体中的一者在CT26同种同基因小鼠结肠直肠肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。显示了携带经CT26建立肿瘤的雌性C57BL/6小鼠的不同治疗组的肿瘤生长曲线。数据点代表组平均值；误差棒代表SEM。
图16显示同种型对照抗体、亲本抗体TY21580或三种可活化抗体中的一者在H22同种同基因小鼠肝肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。显示了携带经H22建立肿瘤的雌性C57BL/6小鼠的不同治疗组的肿瘤生长曲线。数据点代表组平均值；误差棒代表SEM。
图17A-图17B显示亲本抗体TY21580、同种型对照抗体和示例性可活化抗体TY22401、TY22402或TY22566在3LL同种同基因小鼠肺肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。图17A显示携带经3LL建立肿瘤的雌性C57BL/6小鼠的不同治疗组的肿瘤生长曲线。数据点代表组平均值；误差棒代表SEM。图17B显示用TY21580、TY22401、TY22402和TY22566治疗的组的单个肿瘤生长曲线。
图18A-图18C显示在10mg/kg的浓度下向雌性BALB/c小鼠静脉内施用的测试物品(TA)的血液浓度的时程，如通过ELISA所测定。图18A显示相较于亲本抗体TY21580，在10mg/kg的浓度下向雌性BALB/c小鼠静脉内施用的可活化抗体TY22401的血液浓度的时程。图18B显示相较于亲本抗体TY21580，在10mg/kg的浓度下向雌性BALB/c小鼠静脉内施用的可活化抗体TY22402的血液浓度的时程。图18C显示相较于亲本抗体TY21580，在10mg/kg的浓度下向雌性BALB/c小鼠静脉内施用的可活化抗体TY22404的血液浓度的时程。
图19显示使用NOD小鼠模型，同种型对照抗体、亲本抗体TY21580和示例性可活化抗体TY22566、TY22401和TY22402的重复给药毒性。显示了每个处理组的历经20天的存活率百分比。
图20A-图20B显示靶向人CD137的Fab和scFv在酵母上的功能性展示，如通过流式细胞计量术所测定。图20A显示靶向CD137的scFv在酵母的表面上的功能性展示。图20B显示靶向CD137的Fab在酵母的表面上的功能性展示。
图21显示对靶向人CD137的可活化抗体的一示例性选择过程。使展示融合蛋白的酵母文库经受若干轮基于FACS的筛选。
图22A-图22B显示示例性CD137可活化抗体克隆的CD137结合亲和力，如通过流式细胞计量术所测定。图22A显示相较于靶标抗体的不具有掩蔽肽的scFv片段，呈scFv形式的CD137可活化抗体克隆的结合亲和力，包括CD137可活化抗体克隆B13428的掩蔽肽保持完整的情况，或掩蔽肽由TEV蛋白酶裂解的情况。图22B显示相较于靶标抗体的不具有掩蔽肽的scFv片段，呈scFv形式的CD137可活化抗体克隆的CD137结合亲和力，包括CD137可活化抗体克隆B13439的掩蔽肽保持完整的情况，或掩蔽肽由TEV蛋白酶裂解的情况。
图23显示相较于亲本抗体TY21242，针对人CD137的示例性可活化抗体的掩蔽效率，通过流式细胞计量术所测定。
图24A和图24B描绘相较于亲本抗体TY21580，含有可变长度的掩蔽肽的示例性可活化抗体的掩蔽效率。使用基于ELISA的方法测定掩蔽效率。图24A和图24B代表使用相同实验方法来测试各种可活化抗CTLA4抗体的两种实验设置。
图25描绘相较于亲本抗体TY21580，含有不同长度的裂解肽的示例性可活化抗体的掩蔽效率。使用基于ELISA的方法测定掩蔽效率。
具体实施方式
I.一般性技术
本文中描述或参考的技术和程序通常由本领域技术人员所充分了解，并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用，所述方法诸如像以下中描述的广泛利用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编,(2003))；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))；Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual以及Animal CellCulture(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.LippincottCompany,1993)。
II.定义
在详细描述本公开之前，应了解本公开不限于毫无疑问可变化的特定组合物或生物***。还应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
如本文所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“一个(种)分子”任选地包括两个(种)或更多个(种)所述分子的组合，以此类推。
如本文所用的术语“约”是指相应值的易于为本技术领域中的熟练人士所知的通常误差范围。在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关那个值或参数本身的实施方案。
应了解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”以及“基本上由……组成”方面和实施方案。
如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括A与B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，如本文在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构，但C末端羧基、N末端氨基或侧链官能团已被化学修饰成另一官能团的化合物。术语“氨基酸模拟物”是指结构不同于氨基酸的一般性化学结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
如本文所用，二十种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见例如Immunology—A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，并且可指两个或更多个氨基酸的聚合物。
如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基、和/或它们的类似物或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应来并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰核苷酸诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，那么可在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸可包含在合成之后进行的一个或多个修饰，诸如与标记的缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物取代天然存在的核苷酸中的一者或多者；核苷酸间修饰诸如像具有不带电荷键联(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)以及具有带电荷键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧挂部分诸如像蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多L-赖氨酸等)的那些、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的那些、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、具有经修饰键联(例如α端基异构核酸等)的那些；以及一种或多种多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基都可例如由膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，由标准保护基加以保护，或被活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可缀合于固体或半固体载体。5’和3’末端OH可加以磷酸化，或用胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分加以取代。其他羟基也可加以衍生以获得标准保护基。多核苷酸还可含有核糖或脱氧核糖的通常在本领域中是已知的类似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖；2’-O-烯丙基-核糖；2’-氟-核糖或2’-叠氮基-核糖；碳环糖类似物；α-端基异构糖；差向异构糖诸如***糖、木糖或来苏糖；吡喃糖；呋喃糖；景天庚酮糖；无环类似物以及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可由替代性连接基团替换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯由P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)替换的实施方案，其中每个R或R’独立地是H或任选地含有醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代的烷基(1-20个C)。并非所有在多核苷酸中的键联都需要是相同的。先前描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“经分离核酸”是指基因组、cDNA、或合成来源的核酸分子或它们的组合，所述核酸分子与存在于所述核酸的天然来源中的其他核酸分子分离。举例来说，关于基因组DNA，术语“经分离”包括核酸分子与基因组DNA天然地与其相伴的染色体分离。优选地，“经分离”核酸不含天然地侧接于所述核酸的序列，即位于目标核酸的5′和3′末端处的序列。
如本文所用，“文库”是指两种或更多种具有共有类别的实体的集合。举例来说，含有多核苷酸的文库可指两种或更多种多核苷酸的集合。术语“文库”在本文中在最广泛意义上使用，并且明确涵盖可或可不加以组合的子文库。
如本文所用，“独特”是指某一集合的某一成员不同于所述集合的其他成员。举例来说，文库中的独特可活化抗体可指具有不由所述文库中的其他可活化抗体所共有的特定序列的可活化抗体。实际上，应了解，文库的实体性实现形式的“独特”成员可以超过一个拷贝存在。举例来说，文库可含有多种“独特”可活化抗体，其中“独特”可活化抗体分子中的一者或多者以超过一个拷贝存在。
如本文所用，“多样性”是指多样化和/或异质性。举例来说，文库中的抗体的多样性可指所述文库中存在多种具有独特序列的抗体。
术语“抗体”在本文中在最广泛意义上使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段(例如Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和/或单链可变片段或scFv)，只要它们展现所需生物活性即可。
在一些实施方案中，术语“抗体”是指具有由两个相同重(H)链和两个相同轻(L)链组成的基本四多肽链结构的抗原结合蛋白(即免疫球蛋白)。每个L链通过一个共价二硫键连接于H链，而两个H链视H链同种型而定通过一个或多个二硫键彼此连接。每个重链在N末端具有可变区(在本文中缩写为VH)，继之以恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每个轻链在N末端具有可变区(在本文中缩写为VI)，继之以在它的另一末端的恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VL与VH对准，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。VH和VL一起配对形成单一抗原结合位点。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的额外多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可聚合以形成包含2-5个基本4链单元以及J链的多价集合体。
VH区和VL区可基于结构和序列分析进一步再分成高变性区域，被称为高变区(HVR)。HVR与被称为框架区(FW)的更保守区域交替散布(参见例如Chen等(1999)J.Mol.Biol.(1999)293,865-881)。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个HVR和四个FW组成：FW-1_HVR-1_FW-2_HVR-2_FW-3_HVR-3_FW4。在整篇本公开中，重链的三个HVR被称为HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。类似地，轻链的三个HVR被称为HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。在轻链和重链内，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区(参见例如FundamentalImmunology第7章(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y).(1989))。
来自任何脊椎动物物种的L链都可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列来被指定为称为κ和λ的两种明确不同类型中的一者。视抗体的重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列而定，抗体可被指定为不同类别或同种型。存在五个抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指定为α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)和μ(mu)的重链。IgG抗体类别可根据γ重链Y1-Y4来进一步分类成四个子类，即分别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。。
术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留结合所述抗体结合的抗原的能力的部分。抗体的“抗原结合片段”的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等,Nature 341:544-546(1989))，其由VH结构域组成；和(vi)经分离互补决定区(CDR)。
术语“CTLA4”在本申请中使用，并且包括人CTLA4(例如UniProt登录号P16410)以及其变体、亚型和物种同源物(例如小鼠CTLA4(UniProt登录号P09793)、大鼠CTLA4(UniProt登录号Q9Z1A7)、狗CTLA4(UniProt登录号Q9XSI1)、食蟹猴CTLA4(UniProt登录号G7PL88)等)。因此，结合分子(例如可活化抗体)还可结合来自除人以外的物种的CTLA4。在其他情况下，结合分子可对人CTLA4具有完全特异性，并且可不展现物种交叉反应性或其他类型的交叉反应性。
术语“CD137”在本申请中使用，并且包括人CD137(例如GenBank登录号NM_001561；NP_001552)以及其变体、亚型和物种同源物(例如小鼠CD137(GenBank基因标识符21942)、大鼠CD137(GenBank基因标识符500590)、狗CD137(GenBank基因标识符608274)、食蟹猴CTLA4(GenBank基因标识符102127961)等)。因此，结合分子(例如可活化抗体)还可结合来自除人以外的物种的CD137。在其他情况下，结合分子可对人CD137具有完全特异性，并且可不展现物种交叉反应性或其他类型的交叉反应性。
术语“嵌合抗体”是指包含源于不同动物物种的氨基酸序列的抗体，诸如具有源于人抗体的可变区和鼠免疫球蛋白恒定区的那些。
术语“竞争结合”是指两个抗体在它们与结合靶标结合时的相互作用。如果相较于在不存在第二抗体下第一抗体的结合，在第二抗体存在下，第一抗体与它的同源表位的结合被可检测地降低，那么第一抗体与第二抗体竞争结合。其中在第一抗体存在下，第二抗体与它的表位的结合也被可检测地降低的替代方案可为但无需为事实。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与它的表位的结合，而不伴有第二抗体抑制第一抗体与它的相应表位的结合的情况。然而，当每个抗体可检测地抑制另一抗体与它的同源表位的结合时，无论程度相同、更大还是更小，抗体都被称为彼此“交叉竞争”结合它们的一个或多个相应表位。
术语“表位”是指抗原的由抗体(或其抗原结合片段)结合的部分。表位可由邻接氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而毗邻的非邻接氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丧失。表位可包括呈独特空间构象的各种数目的氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体照相术、2维核磁共振、氘和氢交换与质谱测定法组合、或定点诱变、或所有方法与对抗原以及它与它的结合抗体和它的变体的复合结构的计算建模组合使用(参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris编(1996))。一旦确定抗原的所需表位，即可例如使用本文所述的技术产生针对那个表位的抗体。抗体的产生和表征也可阐明关于合乎需要表位的信息。根据这个信息，于是有可能竞争性筛选结合相同表位的抗体。一种用以实现此举的方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合抗原。一种用于基于它们的交叉竞争来“划分”抗体的高通量方法描述于PCT公布号WO 03/48731中。
术语“种系”是指当抗体基因和基因区段通过生殖细胞从亲代传至后代时它们的核苷酸序列。种系序列不同于成熟B细胞中编码抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列已在B细胞成熟的过程期间通过重组和高突变事件而改变。
术语“糖基化位点”是指由真核细胞识别为糖残基的连接位置的氨基酸残基。连接碳水化合物诸如寡糖所处的氨基酸通常是天冬酰胺(N连接)、丝氨酸(O连接)和苏氨酸(O连接)残基。特定连接位点通常由在本文中称为“糖基化位点序列”的氨基酸序列指示。用于N连接的糖基化的糖基化位点序列是：-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可为除脯氨酸以外的任何常规氨基酸。术语“N连接”和“O连接”是指充当糖分子与氨基酸残基之间的连接位点的化学基团。N连接的糖通过氨基连接；O连接的糖通过羟基连接。术语“聚糖占据”是指存在连接于糖基化位点的碳水化合物部分(即聚糖位点被占据)。当在多肽上存在至少两个潜在糖基化位点时，无(0聚糖位点占据)、一个(1聚糖位点占据)或两个(2聚糖位点占据)位点可由碳水化合物部分占据。
术语“宿主细胞”是指可被工程改造来产生目标蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞***。宿主细胞包括不限于培养细胞，例如源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞诸如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；人细胞，例如HEK293F细胞、HEK293T细胞；或人组织或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞(例如S2细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。所述术语不仅涵盖特定主题细胞，而且还涵盖这种细胞的子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以所述子代可能不与亲本细胞相同，但仍然被包括在术语“宿主细胞”的范围内。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或源于非人来源的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，所述非人来源利用人抗体谱系或其他人抗体编码序列。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“人源化抗体”是指含有源于人抗体序列的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体可含有来自非人动物或合成抗体的CDR或HVR中的一些或全部，而抗体的框架区和恒定区含有源于人抗体序列的氨基酸残基。
术语“说明性抗体”是指本文所述的抗体中的任一者。这些抗体可处于任何类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。因此，以上鉴定的每种抗体涵盖处于所有五个类别的具有相同VL区和VH区氨基酸序列的抗体。此外，处于IgG类别的抗体可处于任何子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。因此，处于IgG子类的以上鉴定的每种抗体涵盖处于所有四个子类的具有相同VL区和VH区氨基酸序列的抗体。处于五个类别以及处于四个IgG子类的人抗体的重链恒定区的氨基酸序列在本领域中是已知的。本公开中提供了表1b中所示的说明性抗体中的每一者的IgG4子类的全长重链和轻链的氨基酸序列。
“经分离”抗体或结合分子是已与它的天然环境的组分分离的抗体或结合分子。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)所测定。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，而术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。它由kd与ka的比率(即kd/ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。KD用作抗体与它的结合配偶体的结合的亲和力的量度。KD越小，抗体越紧密结合，或抗体与抗原之间的亲和力越高。举例来说，相比于具有微体积摩尔浓度(μM)解离常数的抗体，具有纳体积摩尔浓度(nM)解离常数的抗体更紧密结合特定抗原。抗体的KD值可使用本领域中完善建立的方法确定。一种用于确定抗体的KD的方法是通过使用ELISA。举例来说，使用ELISA的测定程序描述于本公开的至少实施例3中。
术语“哺乳动物”是指哺乳纲的任何动物物种。哺乳动物的实例包括：人；实验室动物诸如大鼠、小鼠、仓鼠、兔、非人灵长类动物和豚鼠；家养动物诸如猫、狗、牛、绵羊、山羊、马和猪；以及圈养野生动物诸如狮子、老虎、大象等。
关于哺乳动物的某一疾病状况的术语“预防(prevent/preventing)”是指防止或延迟疾病的发作，或防止疾病的临床或亚临床症状的显现。
如本文所用，两个多肽序列之间的“序列同一性”指示在序列之间相同的氨基酸的百分比。多肽的氨基酸序列同一性可使用已知计算机程序诸如Bestfit、FASTA或BLAST加以常规确定(参见例如Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000)；Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与参考氨基酸序列例如95％同一时，设置参数以使历经所述参考氨基酸序列的全长计算同一性百分比，并且允许同源性中的空位占所述参考序列中氨基酸残基的总数的多达5％。这个在以上在确定多肽之间的同一性百分比时提及的方法可适用于本文公开的所有蛋白质、其片段或变体。
如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“对……具有特异性”是指靶标与抗体之间的可测量和可重现相互作用诸如结合，此在包括生物分子的分子的异质群体存在下，确定所述靶标的存在。举例来说，结合或特异性结合靶标(其可为表位)的抗体是相比于它结合其他靶标，以更大亲和力、亲合力，更易于和/或以更久持续时间结合这个靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体与无关靶标结合的程度小于所述抗体与靶标结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质之间保守的表位。在另一实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
关于哺乳动物的某一疾病状况的术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指在具有所述疾病状况的所述哺乳动物中导致合乎需要或有益的作用。合乎需要或有益的作用可包括疾病的一种或多种症状(即肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数目和/或活性介导的其他影响等)的频率或严重性降低，或疾病、疾患或病症的进一步发展得到遏止或抑制。在治疗哺乳动物的癌症的情形下，合乎需要或有益的作用可包括抑制癌细胞的进一步生长或扩散，使癌细胞死亡，抑制癌症的复发，减轻与癌症相关的疼痛，或改进哺乳动物的存活期。作用可为主观的或客观的。举例来说，如果哺乳动物是人，那么人可注意到精力或活力改进或疼痛减轻作为主观改进征兆或对疗法的响应。或者，临床医师可基于身体检查、实验室参数、肿瘤标志物或放射摄影研究结果察觉到肿瘤尺寸或肿瘤负荷降低。临床医师可观察到的关于对治疗的响应的一些实验室征象包括测试的正常化，所述测试诸如白血细胞计数、红血细胞计数、血小板计数、红细胞沉降速率和各种酶水平测试。另外，临床医师可观察到可检测肿瘤标志物的降低。或者，其他测试可用于评估客观改进，诸如超声波扫描图、核磁共振测试和正电子发射测试。
术语“载体”是指能够运送外来核酸分子的核酸分子。外来核酸分子通过重组技术诸如连接或重组来连接于载体核酸分子。这允许在宿主细胞或生物体中繁殖、选择、进一步操作或表达外来核酸分子。载体可为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒或病毒粒子。一种类型的载体可在引入宿主细胞中后整合至宿主细胞的基因组中，并且由此连同宿主基因组一起复制(例如非游离型哺乳动物载体)。另一类型的载体能够在它所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。能够引导它们所操作性地连接的可表达外来核酸的表达的另一特定类型的载体通常被称为“表达载体”。表达载体通常具有驱动可表达外来核酸的表达的控制序列。被称为“转录载体”的较简单载体仅能够被转录而非翻译：它们可在靶标细胞中复制而非表达。术语“载体”涵盖所有类型的载体，无论它们的功能如何。能够引导它们所操作性地连接的可表达核酸的表达的载体通常被称为“表达载体”。“载体”的其他实例可包括展示载体(例如引导所编码多肽在病毒或细胞(诸如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞)的表面上表达和展示的载体)。
如本文所用，“受试者”、“患者”或“个体”可指人或非人动物。“非人动物”可指不分类为人的任何动物，诸如家养动物、农场动物或动物园动物、运动动物、玩赏动物(诸如狗、马、猫、母牛等)以及研究中使用的动物。研究动物可不加限制地指代线虫、节肢动物、脊椎动物、哺乳动物、蛙、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、鱼(例如斑马鱼或河豚鱼)、鸟(例如鸡)、狗、猫以及非人灵长类动物(例如恒河猴、食蟹猴、黑猩猩等)。在一些实施方案中，受试者、患者或个体是人。
“有效量”是指至少以下数量：在必要剂量下以及持续必要时期，所述数量有效实现一种或多种包括治疗或防治结果的所需或所指示作用。有效量可以一次或多次施用来提供。出于本公开的目的，抗体、药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现防治性或治疗性治疗的量。如在临床情形下所了解，药物、化合物或药物组合物的有效量可或可不与另一药物、化合物或药物组合物联合实现(例如如以单药疗法或组合疗法形式施用的有效量)。因此，可在施用一种或多种治疗剂的情形下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂联合，可实现或实现了合乎需要结果，那么单一药剂可被视为以有效量给与。
III.可活化结合多肽文库以及文库的产生
本公开的某些方面涉及可用于筛选和/或鉴定一种或多种可活化结合多肽(即一种或多种可活化抗体)的多核苷酸(例如编码本文所述的任何多肽)和/或例如编码多肽的多核苷酸的文库，所述可活化结合多肽包括可活化抗体、其可活化抗原结合片段、或可活化抗体的衍生物。
术语“可活化结合多肽”、“ABP”或“可活化抗体”包括包含靶标结合部分(TBM)、可裂解部分(CM)和掩蔽部分(MM)的多肽。在一些实施方案中，TBM包含结合靶标的氨基酸序列。在一些实施方案中，TBM包含抗体或其抗体片段的抗原结合结构域(ABD)。在一些实施方案中，TBM包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，其中所述VH和所述VL形成在不存在MM下结合靶标的结合结构域。在一些实施方案中，VH和VL共价连接，例如在scFv中。在一些实施方案中，VH和VL形成Fab片段。在一些实施方案中，VH连接于抗体重链恒定区，并且VL连接于抗体轻链恒定区。
在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL，并且可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含VH(例如Fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL-VH(例如scFv)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH，并且可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含VL(例如Fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH-VL(例如scFv)。
在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-L1-可裂解部分(CM)-L2-VL，并且可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含VH(例如Fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-L1-可裂解部分(CM)-L2-VL-L3-VH(例如scFv)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-L1-VH，并且可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含VL(例如Fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：掩蔽部分(MM)-L1-可裂解部分(CM)-L2-VH-L3-VL(例如scFv)。在一些实施方案中，L1、L2和/或L3是接头。在一些实施方案中，L1、L2和L3中的每一者是可具有独立选择的长度的接头，所述长度是0个氨基酸或1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、或10个或更多个氨基酸。
