TW202409082A - 抗ｃｄ２８抗體及其使用方法 - Google Patents

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培志 羅
杜方勇
李豔
劉桂中
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新加坡商天演藥業公司
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本揭示案為結合至人類CD28及其抗原結合片段之抗CD28抗體，組成其之組合物，及其在延遲及/或預防腫瘤生長之用途。

Description

抗CD28抗體及其使用方法
[相關申請案之交互參照] 本申請案主張2022年4月8日申請之PCT/CN2022/085838之優先權，其全文以引用的方式併入本文中。
序列表 本申請案含有以電子方式遞交之XML格式序列表且該序列表全文以引用的方式併入本文中。2023年4月6日創建並命名為123687_WO003_SL.xml之序列表電子拷貝，大小為488,908 bytes。
CD28為T細胞上之共刺激信號分子，且在其活化、增殖及存活中起關鍵作用。CD28共刺激信號分子活化具有增強抗腫瘤T細胞免疫力之潛力。然而，靶向CD28之系統性T細胞活化療法已引起有害之細胞介素風暴及多器官衰竭(Suntharalingam等人，N Engl J Med. (2006) 355(10):1018-28)。因此，有必要改進CD28靶向療法，以避免與系統性CD28活化相關之嚴重自身免疫不良事件。
本發明提供靶向腫瘤相關抗原(例如，B7-H3、HER2、TROP2或PD-L1)及CD28之新穎結合分子，及包含一個或多個此等結合分子之醫藥組合物，以及使用此等結合分子及醫藥組合物治療癌症。相較於當前可獲得之癌症治療(包括抗體治療)，本發明之結合分子預計可提供更優之臨床回應。
於一些態樣中，本發明提供抗原結合蛋白(例如抗體或其抗原結合片段)，包含CD28結合部分，其中CD28結合部分結合人類CD28並與食蟹獼猴及小鼠CD28交叉反應。於一些實施例中，CD28結合部分結合至CD28抗原表位，其包含人類CD28 (SEQ ID NO: 1)之51-122胺基酸殘基。於特定實施例中，CD28抗原表位包含SEQ ID NO: 1之51、52、54、55、98-101、110-111、113-114及118-122胺基酸殘基。
於一些實施例中，本發明提供抗原結合蛋白(例如抗體或其抗原結合片段)，其包含結合人類CD28之CD28結合部分，其中CD28結合部分包含抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L)，及其中V H及V L包含所示之重鏈互補決定區(CDRs) 1-3及輕鏈CDR1-3，分別為SEQ ID NOs: 5-10，分別為SEQ ID NOs: 15、6、16、17-19，分別為SEQ ID NOs: 24、6、25、26-28，分別為SEQ ID NOs: 33、6、35-38，分別為SEQ ID NOs: 43、6、44、45、9及46，分別為 SEQ ID NOs: 33、51-53、300及10，分別為SEQ ID NOs: 24、58、59、60、300及61，分別為SEQ ID NOs: 66-69、300及70，分別為SEQ ID NOs: 24、6、75、76、18及28，分別為SEQ ID NOs: 24、58、81、82、27及83，分別為SEQ ID NOs: 88-91、300及70，分別為SEQ ID NOs: 24、96-98、9及70，分別為SEQ ID NOs: 103-106、18及83，分別為SEQ ID NOs: 111、6、112、113、18及114，分別為SEQ ID NOs: 15、6、119、120、9及121，分別為SEQ ID NOs: 126、67、127、128、18及129，分別為SEQ ID NOs: 134、6、135、136、27及83，分別為SEQ ID NOs: 43、58、141、142、300及143，分別為SEQ ID NOs: 148、6、149、150、300及83，分別為SEQ ID NOs: 15、155、16、156、27及70，或SEQ ID NOs: 161、6、162、163、300及164。
於一些實施例中，CD28結合部分包含所示之VH及VL，分別為SEQ ID NOs: 11及12，分別為SEQ ID NOs: 20及21，分別為SEQ ID NOs: 29及30，分別為SEQ ID NOs: 39及40，分別為SEQ ID NOs: 47及48，分別為SEQ ID NOs: 54及55，分別為SEQ ID NOs: 62及63，分別為SEQ ID NOs: 71及72，分別為SEQ ID NOs: 77及78，分別為SEQ ID NOs: 84及85，分別為SEQ ID NOs: 92及93，分別為SEQ ID NOs: 99及100，分別為SEQ ID NOs: 107及108，分別為SEQ ID NOs: 115及116，分別為SEQ ID NOs: 122及123，分別為SEQ ID NOs: 130及131，分別為SEQ ID NOs: 137及138，分別為SEQ ID NOs: 144及145，分別為SEQ ID NOs: 151及152，分別為SEQ ID NOs: 157及158，分別為SEQ ID NOs: 165及166，分別為SEQ ID NOs: 362及363，分別為SEQ ID NOs: 364及365，分別為SEQ ID NOs: 366及367，分別為SEQ ID NOs: 368及369，分別為SEQ ID NOs: 370及371，分別為SEQ ID NOs: 372及373，分別為SEQ ID NOs: 374及375，分別為SEQ ID NOs: 376及12，分別為SEQ ID NOs: 377及378，分別為SEQ ID NOs: 379及380，分別為SEQ ID NOs: 381及12，分別為SEQ ID NOs: 382及12，分別為SEQ ID NOs: 383及12，分別為SEQ ID NOs: 384及12，分別為SEQ ID NOs: 385及12，或分別為SEQ ID NOs: 386及12。
於一些實施例中，CD28結合部分包含所示之重鏈(HC)及輕鏈(LC)，分別為SEQ ID NOs: 13及14，分別為SEQ ID NOs: 22及23，分別為SEQ ID NOs: 31及32，分別為SEQ ID NOs: 41及42，分別為SEQ ID NOs: 49及50，分別為SEQ ID NOs: 56及57，分別為SEQ ID NOs: 64及65，分別為SEQ ID NOs: 73及74，分別為SEQ ID NOs: 79及80，分別為SEQ ID NOs: 86及87，分別為SEQ ID NOs: 94及95，分別為SEQ ID NOs: 101及102，分別為SEQ ID NOs: 109及110，分別為SEQ ID NOs: 117及118，分別為SEQ ID NOs: 124及125，分別為SEQ ID NOs: 141及142，分別為SEQ ID NOs: 132及133，分別為SEQ ID NOs: 139及140，分別為SEQ ID NOs: 146及147，分別為SEQ ID NOs: 153及154，分別為SEQ ID NOs: 159及160，或分別為SEQ ID NOs: 167及168。
於一些態樣中，本發明亦提供醫藥組合物，其包含抗原結合蛋白(例如本文所述抗體或其抗原結合片段)及醫藥上可接受之載劑；編碼抗原結合蛋白之核酸分子；包含核酸分子之表現載體；及包含載體之宿主細胞，其中宿主細胞可為原核細胞或真核細胞(例如哺乳動物細胞)。
於一些態樣中，本發明亦提供一種產生抗原結合蛋白(例如本文所述抗體或其抗原結合片段)之方法，包括在允許抗原結合蛋白表現之條件下培養宿主細胞，及自培養基中單離抗原結合蛋白。
於一些態樣中，本發明亦提供一種治療有需要患者癌症之方法，包括向患者投與治療有效量之抗原結合蛋白，例如本文所述抗體或抗原結合片段。於一些實施例中，方法另包含向患者投與另外抗癌症治療劑。於進一步之實施例中，另外抗癌症治療劑為靶向CD3及腫瘤相關抗原(TAA)之雙特異性抗體(bsAb)。於特定實施例中，TAA為B7-H3、HER2或TROP2。於一些實施例中，另外抗癌症治療劑為免疫檢查點抑制劑，視情況可為抗PD-1、抗CTLA4或抗PD-L1抗體。
本文亦提供本發明之抗原結合蛋白(例如抗體或其抗原結合片段)，或醫藥組合物，其用於治療有需要患者癌症；使用本發明之抗原結合蛋白(例如抗體或其抗原結合片段)製造用於治療有需要患者癌症之藥物；及製品(例如，套組)，其含有本發明抗原結合蛋白(例如抗體或其片段)之一個或多個給藥單元。
本發明之其它特徵、目的及優點於以下詳細描述中顯而易見。然而，應瞭解，詳細描述在指示本發明之實施例及方面之同時，僅以說明而非限制之方式給出。根據詳細描述，本領域技術人員將清楚地理解本發明範圍內之多種變化及修改。
I. 定義 在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明揭示內容不限於特定組合物或生物系統，當然其可變化。亦應瞭解，本文中所用之術語係僅出於描述特定實施例之目的，且不旨在限制。
如本文中所用，術語「約」系指為此技術領域之熟習者容易知曉之各自值的通常誤差範圍。本文中提及「約」值或參數包括(且描述)指向該值或參數本身之實施例。
應瞭解，本文中所述之本發明之態樣及實施例包括「包含」、「由…組成」及「基本上由…組成」態樣及實施例。
如本文中所用，術語「及/或」，諸如「A及/或B」之短語意欲包括A及B二者；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如本文中所用，術語「及/或」，諸如「A、B及/或C」之短語意欲涵蓋下列實施例各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
術語「抗體」涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化或不可活化抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，包括經遮蔽雙特異性抗體)及抗體片段(例如，單鏈可變片段或scFv)，只要其展示所需生物活性(例如，以期望之特異性及親和力結合靶抗原之能力)。
術語「抗體」涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化或不可活化抗體)及多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。術語「抗體」亦包括，但不限於，嵌合抗體、人源化抗體及全長人類抗體。
於一些實施例中，術語「抗體」指具有由兩條相同重(H)鏈及兩條相同輕(L)鏈組成之基本四多肽鏈結構之抗原結合蛋白(即免疫球蛋白)。每一L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接，此端視H鏈同型而定。每一重鏈在N末端具有可變區(亦稱為可變結構域) (在本文中縮寫為V H)，其後為恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域C H1、C H2及C H3。每一輕鏈在N末端具有可變區(亦稱為可變結構域) (在本文中縮寫為V L)，其後為處於該輕鏈另一端之恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域C L。V L與V H對準且C L與重鏈之第一恆定結構域(C H1)對準。V H及V L之配對一起形成單一抗原結合位點。
V H及V L可進一步細分成互補決定區(CDR)及框架區(FW)。CDR具有最高之序列變異性及/或參與抗原識別。CDR及FR按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4之順序散佈。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR (abbreviated-CDR)或a-CDR之區內。例示性a-CDR (a-LCDR1、a-LCDR2、a-LCDR3、a-HCDR1、a-HCDR2及a-HCDR3)各自出現在輕鏈之31-34、50-55、89-96，以及重鏈之31-35、50-58及95-102胺基酸殘基處。參見Almagro及Fransson，Front. Biosci. (2008) 13:1619-33。除非另有指示，否則可變區殘基在本文中係根據Kabat等人，J Biol Chem. (1977) 252:6609-16；Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)來編號。
下表1提供根據此項技術中已知之各種演算法之例示性CDR定義。 表1. CDR定義
   Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3 IMGT 4 AHo 5
HCDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
HCDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
HCDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
LCDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
LCDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
LCDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1殘基編號遵循Kabat等人，參見上文之命名法。 2殘基編號遵循Chothia等人，J. Mol. Biol. (1987) 196:901-917；Al-Lazikani B.等人，J. Mol. Biol., (1997) 273: 927-948之命名法。 3殘基編號遵循MacCallum等人，J. Mol. Biol. (1996) 262:732-745；Abhinandan及Martin，Mol. Immunol., (2008) 45: 3832-3839之命名法。 4殘基編號遵循Lefranc M.P.等人，Dev. Comp. Immunol., (2003) 27:55-77；及Honegger及Plückthun，J. Mol. Biol., (2001) 309:657-670之命名法。 5殘基編號遵循Honegger及Plückthun，J. Mol. Biol., (2001) 309:657-670之命名法。
來自任一脊椎動物物種之L鏈基於其恆定結構域之胺基酸序列可分配至兩種明顯不同之類型(稱為κ及λ)中之一者。端視抗體重鏈(C H)之恆定結構域之胺基酸序列，該等抗體可分配至不同之類別或同型。存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其重鏈分別命名為α (alpha)、δ (delta)、ε (epsilon)、γ (gamma)及μ (mu)。藉由γ重鏈Y1-Y4，IgG類抗體可進一步分成四個子類，分別為IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4。
術語「抗原結合片段」或「抗原結合部分」於本文中可交換使用，係指保留結合至抗體抗原之能力之抗體之部分。抗體之「抗原結合片段」之實例包括但不限於，(i) Fab片段，由V L、V H、C L及C H1結構域組成之單價片段，藉由木瓜蛋白酶消化獲得；(ii) F(ab′) 2片段，包含由鉸鏈區之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段，藉由胃蛋白酶消化獲得；(iii)由抗體之單臂之V L及V H結構域組成之Fv片段，(iv)單鏈Fv (scFv)片段，其包含彼此融合之抗體之V H及V L結構域；及(v)單鏈Fab (scFab)片段，其包含含有V L、V H、C L及C H1結構域之單鏈多肽。