CM通常包括可裂解的，例如充当酶的底物的氨基酸序列，和/或能够形成可还原二硫键的半胱氨酸-半胱氨酸配对。因此，当术语“裂解”、“可裂解”、“经裂解”等与CM关联使用时，所述术语涵盖例如由蛋白酶达成的酶促裂解，以及通过可由暴露于还原剂所致的二硫键还原来破坏半胱氨酸-半胱氨酸配对之间的二硫键。
MM是指当可活化抗体的CM是完整的(例如未由相应酶裂解，和/或含有未还原半胱氨酸-半胱氨酸二硫键)时，MM干扰或抑制TBM与它的靶标的结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，MM如此高效地干扰或抑制TBM与它的靶标的结合，以致TBM与它的靶标的结合是极低的和/或在检测限以下(例如结合不能在ELISA或流式细胞计量术测定中检测到)。CM的氨基酸序列可与MM重叠，或包括在MM内。应注意，为方便起见，“ABP”或“可活化抗体”在本文中用于指代处于它们的未裂解(或“天然”)状态以及处于它们的经裂解状态的ABP或可活化抗体。将为普通技术人员显而易知的是，在一些实施方案中，经裂解ABP可由于例如由蛋白酶对CM的裂解而缺乏MM，所述裂解导致释放至少所述MM(例如当所述MM不通过共价键(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)接合于ABP时)。示例性ABP在以下更详细描述。
本公开的文库可含有一种或多种编码本文所述的任何多肽(例如本文所述的可活化结合多肽中的一者或多者)的多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的文库的多核苷酸中的一者或多者(即一者、一些或全部)编码包含一个或多个全长抗体轻链和/或重链的多肽。在一些实施方案中，本文所述的文库的多核苷酸中的一者或多者(即一者、一些或全部)编码包含一个或多个轻链和/或重链Fab片段的多肽。在一些实施方案中，本文所述的文库的多核苷酸中的一者或多者(即一者、一些或全部)编码包含一个或多个单链可变片段(scFv)的多肽。
本公开的其他方面涉及可用于筛选和/或鉴定一种或多种可活化结合多肽(即一种或多种可活化抗体)的多肽(例如本文所述的任何多肽)和/或多肽的文库，所述可活化结合多肽包括可活化抗体、其可活化抗原结合片段、或可活化抗体的衍生物。本公开的文库可含有本文所述的多肽中的一者或多者(例如一种或多种可活化结合多肽)。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个全长抗体轻链和/或重链。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个轻链和/或重链Fab片段。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，多肽在细胞表面上表达(例如酵母或哺乳动物细胞展示)。
在一些实施方案中，本公开的多肽包含：(a)第一肽(FP)；(b)可裂解部分(CM)；和(c)靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，FP是本文所述的任何第一肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)。在一些实施方案中，X不是W、M和/或C。在一些实施方案中，式(XIII)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，和/或式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，FP是本文所述的任何第一肽(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，X不是W、M和/或C。在一些实施方案中，式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，和/或式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，FP是本文所述的任何第一肽(例如包含根据式(XII)：ZmCZnCZo(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，CM是本文所述的任何可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))。在一些实施方案中，CM是本文所述的任何可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))。在一些实施方案中，TBM是本文所述的任何靶标结合部分(例如包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM))。
在一些实施方案中，第一肽(FP)干扰、阻碍靶标结合部分结合它的靶标，降低靶标结合部分结合它的靶标的能力，阻止、抑制靶标结合部分结合它的靶标，或与靶标结合部分竞争结合它的靶标(例如“非活性”可活化抗体)。在一些实施方案中，第一肽(FP)仅当多肽尚未被活化(例如通过pH变化(增加或降低)而活化，通过温度变动(增加或降低)而活化，在与第二分子(诸如小分子或蛋白质配体)接触之后而活化等)时干扰、阻碍、降低、阻止、抑制靶标结合部分结合它的靶标，或与靶标结合部分竞争结合它的靶标。在一些实施方案中，活化诱导在裂解部分内对多肽的裂解。在一些实施方案中，活化诱导多肽的构象变化(例如第一肽(FP)的移位)，从而导致第一肽不再阻止可活化抗体结合它的靶标。在一些实施方案中，第一肽(FP)仅当可裂解部分(CM)尚未由一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶裂解时干扰、阻碍靶标结合部分结合它的靶标，降低靶标结合部分结合它的靶标的能力，阻止、抑制靶标结合部分结合它的靶标，或与靶标结合部分竞争结合它的靶标。在一些实施方案中，在活化之前，第一肽(FP)具有至少约2.0(例如至少约2.0、至少约3.0、至少约4.0、至少约5.0、至少约6.0、至少约7.0、至少约8.0、至少约9.0、至少约10、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500等)的掩蔽效率。在一些实施方案中，掩蔽效率测量为包含第一肽(FP)的可活化抗体结合它的靶标的亲和力(在活化之前)相对于缺乏第一肽的多肽结合它的靶标的亲和力的差异(例如包含第一肽(FP)的可活化抗体(在活化之前)相对于缺乏第一肽(FP)的亲本抗体，在对靶标抗原(诸如CTLA4)的亲和力方面的差异，或包含第一肽(FP)的可活化抗体对靶标抗原(诸如CTLA4)的亲和力(在活化之前)相对于所述可活化抗体在活化之后对所述靶标抗原的亲和力的差异)。在一些实施方案中，掩蔽效率通过用包含第一肽(FP)的可活化抗体的结合的EC50(在活化之前)除以亲本抗体的EC50来测量(例如通过用ELISA测量EC50；参见例如实施例3的方法)。在一些实施方案中，掩蔽效率测量为包含第一肽(FP)的可活化抗体在活化之前结合它的靶标的亲和力相对于包含第一肽(FP)的可活化抗体在活化之后结合它的靶标的亲和力的差异(例如可活化抗体在活化之前相对于所述可活化抗体在活化之后，在对靶标抗原(诸如CTLA4)的亲和力方面的差异)。在一些实施方案中，第一肽(FP)结合靶标结合部分(TBM)，并且阻止可活化抗体结合它的靶标(例如“非活性”可活化抗体)。在一些实施方案中，第一肽(FP)具有的关于结合靶标结合部分(TBM)的解离常数大于靶标结合部分(TBM)关于它的靶标的解离常数。在一些实施方案中，第一肽(FP)是掩蔽部分(MM)。解离常数可例如通过诸如ELISA、表面等离子体共振或生物层干涉测量术(BLI)或流式细胞计量术的技术来测量。
在一些实施方案中，在多肽已被活化(例如通过用一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶处理而活化，通过pH变化(增加或降低)而活化，通过温度变动(增加或降低)而活化，在与第二分子(诸如酶)接触之后而活化等)之后，第一肽(FP)不干扰、阻碍靶标结合部分(TBM)结合它的靶标，降低靶标结合部分(TBM)结合它的靶标的能力，阻止、抑制靶标结合部分(TBM)结合它的靶标，或与靶标结合部分(TBM)竞争结合它的靶标。在一些实施方案中，在可裂解部分(CM)已由一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶裂解之后，第一肽(FP)不干扰、阻碍靶标结合部分(TBM)结合它的靶标，降低靶标结合部分(TBM)结合它的靶标的能力，阻止、抑制靶标结合部分(TBM)结合它的靶标，或与靶标结合部分(TBM)竞争结合它的靶标。在一些实施方案中，在活化之后，第一肽(FP)具有至多约1.75(例如至多约1.75、至多约1.5、至多约1.4、至多约1.3、至多约1.2、至多约1.1、至多约1.0、至多约0.9、至多约0.8、至多约0.7、至多约0.6或至多约0.5等)的掩蔽效率(例如相较于亲本抗体的亲和力，可活化抗体在活化之后的相对亲和力)。
在一些实施方案中，本公开的多肽从N末端至C末端包含以下结构：第一肽(FP)-可裂解部分(CM)-靶标结合部分(TBM)。本公开的文库可用于筛选一种或多种当呈活性形式时结合任何目标靶标的可活化结合多肽(即可活化抗体)，所述目标靶标包括例如CTLA4、CD137、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、OX40、CD3、CD19、CD20、CD40、CD95、CD120a、BTLA、VISTA、ICOS、BCMA、Her1、Her2、Her3和/或B7-H4。
在一些实施方案中，本公开的文库含有编码至少一种、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种如本文所述的独特多肽的多种多核苷酸，所述多肽包含：(a)第一肽(FP)；(b)可裂解部分(CM)；和(c)靶标结合部分(TBM)。
在一些实施方案中，本公开的文库含有编码至少一种、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种如本文所述的多肽的多种多核苷酸，所述多肽包含：(a)独特第一肽(FP)；(b)可裂解部分(CM)；和(c)靶标结合部分(TBM)。
在一些实施方案中，本公开的文库：1)编码和/或含有数目小于见于典型随机肽文库中的数目的独特肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)或式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的FP)；2)编码和/或含有在固定位置处包含一对半胱氨酸残基以确保展示肽具有受约束构象的肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)或式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的FP)；和/或3)编码和/或含有具有少许或不具有化学不稳定残基(诸如甲硫氨酸或色氨酸)的肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQID NO:86)或式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的FP)。有利的是，相对于随机肽文库，本公开的文库具有显著降低的文库大小，从而使得能够构建具有好得多的肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)或式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的FP)覆盖度的文库。此外，在固定位置处包括一对半胱氨酸残基确保了展示肽具有受约束构象，从而倾向于展现增加的结合亲和力和/或特异性。此外，本公开的文库具有包括少许直至不包括不利于制造过程的残基诸如甲硫氨酸或色氨酸的肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)或式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的FP)。
在一些实施方案中，本公开的文库含有多种多核苷酸，其中所述文库中的所述多核苷酸中的至少一者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。在一些实施方案中，本公开的文库含有多种多核苷酸，其中所述文库中的所述多核苷酸中的至少一者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码包含根据式(III)EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的多肽，其中X1是A、D、I、N、P或Y，X2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码包含选自SEQ ID NO:25-46的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019者编码包含根据式(III)EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的多肽，其中X1是A、D、I、N、P或Y，X2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少250、至少500、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019者编码包含选自SEQ ID NO:25-46的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码包含以下的多肽：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；和c)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码包含根据式(III)EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的多肽，其中X1是A、D、I、N、P或Y，x2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的每一者编码包含选自SEQ ID NO:25-46的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸中的至少一者编码可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。
在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)；和d)抗体重链可变区。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)；和d)抗体重链可变区。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，多肽从N末端至C末端包含以下结构：第一肽(FP)-可裂解部分(CM)-VL-VH。在一些实施方案中，多肽中的至少一者是可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，接头序列分隔VL和VH(即结构VL-接头-VH)。接头序列可为本领域中已知的任何接头序列，例如本文所述的任何接头序列。在一些实施方案中，接头序列是任何拷贝数的GGGGS(SEQ ID NO:17)(例如重复2次，重复3次等)。
在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)，并且所述文库还包含一种或多种编码抗体重链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)，并且所述文库还包含一种或多种编码抗体重链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，编码包含含有抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽的多核苷酸和编码抗体重链可变区的多核苷酸在同一载体上(例如从它们自身的启动子表达)或在不同载体上。在一些实施方案中，多肽中的至少一者在与抗体重链可变区偶联时形成可活化结合多肽(即可活化抗体)。
在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)；和d)抗体轻链可变区。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，可活化结合多肽包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：第一肽(FP)-可裂解部分(CM)-VH-VL。在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)；和d)抗体轻链可变区。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，可活化结合多肽包含从N末端至C末端包含以下结构的多肽：第一肽(FP)-可裂解部分(CM)-VH-VL。在一些实施方案中，多肽中的至少一者是可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，接头序列分隔VH和VL(即结构VH-接头-VL)。接头序列可为本领域中已知的任何接头序列，例如本文所述的任何接头序列。在一些实施方案中，接头序列是任何拷贝数的GGGGS(SEQ ID NO:17)(例如重复2次，重复3次等)。
在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)，并且所述文库还包含一种或多种编码抗体轻链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，本公开的文库含有至少一种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)编码包含以下的多肽的多核苷酸：(a)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸；(b)包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)的可裂解部分(CM)；c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)，并且所述文库还包含一种或多种编码抗体轻链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，编码包含含有抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽的多核苷酸和编码抗体轻链可变区的多核苷酸在同一载体上(例如从它们自身的启动子表达)或在不同载体上。在一些实施方案中，多肽中的至少一者在与抗体轻链可变区偶联时形成可活化结合多肽(即可活化抗体)。
本文所述的多核苷酸和/或多核苷酸文库可并有本文所述的任何抗体(例如抗CTLA4抗体、抗CD137抗体)的任何HVR序列(例如重链可变区HVR序列中的一者、两者或三者，和/或轻链可变区HVR序列中的一者、两者或三者)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列。本文所述的多核苷酸和/或多核苷酸文库还可并有PCT申请号PCT/CN2017/098333(以引用的方式整体并入本文)和/或PCT申请号PCT/CN2017/098299(以引用的方式整体并入本文)中所述的任何HVR序列(例如重链可变区HVR序列中的一者、两者或三者，和/或轻链可变区HVR序列中的一者、两者或三者)、重链可变区序列、轻链可变区序列、重链和/或轻链。
在一些实施方案中，本公开的文库包括一种或多种编码一种或多种本公开的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的载体(例如表达载体和/或展示载体)。
本文还提供了一种例如通过提供以及组装本公开的文库的多核苷酸序列(例如一种或多种合成多核苷酸)来制备文库的方法。本文还提供了一种例如通过以下方式来制备文库的方法：选择多种(例如至少一种、至少两种、至少5、至少10、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017、至少1018或至少1019种)第一肽(FP)序列、可裂解部分(CM)序列和/或靶标结合部分(TBM)序列(例如本文所述的FP、CM和TBM序列中的任何一者或多者)，以及组装编码这些序列的多核苷酸序列以产生编码多种多肽的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的文库。在一些实施方案中，由组装文库编码的多肽中的至少一者是可活化结合多肽(即可活化抗体)。
可将编码如本文所述的多肽的多核苷酸克隆至任何适合载体中以表达一部分或整个多肽序列。在一些实施方案中，将多核苷酸克隆至载体中，从而允许产生融合于蛋白质(例如病毒外壳蛋白、细菌表面蛋白、酵母表面蛋白、昆虫细胞表面蛋白、哺乳动物细胞表面蛋白)的全部或一部分(即创建融合蛋白)，并且展示在粒子或细胞的表面上的一部分或整个多肽。若干类型的载体是可用的，并且可用于实施本公开，例如噬菌粒载体。噬菌粒载体通常含有多种组分，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制起点位点以及如为本领域普通技术人员所知的其他必需组分。在一些实施方案中，可将编码多肽区域的多核苷酸克隆至载体中以在细菌细胞中表达来达成细菌展示，或在酵母细胞中表达来达成酵母展示。示例性载体描述于美国授予前公布号US20160145604中。在一些实施方案中，载体是展示载体，所述展示载体从5’至3’包含编码待展示在表面(例如噬菌体、细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞的表面)上的氨基酸序列的多核苷酸、限制位点、编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二多核苷酸、以及第二限制位点。在一些实施方案中，第二多核苷酸编码噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白(诸如Aga2)、细菌外膜蛋白、细胞表面栓系结构域、或衔接物、或它们的截短形式或衍生物。在一些实施方案中，表面肽用于噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、昆虫展示或哺乳动物展示、或在它们之间的穿梭展示。在一些实施方案中，当表达时，氨基酸序列和表面肽以融合蛋白形式展示在表面上。在一些实施方案中，载体还包含在第一限制位点的5’或在第二限制位点的3’的融合标签。
本公开的某些方面涉及一种含有一种或多种本文所述的载体的细胞群体。可使由通过本文所述的任何技术或其他适合技术产生的多核苷酸编码的多肽表达，并且加以筛选以鉴定具有所需结构和/或活性的可活化结合多肽。多肽的表达可例如使用无细胞提取物(例如核糖体展示)、噬菌体展示、原核细胞(例如细菌展示)或真核细胞(例如酵母展示)来进行。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。用于转染细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞的方法在本领域中是已知的，并且描述于本文引用的参考文献中。以下更详细描述在这些细胞类型中(例如从本公开的文库)表达多肽(例如一种或多种可活化结合多肽)以及筛选目标可活化结合多肽。
或者，多核苷酸可在诸如由Pluckthun和Skerra所述的大肠杆菌表达***中表达。(Meth.Enzymol.,1989,178:476；Biotechnology,1991,9:273)。可表达突变蛋白质以达成分泌在培养基中和/或分泌在细菌的细胞质中，如由Better和Horwitz,Meth.Enzymol.,1989,178:476所述。在一些实施方案中，使多肽连接于编码信号序列诸如ompA、phoA或pelB信号序列的序列的3′末端(Lei等,J.Bacteriol.,1987,169:4379)。这些基因融合物组装在双顺反子构建体中，因此，它们可从单一载体表达，并且分泌至大肠杆菌的周质间隙中，在所述周质间隙中，它们将再折叠，并且可以活性形式加以回收。(Skerra等,Biotechnology,1991,9:273)。举例来说，编码包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和包含抗体轻链的靶标结合部分(TBM)的多肽的基因可与抗体重链基因并行表达以产生目标多肽。
在其他实施方案中，使用如例如US20040072740；US20030100023；和US20030036092中所述的分泌信号和脂质化部分，本公开的多肽序列在原核生物例如大肠杆菌的膜表面上表达。
或者，本公开的多肽序列可通过如例如Jeong等,PNAS,2007,104:8247中所述的锚定周质表达(APEx双杂交表面展示)，或通过如例如Mazor等,Nature Biotechnology,2007,25:563中所述的其他锚定方法来表达和筛选。
高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞(例如NS/0细胞)、杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾(HEK)细胞，也可用于表达本公开的多肽。在哺乳动物细胞中表达的多肽(例如可活化结合多肽)可被设计来分泌至培养基中，或在细胞的表面上表达。
在其他实施方案中，多肽(例如可活化结合多肽)可使用哺乳动物细胞展示来选择(Ho等,PNAS,2006,103:9637)。在一些实施方案中，如在以上所述以及在以下所例示，可在例如使用噬菌体展示来产生融合于病毒外壳蛋白的全部或一部分(即产生融合蛋白)，并且展示在粒子或细胞的表面上的一部分或整个多肽序列之后，对多肽(例如可活化结合多肽)进行选择。
本公开的某些方面涉及一种包含本公开的多核苷酸或多核苷酸文库的非人动物。举例来说，本公开的非人动物可被修饰，以致它的基因组包括编码本公开的多肽(例如可活化结合多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，转基因动物(例如小鼠)表达由多核苷酸编码的多肽。用于修饰非人动物的基因组的技术在本领域中是已知的(例如用于产生XenomouseTM的方法)。
筛选由本公开的文库获得的可活化结合多肽可通过任何适当手段进行(例如测定在活化(诸如用一种或多种在可裂解部分(CM)内裂解序列的蛋白酶处理多肽)之前和之后的靶标结合)。举例来说，可通过标准免疫测定和/或亲和色谱法来评估结合活性。关于催化功能例如蛋白水解功能来对本公开的多肽进行的筛选可使用标准测定例如血红蛋白斑块测定来实现。测定多肽(例如可活化结合多肽)对靶标的结合亲和力可使用多种熟知技术在体外测定，所述技术例如是ELISA、基于表面等离子体共振来测量蛋白质与给定靶标的结合速率的BIACORETM仪器、或如使用ForteBio
Figure BDA0002697663470000511
RED96平台(Pall Life Sciences)在以下所例示的生物层干涉测量术。(BLI)，体内测定可使用许多动物模型中的任一者来进行，接着在适当时在人中加以随后测试。还涵盖基于细胞的生物测定。多肽(例如可活化结合多肽)可关于功能活性例如拮抗或激动活性加以进一步选择。举例来说，在一些实施方案中，通过用人IgG1-Fc标签对抗原加标签以及通过抗hIgG-Fc捕集(AHC)生物传感器来捕集(例如在活化之前和之后)，使用BLI测量包含一个或多个fab片段的多肽与一种或多种靶标之间的结合亲和力。多肽可在CH1结构域的C末端用His6标签加标签，在宿主细胞诸如大肠杆菌中过度表达，并且例如使用Ni-NTA树脂加以纯化。亲和力可接着使用AHC传感器(抗人IgG-Fc捕集浸渍和读取生物传感器)来测量(例如在活化之前和之后)，所述AHC传感器被浸渍至含有用动力学缓冲液例如稀释至5-10μg/mL的包含Fab的纯化多肽的孔中。
在鉴定了结合剂之后(例如通过确定多肽在“具有活性”时(例如在用蛋白酶处理之后)而非在“非活性”时(例如在用蛋白酶处理之前)能够结合靶标或抗原)，可提取核酸。所提取DNA可接着直接用于转化大肠杆菌宿主细胞，或者，可例如使用PCR以适合引物来扩增编码序列，并且通过任何典型测序方法来测序。可对结合剂的DNA序列进行限制酶消化，接着***载体中以进行蛋白质表达。
第一肽(FP)
在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种包含第一肽(FP)的多肽的多核苷酸和/或多核苷酸文库。在一些实施方案中，本公开涉及包含至少一种包含第一肽(FP)的多肽的多肽和/或多肽文库。在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，X不是W、M和/或C。在一些实施方案中，式(XIII)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，和/或式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，FP包含由根据式(XIV)：(NNK)mTGY(NNK)nTGY(NNK)o(SEQ IDNO:87)的多核苷酸序列编码的多肽，其中每个N都独立地是A、G、T或C，其中每个K都独立地是T或G，并且其中每个Y都独立地是T或C，并且其中每个H都独立地是A、T或C。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，X不是W、M和/或C。在一些实施方案中，式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸，并且式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，FP包含由根据式(II)：(NNK)mTGY(NNK)nTGY(NHC)o(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列编码的多肽，其中每个N都独立地是A、G、T或C，其中每个K都独立地是T或G，其中每个Y都独立地是T或C，并且其中每个H都独立地是A、T或C。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(XII)：ZmCZnCZo(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列，其中m是2-10(例如3-10)，n是3-10，并且o是1-10，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，m是3-10。
在一些实施方案中，m是2-5、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10。在一些实施方案中，m是6-8。在一些实施方案中，m是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，m是6。
在一些实施方案中，n是3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10。在一些实施方案中，n是6-8。在一些实施方案中，n是3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是8。
在一些实施方案中，o是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9、或9-10。在一些实施方案中，o是1-2。在一些实施方案中，o是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，o是2。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(IV)：Z6CX6CZ2(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(V)：Z6CX8CZ2(SEQ ID NO:56)的氨基酸序列，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(VI)：(Z6)C(Z6)C(Z2)(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列，其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含根据式(VII)：(Z6)C(Z8)C(Z2)(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列，其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：XmCADAPNHCXX(SEQ ID NO:88)、XmCHHSPANCXX(SEQ ID NO:89)、XmCPILRHRCXX(SEQ ID NO:90)、XmCKWRPSRCXX(SEQ ID NO:91)、XmCRVLPRRCXX(SEQ ID NO:92)、XmCLWRHRSCXX(SEQ IDNO:93)和XmCPRLRRKCXX(SEQ ID NO:94)，其中m是2-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，每个X不是M、W或C。在一些实施方案中，每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，第一肽(FP)包含氨基酸序列EVGSYPTDLDACADAPNHCHF(SEQ ID NO:95)、EVGSYSSTHAHCHHSPANCIS(SEQ ID NO:96)、EVGSYDTDYDFCPILRHRCDS(SEQ ID NO:97)、EVGSYNDYNYHCKWRPSRCHN(SEQ ID NO:98)、EVGSYYHDYDDCRVLPRRCFN(SEQ ID NO:99)、EVGSYSNNFASCLWRHRSCAD(SEQ ID NO:100)或EVGSYTDNYDYCPRLRRKCYH(SEQ ID NO:101)。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CD137抗体中的一者或多者的序列，所述抗CD137抗体包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CD137抗体中的一者或多者的全长抗体轻链。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：XmCPDHPYPCXX(SEQ ID NO:102)、XnCDAFYPYCXX(SEQ ID NO:103)、XmCDSHYPYCXX(SEQ IDNO:104)和XmCVPYYYACXX(SEQ ID NO:105)，其中m是2-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，第一肽(FP)包含氨基酸序列EVGSYNFVADSCPDHPYPCSA(SEQ ID NO:110)、EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDS(SEQ ID NO:111)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNS(SEQ ID NO:112)、EVGSYPNPSSDCVPYYYACAY(SEQ ID NO:113)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCQS(SEQ ID NO:114)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNS(SEQ ID NO:115)、EVGSYPQPSSDCVPYYYACAY(SEQ ID NO:116)或EVGSYPNPASDCVPYYYACAY(SEQ ID NO:117)。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CTLA4抗体中的一者或多者的序列，所述抗CTLA4抗体包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CTLA4抗体中的一者或多者的全长抗体轻链。
在一些实施方案中，第一肽(FP)包含选自SEQ ID NO:72-85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的任何第一肽(FP)都可还包含一个或多个额外氨基酸序列(例如一个或多个多肽标签)。适合额外氨基酸序列的实例可包括不限于纯化标签(诸如his标签、flag标签、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶标签)、检测标签(诸如可以光度测量方式检测的标签(例如红色或绿色荧光蛋白等))、具有可检测酶活性的标签(例如碱性磷酸酶等)、含有分泌序列、前导序列和/或稳定化序列的标签、蛋白酶裂解位点(例如弗林蛋白酶(furin)裂解位点、TEV裂解位点、凝血酶裂解位点)等。在一些实施方案中，一个或多个额外氨基酸序列在第一肽(FP)的N末端。在一些实施方案中，额外氨基酸序列包含序列EVGSY(SEQ ID NO:16)或由序列EVGSY(SEQ ID NO:16)组成。
在一些实施方案中，第一肽是掩蔽肽，在活化之前(例如在用一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶处理之前，在经受(局部)pH变化(增加或降低)之前，在温度变动(增加或降低)之前，在与第二分子(诸如小分子或蛋白质配体)接触之前，等)，所述掩蔽肽结合靶标结合部分(TBM)，并且抑制多肽结合它的靶标，但在活化之后(例如在用一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶处理之后，在经受(局部)pH变化(增加或降低)之后，在温度变动(增加或降低)之后，在与第二分子(诸如小分子或蛋白质配体)接触之后，等)，不结合TBM和/或抑制多肽结合它的靶标。在一些实施方案中，当CM未被裂解时，第一肽(FP)(例如掩蔽部分)抑制多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))与它的靶标的结合，但当CM被裂解时，不抑制多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))与它的靶标的结合。在一些实施方案中，第一肽(FP)(例如掩蔽部分)具有的关于结合TBM的解离常数大于多肽(例如可活化多肽(即可活化抗体))关于它的靶标的解离常数(例如是至少约1.5倍大、至少约2倍大、至少约2.5倍大、至少约3倍大、至少约3.5倍大、至少约4倍大、至少约4.5倍大、至少约5倍大、至少约10倍大、至少约100倍大、至少约500倍大等)。
可裂解部分(CM)
在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种包含可裂解部分(CM)的多肽的多核苷酸和/或多核苷酸文库。在一些实施方案中，本公开涉及包含至少一种包含可裂解部分(CM)的多肽的多肽和/或多肽文库。
在一些实施方案中，可裂解部分(CM)包含至少第一裂解位点(CS1)(例如第一蛋白酶裂解位点)。在一些实施方案中，第一裂解位点是第一蛋白酶裂解位点。可使用由本领域中已知的任何蛋白酶(例如已知与包含CM的多肽的靶标共定位的蛋白酶)识别和/或裂解的任何适合蛋白酶裂解位点，包括例如由以下识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)；基质金属蛋白酶(例如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26和/或MMP-27)；烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶；纤维蛋白溶酶；凝血酶；PSA；PSMA；ADAMS/ADAMTS(例如ADAM 8、ADAM 9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4和/或ADAMTS5)；卡斯帕酶(例如卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13和/或卡斯帕酶-14)；天冬氨酸蛋白酶(例如RACE和/或肾素(Renin))；天冬氨酸组织蛋白酶(例如组织蛋白酶D和/或组织蛋白酶E)；半胱氨酸组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V/L2和/或组织蛋白酶X/Z/P)；半胱氨酸蛋白酶(例如Cruzipain、豆荚蛋白(Legumain)和/或Otubain-2)；KLK(例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和/或KLK14)；金属蛋白酶(例如穿膜肽酶(Meprin)、中性溶酶(Neprilysin)、PSMA和/或BMP-1)；丝氨酸蛋白酶(例如经活化蛋白C、组织蛋白酶A、组织蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)和/或凝血因子蛋白酶(诸如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa))；弹性蛋白酶(elastase)；粒酶B；胍基苯甲酸酶；HtrA1；人嗜中性白细胞弹性蛋白酶；乳铁传递蛋白(lactoferrin)；marapsin；NS3/4A；PACE4；tPA；类胰蛋白酶(tryptase)；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)(例如DESC1、DPP-4、FAP、肝丝酶(Hepsin)、基质蛋白酶-2(Matriptase-2)、MT-SP1/基质蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3和/或TMPRSS4)；等。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点是选自以下的蛋白酶的裂解位点：uPA、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、TEV蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点是选自以下的蛋白酶的裂解位点：uPA、MMP-2、MMP-9和/或TEV蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点包含选自SGRSA(SEQ ID NO:13)、PLGLAG(SEQ ID NO:14)和ENLYFQG(SEQ IDNO:15)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的多肽包含根据式(VIII)：EVGSY(Z6)C(Z6)C(Z2)SGRSA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸。
在一些实施方案中，包含第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的多肽包含根据式(IX)：EVGSY(Z6)C(X6)C(Z2)SGRSA(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，包含第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的多肽包含根据式(X)：EVGSY(Z6)C(Z8)C(Z2)SGRSA(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，其中每个Z都独立地是选自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P的氨基酸。
在一些实施方案中，包含第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的多肽包含根据式(XI)：EVGSY(Z6)C(X8)C(Z2)SGRSA(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，可裂解部分(CM)还包含第一接头(L1)。在一些实施方案中，第一接头(L1)在第一裂解位点(CS1)(例如第一蛋白酶裂解位点)的C末端。在一些实施方案中，可裂解部分(CM)从N末端至C末端包含以下结构：(CS1)-L1。
可使用本领域中已知的任何适合接头(例如柔性接头)，包括例如：甘氨酸聚合物(G)n，其中n是至少1(例如至少一、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)的整数；甘氨酸-丝氨酸聚合物(GS)n，其中n是至少1(例如至少一、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)的整数，诸如GGGGS(SEQ ID NO:17)、SGGS(SEQ ID NO:18)、GGSG(SEQ ID NO:19)、GGSGG(SEQ ID NO:20)、GSGSG(SEQ ID NO:21)、GSGGG(SEQ ID NO:22)、GGGSG(SEQ ID NO:23)和/或GSSSG(SEQ ID NO:24)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；等。接头序列可具有任何长度，诸如约1个氨基酸(例如甘氨酸或丝氨酸)至约20个氨基酸(例如20氨基酸甘氨酸聚合物或甘氨酸-丝氨酸聚合物)、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约12个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸等。在一些实施方案中，接头的长度是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，接头包含选自SEQ ID NO:17-24的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可裂解部分(CM)还包含至少第二裂解位点(例如至少第二、至少第三、至少第四、至少第五，等)。在一些实施方案中，可裂解部分(CM)还包含第二裂解位点(CS2)。在一些实施方案中，第二裂解位点是第二蛋白酶裂解位点。第二蛋白酶裂解位点可为由以上所述的任何蛋白酶识别和/或裂解的任何适合蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，第一(CS1)和第二(CS2)裂解位点是由相同蛋白酶识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，第一(CS1)和第二(CS2)裂解位点是由不同蛋白酶识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点(例如第一蛋白酶裂解位点由uPA识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由MMP-2识别和/或裂解；第一蛋白酶裂解位点由uPA识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由MMP-9识别和/或裂解；第一蛋白酶裂解位点由uPA识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由TEV蛋白酶识别和/或裂解；等)。在一些实施方案中，至少第二裂解位点(CS2)在第一接头(L1)的C末端。在一些实施方案中，可裂解部分(CM)从N末端至C末端包含以下结构：(CS1)-L1-(CS2)。
在一些实施方案中，可裂解部分(CM)还包含至少第二接头(例如至少第二、至少第三、至少第四、至少第五，等)。在一些实施方案中，可裂解部分(CM)还包含第二接头(L2)。第二接头(L2)可为以上所述的任何适合接头。在一些实施方案中，第二接头包含选自SEQ IDNO:17-24的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一(L1)和第二(L2)接头是相同的(例如两个接头均包含SEQ ID NO:17或18的序列)。在一些实施方案中，第一(L1)和第二(L2)接头是不同的(例如第一接头(L1)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，而第二接头(L2)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，等)。在一些实施方案中，至少第二接头(L2)在第二裂解位点(CS2)的C末端。在一些实施方案中，可裂解部分(CM)从N末端至C末端包含以下结构：(CS1)-L1-(CS2)-L2。
示例性FP-CM序列
在一些实施方案中，本公开的多肽从N末端至C末端包含以下结构：(FP)-(PCS1)-L1-(PCS2)-L2。在一些实施方案中，本公开的多肽包含以下氨基酸序列：EVGSYDALHYACPPDYYACYYSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:25)；EVGSYNSYHAYCPHPLYPCTASGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:26)；EVGSYASSAVLCVTAYFSCNSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:27)；EVGSYNFVADSCPDHPYPCSASGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:28)；EVGSYNFVADSCPDHPYPCSASGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:29)；EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:30)；EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:31)；EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:32)；EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:33)；EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:34)；EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:35)；EVGSYYSAYPACDSHYPYCQSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:36)；EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSAGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:37)；EVGSYPQPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:38)；EVGSYPNPASDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:39)；EVGSYPTDLDACADAPNHCHFSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:40)；EVGSYSSTHAHCHHSPANCISSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:41)；EVGSYDTDYDFCPILRHRCDSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:42)；EVGSYNDYNYHCKWRPSRCHNSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:43)；EVGSYYHDYDDCRVLPRRCFNSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:44)；EVGSYSNNFASCLWRHRSCADSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:45)；和/或EVGSYTDNYDYCPRLRRKCYHSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS(SEQ ID NO:46)。在一些实施方案中，本公开的多肽从N末端至C末端包含以下结构：(FP)-(PCS1)-L1-(PCS2)-L2-(TBM)。
靶标结合部分(TBM)
在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种包含靶标结合部分(TBM)的多肽的多核苷酸和/或多核苷酸文库。在一些实施方案中，本公开涉及包含至少一种包含靶标结合部分(TBM)的多肽的多肽和/或多肽文库。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体轻链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体重链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区。在一些实施方案中，抗体重链可变区在抗体轻链可变区的C末端。在一些实施方案中，抗体轻链可变区在抗体重链可变区的C末端。在一些实施方案中，本公开的靶标结合部分(TBM)包含对任何目标靶标具有特异性的抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区，所述目标靶标包括例如CTLA4、CD137、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、OX40、CD3、CD19、CD20、CD40、CD95、CD120a、BTLA、VISTA、ICOS、BCMA、Her1、Her2、Her3和/或B7-H4。
在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含全长抗体轻链和/或全长抗体重链。抗体轻链可为κ或λ轻链。抗体重链可处于任何类别，诸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。在一些实施方案中，抗体重链处于IgG类别，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子类。使用本领域中已知的方法，可使本文所述的抗体重链从一个类别或子类转变成另一类别或子类。
本文所述的靶标结合部分(TBM)中的任何一者或多者可并有PCT申请号PCT/CN2017/098333(以引用的方式整体并入本文)、PCT申请号PCT/CN2017/098299(以引用的方式整体并入本文)、PCT申请号PCT/CN2017/098332(以引用的方式整体并入本文)和/或以代理人案号69540-2000540与本文并行提交的题为“Compositions Comprising Cross-reactive Anti-CTLA4 Antibodies,and Methods of Making and Using the Same”的PCT申请(以引用的方式整体并入本文)中所述的任何抗体的任何HVR序列(例如重链可变区HVR序列中的一者、两者或三者，和/或轻链可变区HVR序列中的一者、两者或三者)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
本文所述的靶标结合部分(TBM)中的任何一者或多者可并有本文所述的任何抗体(例如抗CTLA4抗体、抗CD137抗体)的任何HVR序列(例如重链可变区HVR序列中的一者、两者或三者，和/或轻链可变区HVR序列中的一者、两者或三者)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CTLA4抗体中的一者或多者的序列，所述抗CTLA4抗体包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含含有氨基酸序列RASQSVRGRFLA(SEQ ID NO:62)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNRATGI(SEQ ID NO:63)的HVR-L2和/或含有氨基酸序列YCQQSSSWPPT(SEQ ID NO:64)的HVR-L3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗体轻链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含含有氨基酸序列YSISSGYHWSWI(SEQ ID NO:59)的HVR-H1、含有氨基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL(SEQ ID NO:60)的HVR-H2和/或含有氨基酸序列ARSYVYFDY(SEQ ID NO:61)的HVR-H3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗体重链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含：a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含含有氨基酸序列RASQSVRGRFLA(SEQ ID NO:62)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNRATGI(SEQ ID NO:63)的HVR-L2和/或含有氨基酸序列YCQQSSSWPPT(SEQ ID NO:64)的HVR-L3；和b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含含有氨基酸序列YSISSGYHWSWI(SEQ ID NO:59)的HVR-H1、含有氨基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL(SEQ ID NO:60)的HVR-H2和/或含有氨基酸序列ARSYVYFDY(SEQ IDNO:61)的HVR-H3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗体轻链可变区，以及含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗体重链可变区。
在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含本文所述的抗CD137抗体中的一者或多者的序列，所述抗CD137抗体包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含含有氨基酸序列RASQSIGSYLA(SEQ ID NO:68)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNLETGV(SEQ ID NO:69)的HVR-L2和/或含有氨基酸序列YCQQGYYLWT(SEQ ID NO:70)的HVR-L3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗体轻链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含含有氨基酸序列FSLSTGGVGVGWI(SEQ ID NO:65)的HVR-H1、含有氨基酸序列LALIDWADDKYYSPSLKSRL(SEQ ID NO:66)的HVR-H2和/或含有氨基酸序列ARGGSDTVIGDWFAY(SEQ ID NO:67)的HVR-H3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗体重链可变区。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含：a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含含有氨基酸序列RASQSIGSYLA(SEQ ID NO:68)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNLETGV(SEQ ID NO:69)的HVR-L2和/或含有氨基酸序列YCQQGYYLWT(SEQ ID NO:70)的HVR-L3；和b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含含有氨基酸序列FSLSTGGVGVGWI(SEQ ID NO:65)的HVR-H1、含有氨基酸序列LALIDWADDKYYSPSLKSRL(SEQ ID NO:66)的HVR-H2和/或含有氨基酸序列ARGGSDTVIGDWFAY(SEQ ID NO:67)的HVR-H3。在一些实施方案中，靶标结合部分(TBM)包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗体轻链可变区，以及含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗体重链可变区。
V.多肽和多肽文库
本公开的其他方面涉及可用于筛选、鉴定和/或选择一种或多种可活化结合多肽(即一种或多种可活化抗体)的多肽(例如本文所述的任何多肽)和/或多肽的文库，所述可活化结合多肽包括可活化抗体、其可活化抗原结合片段、或可活化抗体的衍生物。本公开的文库可含有本文所述的多肽中的一者或多者(例如一种或多种可活化结合多肽)。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个全长抗体轻链和/或重链。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个轻链和/或重链Fab片段。在一些实施方案中，本文所述的文库的多肽中的一者或多者(例如一者、一些或全部)包含一个或多个单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，多肽在细胞表面上表达(例如酵母或哺乳动物细胞展示)。