術語「經遮蔽抗體」係指包含遮蔽性肽之抗體(包括多特異性抗體)或其抗原結合片段幹預、阻止、降低(能力)、防止、抑制結合至其靶，或與抗體之抗原結合域競爭結合至其靶。經遮蔽抗體可以藉由將遮蔽性肽連接至抗體之抗原結合域來產生。於一些實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段在未活化狀態下(例如，被遮蔽性肽抑制或遮蔽)對靶表現出之第一結合親和力，並在活化狀態下(例如，未被遮蔽性肽抑制或遮蔽(例如，從抗體上裂解之遮蔽性肽))對靶表現出第二結合親和力，其中第二結合親和力大於第一結合親和力。經遮蔽抗體可以藉由將包含可活化部分(例如，連接單元之可裂解位點或「LU」)之遮蔽性肽連接至抗體之抗原結合域來產生。於一些實施例中，經遮蔽抗體，或其經遮蔽抗原結合片段為多特異性抗體，其包含對T細胞表面分子(例如，CD28、CD3)及腫瘤細胞表面抗原(例如，HER2、B7H3、TROP2等)具有特異性之結合域。於一些實施例中，經遮蔽抗體為二價，且在兩個結合域中的一個上具有單價遮蔽。於一些實施例中，經遮蔽抗體為二價，且在兩個結合域中的每一個上都具有遮蔽。例如，對於單價經遮蔽抗體，抗體的一個結合域被融合或綴合遮蔽性肽遮蔽。對於雙特異性抗體，一個或兩個結合域可被具有特異性但不同的遮蔽性肽遮蔽。同時靶向癌細胞及T細胞之未經活化雙特異性抗體可具有遮蔽兩個結合域之結合位點，以抑制(或最小化)與抗原表現癌症細胞及T細胞之結合。然而，在活化狀態下，遮蔽性部分被裂解以允許抗體於腫瘤微環境(TME)中與腫瘤抗原及T細胞表面分子(例如，CD28)結合。於此種情況下，經活化雙特異性抗體選擇性地接合T細胞，殺死靶向腫瘤抗原表現之癌症細胞。
術語「遮蔽性肽」係指抑制抗原結合域與其靶抗原結合之肽，並且通常自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)。遮蔽性肽之C端通常與抗原結合域之V H或V L之N端相連。於一些實施例中，遮蔽性肽或其一部分幹擾或抑制抗原結合域與其靶之結合如此有效使得抗原結合域與其靶結合極低及/或在檢測限以下(例如，於ELISA或流式細胞術檢定中不可檢測結合)。本文所述經遮蔽抗體或多肽可包含一個或多個連接體，例如，在LU內、置於MU及LU之間、LU及V H或V L之間或V H及Fc鉸鏈區之間。
遮蔽性肽之LU可以包含至少一個可裂解位點。該裂解位點一般包含可裂解之胺基酸序列，例如，用作能形成可還原二硫鍵之酵素及/或半胱胺酸-半胱胺酸對之受質。因而，當術語「裂解」、「可裂解」、「經裂解」及類似者結合裂解位點使用時，該等術語涵蓋例如藉由蛋白酶之酶促裂解，以及半胱胺酸-半胱胺酸對之間之二硫鍵經由可由暴露於還原劑產生之二硫鍵之還原之中斷。該裂解位點之胺基酸序列可與該MU重迭或包含於該MU內。經遮蔽抗體或經遮蔽多肽可以包含配置為介導抗體或多肽活化之裂解位點。例如，當可活化抗體之裂解位點為完整時(例如，未藉由對應酵素裂解，及/或含有未經還原之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵)，該遮蔽性肽或其一部分可能幹預或抑制抗原結合域結合至其靶。於一些實施例中，遮蔽性肽之LU不包含可裂解位點。
術語「遮蔽效率」係指遮蔽性肽抑制抗原結合域與靶抗原結合之效率。遮蔽效率可以藉由包含抗原結合域之經遮蔽抗體或經遮蔽多肽之結合親和力相對於包含抗原結合域(例如，從抗體上裂解之遮蔽性肽)之未經遮蔽抗體或未經遮蔽多肽之結合親和力之差異或比率來量測。例如，遮蔽效率可以藉由經遮蔽抗體之未活化狀態(例如，抑制、遮蔽及/或未裂解)與靶抗原結合之EC 50或K D除以未經遮蔽抗體之活化狀態(例如，未抑制、未遮蔽及/或裂解)與靶抗原結合之EC 50或K D，或親本抗體(例如，未連接遮蔽性肽)與靶抗原結合之EC 50或K D來量測。可以藉由ELISA量測或Jurkat NFAT報告子分析測定EC 50值，例如美國專利公開第US20210207126 A1號所述。K D值可以藉由，例如，使用表面電漿子共振量測。
術語「抗原表位」係指抗體(或其抗原結合片段)結合之抗原之部分。抗原表位可自鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並置之非鄰接胺基酸二者形成。自鄰接胺基酸形成之抗原表位通常保留暴露於變性劑，然而藉由三級折疊形成之抗原表位通常在用變性溶劑處理中喪失。抗原表位可包含各種數目之胺基酸於獨特空間構形中。測定抗原表位之空間構形之方法包括例如x-射線結晶學、2維核磁共振、氘及氫交換與質譜法組合、或定點誘變、或與抗原及其複合結構與其結合抗體及其變異體之電腦建模組合使用之所有方法(參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G. E. Morris編輯.(1996))。一旦確定抗原之所需抗原表位，可例如使用本文中所述技術產生該抗原表位之抗體。抗體之產生及表徵亦可闡明關於所需抗原表位之資訊。自此資訊，然後可競爭篩選結合至相同抗原表位之抗體。達成此之一種方法為進行交叉競爭研究以找到彼此競爭結合之抗體，即，競爭結合至抗原之抗體。基於其交叉競爭「分類」抗體之高通量方法描述於PCT公開案第WO 03/48731號中。
術語「生殖系」係指抗體基因及基因片段之核苷酸序列，因為其經由生殖細胞自親本傳給後代。生殖系序列不同於成熟B細胞中編碼抗體之核苷酸序列，該等核苷酸序列已在B細胞成熟過程期間藉由重組及高突變事件改變。