在一些实施方案中，本公开的多肽(例如处于文库中)包含：(a)第一肽(FP)；(b)可裂解部分(CM)；和(c)靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，FP是本文所述的任何第一肽(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)。在一些实施方案中，FP是本文所述的任何第一肽(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，CM是本文所述的任何可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))。在一些实施方案中，TBM是本文所述的任何靶标结合部分(例如包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM))。
在一些实施方案中，本文提供了一种抗原结合结构域和/或包含抗原结合结构域的文库，其中所述抗原结合结构域中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含本公开的多肽。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分。在一些实施方案中，抗原结合结构域还包含抗体重链可变区。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗原结合结构域中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗原结合结构域还包含抗体轻链可变区。
在一些实施方案中，本文还提供了一种包含本文所述的任何多肽的抗体片段或scFv。在一些实施方案中，抗体片段或scFv包含含有包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽。在一些实施方案中，抗体片段或scFv包含含有包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种具有抗体片段或scFv的文库，其中所述抗体片段或scFv中的至少一者包含本文所述的任何多肽。在一些实施方案中，文库中的抗体片段或scFv中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含含有包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽。在一些实施方案中，文库中的抗体片段或scFv中的至少一者(例如一者、一些或全部)包含含有包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)的多肽。本文还提供了在它们的表面上表达本文所述的抗体片段和/或scFv中的一者或多者的细胞和/或细胞的文库。
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含本公开的多肽的抗体轻链。在一些实施方案中，抗体轻链包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗体轻链包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体轻链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体轻链的文库，其中所述文库中的所述抗体轻链中的至少一者(例如一者、一些或全部)是如上所述的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体轻链和抗体重链的抗体，其中所述抗体轻链是如上所述的抗体轻链。在一些实施方案中，抗体重链是本领域中已知的任何抗体重链(包括本文所述的任何抗体重链)。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体的文库，其中所述抗体中的至少一者(例如一者、一些或全部)是如上所述的抗体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含本公开的多肽的抗体重链。在一些实施方案中，抗体重链包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，抗体重链包含从N末端至C末端包含以下的多肽：(a)第一肽(FP)(例如包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的第一肽(FP)，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，每个X都独立地是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，并且每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸)；(b)可裂解部分(例如包含至少第一蛋白酶裂解位点的可裂解部分(CM))；和(c)包含抗体重链可变区的靶标结合部分(TBM)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体重链的文库，其中所述文库中的所述抗体重链中的至少一者(例如一者、一些或全部)是如上所述的抗体重链。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体重链和抗体轻链的抗体，其中所述抗体重链是如上所述的抗体重链。在一些实施方案中，抗体轻链是本领域中已知的任何抗体轻链(包括本文所述的任何抗体轻链)。在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗体的文库，其中所述抗体中的至少一者(例如一者、一些或全部)是如上所述的抗体。
本公开的多肽(例如以上所述的任何抗体)可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生。在一些实施方案中，提供了编码任何多肽(例如以上所述的任何抗体)的经分离核酸。所述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，本文提供了一种或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体)。在一些实施方案中，提供了一种包含所述核酸的宿主细胞。在一个所述实施方案中，宿主细胞包含(例如已转化有)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含含有VL的本公开的多肽的氨基酸序列以及包含VH的氨基酸序列(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))，(2)包含核酸的载体，所述核酸编码包含含有VH的本公开的多肽的氨基酸序列以及包含VL的氨基酸序列(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))，(3)包含编码包含含有VL的本公开的多肽的氨基酸序列的核酸的第一载体，以及包含编码包含VH的氨基酸序列的核酸的第二载体(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))，或(4)包含编码包含含有VH的本公开的多肽的氨基酸序列的核酸的第一载体，以及包含编码包含VL的氨基酸序列的核酸的第二载体(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如酵母细胞、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了一种制备多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))的方法，其中所述方法包括在适于表达所述多肽的条件下培养如上提供的包含编码所述多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))的核酸的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))。
对于重组产生本公开的多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))，分离编码例如如上所述的多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))的核酸，并且***一种或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。所述核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码一种或多种多肽的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。
适于克隆或表达多肽编码(例如可活化结合多肽(即可活化抗体)编码)载体的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。举例来说，多肽(例如可活化结合多肽(即可活化抗体))可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时(参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523；也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。)。在表达之后，多肽可于可溶性级分中从细菌细胞糊状物分离，并且可进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适于多肽编码(例如可活化结合多肽(即可活化抗体)编码)载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)以及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化多肽的宿主细胞还源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定可与昆虫细胞联合使用的众多杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(所述专利描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是通过SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7)；人胚肾株系(293或293细胞，如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
VI.可活化结合多肽以及它们的产生
在一些实施方案中，本文提供了从本文所述的任何多核苷酸和/或多肽文库筛选、鉴定和/或选择的可活化结合多肽(例如可活化抗体)。
在一些实施方案中，本公开的可活化抗体具有情形依赖性(例如在某些情形下(诸如在富含蛋白酶的肿瘤微环境中)是活化的(仅能够结合它们的靶标))。在一些实施方案中，本公开的可活化抗体提供优于更加传统的非可活化抗体的改进的安全性(例如显示毒性降低，不诱导对许多器官的重量的显著改变，不改变肝组织病理学、血液学和/或血液生物化学等)。在一些实施方案中，相较于更加传统的非可活化抗体，本公开的可活化抗体具有改进的药物代谢动力学性质(例如具有更久体内半衰期)。
在一些实施方案中，本公开的可活化结合多肽包含：(a)第一肽(FP)(例如掩蔽部分)，(b)可裂解部分，和(c)靶标结合部分。在一些实施方案中，第一肽(FP)结合可活化结合结构域的靶标结合部分(TBM)，并且相较于缺乏掩蔽部分的相应结合多肽与靶标的结合，和/或相较于亲本抗体与靶标的结合，降低或抑制可活化结合部分与它的靶标(例如人CTLA4或人CD137)的结合。在一些实施方案中，在活化之前，掩蔽部分(MM)具有至少约2.0(例如至少约2.0、至少约3.0、至少约4.0、至少约5.0、至少约6.0、至少约7.0、至少约8.0、至少约9.0、至少约10、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500等)的掩蔽效率。在一些实施方案中，掩蔽效率测量为包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体结合它的靶标的亲和力(在活化之前)相对于缺乏掩蔽部分的多肽结合它的靶标的亲和力的差异(例如包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体(在活化之前)相对于缺乏掩蔽部分(MM)的亲本抗体，在对靶标抗原(诸如CTLA4或CD137)的亲和力方面的差异，或包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体对靶标抗原(诸如CTLA4或CD137)的亲和力(在活化之前)相对于所述可活化抗体在活化之后对所述靶标抗原的亲和力的差异)。在一些实施方案中，掩蔽效率通过用包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体的结合的EC50(在活化之前)除以亲本抗体的EC50来测量(例如通过用ELISA测量EC50；参见例如实施例3的方法)。在一些实施方案中，掩蔽效率测量为包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体在活化之前结合它的靶标的亲和力相对于包含掩蔽部分(MM)的可活化抗体在活化之后结合它的靶标的亲和力的差异(例如可活化抗体在活化之前相对于所述可活化抗体在活化之后，在对靶标抗原的亲和力方面的差异)。在一些实施方案中，掩蔽部分(MM)结合靶标结合部分(TBM)，并且阻止可活化抗体结合它的靶标(例如“非活性”可活化抗体)。
在一些实施方案中，“可活化”结合多肽是指以下结合多肽：当处于抑制、掩蔽和/或未裂解状态时展现与靶标的第一结合水平，并且在处于未抑制、未掩蔽和/或裂解状态时展现与所述靶标的第二结合水平，其中所述第二靶标结合水平大于所述第一靶标结合水平。在一些实施方案中，在可裂解部分内裂解(例如由一种或多种蛋白酶)之后，可活化结合多肽接近靶标的机会增大。
在一些实施方案中，当相较于在多肽的活化之前，在多肽的活化之后(例如在通过用一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶处理来活化之后，在通过pH变化(增加或降低)来活化之后，在通过温度变动(增加或降低)来活化之后，在通过与第二分子(诸如小分子或蛋白质配体)接触来活化之后，等)，多肽对它的靶标(例如人CTLA4或CD137)的结合亲和力增加至至少约2倍(例如至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1000倍或更多倍)时，本公开的多肽通常被视为是“可活化”结合多肽。在一些实施方案中，如果在“活化”之后，多肽的EC50降低至至少约1/2(例如至少约1/2，至少约1/2.5，至少约1/3，至少约1/3.5，至少约1/4，至少约1/4.5，至少约1/5，至少约1/5.5，至少约1/6，至少约1/6.5，至少约1/7，至少约1/7.5，至少约1/8，至少约1/8.5，至少约1/9，至少约1/9.5，至少约1/10，至少约1/25，至少约1/50，至少约1/75，至少约1/100，至少约1/250，至少约1/500，至少约1/750或至少约1/1000，或降低至更小)(例如如通过ELISA或FACS测定所测量；参见以下实施例)，那么本公开的多肽通常被视为“可活化”。在一些实施方案中，如果在用在可裂解部分内进行裂解的蛋白酶处理之后，多肽的EC50降低至至少约1/2(例如如通过ELISA或FACS测定所测量；参见以下实施例)，那么本公开的多肽通常被视为“可活化”。
在一些实施方案中，当掩蔽部分结合于可活化结合多肽的靶标结合部分时，可活化结合多肽关于它的靶标的KD是掩蔽部分未结合于靶标结合部分时(例如在可活化结合多肽的“活化”之后(诸如在进行蛋白酶处理以在可裂解部分内进行裂解之后))和/或是亲本抗体关于靶标的KD的约2(例如约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约25、约50、约75、约100、约250、约500、约750或约1000或更多)倍大。测量亲和力的方法在本领域中是已知的，包括例如通过以下实施例3中所述的方法。
在一些实施方案中，相对于当掩蔽部分未结合于靶标结合部分时(例如在可活化结合多肽的“活化”之后(诸如在进行蛋白酶处理以在可裂解部分内进行裂解之后))，和/或相对于亲本抗体关于靶标的KD，当掩蔽部分结合于可活化结合多肽的靶标结合部分时，可活化结合多肽关于它的靶标的KD降低至少约25％(例如至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)。测量亲和力的方法在本领域中是已知的，包括例如通过以下实施例3中所述的方法。
在一些实施方案中，掩蔽部分在空间上阻碍可活化结合多肽与它的靶标的结合，和/或变构阻碍可活化结合多肽与它的靶标的结合。在一些实施方案中，掩蔽部分不包含可活化结合多肽的天然结合配偶体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽部分关于靶标结合部分的解离常数大于可活化结合多肽关于靶标的解离常数(当呈活性活化形式时)。在一些实施方案中，掩蔽部分关于靶标结合部分的解离常数是可活化结合多肽关于靶标的解离常数(当呈活化形式时)的约2(例如约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约25、约50、约75、约100、约250、约500、约750或约1000或更多)倍大。在一些实施方案中，掩蔽部分关于靶标结合部分的解离常数约等于可活化结合多肽关于靶标的解离常数(当呈活化形式时)。在一些实施方案中，第一肽(FP)仅当多肽尚未被活化(例如通过用一种或多种在可裂解部分(CM)内进行裂解的蛋白酶处理而活化，通过pH变化(增加或降低)而活化，通过温度变动(增加或降低)而活化，在与第二分子(诸如小分子或蛋白质配体)接触之后而活化等)时结合靶标结合部分(TBM)，并且阻止多肽结合它的靶标。在一些实施方案中，活化诱导在裂解部分内对多肽的裂解。在一些实施方案中，活化诱导多肽的构象变化(例如第一肽(FP)的移位)，从而导致第一肽不再阻止多肽结合它的靶标。
可进一步修饰本文所述的可活化结合多肽(即可活化抗体)。在一些实施方案中，可活化结合多肽连接于额外分子实体。额外分子实体的实例包括药物制剂、肽或蛋白质、检测剂或标记、以及抗体。
在一些实施方案中，本公开的可活化结合多肽连接于药物制剂。药物制剂的实例包括细胞毒性剂或其他癌症治疗剂以及放射性同位素。细胞毒性剂的特定实例包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它们的类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢剂(antimetabolite)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(先前称为放线菌素(actinomycin))、博莱霉素(bleomycin)、米拉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin)(AMC))、以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春花碱)。可缀合于抗体以进行诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。用于使多肽连接于药物制剂的方法在本领域中是已知的，诸如使用各种接头技术。接头类型的实例包括腙、硫醚、酯、二硫醚和含肽接头。对于用于使治疗剂连接于抗体的接头和方法的进一步讨论，参见例如Saito等,Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215(2003)；Trail,等,Cancer Immunol.Immunother.52:328-337(2003)；Payne,Cancer Cell3:207-212(2003)；Allen,Nat.Rev.Cancer 2:750-763(2002)；Pastan和Kreitman,Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091(2002)；Senter和Springer(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
靶向CTLA4的可活化结合多肽
在一些实施方案中，本公开涉及结合人CTLA4的可活化结合多肽(即可活化抗体)，包括可活化抗CTLA4抗体、可活化抗CTLA4抗体的抗原结合片段、和/或可活化抗CTLA4抗体的衍生物。在一些实施方案中，可活化抗体包含：(a)从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)；和(b)抗体重链可变区(VH)。在一些实施方案中，m是3-10。在一些实施方案中，当CM未被裂解时，MM抑制可活化抗体与人CTLA4的结合。在一些实施方案中，当CM被裂解时，可活化抗体能够结合人CTLA4。在一些实施方案中，MM包含选自SEQ ID NO:72-78的氨基酸序列，如表A中所列。
表A.可活化抗体的掩蔽肽序列
Figure BDA0002697663470000781
Figure BDA0002697663470000791
在一些实施方案中，可活化结合多肽包含本文所述的任何抗CTLA4抗体，包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，抗CTLA4抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗CTLA4抗体是人源化抗体和/或嵌合抗体。
在一些实施方案中，可活化结合多肽包含：a)含有氨基酸序列YSISSGYHWSWI(SEQID NO:59)的HVR-H1、含有氨基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL(SEQ ID NO:60)的HVR-H2和含有氨基酸序列ARSYVYFDY(SEQ ID NO:61)的HVR-H3；和/或b)含有氨基酸序列RASQSVRGRFLA(SEQ ID NO:62)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNRATGI(SEQ ID NO:63)的HVR-L2和含有氨基酸序列YCQQSSSWPPT(SEQ ID NO:64)的HVR-L3。在一些实施方案中，可活化结合多肽包含：a)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区；和/或b)含有SEQ IDNO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本公开涉及可活化结合多肽，所述可活化结合多肽当呈活性形式时(例如所述可活化结合多肽在可裂解部分中裂解(例如用一种或多种蛋白酶)之后是活性的，但在可裂解部分中裂解(例如用一种或多种蛋白酶)之前是非活性的)结合人CTLA4，并且具有以下功能性质中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、至少八者或全部九者)：(a)以500nM或更小的KD结合人、食蟹猴、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4；(b)对人CTLA4具有拮抗活性；(c)在多达100nM的浓度下不结合人PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、CD95、CD120a、OX40、CD40、BTLA、VISTA、ICOS和/或B7-H4；(d)与猴、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4具有交叉反应性；(e)诱导ADCC效应(例如对Treg)；(f)使人PBMC活化(例如刺激IL-2和/或IFNγ的分泌)；(g)能够抑制肿瘤细胞生长；(h)对癌症具有治疗作用；和(i)抑制人CTLA4与人CD80和/或人CD86的结合。本文还提供了一种或多种与本文所述的靶向CTLA4的可活化结合多肽和/或抗CTLA4抗体中的一者或多者交叉竞争结合人CTLA4的可活化结合多肽。
在一些实施方案中，当呈非活性形式时，可活化结合多肽以约500nM或更大的KD结合人、食蟹猴、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽以约500nM或更小(例如约500nM或更小、约450nM或更小、约400nM或更小、约350nM或更小、约300nM或更小、约250nM或更小、约200nM或更小、约150nM或更小、约100nM或更小、约90nM或更小、约80nM或更小、约70nM或更小、约60nM或更小、约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约25nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、约0.1nM或更小等)的KD结合人、食蟹猴、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽以约350nM或更小的KD结合人、食蟹猴、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽以约100nM或更小的KD结合人CTLA4。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽以约50nM或更小的KD结合人CTLA4。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽以约10nM或更小的KD结合人CTLA4。测量可活化结合多肽的KD的方法可使用本领域中已知的任何方法进行，包括例如通过表面等离子体共振、ELISA、等温滴定量热法、滤膜结合测定、EMSA等。在一些实施方案中，KD通过ELISA测量(参见例如以下实施例3)。
在一些实施方案中，当呈非活性形式时，可活化结合多肽不对人CTLA4具有拮抗活性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽对人CTLA4具有拮抗活性(例如诱导ADCC效应(诸如对Treg)，使PBMC活化(诸如通过对IL-2和/或IFNγ分泌进行活化、诱导和/或刺激)，阻断人CTLA4与人CD80和/或人CD86的结合等)。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽阻遏人CTLA4的一种或多种活性(例如当表达人CTLA4的细胞(诸如人细胞)由活化的可活化结合多肽接触时，阻遏人CTLA4的一种或多种活性)。
在一些实施方案中，当呈非活性形式时，可活化结合多肽不与猴(例如食蟹猴)、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与猴(例如食蟹猴)、小鼠、大鼠和/或狗CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与猴CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与小鼠CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与大鼠CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与狗CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽与猴和小鼠CTLA4；猴和大鼠CTLA4；猴和狗CTLA4；小鼠和大鼠CTLA4；小鼠和狗CTLA4；大鼠和狗CTLA4；猴、小鼠和大鼠CTLA4；猴、小鼠和狗CTLA4；猴、大鼠和狗CTLA4；小鼠、大鼠和狗CTLA4；或猴、小鼠、大鼠和狗CTLA4具有交叉反应性。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化结合多肽在约350nM下(例如在约1nM下，在约10nM下，在约25nM下，在约50nM下，在约75nM下，在约100nM下，在约150nM下，在约200nM下，在约250nM下，在约300nM下，在约350nM下)具有交叉反应性。测量交叉反应性的方法在本领域中是已知的，包括不限于表面等离子体共振、ELISA、等温滴定量热法、滤膜结合测定、EMSA等。
在一些实施方案中，当呈非活性形式时，可活化结合多肽不诱导ADCC效应(例如对人细胞诸如Treg)。在一些实施方案中，相较于对照结合多肽(例如缺乏第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的亲本抗体)，当呈非活性形式时，可活化结合多肽具有降低的ADCC效应(例如对人细胞诸如Treg)。在一些实施方案中，当呈活性形式时，可活化抗体诱导ADCC效应(例如对人细胞诸如Treg)。测量ADCC效应的方法(例如体外方法)在本领域中是已知的，包括不限于通过以下实施例4中所述的方法。在一些实施方案中，相对于对照(例如缺乏第一肽(FP)和可裂解部分(CM)的亲本抗体)，当呈非活性形式时，可活化结合多肽诱导ADCC效应小于约10％(例如诱导ADCC小于约10％、小于约5％、小于约1％等)。在一些实施方案中，相对于对照(例如同种型对照)，当呈活性形式时，可活化结合多肽诱导ADCC效应超过约10％(例如诱导ADCC超过约10％、超过约15％、超过约20％、超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％等)。
在一些实施方案中，可活化结合多肽能够抑制肿瘤细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，相对于未与可活化结合多肽接触的相应肿瘤细胞(或相对于与同种型对照抗体接触的相应肿瘤细胞)，当与可活化结合多肽接触时，肿瘤细胞生长和/或增殖被抑制至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。在一些实施方案中，当向受试者施用可活化结合多肽时，可活化结合多肽能够使所述受试者中的肿瘤体积降低。在一些实施方案中，相对于受试者中的初始肿瘤体积(例如在施用可活化结合多肽之前；相较于被施用同种型对照抗体的受试者中的相应肿瘤)，可活化结合多肽能够使所述受试者中的肿瘤体积降低至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。监测肿瘤细胞生长/增殖、肿瘤体积和/或肿瘤抑制的方法在本领域中是已知的，包括例如通过以下实施例4中所述的方法。
在一些实施方案中，可活化结合多肽对癌症具有治疗作用。在一些实施方案中，可活化结合多肽使癌症的一种或多种征象或症状减轻。在一些实施方案中，当被施用可活化结合多肽时，罹患癌症的受试者得到部分或完全缓解。