術語「糖基化位點」係指藉由真核細胞識別為糖殘基之連接位置之胺基酸殘基。在碳水化合物(諸如寡糖)之情況下連接之胺基酸通常為天冬醯胺(N-鍵聯)、絲胺酸(O-鍵聯)及蘇胺酸(O-鍵聯)殘基。特定連接位點通常藉由胺基酸序列(本文中稱作「糖基化位點序列」)信號傳導。用於N-連接之糖基化之糖基化位點序列為：-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可為習知胺基酸中之任一者，除了脯胺酸。術語「N-連接」及「O-連接」係指用作糖分子與胺基酸殘基之間之連接位點之化學基團。N-連接之糖通過胺基連接；O-連接之糖通過羥基連接。術語「多醣佔用」係指連接至糖基化位元元點之碳水化合物部分之存在(即，佔用多醣位點)。在多肽上存在至少兩個潛在糖基化位點之情況下，無(0-多醣位點佔用)、一個(1-多醣位點佔用)或兩個(2-多醣位點佔用)位元點可由碳水化合物部分佔用。
術語「宿主細胞」係指可工程改造以產生所關注蛋白質、蛋白質片段或肽之細胞系統。宿主細胞包括(不限於)經培養細胞，例如，源自囓齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠或倉鼠)之哺乳動物培養細胞，諸如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；人類細胞(例如，HEK293F細胞、HEK293T細胞)；或人類組織或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞(例如，S2細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E. coli)細胞)及包含於轉殖基因動物或經培養組織內之細胞。術語不僅涵蓋特定受試者細胞，而且涵蓋此細胞之後代。因為某些修飾可發生於後代中，由於突變或環境影響，此後代可不與親本細胞相同，但是仍包含於術語「宿主細胞」之範圍內。
「人類抗體」為具有胺基酸序列者，該胺基酸序列對應於藉由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。
術語「人源化抗體」係指含有源自人類抗體序列之胺基酸殘基之嵌合抗體。人源化抗體可含有來自非人類動物或合成抗體之CDR中之一些或所有，而抗體之框架區及恒定區含有源自人類抗體序列之胺基酸殘基。
術語「例示性抗體」係指本文所述抗體中之任一者。此等抗體可為任何類別(例如，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。因此，以上所識別之各抗體涵蓋具有V L及V H區之相同胺基酸序列之所有五類抗體。此外，IgG類別之抗體可為任何子類別(例如，IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4)。因此，以上於IgG子類別中所識別之各抗體涵蓋具有V L及V H區之相同胺基酸序列之所有四種子類別之抗體。五類以及四種IgG子類別之人類抗體之重鏈恆定區的胺基酸序列係此項技術中已知。
「經單離」抗體或結合分子為已自其自然環境之組分分離者。於一些實施例中，抗體經純化為大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。評論用於評估抗體純度之方法，參見例如，Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。術語「k a」係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率常數，其中術語「k d」係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。
術語「K D」係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。其自k d與k a之比率(即，k d/k a)獲得且表示為莫耳濃度(M)。K D係用作抗體結合至其結合搭檔之親和力之量度。K D越小，抗體結合越緊密，或抗體與抗原之間之親和力越高。例如，具有奈莫耳(nM)解離常數之抗體較具有微莫耳(μM)解離常數之抗體與特定抗原結合更緊密。可使用此項技術中良好建立之方法測定抗體之K D值。一種測定抗體之K D之方法為藉由使用ELISA。例如，使用ELISA之檢定程式。
術語「哺乳動物」係指哺乳綱類別之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；實驗動物，諸如大鼠、小鼠、倉鼠、兔、非人類靈長類動物及豚鼠；家養動物，諸如貓、狗、牛、綿羊、山羊、馬及豬；及被俘野生動物，諸如獅子、老虎、大象及類似者。
關於哺乳動物之某種疾病病狀之術語「預防(prevent/preventing)」係指預防或延遲該疾病之發作，或預防其臨床或亞臨床症狀之表現。
如本文所用之兩條多肽序列之間之「序列一致性」指示序列之間一致之胺基酸之百分比。多肽之胺基酸序列一致性可按慣例使用已知電腦程式(例如Bestfit、FASTA或BLAST)來確定(參見例如Pearson, Methods Enzymol. (1990) 183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. (2000) 132:185-219；Altschul等人，J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410；Altschul等人，Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402)。在使用Bestfit或任何其他序列比對程式來確定例如特定序列是否與參考胺基酸序列95%一致時，設定參數，使得在參考胺基酸序列之全長內計算一致性百分比且允許參考序列中高達5%之胺基酸殘基總數之同源性差異。此上文所提及確定多肽之間之一致性百分比之方法適用於本文所揭示之所有蛋白質、其片段或變異體。
如本文中所用，術語「結合」、「結合至」、「特異性結合」、「特異性結合至」或「對…特異性」係指可量測且可再生相互作用，諸如靶與抗體之間之結合，其確定在分子(包括生物分子)異質群之存在下靶之存在。例如，結合至或特異性結合至靶(其可為抗原表位)之抗體為結合此靶之抗體，結合此靶較其結合至其他靶具有更高親和力、抗體親抗原性(avidity)、更便利及/或更多持續時間。於一實施例中，抗體與不相關靶之結合程度係小於抗體與該靶之結合之約10%，如例如藉由放射性免疫檢定(RIA)所量測。於某些實施例中，特異性結合至靶之抗體具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM或≤ 0.1 nM之解離常數(Kd)。於某些實施例中，抗體特異性結合至蛋白質上之抗原表位，該蛋白質在來自不同物種之蛋白質中係保守的。於另一實施例中，特異性結合可包括但不需要專一結合。例如，若本文所述經遮蔽抗CD28抗體結合至人類CD28之EC 50低於如在活體外分析中其結合不同抗原之EC 50的10%，則稱本文所述經遮蔽抗CD28抗體選擇性結合至人類CD28。
提及哺乳動物之某一疾病病狀之術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指在患有疾病病狀之哺乳動物中產生期望或有益效應。期望或有益效應可包括減小疾病之一種或多種症狀(即腫瘤生長及/或轉移，或由免疫細胞之數量及/或活性介導之其他效應及諸如此類)之頻率或嚴重程度、或阻止或抑制疾病、疾患或病症之進一步發展。在治療哺乳動物之癌症之上下文中，期望或有益效應可包括抑制癌細胞之進一步生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症之再發、減輕與癌症相關之疼痛或改良哺乳動物之存活。效應可為主觀或客觀的。舉例而言，若哺乳動物係人類，則人類可注意到改良之精力或活力或減輕的疼痛作為對療法之改良或反應之主觀症狀。替代地，臨床醫師可基於體檢、實驗室參數、腫瘤標記物或放射學發現注意到腫瘤大小或腫瘤負荷之減小。臨床醫師可觀察到治療反應之一些實驗室跡象包括測試之正規化，例如白血球計數、紅血球計數、血小板計數、成熟紅血球沉降速率及各個酶水準。另外，臨床醫師可觀察到可偵測腫瘤標記物之減少。替代地，可使用其他測試來評估客觀改良，例如音波圖、核磁共振測試及正電子發射測試。
術語「載體」係指能轉運外來核酸分子之核酸分子。外來核酸分子藉由重組技術(諸如連接或重組)連接至載體核酸分子。此允許外來核酸分子***作，選擇，進一步操作或於宿主細胞或生物體中表現。載體可為質粒、噬菌體、轉位子、黏粒、染色體、病毒或病毒子。可在引入宿主細胞後將一種載體融合至宿主細胞之基因組，及從而連同宿主基因組(例如，非表小體哺乳動物載體)複製。另一種載體能於引入其之宿主細胞中自發複製(例如，具有複製之細菌來源之細菌載體及表小體哺乳動物載體)。能指導以可操作方式連接其之可表現外來核酸之表現之另一特定類型之載體通常被稱作「表現載體」。表現載體一般具有驅動可表現外來核酸之表現之控制序列。稱作「轉錄載體」之更簡單載體僅能被轉錄但是不能被轉譯：其可於靶細胞中複製但是不可表現。術語「載體」涵蓋所有類型之載體，不管其功能。能指導以可操作方式連接其之可表現核酸之表現之載體通常被稱作「表現載體」。「載體」之其他實例可包括顯示載體(例如，指導編碼多肽在病毒或細胞(諸如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞)表面上表現及顯示之載體)。
如本文中所用，「受試者」、「患者」或「個體」可係指人類或非人類動物。「非人類動物」可係指不歸類為人類之任何動物，諸如家養動物、農場動物或動物園動物、競技動物、寵物(諸如狗、馬、貓、牛等)，以及用於研究之動物。研究動物可係指(不限於)線蟲類動物、節肢動物、脊椎動物、哺乳動物、青蛙、囓齒動物(例如，小鼠或大鼠)、魚(例如，斑馬魚或尖鼻魨)、禽(例如，雞)、狗、貓及非人類靈長類動物(例如，恆河猴、食蟹獼猴、黑猩猩等)。於一些實施例中，受試者、患者或個體為人類。
「有效量」係指至少在必要之劑量及時間段內達到一種或多種預期或訓示效果之有效量，包括治療或預防效果。可在一次或多次施用中提供有效量。為了本公開之目的，有效量之抗體、藥物、化合物或藥物組合物是足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床上下文中所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可或可不結合另一藥物、化合物或醫藥組合物達成(例如，作為單藥療法或組合療法施用之有效量)。因此，若結合一種或多種其他劑可達成或達成期望結果，則「有效量」可視為在投與一種或多種治療劑之上下文中，且單一劑可視為以有效量給予。
本文引用之所有參考文獻，包括專利申請及出版物，其全文以引用的方式併入本文中。 II. 抗體