在一些实施方案中，本公开提供了当呈活性形式时，与包含以下的抗体竞争或交叉竞争结合人CTLA4的经分离可活化结合多肽：a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H2；和含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-H3；和/或b)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-L1；含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L2；和含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本公开提供了当呈活性形式时，与包含以下的抗体竞争或交叉竞争结合人CTLA4的经分离可活化结合多肽：a)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区；和/或b)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。可活化结合多肽与抗体竞争或交叉竞争结合的能力可使用本领域中已知的标准结合测定诸如BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞计量术来测定。举例来说，可使抗体(例如如上所述)在饱和条件下结合人CTLA4，接着测量测试可活化结合多肽(当呈活性形式时)结合CTLA4的能力。如果测试可活化结合多肽能够与抗体同时结合CTLA4，那么测试可活化结合多肽与抗体结合不同表位。然而，如果测试可活化结合多肽不能同时结合CTLA4，那么测试可活化结合多肽结合相同表位、重叠表位、或紧密邻近于由抗体结合的表位的表位。这个实验可使用各种方法诸如ELISA、RIA、FACS或表面等离子体共振来进行。
在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈非活性形式时)不抑制CTLA4与它的结合配偶体中的一者或多者(例如人CTLA4与人CD80、人CTLA4与人CD86)之间的结合。在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈活性形式时)抑制CTLA4与它的结合配偶体中的一者或多者(例如人CTLA4与人CD80、人CTLA4与人CD86)之间的结合。在一些实施方案中，可活化结合多肽在体外抑制CTLA4与它的配体之间的结合。在一些实施方案中，对于抑制CTLA4与CD80和/或CD86的结合，可活化结合多肽具有约500nM或更小(例如约500nM或更小、约400nM或更小、约300nM或更小、约200nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小等)的半数最大抑制浓度(IC50)。在一些实施方案中，对于抑制CTLA4与CD80和/或CD86的结合，可活化结合多肽具有约100nM或更小的半数最大抑制浓度(IC50)。在一些实施方案中，当在约100nM或更大(例如约100nM或更大、约500nM或更大、约1μM或更大、约10μM或更大等)的浓度下提供时，可活化结合多肽完全抑制人CTLA4与CD80和/或CD86的结合。如本文所用，术语“完全抑制(complete inhibiting/completelyinhibits)”是指可活化结合多肽能够使第一蛋白与第二蛋白之间的结合降低至少约80％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％等)。测量多肽抑制第一蛋白(例如人CTLA4)和第二蛋白(例如人CD80或人CD86)的结合的能力的方法在本领域中是已知的，包括不限于通过BIAcore分析、ELISA测定和流式细胞计量术。
靶向CD137的可活化结合多肽
在一些实施方案中，本公开涉及结合人CD137的可活化结合多肽(即可活化抗体)，包括可活化抗CD137抗体、可活化抗CD137抗体的抗原结合片段、和/或可活化抗CD137抗体的衍生物。在一些实施方案中，可活化抗体包含：(a)从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)；和(b)抗体重链可变区(VH)。在一些实施方案中，可活化抗体包含：(a)从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VH)；和(b)抗体重链可变区(VL)。在一些实施方案中，可活化抗体包含：(a)从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中所述CM包含至少第一裂解位点(例如至少第一蛋白酶裂解位点)；并且其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在一些实施方案中，m是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n是3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，o是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，当CM未被裂解时，MM抑制可活化抗体与人CD137的结合。在一些实施方案中，当CM被裂解时，可活化抗体能够结合人CD137。在一些实施方案中，MM包含选自SEQ ID NO:79-85以及88-94的氨基酸序列，如表B中所列。
表B.可活化抗体的掩蔽肽序列
Figure BDA0002697663470000851
Figure BDA0002697663470000861
m是2-10；并且每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸。
在一些实施方案中，可活化结合多肽包含本文所述的任何抗CD137抗体，包括关于HVR、可变区(VL、VH)和/或轻链和重链(例如IgG1、IgG2、IgG4)的特定氨基酸序列所述的抗体。在一些实施方案中，抗CD137抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗CD137抗体是人源化抗体和/或嵌合抗体。
在一些实施方案中，可活化结合多肽包含：a)含有氨基酸序列FSLSTGGVGVGWI(SEQID NO:65)的HVR-H1、含有氨基酸序列LALIDWADDKYYSPSLKSRL(SEQ ID NO:66)的HVR-H2和含有氨基酸序列ARGGSDTVIGDWFAY(SEQ ID NO:67)的HVR-H3；和/或b)含有氨基酸序列RASQSIGSYLA(SEQ ID NO:68)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNLETGV(SEQ ID NO:69)的HVR-L2和含有氨基酸序列YCQQGYYLWT(SEQ ID NO:70)的HVR-L3。在一些实施方案中，可活化结合多肽包含：a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与SEQ IDNO:49具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；和/或b)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或与SEQID NO:50具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开涉及可活化结合多肽，所述可活化结合多肽当呈活性形式时(例如所述可活化结合多肽在可裂解部分中裂解(例如用一种或多种蛋白酶)之后是活性的，但在可裂解部分中裂解(例如用一种或多种蛋白酶)之前是非活性的)结合人CD137，并且具有以下功能性质中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者或全部八者)：(a)以500nM或更小的KD结合人CD137；(b)对人CD137具有激动活性；(c)在多达1000nM的浓度下不结合人OX40、CD40、GITR和/或CD27受体；(d)与猴、小鼠、大鼠和/或狗CD137具有交叉反应性；(e)不诱导ADCC效应；(f)能够抑制肿瘤细胞生长；(g)对癌症具有治疗作用；和(h)抑制CD137与CD137L之间的结合。在一些实施方案中，本文公开的可活化结合多肽还可抑制例如完全抑制CD137与它的配体CD137L之间的结合。本文还提供了一种或多种与本文所述的靶向CD137的可活化结合多肽和/或抗CD137抗体中的一者或多者交叉竞争结合人CD137的可活化结合多肽抗CD137抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈非活性形式时)以约500nM或更大的KD结合人CD137。在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈活性形式时)以约500nM或更小(例如约500nM或更小、约400nM或更小、约300nM或更小、约200nM或更小、约150nM或更小、约100nM或更小、约90nM或更小、约80nM或更小、约75nM或更小、约70nM或更小、约60nM或更小、约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约25nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、约0.1nM或更小等)的KD结合人CD137。在一些实施方案中，可活化结合多肽以约100nM或更小的KD结合人CD137。在一些实施方案中，可活化结合多肽以约50nM或更小的KD结合人CD137。测量可活化结合多肽的KD的方法可使用本领域中已知的任何方法进行，包括例如通过表面等离子体共振、ELISA、等温滴定量热法、滤膜结合测定、EMSA等。在一些实施方案中，KD通过ELISA测量(参见例如以下实施例5)。
在一些实施方案中，本文所述的可活化结合多肽(当呈活性形式时)对人CD137具有激动活性。在一些实施方案中，当表达人CD137的细胞(例如人细胞)由(活性)可活化结合多肽接触时，可活化结合多肽诱导人CD137的一种或多种(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种等)活性。各种CD137活性在本领域中是已知的，并且可包括不限于诱导NF-κB依赖性转录，诱导T细胞增殖，使T细胞存活延长，共刺激活化的T细胞，诱导细胞因子分泌(诸如IL-2)，以及诱导单核细胞活化。在一些实施方案中，一种或多种CD137活性不是CD137与它的配体的结合。测量CD137活性(例如对NF-κB依赖性转录和/或T细胞增殖的诱导等)的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可活化结合多肽使表达人CD137的细胞(例如人细胞)中NF-κB依赖性转录增加。在一些实施方案中，相对于未与可活化结合多肽接触的相应细胞(例如与同种型对照抗体接触的相应细胞)或与当呈非活性形式时的可活化结合多肽接触的相应细胞，在与(活性)可活化结合多肽接触的表达CD137的细胞(例如人细胞)中，NF-κB依赖性转录增加约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、或约99％或更多。在一些实施方案中，相对于未与可活化结合多肽接触的相应细胞(例如与同种型对照抗体接触的相应细胞)或与当呈非活性形式时的可活化结合多肽接触的相应细胞，在与可活化结合多肽(当呈活性形式时)接触的表达CD137的细胞(例如人细胞)中，NF-κB依赖性转录增加至约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍、1000倍或更多倍。
在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈非活性形式时)不与猴(例如食蟹猴)、小鼠、大鼠和/或狗CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈活性形式时)与猴(例如食蟹猴)、小鼠、大鼠和/或狗CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽与猴CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽与小鼠CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽与大鼠CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽与狗CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽与猴和小鼠CD137；猴和大鼠CD137；猴和狗CD137；小鼠和大鼠CD137；小鼠和狗CD137；大鼠和狗CD137；猴、小鼠和大鼠CD137；猴、小鼠和狗CD137；猴、大鼠和狗CD137；小鼠、大鼠和狗CD137；或猴、小鼠、大鼠和狗CD137具有交叉反应性。在一些实施方案中，可活化结合多肽在约100nM下(例如在约1nM下，在约10nM下，在约25nM下，在约50nM下，在约75nM下，在约100nM下)具有交叉反应性。测量交叉反应性的方法在本领域中是已知的，包括不限于表面等离子体共振、ELISA、等温滴定量热法、滤膜结合测定、EMSA等。
在一些实施方案中，可活化结合多肽不诱导ADCC效应。测量ADCC效应的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，相对于对照，可活化结合多肽(当呈活性形式或非活性形式时)不诱导ADCC效应超过约10％(不诱导ADCC超过约10％、超过约5％、超过约1％、超过约0.1％、超过约0.01％)。
在一些实施方案中，可活化结合多肽能够抑制肿瘤细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，相对于未与可活化结合多肽接触的相应肿瘤细胞(或相对于与同种型对照抗体接触的相应肿瘤细胞)，当与可活化结合多肽接触时，肿瘤细胞生长和/或增殖被抑制至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。在一些实施方案中，当向受试者施用可活化结合多肽时，可活化结合多肽能够使所述受试者中的肿瘤体积降低。在一些实施方案中，相对于受试者中的初始肿瘤体积(例如在施用可活化结合多肽之前；相较于被施用同种型对照抗体的受试者中的相应肿瘤)，可活化结合多肽能够使所述受试者中的肿瘤体积降低至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。监测肿瘤细胞生长/增殖、肿瘤体积和/或肿瘤抑制的方法在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，可活化结合多肽对癌症具有治疗作用。在一些实施方案中，可活化结合多肽使癌症的一种或多种征象或症状减轻。在一些实施方案中，当被施用可活化结合多肽时，罹患癌症的受试者得到部分或完全缓解。
在一些实施方案中，本公开提供了当呈活性形式时，与包含以下的抗体竞争或交叉竞争结合人CD137的经分离可活化结合多肽：a)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-H1；含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H2；和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H3；和/或b)含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-L1；含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L2；和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，本公开提供了当呈活性形式时，与包含以下的抗体竞争或交叉竞争结合人CD137的经分离可活化结合多肽：a)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区；和/或b)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区。可活化结合多肽与抗体竞争或交叉竞争结合的能力可使用本领域中已知的标准结合测定诸如BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞计量术来测定。举例来说，可使抗体(例如如上所述)在饱和条件下结合人CD137，接着测量测试可活化结合多肽(当呈活性形式时)结合CD137的能力。如果测试可活化结合多肽能够与抗体同时结合CD137，那么测试可活化结合多肽与抗体结合不同表位。然而，如果测试可活化结合多肽不能同时结合CD137，那么测试可活化结合多肽结合相同表位、重叠表位、或紧密邻近于由抗体结合的表位的表位。这个实验可使用各种方法诸如ELISA、RIA、FACS或表面等离子体共振来进行。
在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈非活性形式时)不抑制CD137与它的配体(例如人CD137与人CD137L)之间的结合。在一些实施方案中，可活化结合多肽(当呈活性形式时)抑制CD137与它的配体(例如人CD137与人CD137L)之间的结合。在一些实施方案中，可活化结合多肽在体外抑制CD137与它的配体之间的结合。在一些实施方案中，对于抑制CD137与它的配体的结合，可活化结合多肽(当呈活性形式时)具有约500nM或更小(例如约500nM或更小、约400nM或更小、约300nM或更小、约200nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小等)的半数最大抑制浓度(IC50)。在一些实施方案中，对于抑制CD137与它的配体的结合，可活化结合多肽具有约100nM或更小的半数最大抑制浓度(IC50)。在一些实施方案中，当在约100nM或更大(例如约100nM或更大、约500nM或更大、约1μM或更大、约10μM或更大等)的浓度下提供时，可活化结合多肽完全抑制人CD137与它的配体的结合。测量多肽抑制第一蛋白(例如CD137)和第二蛋白(例如CD137L)的结合的能力的方法在本领域中是已知的，包括不限于通过BIAcore分析、ELISA测定和流式细胞计量术。
抗体
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含本文所述的抗体(例如以上所述的CTLA4或CD137抗体)的可活化结合多肽。本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)可处于任何类别，诸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。在一些实施方案中，本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)处于IgG类别，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子类。使用本领域中已知的方法，可使本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)从一个类别或子类转变成另一类别或子类。用于产生处于所需类别或子类的抗体的一示例性方法包括以下步骤：分离编码本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的重链的核酸和编码本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的轻链的核酸，分离编码VH区的序列，使VH序列连接于编码所述所需类别或子类的重链恒定区的序列，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，以及收集抗体。
抗原结合片段
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含抗原结合片段(例如本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的抗原结合片段)的可活化结合多肽。
抗原结合片段可包含本文所述的任何抗体的任何序列。在一些实施方案中，抗原结合片段包含(1)本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的轻链；(2)本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的重链；(3)来自本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的轻链的可变区；(4)来自本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的重链的可变区；(5)本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的一个或多个HVR(例如一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR)；或(6)来自本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的轻链的三个HVR和来自本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的重链的三个HVR的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了抗体(结合人CTLA4)的一种抗原结合片段，所述抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含：含有氨基酸序列YSISSGYHWSWI(SEQID NO:59)的HVR-H1、含有氨基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL(SEQ ID NO:60)的HVR-H2和含有氨基酸序列ARSYVYFDY(SEQ ID NO:61)的HVR-H3；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含：含有氨基酸序列RASQSVRGRFLA(SEQ ID NO:62)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNRATGI(SEQ ID NO:63)的HVR-L2和含有氨基酸序列YCQQSSSWPPT(SEQ ID NO:64)的HVR-L3。在一些实施方案中，本公开提供了抗体的一种抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：a)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区；和/或b)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本公开提供了抗体(结合人CD137)的一种抗原结合片段，所述抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含：含有氨基酸序列FSLSTGGVGVGWI(SEQID NO:65)的HVR-H1、含有氨基酸序列LALIDWADDKYYSPSLKSRL(SEQ ID NO:66)的HVR-H2和含有氨基酸序列ARGGSDTVIGDWFAY(SEQ ID NO:67)的HVR-H3；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含：含有氨基酸序列RASQSIGSYLA(SEQ ID NO:68)的HVR-L1、含有氨基酸序列DASNLETGV(SEQ ID NO:69)的HVR-L2和含有氨基酸序列YCQQGYYLWT(SEQ ID NO:70)的HVR-L3。在一些实施方案中，本公开提供了抗体的一种抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：a)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区；和/或b)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的抗原结合片段包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)经分离CDR，和(vii)单链抗体(scFv)，其是包含抗体的VL区连接于抗体的VH区的多肽(参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。
抗体衍生物
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的衍生物的可活化结合多肽。
在一些实施方案中，抗体衍生物由修饰亲本抗体的氨基酸序列，同时保持亲本抗体氨基酸序列的总体分子结构来获得。可修饰亲本抗体链的任何区域的氨基酸序列，诸如框架区、HVR区或恒定区。修饰的类型包括对亲本抗体的一个或多个氨基酸进行的取代、***、缺失或它们的组合。
在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:47-50中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的VL或VH区。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:59或65中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-H1氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:60或66中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-H2氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:61或67中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-H3氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:62或68中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-L1氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:63或69中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-L2氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如以SEQ ID NO:64或70中的任一者阐述的氨基酸序列至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的HVR-L3氨基酸序列区域。
在一些特定实施方案中，衍生物包含对本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守性或非保守性取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个添加和/或缺失。
氨基酸取代涵盖保守性取代与非保守性取代两者。术语“保守性氨基酸取代”意指一个氨基酸被另一氨基酸替换，其中两个氨基酸在某些物理化学性质方面具有类似性，所述物理化学性质诸如所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质。举例来说，取代通常可在以下群组中的每一者内进行：(a)非极性(疏水性)氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷(碱性)氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)带负电荷(酸性)氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸。
修饰可在抗体的氨基酸序列的任何位置中进行，包括HVR、框架区或恒定区。在一个实施方案中，本公开提供了一种含有本文所述的说明性抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的VH和VL HVR序列，但含有与所述说明性抗体的那些框架序列不同的框架序列的抗体衍生物。所述框架序列可从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开参考文献获得。举例来说，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于Genbank数据库中或“VBase”人种系序列数据库中(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242(1991)；Tomlinson等,J.Mol.Biol.227:776-798(1992)；以及Cox等,Eur.J.Immunol.24:827-836(1994))。可用于构建抗体衍生物的框架序列包括在结构上与由本公开的说明性抗体使用的框架序列类似的那些。举例来说，可将说明性抗体的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列以及HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列移植于与见于框架序列所源于的种系免疫球蛋白基因中的框架区具有相同序列的框架区上，或可将HVR序列移植于相较于种系序列含有一个或多个突变的框架区上。
在一些实施方案中，抗体衍生物是包含本文所述的说明性抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的氨基酸序列的嵌合抗体。在一个实例中，来自一种或多种说明性抗体的一个或多个HVR与来自非人动物诸如小鼠或大鼠的抗体的HVR组合。在另一实例中，嵌合抗体的HVR全都源于一种或多种说明性抗体。在一些特定实施方案中，嵌合抗体包含一个、两个或三个来自说明性抗体的重链可变区的HVR和/或一个、两个或三个来自说明性抗体的轻链可变区的HVR。嵌合抗体可使用本领域中已知的常规方法产生。
另一类型的修饰是使VH和/或VL链的HVR区内的氨基酸残基突变。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变，并且可在本领域中已知的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目标功能性质的影响。通常，引入保守性取代。突变可为氨基酸添加和/或缺失。此外，通常改变HVR区内的至多一个、两个、三个、四个或五个残基。在一些实施方案中，抗体衍生物在重链HVR中和/或在轻链HVR中包含1、2、3或4个氨基酸取代。在另一实施方案中，氨基酸取代是使抗体中的一个或多个半胱氨酸变为另一残基，诸如不限于丙氨酸或丝氨酸。半胱氨酸可为典型或非典型半胱氨酸。在一个实施方案中，相对于说明性抗体的氨基酸序列，抗体衍生物在重链HVR区中具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代。
还可对VH和/或VL区内的框架残基进行修饰。通常，制备所述框架变体以降低抗体的免疫原性。一种方法是使一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。已经受体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的框架残基。可通过将抗体框架序列与抗体所源于的种系序列进行比较来鉴定所述残基。为使框架区序列返回至它们的种系配置，可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变使体细胞突变“回复突变”成种系序列。
此外，还可在说明性抗体的Fc区内进行修饰，通常用以改变抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。在一个实例中，修饰CH1的铰链区以使铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或降低。这个方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如有助于轻链和重链的组装或以增加或降低抗体的稳定性。在另一情况下，使抗体的Fc铰链区突变以降低所述抗体的生物半衰期。
此外，可根据本领域中已知的常规实验来修饰本公开的抗体以改变它的潜在糖基化位点或样式。在另一方面，本公开提供了本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的在轻链或重链的可变区中含有至少一个改变所述可变区中的糖基化样式的突变的衍生物。这种抗体衍生物就结合抗原来说可具有增加的亲和力和/或改变的特异性。突变可在V区中添加新糖基化位点，改变一个或多个V区糖基化位点的位置，或移除预先存在的V区糖基化位点。在一个实施方案中，本公开提供了在重链可变区中在天冬酰胺处具有潜在N连接的糖基化位点的本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的衍生物，其中在一个重链可变区中的所述潜在N连接的糖基化位点被移除。在另一实施方案中，本公开提供了在重链可变区中在天冬酰胺处具有潜在N连接的糖基化位点的本文所述的抗体(例如CTLA4或CD137抗体)的衍生物，其中在两个重链可变区中的所述潜在N连接的糖基化位点被移除。改变抗体的糖基化样式的方法在本领域中是已知的，诸如美国专利号6,933,368中所述的那些方法，所述美国专利的公开内容以引用的方式并入本文。
由本公开提供的其他抗体衍生物的实例包括单链抗体、微型双功能抗体、结构域抗体、纳米抗体和单抗体。“单链抗体”(scFv)由包含VL结构域连接于VH结构域的单一多肽链组成，其中VL结构域和VH结构域配对以形成单价分子。单链抗体可根据本领域中已知的方法制备(参见例如Bird等,(1988)Science 242:423-426以及Huston等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。“微型双功能抗体”由两个链组成，每个链在同一多肽链上包含重链可变区连接于轻链可变区，由短肽接头连接，其中在同一链上的两个区域不彼此配对，而是与在另一链上的互补性结构域配对以形成双特异性分子。制备微型双功能抗体的方法在本领域中是已知的(参见例如Holliger P.等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448以及Poljak R.J.等,(1994)Structure 2:1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的小型功能性结合单元，对应于抗体的重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞***中良好表达。结构域抗体及其产生方法的其他细节在本领域中是已知的(参见例如美国专利号6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684和0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609)。纳米抗体源于抗体的重链。纳米抗体通常包含单一可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)，并且保留原始抗体的抗原结合能力。纳米抗体可通过本领域中已知的方法制备(参见例如美国专利号6,765,087、美国专利号6,838,254、WO 06/079372)。单抗体由IgG4抗体的一个轻链和一个重链组成。单抗体可通过移除IgG4抗体的铰链区来制备。单抗体以及制备它们的方法的其他细节可见于WO2007/059782中。
VII.组合物
在其他方面，本公开提供了一种包含本文所述的多肽(例如可活化结合多肽)中的一者或多者的组合物。在一些实施方案中，组合物是包含多肽(例如可活化结合多肽)和药学上可接受的载体的药物组合物。组合物可通过本领域中已知的常规方法制备。
术语“药学上可接受的载体”是指适合在用于递送多肽(例如可活化结合多肽)的制剂中使用的任何非活性物质。载体可为防粘剂、粘合剂、包覆剂、崩解剂、填充剂或稀释剂、防腐剂(诸如抗氧化剂、抗细菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。适合药学上可接受的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、右旋糖、植物油(诸如橄榄油)、盐水、缓冲剂、缓冲盐水、以及等张剂诸如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
组合物可呈任何适合形式，诸如液体、半固体和固体剂型。液体剂型的实例包括溶液(例如可注射和可输注溶液)、微乳液、脂质体、分散液或混悬液。固体剂型的实例包括片剂、丸剂、胶囊、微胶囊和粉剂。适于递送多肽(例如可活化结合多肽)的组合物的一特定形式是无菌液体，诸如用于注射或输注的溶液、混悬液或分散液。无菌溶液可通过将多肽(例如可活化结合多肽)以所需量并入适当载体中，继之以灭菌微滤来制备。分散液可通过将多肽(例如可活化结合多肽)并入含有基本分散介质和其他载体的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌液体的无菌粉剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)，以产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。组合物的各种剂型可通过本领域中已知的常规技术制备。
包括在组合物中的多肽(例如可活化结合多肽)的相对量将视许多因素而变化，诸如所用特定多肽和载体、剂型、以及所需释放和药物效应动力学特征。多肽(例如可活化结合多肽)在单一剂型中的量将通常是产生治疗作用的那个量，但还可为更小量。通常，相对于剂型的总重量，这个量将在约0.01％至约99％、约0.1％至约70％、或约1％至约30％的范围内。
除多肽(例如可活化结合多肽)之外，还可在组合物中包括一种或多种额外治疗剂。本文在以下描述额外治疗剂的实例。待包括在组合物中的额外治疗剂的适合量可易于由本领域技术人员选择，并且将视许多因素而变化，诸如所用特定药剂和载体、剂型、以及所需释放和药物效应动力学特征。包括在单一剂型中的额外治疗剂的量将通常是药剂的产生治疗作用的那个量，但也可为更小量。
本文所述的任何多肽(例如可活化结合多肽)和/或组合物(例如药物组合物)都可用于制备药剂(例如用于治疗有需要的受试者的癌症或延迟所述癌症的进展的药剂)。
VIII.可活化结合多肽和药物组合物的用途
由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)及其药物组合物可用于治疗、诊断或其他目的，诸如调节免疫应答，治疗癌症，使其他癌症疗法的功效增强，使疫苗功效增强，或治疗自体免疫疾病。因此，在其他方面，本公开提供了使用多肽(例如可活化结合多肽)或其药物组合物的方法。在一个方面，本公开提供了一种治疗哺乳动物的病症的方法，所述方法包括向需要治疗的所述哺乳动物施用有效量的由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)或其组合物。在一些实施方案中，多肽是当呈活性形式时结合CTLA4(例如人CTLA4)或CD137(例如人CD137)的可活化结合多肽。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，病症是癌症。多种癌症可用由本公开提供的方法、用途或药剂治疗或预防。所述癌症的实例包括肺癌诸如支气管癌(例如鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨瘤性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌诸如黏液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌诸如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞肿瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤因氏肿瘤(Ewing's tumor)(尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma))和网状细胞肉瘤；脑癌诸如神经胶质瘤(例如多形性胶质母细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、寡树突神经胶质细胞瘤、神经管母细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑脊髓膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化***中的癌症诸如平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌诸如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌诸如肾腺癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤和肾盂移行细胞癌；膀胱癌；血液癌症诸如急性淋巴细胞性(淋巴母细胞性)白血病、急性骨髓性(髓细胞性、骨髓源性、髓母细胞性、髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如西泽里综合征(Sezary syndrome)和毛细胞白血病)、慢性髓细胞性(骨髓性、骨髓源性、粒细胞性)白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和骨髓增生性病症(包括诸如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性髓细胞性白血病的骨髓增生性病症)；皮肤癌诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)和佩吉特氏病(Paget's disease)；头颈部癌；眼相关癌诸如视网膜母细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖***癌诸如良性***肥大、***癌和睾丸癌(例如***瘤、畸胎瘤、胚性癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；雌性生殖***癌诸如子宫癌(子宫内膜癌)、子***(***)、卵巢癌(卵巢癌瘤)、外阴癌、***癌、输卵管癌和***；甲状腺癌(包括***状、滤泡性、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长物；胰腺癌；以及血液癌症诸如白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。
在另一方面，本公开提供了一种使哺乳动物中的免疫应答增强的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)或其组合物。在一些实施方案中，多肽是结合CTLA4(例如人CTLA4)或CD137(例如人CD137)的可活化结合多肽，并且哺乳动物是人。术语“使免疫应答增强”或它的语法变化形式意指刺激、激起、增加、改进或加强哺乳动物的免疫***的任何应答。免疫应答可为细胞应答(即由细胞介导，诸如由细胞毒性T淋巴细胞介导)或体液应答(即由抗体介导)，并且可为初级或次级免疫应答。使免疫应答增强的实例包括使PBMC和/或T细胞活化(包括使一种或多种细胞因子诸如IL-2和/或IFNγ的分泌增加)。免疫应答的增强可使用为本领域技术人员所知的许多体外或体内测量来评估，包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定、细胞因子的释放、肿瘤的消退、携带肿瘤的动物的存活期、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标志物的表达、以及细胞毒性。通常，当相较于由未治疗哺乳动物或未使用所叙述方法治疗的哺乳动物达成的免疫应答时，本公开的方法使由哺乳动物达成的免疫应答增强。
在实施治疗方法时，多肽(例如可活化结合多肽)可作为单药疗法单独施用，或与一种或多种额外治疗剂或疗法组合施用。因此，在另一方面，本公开提供了一种包含多肽(例如可活化结合多肽)与一种或多种用于分开、依序或同时施用的额外疗法或治疗剂组合的组合疗法。术语“额外治疗剂”可指除由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)以外的任何治疗剂。在一个特定方面，本公开提供了一种用于治疗哺乳动物的癌症的组合疗法，所述组合疗法包括向所述哺乳动物施用有效量的本文提供的多肽(例如可活化结合多肽)与一种或多种额外治疗剂组合。在另一实施方案中，哺乳动物是人。
广泛多种癌症治疗剂可与由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)组合使用。本领域普通技术人员将认识到可与本公开的方法和多肽组合使用的其他癌症疗法的存在和发展，并且将不限于本文阐述的那些疗法形式。可用于用以治疗癌症的组合疗法中的额外治疗剂的种类的实例包括(1)化学治疗剂，(2)免疫治疗剂，和(3)激素治疗剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是病毒基因疗法、免疫检查点抑制剂、靶向疗法、放射疗法和/或化学治疗剂。
术语“化学治疗剂”是指可导致癌细胞死亡，或干扰癌细胞的生长、***、修复和/或功能的化学或生物物质。化学治疗剂的实例包括WO 2006/129163和US 20060153808中公开的那些，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。特定化学治疗剂的实例包括：(1)烷基化剂，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)(瘤克宁(LEUKERAN))、环磷酰胺(癌得星(CYTOXAN))、异环磷酰胺(ifosfamide)(伊弗克斯(IFEX))、盐酸二氯甲基二乙胺(mechlorethamine hydrochloride)(盐酸氮芥(MUSTARGEN))、噻替派(thiotepa)(噻普勒斯(THIOPLEX))、链脲佐菌素(streptozotocin)(链佐星(ZANOSAR))、卡莫司汀(carmustine)(比克纽(BICNU)、格立得糯米纸囊剂(GLIADEL WAFER))、洛莫司汀(lomustine)(斯思尤(CEENU))和达卡巴嗪(dacarbazine)(甲氮咪胺(DTIC-DOME))；(2)生物碱或植物长春花生物碱，包括细胞毒性抗生素，诸如多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(ADRIAMYCIN))、表柔比星(epirubicin)(艾棱斯(ELLENCE)、泛艾霉素(PHARMORUBICIN))、柔红霉素(daunorubicin)(司比定(CERUBIDINE)、柔红霉素脂质体(DAUNOXOME))、奈莫柔比星(nemorubicin)、伊达比星(idarubicin)(伊达霉素无防腐剂溶液(IDAMYCIN PFS)、善唯达(ZAVEDOS))、米托蒽醌(mitoxantrone)(DHAD、诺凡特龙(NOVANTRONE))、更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(actinomycin D)、可美净(COSMEGEN))、光神霉素(plicamycin)(光辉霉素(MITHRACIN))、丝裂霉素(mitomycin)(突变霉素(MUTAMYCIN))和博莱霉素(bleomycin)(布兰诺克塞(BLENOXANE))、酒石酸长春瑞滨(vinorelbinetartrate)(诺维本(NAVELBINE))、长春花碱(vinblastine)(维尔班(VELBAN))、长春新碱(vincristine)(昂可文(ONCOVIN))和长春地辛(vindesine)(癌的散(ELDISINE))；(3)抗代谢剂，诸如卡培他滨(capecitabine)(希罗达(XELODA))、阿糖胞苷(cytarabine)(塞特沙-U(CYTOSAR-U))、氟达拉滨(fludarabine)(福达华(FLUDARA))、吉西他滨(gemcitabine)(健择(GEMZAR))、羟基脲(hydroxyurea)(海卓(HYDRA))、甲氨蝶呤(methotrexate)(福勒克斯(FOLEX)、麦沙特(MEXATE)、曲夏尔(TREXALL))、奈拉滨(nelarabine)(阿仑恩(ARRANON))、三甲曲沙(trimetrexate)(宁赐新(NEUTREXIN))和培美曲塞(pemetrexed)(爱宁达(ALIMTA))；(4)嘧啶拮抗剂，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)；卡培他滨(希罗达)、雷替曲塞(raltitrexed)(图姆戴克斯(TOMUDEX))、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)(优服托拉(UFTORAL))和吉西他滨(健择)；(5)紫杉烷，诸如多西他赛(docetaxel)(泰索帝(TAXOTERE))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(泰素(TAXOL))；(6)铂药物，诸如顺铂(cisplatin)(帕拉汀洛(PLATINOL))和卡铂(carboplatin)(伯尔定(PARAPLATIN))以及奥沙利铂(oxaliplatin)(乐沙定(ELOXATIN))；(7)拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康(irinotecan)(开普拓沙(CAMPTOSAR))、拓扑替康(topotecan)(癌康定(HYCAMTIN))、依托泊苷(etoposide)(凡毕复(ETOPOPHOS)、灭必治(VEPESSID)、托普萨(TOPOSAR))和替尼泊苷(teniposide)(威猛(VUMON))；(8)表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物)，诸如依托泊苷(凡毕复、灭必治、托普萨)；(9)叶酸衍生物，诸如甲酰四氢叶酸(leucovorin)(维尔卡伏(WELLCOVORIN))；(10)亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(比克纽)、洛莫司汀(斯思尤)；(11)包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素受体、***受体(IGFR)、肝细胞生长因子受体(HGFR)和血小板源性生长因子受体(PDGFR)的受体酪氨酸激酶的抑制剂，诸如吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙(IRESSA))、埃罗替尼(erlotinib)(塔西瓦(TARCEVA))、硼替佐米(bortezomib)(维尔科德(VELCADE))、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(格列卫(GLEEVEC))、吉非替尼(genefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、沙利度胺(thalidomide)、舒尼替尼(sunitinib)(舒腾特(SUTENT))、阿西替尼(axitinib)、利妥昔单抗(rituximab)(利妥星(RITUXAN)、美罗华(MABTHERA))、曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(HERCEPTIN))、西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥(ERBITUX))、贝伐单抗(bevacizumab)(阿伐斯汀(AVASTIN))和雷珠单抗(ranibizumab)(诺适得(LUCENTIS))、lym-1(安可临(ONCOLYM))、WO2002/053596中公开的针对***-1受体(IGF-1R)的抗体；(12)血管生成抑制剂，诸如贝伐单抗(阿伐斯汀)、苏拉明(suramin)(各莫素(GERMANIN))、血管抑素(angiostatin)、SU5416、沙利度胺和基质金属蛋白酶抑制剂(诸如巴马司他(batimastat)和马立马司他(marimastat))以及WO2002055106中公开的那些；和(13)蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(维尔科德)。
术语“免疫治疗剂”是指可使哺乳动物的免疫应答增强的化学或生物物质。免疫治疗剂的实例包括：卡介苗(BCG)；细胞因子，诸如干扰素；疫苗，诸如MyVax个性化免疫疗法、Onyvax-P、安可菲(Oncophage)、GRNVAC1、法维得(Favld)、普罗温基(Provenge)、吉瓦克斯(GVAX)、洛瓦新C(Lovaxin C)、拜瓦希得(BiovaxID)、吉姆克斯(GMXX)和纽瓦克斯(NeuVax)；以及抗体，诸如阿来珠单抗(alemtuzumab)(坎帕斯(CAMPATH))、贝伐单抗(阿伐斯汀)、西妥昔单抗(爱必妥)、奥佐米星吉妥单抗(gemtuzunab ozogamicin)(米洛他(MYLOTARG))、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(泽瓦林(ZEVALIN))、帕尼单抗(panitumumab)(维克替比(VECTIBIX))、利妥昔单抗(利妥星、美罗华)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、托西莫单抗(tositumomab)(百克沙(BEXXAR))、易普利单抗(ipilimumab)(叶沃(YERVOY))、曲美木单抗(tremelimumab)、CAT-3888、针对OX40受体的激动抗体(诸如WO2009/079335中公开的那些)、针对CD40受体的激动抗体(诸如WO2003/040170中公开的那些)和TLR-9激动剂(诸如WO2003/015711、WO2004/016805和WO2009/022215中公开的那些)。
术语“激素治疗剂”是指抑制或消除激素的产生，或抑制或抵抗激素对癌性细胞的生长和/或存活的影响的化学或生物物质。适于本文方法的所述药剂的实例包括US20070117809中公开的那些。特定激素治疗剂的实例包括他莫昔芬(tamoxifen)(洛尔瓦德(NOLVADEX))、托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))、氟维司群(fulvestrant)(法斯洛德(FASLODEX))、阿那曲唑(anastrozole)(安美达(ARIMIDEX))、依西美坦(exemestane)(阿诺新(AROMASIN))、来曲唑(letrozole)(弗隆(FEMARA))、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(美格思(MEGACE))、戈舍瑞林(goserelin)(诺雷德(ZOLADEX))和亮脯利特(leuprolide)(利普安(LUPRON))。本公开的结合分子还可与非药物激素疗法组合使用，所述非药物激素疗法诸如(1)移除参与产生激素的器官或腺体诸如卵巢、睾丸、肾上腺和垂体腺的全部或一部分的手术方法，和(2)放射治疗，其中使患者的器官或腺体经受数量足以抑制或消除所靶向激素的产生的放射。
在一些实施方案中，额外治疗剂是以下中的一者或多者：泊马莱斯特、雷利米德、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、DNA烷基化含铂衍生物顺铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、抗CD137抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗DR5抗体、抗CD1d抗体、抗TIM3抗体、抗SLAMF7抗体、抗KIR受体抗体、抗OX40抗体、抗HER2抗体、抗ErbB-2抗体、抗EGFR抗体、西妥昔单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕母单抗、放射疗法、单次剂量放射、分次放射、局灶性放射、全器官放射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受体、继承性转移的T细胞、抗癌疫苗和溶瘤性病毒。
用于治疗癌症的组合疗法还涵盖结合分子与用以移除肿瘤的手术的组合。结合分子可在手术之前、期间或之后向哺乳动物施用。
用于治疗癌症的组合疗法还涵盖多肽(例如可活化结合多肽)与放射疗法诸如离子化(电磁)放射疗法(例如X射线或γ射线)和粒子束放射疗法(例如高线性能量放射)的组合。放射源可在哺乳动物的外部或内部。多肽可在放射疗法之前、期间或之后向哺乳动物施用。
由本公开提供的多肽(例如可活化结合多肽)及其组合物可通过任何适合经肠施用途径或胃肠外施用途径施用。术语“经肠施用途径”是指通过胃肠道的任何部分来施用。经肠途径的实例包括口服、经粘膜、经颊和经直肠途径，或胃内途径。“胃肠外施用途径”是指除经肠途径以外的施用途径。胃肠外施用途径的实例包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、肿瘤内、膀胱内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、经气管、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内、皮下或经表面施用。本公开的多肽(例如可活化结合多肽)和组合物可使用任何适合方法施用，诸如通过口服摄取、鼻饲管、胃造口管、注射、输注、可植入输注泵和渗透泵。适合施用途径和方法可视许多因素而变化，诸如所用特定多肽、所需吸收速率、所用特定制剂或剂型、所治疗病症的类型或严重性、特定作用部位以及患者的状况，并且可易于由本领域技术人员选择。
术语结合分子的“有效量”可指有效达成预定治疗目的的量。举例来说，在使免疫应答增强的情形下，“有效量”可为有效刺激、激起、增加、改进或加强哺乳动物的免疫***的任何应答的任何量。在治疗疾病的情形下，“有效量”可为足以在所治疗哺乳动物中导致任何合乎需要或有益的作用的任何量。特别地，在治疗癌症的情况下，合乎需要或有益的作用的实例包括抑制癌细胞的进一步生长或扩散，使癌细胞死亡，抑制癌症的复发，减轻与癌症相关的疼痛，或改进哺乳动物的存活期。本文所述的多肽(例如可活化结合多肽)的有效量可在哺乳动物的每kg体重约0.001至约500mg，或在约0.01至约100mg/kg的范围内。举例来说，量可为哺乳动物的每kg体重约0.3mg、1mg、3mg、5mg、10mg、50mg或100mg。在一些实施方案中，本公开的多肽(例如可活化结合多肽)的有效量在哺乳动物的每kg体重约0.01-30mg的范围内。在一些其他实施方案中，本公开的多肽(例如可活化结合多肽)的有效量在哺乳动物的每kg体重约0.05-15mg的范围内。待施用的精确剂量水平可易于由本领域技术人员确定，并且将取决于许多因素，诸如待治疗病症的类型和严重性、采用的特定多肽、施用途径、施用时间、治疗的持续时间、采用的特定额外疗法、所治疗患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康状况和先前医学史，以及医学领域中熟知的类似因素。
可在多个时刻施用多肽(例如可活化结合多肽)或其组合物。单一剂量之间的间隔可为例如每日、每周、每月、每三个月或每年。一示例性治疗方案需要每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，一个月一次，每三个月一次或每三至六个月一次进行施用。用于本公开的多肽(例如可活化结合多肽)的剂量方案可包括通过静脉内施用，每kg体重1mg或每kg体重3mg，使用以下给药时程中的一者：(i)每四周，持续六次剂量，接着每三个月；(ii)每三周；(iii)每kg体重3mg，1次，继之以每三周，每kg体重1mg。
IX.试剂盒
在另一方面，本文提供了一种包括本公开的多核苷酸的文库的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包括包装插页，所述包装插页包含关于表达、修饰、筛选或以其他方式使用文库例如以鉴定目标可活化结合多肽的说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种例如用于储存、转移、转染或以其他方式使用多核苷酸(例如合成多核苷酸)中的一者或多者的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个用于储存多核苷酸中的一者或多者的容器。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种例如用于用多核苷酸中的一者或多者来转染宿主细胞的载体。
在另一方面，本文提供了一种包括本文所述的可活化结合多肽和/或组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包括包装插页，所述包装插页包含关于使用可活化结合多肽和/或组合物的说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种例如用于储存、转移、施用或以其他方式使用可活化结合多肽和/或组合物的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个用于储存或施用可活化结合多肽和/或组合物的容器(例如注射器等)。
先前书面描述被视为足以使得本领域技术人员能够实施本公开。以下实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本公开的范围。实际上，除本文显示和描述的那些修改之外，根据先前描述，本公开的各种修改将变得为本领域技术人员显而易知，并且落在随附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：鉴定用于可活化结合多肽的自阻断肽的方法
如上所述，存在对可用于鉴定用于可活化结合多肽的自阻断肽的改进方法和产品的需要。因此，本文描述一种已被设计和执行以高效发现具有良好可开发性的掩蔽部分的新***。在这个***中，首先使靶标抗体片段Fab(图1)或scFv(图2)展示在酵母表面上，并且确认在结合它的抗原方面具有功能性。接着，使改进的肽文库直接融合于轻链的N末端，并且构建在酵母表面上展示融合蛋白的酵母文库。酵母文库接着经受若干轮基于FACS的筛选：首先，使与抗原具有低结合的酵母克隆富集，接着用蛋白酶处理经富集酵母克隆以移除N末端肽，并且选择与抗原具有高结合的克隆(图1和图2)。在4-5轮分选之后，从这些克隆提取质粒，并且通过DNA测序来确认掩蔽肽序列。
存在被构建至这个新***中的若干独特特征，所述若干独特特征使得在鉴定具有良好可开发性的用于靶标抗体的掩蔽肽方面是强力的：
1)肽文库直接融合于靶标抗体片段的N末端而非任何外来骨架蛋白，并且掩蔽肽在与最终产品相同的情形下被发现。这消除了假阳性肽序列的污染，并且使用于它们的下游表征的工作量显著降低。