本發明之某些態樣係關於單特異性抗體(例如，傳統、非遮蔽單特異性抗體)、多特異性抗體(例如，非遮蔽多特異性抗體)、經遮蔽抗體(例如，可活化單特異性或多特異性抗體)、其抗原結合片段、或此等抗體之衍生物。 A. Fc區及C H3結構域
於一些實施例中，本文所述抗體(例如，多特異性抗體)包含一個或多個抗體恒定區，例如人類重鏈恒定區及/或人類輕鏈恒定區。於一些實施例中，人類重鏈恆定區屬於選自IgA、IgG及IgD之同型。在一些實施例中，人類輕鏈恆定區屬於選自κ及λ之同型。在一些實施例中，抗體包含人類IgG恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類IgG 4重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類IgG 1重鏈恆定區。在一些此類實施例中，抗體在人類IgG 4恆定區中包含S228P突變。
效應功能是否為所需的可視意欲用於抗體之特定處理方法而定。在一些實施例中，當效應功能為所需的時，選擇包含人類IgG 1重鏈恆定區或人類IgG 3重鏈恆定區之抗體。在一些實施例中，當效應功能不為所需的時，選擇包含人類IgG 4或IgG 2重鏈恆定區之抗體。在一些實施例中，抗體包含含有降低效應功能之一個或多個突變之人類IgG 1重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含含有N297A取代之IgG 1重鏈恆定區。
本文所描述之多特異性抗體(包括可活化多特異性抗體)可包含C H3結構域，其具有一個或多個經工程改造之二硫鍵、一個或多個經工程改造(例如重排或逆轉)之鹽橋或其組合。除非另外說明，否則本文之所有胺基酸殘基編號係基於Eu編號，且胺基酸取代係在野生型(或天然存在之) C H3結構域序列中之對應胺基酸位置相對於野生型(或天然存在之)序列。應瞭解，本文所描述之突變或取代適用於所有IgG亞類及同種異型。IgG同種異型已描述於例如Jefferis及Lefranc mAbs (2009) 1:4, 1-7中，該參考文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本文所描述之胺基酸突變或取代係相對於IgG1之野生型C H3結構域序列，諸如IgG1同種異型G1m、1 (a)、2 (x)、3 (f)或17 (z)。在一些實施例中，本文所描述之胺基酸突變或取代係相對於IgG 4之野生型C H3結構域序列。舉例而言，相對於一種人類IgG 1同種異型之野生型C H3結構域(Uniprot編號P01857)的D356K取代等效於相對於第二人類IgG 1同種異型之野生型C H3結構域或人類IgG 4之野生型C H3結構域的E356K取代。示例性C H3結構域突變顯示於表2及3中。在一些實施例中，本文所描述之胺基酸突變或取代係相對於野生型Fc區序列，例如IgG 1Fc區或IgG 4Fc區。具有突變之C H3序列描述於WO 2021/148006中，其全文以引用的方式併入本文中。於下表及說明書之其它部分，C H3突變注釋中撇號表示第二C H3結構域中之殘基。例如，於N390C-S400’C中，S400C突變位於第二C H3結構域。 表2. Fc突變
設計 突變(第一C H3結構域-第二C H3結構域)
二硫鍵 N390C-S400’C
S400C-N390’C
K392C-V397’C
V397C-K392’C
K392C-S400’C
S400C-K392’C
電荷設計 E357K:T411K-L351’D:K370’D
E357K:S364K-L351’D:K370’D
D356K:E357K:S364K-L351’D:K370’D:K439’D
電荷+二硫鍵設計 E357K:S364K:N390C-L351’D:K370’D:S400’C
E357K:S364K:S400C-L351’D:K370’D:N390’C
D356K:E357K:S364K:N390C-L351’D:K370’D:S400’C:K439’D
D356K:E357K:S364K:S400C-L351’D:K370’D:N390’C:K439’D
表3. Fc突變ID
突變ID 突變(第一C H3結構域-第二C H3結構域)
TRF01 T366S, L368A, Y407V, Y349C-T366’W, S354’C
TRF02 T350V, L351Y, F405A, Y407V-T350’V, T366’L, K392’L, T394’W
TRF03 K196Q, S228P, F296Y, E356K, R409K, H435R, L445P-K196’Q, S228’P, F296’Y, R409’K, K439’E, L445’P
TYM01 T366S, L368A, Y407V, N390C-T366’W, S400’C
TYM02 T366S, L368A, Y407V, S400C-T366’W, N390’C
TYM03 Y349C, L368V, Y407V-S354’C, T366’W
TYM04 L368V, Y407V-T366’W
TYM05 L368V, Y407V, N390C-T366’W, S400’C
TYM06 L368V, Y407V, S400C-T366’W, N390’C
TYM07 E357K:T411K-L351’D:K370’D
TYM08 E357K:S364K-L351’D:K370’D