2)蛋白酶裂解介导的活化机制被整合至筛选过程中。这将确保所发现的肽不仅在活化之前掩蔽抗原结合，而且在蛋白酶裂解之后不再阻断抗原结合。这些是关于有资格作为用于任何可活化抗体的良好掩蔽肽而考虑的先决条件。
3)采用了肽文库的改进设计。不同于通常使用的随机肽文库，在肽文库中将一对半胱氨酸残基引入固定位置中，以确保展示肽具有受约束构象。观察到受约束肽倾向于展现增加的结合亲和力和特异性(Uchiyama等(2005)99(5):448-56)。不同于广泛使用的编码包括化学不稳定残基诸如M和W的全部20种残基的NNK(或NNS)密码子，在肽文库的一部分或全部中采用了NHC密码子。NHC密码子编码12种氨基酸残基(D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P)，并且不包括不利于制造过程的残基，诸如甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸。此外，相对于NNK(或NNS)密码子，使用NHC密码子还使理论肽文库大小显著降低，因此，使得能够构建具有好得多的覆盖度的文库。当针对不同靶标抗体加以测试时，这些文库表现良好。
实施例2：对受约束肽文库(CPL)的设计
设计了四个示例性受约束肽文库(CPL)(表1)。
表1：设计的CPL
Figure BDA0002697663470001101
每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸
在它们的核心处的是序列Z6CX6CZ2(SEQ ID NO:55)或Z6CX8CZ2(SEQ ID NO:56)，并且两个固定半胱氨酸残基形成二硫键以使肽构象受约束。在所合成寡核苷酸中，在除环内部之外的所有位置都采用简并密码子NHC，其中在CPL011和CPL013中还采用NNK密码子。与NNK或NNS密码子相比，NHC密码子编码12种残基(表2)，从而涵盖显著多样性，但缺乏化学不稳定残基甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。此外，相较于NNK或NNS密码子，理论多样性降低使得能够构建具有更好覆盖度的文库。
表2：NHC密码子
Figure BDA0002697663470001111
在这些掩蔽肽序列之后是不变的裂解肽序列(SGRSAGGGGSPLGLAGSGGS，SEQ IDNO:12)，含有两个蛋白酶识别位点：供蛋白酶尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)使用的SGRSA(SEQ ID NO:13)，以及供蛋白酶基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)使用的PLGLAG(SEQ ID NO:14)。这些识别位点已由许多团体用于靶向剂的体内肿瘤细胞特异性活化中(参见例如Ke等(1997)J Biol Chem 272(33):20456-62；Gerspach等(2006)Cancer Immunol Immunother 55(12):1590-600；以及Jiang等(2004)Proc NatlAcad Sci USA 101(51):17867-72)。在基于酵母的筛选期间，由于TEV蛋白酶的可用性和特异性，所以MMP-9识别序列用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别序列(ENLYFQG，SEQ ID NO:15)替换。
使CPL和不变的裂解肽融合于呈scFv或Fab形式的靶标抗体的轻链的N末端，所述靶标抗体连接于酵母表面展示的Aga2蛋白。对替代TEV蛋白酶识别位点的包括在鉴定正确类型的掩蔽肽序列方面是重要的，即抗原结合在蛋白酶裂解之前被阻断，并且抗原结合在蛋白酶裂解之后能够实现。以下描述的实施例证明初始在酵母的情况下显示的可活化抗体的裂解活化机制在哺乳动物细胞中表达的完全IgG分子的情况下得以重现。
实施例3：靶向CTLA4的可活化抗体的构建和验证
在酵母表面上展示功能性靶标抗体
低拷贝数的基于CEN/ARS的载体用于在诱导型GAL1-10启动子的控制下在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达靶标抗体(靶向人CTLA4的抗体TY21580)。scFv的表面展示在GAL1启动子的控制下通过融合在它的C末端的Aga2蛋白来实现，这类似于先前公开的排列(Boder和Wittrup(1997)Nat Biotechnol 15(6):553-7)。对于Fab，它们的表面展示在GAL1启动子的控制下通过融合于重链(VH和CH1的融合)的N末端的Aga2蛋白来实现，而轻链(VL和CL的融合)在GAL10启动子的控制下。Fab通过轻链与膜锚定重链的缔合的来展示在酵母表面上。
Fab或scFv的表面展示通过用识别融合亲和标签的抗体进行染色来验证，并且使用生物素化人CTLA4考查展示在酵母上的Fab或scFv的功能性。简要来说，在半乳糖培养基中诱导之后48小时，收集酵母细胞(1x10^6)，用PBSA缓冲液洗涤一次，接着与10nM生物素化抗原一起在室温下孵育1小时。酵母细胞接着用PBSA缓冲液洗涤两次，并且与PE缀合的链霉亲和素(1:500稀释)(eBioscience#2-4317-87)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过流式细胞计量术分析酵母细胞。如图3A-图3B中所示，靶向CTLA4的Fab(图3A)与scFv(图3B)两者均成功展示在酵母表面上，并且均能够强烈结合它们的抗原。
含有CPL的酵母文库的构建
通过5个PCR循环来使编码CPL的所合成寡核苷酸与编码裂解肽的寡核苷酸融合。所用引物(F引物和R引物)列于表3中。PCR反应的组合物是：1X PrimeSTAR缓冲液、2.5mMdNTP、各100μM的F引物和R引物、以及各100μM模板1(CPL寡核苷酸)和模板2(编码裂解肽的寡核苷酸)、以及2.5U PrimeSTAR HS DNA聚合酶。所用PCR程序是：a)1个循环的96℃持续5分钟；2)5个循环的96℃(15秒)、60℃(15秒)、72℃(6秒)；和3)1个循环的72℃持续3分钟。核酸外切酶I用于消化单链DNA，随后通过凝胶电泳来纯化PCR产物。纯化PCR产物接着用BamHI和KpnI消化，并且克隆至用相同两种限制酶消化的细菌过滤载体中。在过滤载体中，CPL和裂解肽被放置在细菌分泌信号肽的下游，并且在缺乏信号序列的β-内酰胺酶的上游。在氨苄青霉素板上选择的功能性β-内酰胺酶指示CPL和裂解肽的同框融合，由此消除引入所合成简并寡核苷酸中的任何框外错误(N-1或N-2)。此外，还从汇合物减少一些不良折叠的序列。将连接产物转化至电感受态细菌细胞中，并且CPL文库的多样性通常在5x10^9与1x10^10之间。对单个克隆的测序指示通过这个方法实现了极高同框率(在许多情况下，几乎100％)。
表3：PCR引物
Figure BDA0002697663470001131
为制备含有CPL的酵母文库，从细菌文库提取质粒，并且作为模板用于PCR扩增编码CPL和裂解肽的DNA片段。所用引物(PL0009_F和BL1024_R)列于表3中。所扩增PCR片段通过凝胶电泳来纯化，并且连同表达融合于Aga2的靶标抗体的线性化质粒一起转化至电感受态酵母细胞中。在PCR片段和质粒的两个末端上的同源序列确保在酵母细胞内部的高效同源性重组。所构建酵母文库的多样性通常在1x10^9至2x10^9之间。
基于FACS的对针对CTLA4抗体的掩蔽肽的筛选
来自CPL酵母文库的总计1x10^8个酵母细胞用于筛选针对靶标抗体的掩蔽肽。对于通过MoFlo XDP进行的每轮分选，收集在半乳糖培养基中诱导的酵母细胞，用PBSA缓冲液洗涤一次，接着与10nM(在稍后各轮中降低至1nM)生物素化抗原一起在室温下孵育1小时。酵母细胞接着用PBSA缓冲液洗涤两次，并且与PE缀合的链霉亲和素(1:500稀释)(eBioscience#2-4317-87)一起在4℃下孵育30分钟。在用PBSA缓冲液再洗涤两次之后，将酵母细胞调整至2-3OD/mL，并且经受分选。如图4中所示，在第1轮中，使用10nM生物素化CTLA4-Fc，并且使微弱结合剂富集。来自第1轮的酵母细胞在葡萄糖培养基中生长之后，在半乳糖培养基中诱导并用AcTEV蛋白酶(6U/OD细胞)(Thermo Fisher Scientific#12575015)在30℃下处理2小时，并且纯化强力结合剂。从第3轮分选开始，生物素化CTLA4-Fc的浓度降低至1nM，并且收集微弱结合剂。在第4轮，还用AcTEV并行处理各个酵母细胞部分，以验证蛋白酶裂解介导的对靶标抗体的活化。如图4中所示，明显的是AcTEV裂解导致强烈结合于抗原的细胞群体的显著增加，从而表明筛选策略是有效的。将来自第5轮分选的单一克隆涂铺在选择性培养基上，并且使其单个地生长以进一步确认裂解介导的抗原结合活化。
如图5A-图5B中所示，呈scFv(图5A)或Fab(图5B)形式的所选CTLA4可活化抗体克隆在掩蔽肽存在下展现少许与抗原的结合。然而，当用TEV蛋白酶处理酵母细胞以移除掩蔽肽时，与抗原的结合显著增加。在裂解肽中并入TEV识别位点与应用TEV蛋白酶来验证所选克隆的组合使选择掩蔽肽的成功率显著增加。
为鉴定掩蔽肽序列，从所选酵母克隆提取穿梭质粒(Generay#GK2002-200)，并且转化至感受态大肠杆菌细胞中。制备质粒，并且对编码掩蔽肽的区域测序并加以比对。如所预期，这些序列可分成若干组，从而指示通过各轮分选达成的明确富集。四组掩蔽肽序列连同不变的裂解肽序列一起列于表4中。
表4：掩蔽肽序列
Figure BDA0002697663470001151
IgG转化和表达
使表4中所列的四组掩蔽肽以及源于它们中的两者(B13192和B13197)的用以消除潜在糖基化位点的额外四种掩蔽肽序列(表5)转化至IgG1中。
表5：额外掩蔽肽序列
Figure BDA0002697663470001152
Figure BDA0002697663470001161
将重链和轻链分别克隆至哺乳动物表达载体pCDNA3.3(Thermo FisherScientific，目录号K830001)中，并且使掩蔽肽和不变的裂解肽以与在酵母表面上展示相同的方式融合于轻链的N末端。以下列出亲本CTLA4抗体(TY21580)的VH和VL序列(也参见以代理人案号69540-2000540与本文并行提交的题为“Compositions Comprising Cross-reactive Anti-CTLA4 Antibodies,and Methods of Making and Using the Same”的PCT国际申请，所述PCT国际申请以引用的方式整体并入本文)：
抗CTLA4重链可变区(SEQ ID NO:47)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWSWIRQAPGKGLEWLARIDWDDDKYYSTSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARSYVYFDYWGQGTLVTVSS
抗CTLA4轻链可变区(SEQ ID NO:48)：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRGRFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSSWPPTFGQGTKVEIKR。
将各对质粒短暂转染至HEK293F细胞中。在六天之后，收集上清液，通过离心和过滤加以澄清化，并且IgG用标准蛋白A亲和色谱法(MabSelect SuRe，GE Healthcare)纯化。将IgG洗脱并中和，并且进行缓冲液交换以进入PB缓冲液(20mM磷酸钠、150mM NaCl，pH7.0)中。蛋白质浓度通过紫外分光光度测定法来测定，并且在变性、还原性和非还原性条件下通过SDS-PAGE或SEC-HPLC来分析IgG纯度。重要的是，可活化抗体在HEK293细胞中的表达水平类似于它们的亲本抗体，并且它们在蛋白A树脂之后的纯化产率也类似，从而表明掩蔽肽和裂解肽的存在不对抗体在哺乳动物细胞中的表达具有负性影响。
对掩蔽效率的测量
ForteBio Octet RED96***(Pall，USA)用于快速评估掩蔽肽的效率。简要来说，以并行方式将可活化抗体(以及它们的亲本抗体TY21580)在KB缓冲液(补充以0.02％吐温20和0.1％BSA的PBS缓冲液)中稀释至30μg/mL，并且由抗人IgG捕集(AHC)生物传感器(Pall，USA)捕集。接着使传感器与His标签化CTLA4蛋白(25nM)缔合300秒，接着在KB缓冲液中解离又300秒。根据制造商的指导方针，使用ForteBio数据分析7.1(Pall，USA)，将缔合和解离曲线相对于1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型加以拟合。如图6A-图6B中所示，以可活化抗体实现的响应显著低于以亲本抗体实现的响应，从而表明掩蔽肽有效阻断抗体与它的抗原的结合。然而，在四种可活化抗体之中，TY22401的有效性较小，这与来自以下讨论的ELISA测定的结果一致。
将重组人CTLA4-Fc在PBS中稀释至1μg/mL，并且在4℃下在Maxisorp板上包被过夜。将板用补充以3％脱脂奶的PBS在37℃下封闭1小时。在洗涤之后，将100μL 3倍连续稀释的抗体添加至每个孔中。在37℃下孵育1小时之后，将板洗涤四次，并且将100μL HRP缀合的抗人IgG(Fab特异性)抗体(1:6000稀释)添加至每个孔中。将板在37℃下孵育1小时，洗涤四次，接着将50μL TMB底物溶液添加至每个孔中，并且将板在室温下孵育。在用每孔50μLH2SO4使反应终止之后测量在450nm下的吸光度。通过使用GraphPad Prism 6软件的不对称S形(五参数逻辑方程)模型拟合ELISA数据来评估EC50。对可活化抗体TY22401、TY22402和TY22404进行两次实验，从而导致获得了这些可活化抗体中的每一者的两个计算掩蔽效率。每种可活化抗体的掩蔽效率通过用关于可活化抗体的结合的EC50除以亲本抗体(TY21580)的EC50来计算。如图7A-图7C以及表6中所示，相较于亲本抗体，所有可活化抗体都显示与它的抗原的结合显著降低，并且计算掩蔽效率在48至2213的范围内。掩蔽效率的差异可能由在对EC50值的测量和数据拟合方面的变化所致，并且每种可活化抗体的掩蔽效率可能落在计算范围内(例如可活化抗体TY22402的掩蔽效率在377与2213之间)。这些结果指示当在哺乳动物细胞中并且作为完全IgG分子的一部分表达时，从CPL鉴定的多种掩蔽肽维持了它们的掩蔽效率。
表6：在蛋白酶裂解之前的可活化抗体ELISA
Figure BDA0002697663470001181
移除掩蔽肽使抗体活性恢复
用识别裂解序列的蛋白酶处理纯化可活化抗体，并且接着加以测试以确定移除掩蔽肽是否使它们的活性恢复。作为一实例，用1μg重组人uPA(Acrobiosystems，#PLU-H5229)在反应缓冲液(50mM Tris-HCl、0.01％吐温20，pH 8.5)中处理20μg TY22404(0.5mg/mL)；或用5或10单位的重组人MMP-9(BioVision，#7867-500)在反应缓冲液(50mM Tris、150mMNaCl、5mM CaCl2、20μM ZnCl2，pH 7.5)中处理TY22404。在37℃下进行反应21小时。通过SDS-PAGE分析确认掩蔽肽从轻链移除，图8A。接着如上所述通过ELISA来测量掩蔽效率。如图8B和表7中所示，在移除掩蔽肽之后，可活化抗体在它与抗原的结合方面变得不可与亲本抗体区分。
表7：在蛋白酶裂解之后的可活化抗体ELISA
Figure BDA0002697663470001191
可活化抗体可开发性概况
出于制造目的，关键的是所发现的可活化抗体具有良好可开发性概况。用在哺乳动物细胞中表达的纯化可活化抗体进行若干不同测试。将可活化抗体在20mM组氨酸(pH5.5)中调整至1mg/mL，并且利用Waters 2695以及Waters 2996UV检测器和TSKgelg3000SWXL管柱(300mm×7.8mm)(Tosoh Bioscience)，使用分析型尺寸排阻色谱法进行抗体品质分析。对于每个测定，注射10μg抗体，并且用缓冲液(200mM磷酸钠，在pH 7.0下)在0.5mL/min的流速下进行分级分离。
进行了三个加速应激测试：在50℃下孵育可活化抗体7天，在40℃下孵育可活化抗体28天，以及六个冷冻-解冻循环。通过以下方式来进行冷冻-解冻测试：使100μL样品(1mg/mL于20mM组氨酸(pH 5.5)中)在-80℃下冷冻30分钟，随后在室温下解冻60分钟。如图9A-图9C中所示，在50℃下储存7天或在40℃下储存28天之后，所有可活化抗体都保持稳定，并且展现少许聚集。在六个冷冻-解冻循环之后，它们显示略微恶化；然而，主要单体峰保持约95％，从而指示这些可活化抗体在这些加速应激测试下极其稳定。在不希望受理论束缚下，值得注意的是可活化抗体尚未经受广泛缓冲液优化过程，因此，采用优化缓冲液和赋形剂，可活化抗体的稳定性可能进一步改进。
接着，使可活化抗体在20mM组氨酸(pH 5.5)中浓缩至超过150mg/mL(表8)。未观察到可活化抗体沉淀，并且样品的粘度是十分可管理的。接着将浓缩可活化抗体稀释至20mg/mL或1mg/mL以分析高分子量(HMW)物质。如图10和表8中所示，未观察到HMW物质的明显增加，从而表明这些可活化抗体直至高浓度都在测试缓冲液中极其可溶和稳定。
表8：可活化抗体的>150mg/mL的浓度
样品标识符： 起始浓度(mg/mL)： 高浓度(mg/mL)：
TY22401 10.9 187.2
TY22402 8.4 160.0
为研究可活化抗体在低pH下的稳定性，用柠檬酸将纯化可活化抗体(于20mM组氨酸(pH 5.5)中，在10mg/mL下)滴定至1mg/mL，并且将pH调整至3.7并在室温下保持30和60分钟。之后，用1M Tris碱将样品中和至pH 7.0。如上所述用ForteBio测量可活化抗体的掩蔽效率。如图11中所示，在低pH孵育30或60分钟之后，掩蔽效率保持不变，从而表明在低pH孵育之后，掩蔽肽保留它们的阻断功效。
总之，数据指示所发现的可活化抗体在各种应激条件下保持稳定，因此，它们具有良好可开发性概况。
实施例4：对靶向CTLA4的可活化抗体的体外和体内表征
先前显示单独亲本抗体TY21580不刺激人T细胞活化或人PBMC细胞活化(参见以代理人案号69540-2000540与本文并行提交的题为“Compositions Comprising Cross-reactive Anti-CTLA4 Antibodies,and Methods of Making and Using the Same”的PCT国际申请，所述PCT国际申请以引用的方式整体并入本文)。已知的是T细胞上的CTLA-4活性与第一(TCR/CD3)信号和涉及B7-CD28/CTLA-4的第二信号相关。一致地，显示在低浓度的抗CD3抗体的情况下，亲本抗体TY21580使人PBMC细胞活化显著增强。
体外功能性表征
在此处，在低浓度的抗CD3抗体存在下评估靶向CTLA4的可活化抗体关于人PMBC活化的活性。使用Histopaque-1077(Sigma)，通过密度梯度离心从健康供者(#44)的血液新鲜分离人PBMC。将抗CD3(OKT-3)抗体在4℃下在96孔板上包被过夜。在洗涤之后，将1x10^5个新鲜分离的人PBMC添加至每个孔中，随后在不同浓度下添加测试物品。在刺激之后48小时，使用人IL-2ELISA Ready-SET-Go(Invitrogen)试剂盒测量对IL-2的诱导。使用人IFN-γELISA Ready-SET-Go(Invitrogen)试剂盒测量上清液中的IFN-γ。如图12A-图12B中所显示，在高浓度下，TY22404诱导IL-2产生，并且TY22401诱导IFN-γ产生。然而，可活化抗体的活性显著低于亲本TY21580抗体的活性。
接着，测试可活化抗体的抗体依赖性细胞细胞毒性活性，并且与亲本抗体TY21580的抗体依赖性细胞细胞毒性活性进行比较。ADCC报告基因测定用于评估可活化抗体的ADCC活性。过度表达人CTLA4的HEK293F细胞(HEK293F/hCTLA-4细胞)用作靶标细胞；过度表达CD16a和NFAT-Luc的Jurkat细胞系(Jurkat/CD16a细胞)用作效应细胞。使1x10^5个Jurkat/CD16a细胞和1x10^4个HEK293F/hCTLA-4细胞(E:T比率10:1)与不同浓度的抗体混合。在孵育6小时之后，将100μL One-Glo试剂添加至细胞中，并且使细胞溶解10分钟。移除上清液以使用SpectraMax i3x板读取器进行发光测量。如图13中所示，相比于亲本抗体TY21580，可活化抗体显示ADCC活性低若干个对数。TY22401的ADCC活性高于TY22402和TY22404的ADCC活性。总之，体外数据指示得到更好掩蔽的可活化抗体具有较小ADCC活性。
接着在多个同种同基因小鼠肿瘤模型中评估可活化抗体的抗肿瘤活性，并且与亲本抗体TY21580的抗肿瘤活性进行比较，所述模型包括MC38结肠直肠肿瘤模型、CT26结肠直肠肿瘤模型、H22肝肿瘤模型和3LL肺肿瘤模型。
在MC38结肠直肠肿瘤模型中的抗肿瘤功效
用MC38(NTCC-MC38)鼠结肠癌细胞对C57BL/6小鼠(n＝8/组，雌性，6-8周龄)进行皮下接种。当建立了肿瘤(70mm3)时，通过一周两次进行腹膜内注射，以同种型对照抗体、亲本抗体TY21580、或三种可活化抗体中的一者开始治疗。一周两次监测肿瘤生长，评估随时间的平均肿瘤体积±s.e.m.(图14A)和单个肿瘤生长曲线(图14B)。如图14A-图14B中所示，在MC38同种同基因小鼠肿瘤模型中，类似于亲本抗体TY21580，所有三种可活化抗体都显示强力抗肿瘤活性。
在CT26结肠直肠肿瘤模型中的抗肿瘤功效
用CT26(Shanghai Institutes for Biological Sciences)鼠结肠癌细胞对BALB/c小鼠(n＝8/组，雌性，7-8周龄)进行皮下接种。当建立了肿瘤(100mm3)时，通过一周两次进行腹膜内注射，以同种型对照抗体、亲本抗体TY21580、或三种可活化抗体中的一者在5mg/kg下开始治疗。一周两次监测肿瘤生长，并且报告为随时间的平均肿瘤体积±s.e.m.。如图15中所示，在CT26同种同基因小鼠肿瘤模型中，类似于亲本抗体TY21580，所有三种可活化抗体都显示强力抗肿瘤活性。
在H22肝肿瘤模型中的抗肿瘤功效
用H22(China Center for Type Culture Collection)鼠肝癌细胞对BALB/c小鼠(n＝8/组，雌性，7-8周龄)进行皮下接种。当建立了肿瘤(100mm3)时，通过一周两次进行腹膜内注射，以同种型对照抗体、亲本抗体TY21580、或三种可活化抗体中的一者在5mg/kg下开始治疗。一周两次监测肿瘤生长，并且报告为随时间的平均肿瘤体积±s.e.m.。如图16中所示，在H22同种同基因小鼠肿瘤模型中，类似于亲本抗体TY21580，所有三种可活化抗体都显示强力抗肿瘤活性。
在3LL肺癌模型中的抗肿瘤功效
用3LL(JCRB)鼠肺癌细胞对C57BL/6小鼠(n＝10/组，雌性，6-8周龄)进行皮下接种。当建立了肿瘤(75mm3)时，通过一周两次进行腹膜内注射，以同种型对照抗体、亲本抗体TY21580、或三种可活化抗体中的一者开始治疗。一周两次监测肿瘤生长，评估随时间的平均肿瘤体积±s.e.m.(图17A)和单个肿瘤生长曲线(图17B)。如图17A-图17B中所示，在3LL同种同基因小鼠肿瘤模型中，类似于亲本抗体TY21580，所有三种可活化抗体都显示强力抗肿瘤活性。
药物代谢动力学分析
在处于约8周龄下的BALB/c雌性小鼠中进行药物代谢动力学研究。每组三只小鼠用测试物品在10mg/kg下在腹膜内注射。在给药后3、6、24、48、96和168小时收集血液样品(每个样品约50ul)。从三只未进行抗体施用的原初雌性小鼠收集空白对照血液。每种测试抗体的血清浓度通过ELISA来测定，其中抗人IgG Fc抗体用于捕集，并且经HRP标记抗人IgG(Fab特异性)抗体(Sigma)用于检测(图18A-图18C)。相较于对亲本抗体TY21580收集的先前数据，可活化抗体TY22401(图18A)、TY22402(图18B)和TY22404(图18C)具有慢得多的清除时间和长得多的半衰期。TY22401具有196小时的半衰期，并且在168小时时的药物浓度是约55μg/mL。TY22402具有134小时的半衰期，并且在168小时时的药物浓度是约40μg/mL。TY22404具有254小时的半衰期，并且在168小时时的药物浓度是约45μg/mL。相比较来说，亲本抗体TY21580具有107小时的半衰期，并且在168小时时的药物浓度是约17μg/mL。
重复给药毒性研究
当在NOD小鼠中评估TY21580对糖尿病发作年龄的影响时，发现高剂量的TY21580可导致NOD小鼠而非正常BALB/c小鼠的动物死亡。在此处，NOD小鼠模型用于相较于TY21580的安全性来评估可活化抗体的安全性。通过在第0、3、7和12天在50mg/kg下进行腹膜内注射，用同种型对照抗体、亲本抗体TY21580、或三种可活化抗体中的一者处理NOD小鼠(n＝5/组，雌性，6周龄)。在TY21580处理组中，1个动物在第三次给药之后死亡，并且3个动物在第四次给药之后死亡。如图19中所示，在研究终止时，用同种型对照或三种可活化抗体中的任一者处理的所有动物都存活并处于良好健康状况。这些数据指示可活化抗体在小鼠中具有可接受的安全性/毒性概况，并且在NOD小鼠中，可活化抗体比亲本抗体TY21580要安全得多。
实施例5：靶向CD137的可活化抗体的构建和验证
以类似于以上实施例3中所述的用于开发抗CTLA4可活化抗体的流程的方式开发靶向人CD137的可活化抗体。亲本CD137抗体的Fab片段(图20A)或scFv(图20B)通过融合于Aga2蛋白来展示在酵母的表面上，并且通过流式细胞计量术确认它们结合CD137的能力。以下列出亲本CD137抗体(TY21242)的VH和VL序列(也参见以引用的方式整体并入本文的PCT国际申请号PCT/CN2017/098332)：
抗CD137重链可变区(SEQ ID NO:49)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWLALIDWADDKYYSPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGSDTVIGDWFAYWGQGTLVTVSS
抗CD137轻链可变区(SEQ ID NO:50)：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYYLWTFGQGTKVEIK。
以CPL融合于轻链的N末端来构建酵母文库，并且经受基于FACS的筛选过程。将来自第4或第5轮分选(图21)的单一克隆涂铺在选择性培养基上，并且使其单个地生长以确认裂解介导的抗原结合活化。如图22A-图22B中所示，在掩蔽肽存在下，所选CD137可活化抗体克隆展现与抗原的少许结合；然而，当TEV蛋白酶用处理酵母细胞以移除掩蔽肽时，与抗原的结合显著增加。
如同用CTLA4可活化抗体所观察，所鉴定的掩蔽序列可分成若干组，从而指示通过各轮分选达成的明确富集。七组掩蔽肽序列连同不变的裂解肽序列一起列于表9中。这些序列群组中的数者(TY22594、TY22595、TY22596、TY22598、TY22599)源于CPL011文库，所述CPL011文库在两个固定Cys残基之间的环中含有NNK密码子。引起关注的是，对于所有这些序列群组，在环中都存在两个或更多个Arg残基，从而表明在掩蔽肽与亲本抗体的CDR之间可能涉及电荷-电荷相互作用。实际上，在VH CDR2和VH CDR3中存在带负电荷的Asp残基。
表9：掩蔽肽序列
Figure BDA0002697663470001261
接着在哺乳动物细胞中表达的完全IgG4分子的情况下测试掩蔽序列和不变的裂解序列。它们的表达水平类似于它们的亲本抗体，并且它们在蛋白A树脂之后的纯化产率也类似，从而表明掩蔽肽和裂解肽的存在不对抗体在哺乳动物细胞中的表达具有任何负性影响。
接着通过流式细胞计量术测量掩蔽效率。简要来说，在它们的表面上展示人CD137的酵母细胞用PBSA缓冲液洗涤两次，并且将50μL(1x10^6)细胞分配至96孔板的每个孔中。接着使细胞与3倍连续稀释的抗体一起在冰上孵育1小时，用PBSA缓冲液洗涤一次，接着与100μL PE缀合的小鼠抗人Fc抗体(1μg/ml)一起在冰上孵育30分钟。接着将细胞洗涤一次，随后通过流式细胞计量术(
Figure BDA0002697663470001262
CytoFlex)来分析。如图23和表10中所示，相较于亲本抗体TY21242，所有可活化抗体都显示与细胞表面上的人CD137的结合显著降低，并且计算掩蔽效率在20倍(对于TY22596)至超过300倍(对于TY22586、TY22595和TY22599)的范围内。这些结果指示当在哺乳动物细胞中表达时，从展示在酵母上的CPL文库鉴定的掩蔽肽维持了它们的掩蔽效率。
表10：CD137可活化抗体的掩蔽效率
Figure BDA0002697663470001271
太低＝结合是如此微弱，以致它在这个测定中不可检测。
总之，数据指示使用本文所述的方法，针对每种靶标抗体，成功发现了多种强力掩蔽肽。
实施例6：掩蔽肽长度对靶向CTLA4的可活化抗体的掩蔽效率的影响
选择两种可活化抗体TY22402和TY22404以测试掩蔽效率对掩蔽肽的长度的依赖性以适合它们的特定应用。通过从N末端移除残基，从而在掩蔽肽中的第一半胱氨酸残基之前仅保留5或2个残基来使TY22402和TY22404的掩蔽肽从21个残基缩短至16或12个残基(表11)。从哺乳动物细胞表达和纯化这些可活化抗体，并且如实施例3中所述测量它们的掩蔽效率并与亲本抗体TY21580进行比较。来自两个实验的结果指示这些可活化抗体可使用在第一半胱氨酸残基之前的长度在2至11个残基的范围内的不同掩蔽肽制备以调节抗体掩蔽效率(图24A和图24B；表12和表13)。这似乎表明核心掩蔽基序含有半胱氨酸环以及它的紧邻残基，并且足以维持掩蔽效率。
表11：具有不同肽长度的掩蔽肽
Figure BDA0002697663470001281
表12显示图24A中的抗体的的掩蔽效率。表13显示图24B中的抗体的掩蔽效率。
表12：具有不同掩蔽肽长度的抗体的掩蔽效率
样品标识符 EC50(nM) 掩蔽效率
TY21580 0.2223
TY22402 53.99 243
TY22775 37.31 168
TY22404 68.40 308
TY22776 65.90 296
表13：具有不同掩蔽肽长度的抗体的掩蔽效率
Figure BDA0002697663470001282
Figure BDA0002697663470001291
实施例7：裂解肽长度对靶向CTLA4的可活化抗体的掩蔽效率的影响
选择TY22404以测试掩蔽效率对裂解肽的长度的依赖性以适合它们的特定应用。使TY22404的裂解肽缩短至各种长度(表14)。从哺乳动物细胞表达和纯化可活化抗体，并且如实施例3中所述测量它们的掩蔽效率并与亲本抗体TY21580进行比较。如图25和表15中所示，结果指示这些可活化抗体可使用它们的长度在5至20个残基的范围内的不同裂解肽制备以调节抗体掩蔽效率。掩蔽基序与裂解基序之间的强烈关联是惊人的；当肽长度从41个氨基酸截短至17个氨基酸时，相较于TY22404，TY23291的掩蔽效率增强至至少30倍。这些结果指示可设计和工程改造若干新型掩蔽肽。此外，可进一步探究掩蔽基序与裂解基序之间的偶联。
表14：具有不同裂解肽长度的掩蔽肽
Figure BDA0002697663470001292
Figure BDA0002697663470001301
表15显示图25中的抗体的掩蔽效率。
表15：具有不同裂解肽长度的抗体的掩蔽效率
样品标识符 EC50(nM) 掩蔽效率
TY21580 0.2505
TY22404 117.4 469
TY23286 1496 5972
TY23289 133.2 532
TY23280 2952 11784
TY23291 3656 14595
序列表
<110> 天演药业有限公司(Adagene Inc.)
<120> 可活化抗体及其制备和使用方法
<130> 69540-20006.00
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<141> 2019-02-02
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<151> 2019-02-02
<150> PCT/CN2018/075065
<151> 2018-02-02
<160> 133
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<211> 5
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Xaa Cys Xaa Cys Xaa
1 5
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<220>
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<223> 以重复至少一次并且直至十次存在
<400> 2
nnntgnnnnt gnnnc 15
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<221> 变体
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<220>
<221> 变体
<222> 21
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Glu Val Gly Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu
20 25 30
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
<210> 4
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<212> PRT
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<220>
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<400> 4
Glu Val Gly Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Gly Arg Ser Ala
20 25
<210> 5
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<212> PRT
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<400> 5
Glu Val Gly Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Gly Arg Ser Ala
20 25
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Glu Val Gly Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Gly Arg Ser Ala
20 25
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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<221> 变体
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Glu Val Gly Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Gly Arg Ser Ala
20 25
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<211> 45
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 以重复六次存在
<220>
<221> misc_feature
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gaggttggat cctacnnctg tnnctgcnnc tcaggtcgtt ccgct 45
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<212> DNA
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> n = A、T或C
<220>
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> 以重复两次存在
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Glu Val Gly Ser Tyr Asn Ser Tyr His Ala Tyr Cys Pro His Pro Leu
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Tyr Pro Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu
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Glu Val Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Val Leu Cys Val Thr Ala Tyr
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Glu Val Gly Ser Tyr Asn Phe Val Ala Asp Ser Cys Pro Asp His Pro
1 5 10 15
Tyr Pro Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu
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Glu Val Gly Ser Tyr Ile Val His His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr
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Glu Val Gly Ser Tyr Ile Val His His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr
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Pro Tyr Cys Asp Ser Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu
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Glu Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr
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Pro Tyr Cys Asn Ser Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
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Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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Glu Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr
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Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Glu
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1 5 10 15
Pro Tyr Cys Gln Ser Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Pro Tyr Cys Asn Ser Ala Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
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Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
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Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Thr Asp Leu Asp Ala Cys Ala Asp Ala Pro
1 5 10 15
Asn His Cys His Phe Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
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<223> 合成构建体
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Glu Val Gly Ser Tyr Ser Ser Thr His Ala His Cys His His Ser Pro
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
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20 25 30
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Glu Val Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Asn Tyr His Cys Lys Trp Arg Pro
1 5 10 15
Ser Arg Cys His Asn Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Glu Val Gly Ser Tyr Tyr His Asp Tyr Asp Asp Cys Arg Val Leu Pro
1 5 10 15
Arg Arg Cys Phe Asn Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Glu Val Gly Ser Tyr Ser Asn Asn Phe Ala Ser Cys Leu Trp Arg His
1 5 10 15
Arg Ser Cys Ala Asp Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Glu Val Gly Ser Tyr Thr Asp Asn Tyr Asp Tyr Cys Pro Arg Leu Arg
1 5 10 15
Arg Lys Cys Tyr His Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Ser Trp Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Gly
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Ala Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Ser Asp Thr Val Ile Gly Asp Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Tyr Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
tcgggtgagg ttggatccta c 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
gtacaggttc tcggtaccac c 21
<210> 53
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
tggagacaca gacaggatca ctggagactg ggtcagcagg atatcggatc ctgaaccgcc 60
tgaac 65
<210> 54
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
cttcgctgtt tttcaatatt ttctgttatt gcttcagttt tagcaggatc cgaggttgga 60
tcctac 66
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15, 16
<223> Xaa = Asp、Ala、Tyr、Ser、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe、Val、His或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 8, 9, 10, 11, 12, 13
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<400> 55
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18
<223> Xaa = Asp、Ala、Tyr、Ser、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe、Val、His或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<400> 56
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16
<223> Xaa = Asp、Ala、Tyr、Ser、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe、Val、His或Pro
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18
<223> Xaa = Asp、Ala、Tyr、Ser、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe、Val、His或Pro
<400> 58
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr His Trp Ser Trp Ile
1 5 10
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu
1 5 10 15
Lys Ser Arg Leu
20
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Ala Arg Ser Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Ser Trp Pro Pro Thr
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Phe Ser Leu Ser Thr Gly Gly Val Gly Val Gly Trp Ile
1 5 10
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Leu Ala Leu Ile Asp Trp Ala Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Lys Ser Arg Leu
20
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Ala Arg Gly Gly Ser Asp Thr Val Ile Gly Asp Trp Phe Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val
1 5
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Tyr Leu Trp Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> 以重复至少三次并且直至十次存在
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 以重复至少一次并且直至十次存在
<220>
<221> 变体
<222> 1, 3, 5
<223> Xaa = Asp、Ala、Tyr、Ser、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe、Val、His或Pro
<400> 71
Xaa Cys Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Asn Phe Val Ala Asp Ser Cys Pro Asp His Pro Tyr Pro Cys Ser Ala
1 5 10 15
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Ile Val His His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr Pro Tyr Cys Asp Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr Pro Tyr Cys Asn Ser
1 5 10 15
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Pro Asn Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr Pro Tyr Cys Gln Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Pro Gln Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Pro Asn Pro Ala Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Pro Thr Asp Leu Asp Ala Cys Ala Asp Ala Pro Asn His Cys His Phe
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Ser Ser Thr His Ala His Cys His His Ser Pro Ala Asn Cys Ile Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Asp Thr Asp Tyr Asp Phe Cys Pro Ile Leu Arg His Arg Cys Asp Ser
1 5 10 15
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Asn Asp Tyr Asn Tyr His Cys Lys Trp Arg Pro Ser Arg Cys His Asn
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Tyr His Asp Tyr Asp Asp Cys Arg Val Leu Pro Arg Arg Cys Phe Asn
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Asn Asn Phe Ala Ser Cys Leu Trp Arg His Arg Ser Cys Ala Asp
1 5 10 15
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Thr Asp Asn Tyr Asp Tyr Cys Pro Arg Leu Arg Arg Lys Cys Tyr His
1 5 10 15
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
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<220>
<221> 变体
<222> 3
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<220>
<221> 变体
<222> 5
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<220>
<221> 变体
<222> 1, 3, 5
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<400> 86
Xaa Cys Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 87
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 1, 2, 7, 8, 13, 14
<223> n = A、T、C或G
<220>
<221> misc_feature
<222> 3, 9, 15
<223> n = T或G
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 12
<223> n = T或C
<220>
<221> misc_feature
<222> 1, 2, 3
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<220>
<221> misc_feature
<222> 7, 8, 9
<223> 以重复至少三次并且直至十次存在
<220>
<221> misc_feature
<222> 13, 14, 15
<223> 以重复至少一次并且直至十次存在
<400> 87
nnntgnnnnt gnnnn 15
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 88
Xaa Cys Ala Asp Ala Pro Asn His Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 89
Xaa Cys His His Ser Pro Ala Asn Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 90
Xaa Cys Pro Ile Leu Arg His Arg Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 91
Xaa Cys Lys Trp Arg Pro Ser Arg Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 92
Xaa Cys Arg Val Leu Pro Arg Arg Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 93
Xaa Cys Leu Trp Arg His Arg Ser Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 94
Xaa Cys Pro Arg Leu Arg Arg Lys Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 95
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Thr Asp Leu Asp Ala Cys Ala Asp Ala Pro
1 5 10 15
Asn His Cys His Phe
20
<210> 96
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Glu Val Gly Ser Tyr Ser Ser Thr His Ala His Cys His His Ser Pro
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Ser
20
<210> 97
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Glu Val Gly Ser Tyr Asp Thr Asp Tyr Asp Phe Cys Pro Ile Leu Arg
1 5 10 15
His Arg Cys Asp Ser
20
<210> 98
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Glu Val Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Asn Tyr His Cys Lys Trp Arg Pro
1 5 10 15
Ser Arg Cys His Asn
20
<210> 99
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Glu Val Gly Ser Tyr Tyr His Asp Tyr Asp Asp Cys Arg Val Leu Pro
1 5 10 15
Arg Arg Cys Phe Asn
20
<210> 100
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Glu Val Gly Ser Tyr Ser Asn Asn Phe Ala Ser Cys Leu Trp Arg His
1 5 10 15
Arg Ser Cys Ala Asp
20
<210> 101
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Glu Val Gly Ser Tyr Thr Asp Asn Tyr Asp Tyr Cys Pro Arg Leu Arg
1 5 10 15
Arg Lys Cys Tyr His
20
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 102
Xaa Cys Pro Asp His Pro Tyr Pro Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 103
Xaa Cys Asp Ala Phe Tyr Pro Tyr Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 104
Xaa Cys Asp Ser His Tyr Pro Tyr Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1, 10, 11
<223> Xaa = Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 以重复至少两次并且直至十次存在
<400> 105
Xaa Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Xaa Xaa
1 5 10
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<400> 106
000
<210> 107
<400> 107
000
<210> 108
<400> 108
000
<210> 109
<400> 109
000
<210> 110
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Glu Val Gly Ser Tyr Asn Phe Val Ala Asp Ser Cys Pro Asp His Pro
1 5 10 15
Tyr Pro Cys Ser Ala
20
<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Glu Val Gly Ser Tyr Ile Val His His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Pro Tyr Cys Asp Ser
20
<210> 112
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Glu Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr
1 5 10 15
Pro Tyr Cys Asn Ser
20
<210> 113
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr
20
<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Glu Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr
1 5 10 15
Pro Tyr Cys Gln Ser
20
<210> 115
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Glu Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ala Tyr Pro Ala Cys Asp Ser His Tyr
1 5 10 15
Pro Tyr Cys Asn Ser
20
<210> 116
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Gln Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr
20
<210> 117
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Ala Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr
20
<210> 118
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Glu Val Gly Ser Tyr Ile Val His His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Pro Tyr Cys Asp Ser Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
<210> 119
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Glu Val Gly His Ser Asp Cys Asp Ala Phe Tyr Pro Tyr Cys Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro Leu Gly Leu Ala Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Ser
35
<210> 120
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Glu Asp Cys Asp Ala Phe Tyr Pro Tyr Cys Asp Ser Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 121
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
<210> 122
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Glu Val Gly Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro Leu Gly Leu Ala Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Ser
35
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Glu Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 124
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Ala Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu
115
<210> 125
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu
115
<210> 126
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Ile Cys
50 55 60
Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr
85 90 95
Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val
100 105 110
Ile Asp Pro
115
<210> 127
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Asp Ser Ile
50 55 60
Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met
85 90 95
Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr
100 105 110
Val Ile
<210> 128
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
115 120
<210> 129
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 129
Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser His
1 5 10 15
Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His Asn Thr Asp
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln Met Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe Leu Asp
50 55 60
Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
115 120
<210> 130
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Ser Ser Asp Cys Val Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Pro Leu Gly Leu Ala
20 25 30
<210> 131
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Glu Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Ala Pro Leu Gly Leu Ala
20
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Glu Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Ala
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Glu Asp Cys Val Pro Tyr Tyr Tyr Ala Cys Ala Tyr Pro Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala

Claims (97)

1.一种包含多核苷酸的文库，其中所述多核苷酸中的至少一者编码从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
2.如权利要求1所述的文库，其中所述文库中的所述多核苷酸编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少十种独特多肽，并且每种独特多肽从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
3.如权利要求1或权利要求2所述的文库，其中所述文库中的所述多核苷酸中的每一者编码从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
4.如权利要求1-3中任一项所述的文库，其中所述FP由包含根据式(XIV)：(NNK)mTGY(NNK)nTGY(NNK)o(SEQ ID NO:87)的核酸序列的多核苷酸序列编码，其中每个N都独立地是A、G、T或C，其中每个K都独立地是T或G，并且其中每个Y都独立地是T或C。
5.如权利要求1-4中任一项所述的文库，其中每个X不是M、W或C。
6.如权利要求1-5中任一项所述的文库，其中式(XIII)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的文库，其中式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的文库，其中式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的文库，其中m是2或3-6。
10.如权利要求1-9中任一项所述的文库，其中n是6-8。
11.如权利要求1-9中任一项所述的文库，其中n是6。
12.如权利要求1-11中任一项所述的文库，其中o是1-2。
13.如权利要求1-11中任一项所述的文库，其中o是2。
14.如权利要求1-13中任一项所述的文库，其中所述FP还在它的N末端包含额外氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的文库，其中所述额外氨基酸序列包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的文库，其中所述第一裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
17.如权利要求1-16中任一项所述的文库，其中所述CM还在所述第一裂解位点的C末端包含第一接头(L1)。
18.如权利要求17所述的文库，其中所述L1包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的文库，其中所述CM还包含第二裂解位点。
20.如权利要求19所述的文库，其中所述第二裂解位点在所述L1的C末端。
21.如权利要求19或权利要求20所述的文库，其中所述第二裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
22.如权利要求19-21中任一项所述的文库，其中所述第一裂解位点和所述第二裂解位点是不同的。
23.如权利要求19-22中任一项所述的文库，其中所述CM还在所述第二裂解位点的C末端包含第二接头(L2)。
24.如权利要求23所述的文库，其中所述L2包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的文库，其中所述多肽包含根据式(III)：EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，其中X1是A、D、I、N、P或Y，X2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。
26.如权利要求25所述的文库，其中所述文库中的所述多核苷酸中的每一者编码包含根据式(III)的氨基酸序列的多肽。
27.如权利要求1-26中任一项所述的文库，其中所述多肽包含选自由SEQ ID NO:25-46组成的组的氨基酸序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的文库，其中所述TBM包含抗体轻链可变区。
29.如权利要求28所述的文库，其中所述多肽还在所述轻链可变区的C末端包含重链可变区。
30.如权利要求28所述的文库，所述文库还包含编码一种或多种抗体重链可变区的多核苷酸。
31.如权利要求1-27中任一项所述的文库，其中所述TBM包含抗体重链可变区。
32.如权利要求31所述的文库，其中所述多肽还在所述重链可变区的C末端包含轻链可变区。
33.如权利要求31所述的文库，所述文库还包含编码一种或多种抗体轻链可变区的多核苷酸。
34.如权利要求1-33中任一项所述的文库，其中所述多核苷酸中的编码所述多肽的至少一者处于载体中。
35.如权利要求34所述的文库，其中所述载体是表达载体或展示载体。
36.如权利要求1-35中任一项所述的文库，其中所述多核苷酸中的编码所述多肽的至少一者处于细胞中。
37.如权利要求36所述的文库，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
38.一种产生可活化抗体的方法，所述方法包括在适于产生所述可活化抗体的条件下培养如权利要求36或权利要求37所述的细胞。
39.如权利要求38所述的方法，所述方法还包括回收由所述细胞产生的所述可活化抗体。
40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括测试所述可活化抗体在可溶的同时维持可活化表型的能力。
41.一种使用如权利要求1-37中任一项所述的文库来筛选结合靶标的可活化抗体的方法，所述方法包括：
a)在使所述CM裂解之前使所述文库的表达产物与所述靶标接触；
b)在使所述CM裂解之后使所述文库的所述表达产物与所述靶标接触；和
c)分离所述表达产物中的在使所述CM裂解之后结合所述靶标，但在使所述CM裂解之前与所述靶标的结合降低的一者或多者。
42.如权利要求41所述的方法，其中如果在使所述CM裂解之后表达产物的结合亲和力是在使所述CM裂解之前所述表达产物的结合亲和力的至少2倍，那么分离所述表达产物。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述CM包含至少第一蛋白酶裂解位点，所述第一蛋白酶裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述靶标是CTLA4或CD137。
45.一种多肽，所述多肽由一种或多种来自如权利要求1-37中任一项所述的文库的多核苷酸编码。
46.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-37中任一项所述的文库。
47.一种包含抗原结合结构域的文库，其中所述抗原结合结构域中的至少一者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
48.如权利要求47所述的文库，其中所述抗原结合结构域中的至少两者、至少三者、至少四者、至少五者或至少十者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的独特多肽，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
49.如权利要求47或权利要求48所述的文库，其中所述抗原结合结构域中的每一者包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的独特多肽，
其中所述FP包含根据式(XIII)：XmCXnCXo(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
50.如权利要求47-49中任一项所述的文库，其中所述TBM包含抗体轻链可变区，并且所述抗原结合结构域还包含抗体重链可变区。
51.如权利要求47-49中任一项所述的文库，其中所述TBM包含抗体重链可变区，并且所述抗原结合结构域还包含抗体轻链可变区。
52.如权利要求47-51中任一项所述的文库，其中每个X不是M、W或C。
53.如权利要求47-52中任一项所述的文库，式(XIII)中的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
54.如权利要求47-53中任一项所述的文库，其中式(XIII)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
55.如权利要求47-54中任一项所述的文库，其中式(XIII)的Xo中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
56.如权利要求47-55中任一项所述的文库，其中所述抗原结合结构域中的每一者展示在细胞表面上或噬菌体上。
57.一种抗体轻链，所述抗体轻链包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，
其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区。
58.一种包含重链和轻链的抗体，其中所述轻链是如权利要求57所述的轻链。
59.一种抗体重链，所述抗体重链包含从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)的多肽，
其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体重链可变区。
60.一种包含重链和轻链的抗体，其中所述重链是如权利要求59所述的重链。
61.一种包含至少一种展示在它的表面上的多肽的细胞，其中所述至少多肽从N末端至C末端包含第一肽(FP)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，
其中所述FP包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中所述TBM包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区。
62.如权利要求61所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
63.如权利要求61或权利要求62所述的细胞，其中每个X不是M、W或C。
64.如权利要求61-63中任一项所述的细胞，其中式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
65.如权利要求61-64中任一项所述的细胞，其中式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
66.一种可活化抗体，所述可活化抗体包含：
第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)和靶标结合部分(TBM)，
其中所述MM包含根据式(I)：XmCXnCZo(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中m是2-10，n是3-10，并且o是1-10，其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸，并且其中每个Z都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸；其中当所述CM未被裂解时，所述MM抑制所述可活化抗体与人CD137的结合；
其中所述CM包含至少第一裂解位点；并且
其中：
a)所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)，并且所述可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含抗体重链可变区(VH)；
b)所述TBM包含抗体重链可变区(VH)，并且所述可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含抗体轻链可变区(VL)；
c)所述TBM从N末端至C末端包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；或
d)所述TBM从N末端至C末端包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)；并且
其中当所述CM被裂解时，所述可活化抗体通过所述VH和所述VL结合人CD137。
67.如权利要求66所述的可活化抗体，其中所述TBM包含抗体轻链可变区(VL)，并且所述可活化抗体还包含第二多肽，所述第二多肽包含抗体重链可变区(VH)。
68.如权利要求66或权利要求67所述的可活化抗体，其中m是2或3-6。
69.如权利要求66-68中任一项所述的可活化抗体，其中n是6-8。
70.如权利要求69所述的可活化抗体，其中n是6。
71.如权利要求66-69中任一项所述的可活化抗体，其中o是1或2。
72.如权利要求66-71中任一项所述的可活化抗体，其中每个X不是M、W或C。
73.如权利要求66-72中任一项所述的可活化抗体，其中式(I)的Xm中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
74.如权利要求66-73中任一项所述的可活化抗体，其中式(I)的Xn中的每个X都独立地是选自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H和P组成的组的氨基酸。
75.如权利要求66-74中任一项所述的可活化抗体，其中所述MM包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 79-85以及XmCADAPNHCXX(SEQ ID NO:88)、XmCHHSPANCXX(SEQID NO:89)、XmCPILRHRCXX(SEQ ID NO:90)、XmCKWRPSRCXX(SEQ ID NO:91)、XmCRVLPRRCXX(SEQ ID NO:92)、XmCLWRHRSCXX(SEQ ID NO:93)和XmCPRLRRKCXX(SEQ ID NO:94)，其中m是2-10，并且其中每个X都独立地是选自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组的氨基酸。
76.如权利要求66-75中任一项所述的可活化抗体，其中所述MM还在它的N末端包含额外氨基酸序列。
77.如权利要求76所述的可活化抗体，其中所述额外氨基酸序列包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
78.如权利要求66-77中任一项所述的可活化抗体，其中所述第一裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
79.如权利要求66-78中任一项所述的可活化抗体，其中所述CM还在所述第一裂解位点的C末端包含第一接头(L1)。
80.如权利要求79所述的可活化抗体，其中所述L1包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。
81.如权利要求66-80中任一项所述的可活化抗体，其中所述CM还包含第二裂解位点。
82.如权利要求81所述的可活化抗体，其中所述第二裂解位点在所述L1的C末端。
83.如权利要求81或权利要求82所述的可活化抗体，其中所述第二裂解位点是选自由以下组成的组的蛋白酶的蛋白酶裂解位点：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
84.如权利要求81-83中任一项所述的可活化抗体，其中所述第一裂解位点和所述第二裂解位点是不同的。
85.如权利要求81-84中任一项所述的可活化抗体，其中所述CM还在所述第二裂解位点的C末端包含第二接头(L2)。
86.如权利要求85所述的可活化抗体，其中所述L2包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的氨基酸序列。
87.如权利要求66-86中任一项所述的可活化抗体，其中所述CM包含至少第一蛋白酶裂解位点，并且以一种或多种选自由以下组成的组的蛋白酶加以裂解：尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯帕酶-1、卡斯帕酶-2、卡斯帕酶-3、卡斯帕酶-4、卡斯帕酶-5、卡斯帕酶-6、卡斯帕酶-7、卡斯帕酶-8、卡斯帕酶-9、卡斯帕酶-10、卡斯帕酶-11、卡斯帕酶-12、卡斯帕酶-13、卡斯帕酶-14和TACE。
88.如权利要求66-87中任一项所述的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含根据式(III)：EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，其中X1是A、D、I、N、P或Y，X2是A、F、N、S或V，X3是A、H、L、P、S、V或Y，X4是A、H、S或Y，X5是A、D、P、S、V或Y，X6是A、D、L、S或Y，X7是D、P或V，X8是A、D、H、P、S或T，X9是A、D、F、H、P或Y，X10是L、P或Y，X11是F、P或Y，X12是A、P、S或Y，X13是A、D、N、S、T或Y，并且X14是A、S或Y。
89.如权利要求66-88中任一项所述的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含选自由SEQ ID NO:40-46组成的组的氨基酸序列。
90.如权利要求66-89中任一项所述的可活化抗体，其中所述VL包含含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L3。
91.如权利要求66-90中任一项所述的可活化抗体，其中所述VL包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
92.如权利要求66-91中任一项所述的可活化抗体，其中所述VH包含含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H3。
93.如权利要求66-92中任一项所述的可活化抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
94.一种治疗有需要的受试者的癌症或延迟所述癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的由一种或多种来自如权利要求1-37中任一项所述的文库的多核苷酸编码的多肽，或如权利要求66-93中任一项所述的可活化抗体。
95.如权利要求94所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的至少一种额外治疗剂。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述至少一种额外治疗剂选自由病毒基因疗法、免疫检查点抑制剂、靶向疗法、放射疗法和化学疗法组成的组。
97.如权利要求95或权利要求96所述的方法，其中所述至少一种额外治疗剂选自由以下组成的组：泊马莱斯特、雷利米德、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、DNA烷基化含铂衍生物顺铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、抗CD137抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗DR5抗体、抗CD1d抗体、抗TIM3抗体、抗SLAMF7抗体、抗KIR受体抗体、抗OX40抗体、抗HER2抗体、抗ErbB-2抗体、抗EGFR抗体、西妥昔单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕母单抗、放射疗法、单次剂量放射、分次放射、局灶性放射、全器官放射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受体、继承性转移的T细胞、抗癌疫苗和溶瘤性病毒。
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