TYM09 D or E356K:E357K:S364K-L351’D:K370’D:K439’D
TYM10 E357K:S364K:N390C-L351’D:K370’D:S400’C
TYM11 E357K:S364K:S400C-L351’D:K370’D:N390’C
TYM12 D or E356K:E357K:S364K:N390C-L351’D:K370’D:S400’C:K439’D
TYM13 D or E356K:E357K:S364K:S400C-L351’D:K370’D:N390’C:K439’D
在一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含第一C H3結構域中之C390與第二C H3結構域中之C400之間、第一C H3結構域中之C392與第二C H3結構域中之C397之間或第一C H3結構域中之C392與第二C H3結構域中之C400之間的經工程改造之二硫鍵。在一些實施例中，與野生型C H3結構域相比，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含例如在第一C H3結構域中之位置357及411與第二C H3結構域中之位置351及370間(例如E357K:T411K-L351'D:K370'D)，或在第一C H3結構域中之位置357及364與第二C H3結構域中之位置351及370間(例如E357K:S364K-L351'D:K370'D)的重排鹽橋網狀結構。在一些實施例中，與野生型C H3結構域相比，多特異性抗體包含在第一C H3結構域中之位置356與第二C H3結構域中之位置439之間的逆轉鹽橋(例如D356-K439')。具有C H3突變之抗體可具有高產率、優良穩定性(例如，在高溫下或凍融迴圈下抗聚集和沉澱)及有效活性。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含C H3結構域，其具有一個或多個經工程改造之殘基，該等經工程改造之殘基如本文所述促進異二聚體形成。本文亦涵蓋包含多個由包含第一經工程改造之C H3結構域之第一多肽及包含第二經工程改造之C H3結構域之第二多肽形成的異二聚體之異多聚體。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：i)第一C H3結構域包含在位置390之半胱胺酸(C)殘基且第二C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置390之半胱胺酸殘基；或ii)第一C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；或iii)第一C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；且其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中：i)第一C H3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基；或ii)第一C H3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基；或iii)第一C H3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基；或i)與ii)之組合，或i)與iii)之組合，其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含在位置356之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置439之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置439之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置356之帶正電荷之殘基；且其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中：i)第一C H3結構域包含在位置390之半胱胺酸(C)殘基且第二C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置390之半胱胺酸殘基；或ii)第一C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；或iii)第一C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一C H3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；且其中：a)第一C H3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基；或b)第一C H3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基；或c)第一C H3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基；或a)與b)之組合，或a)與c)之組合；其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含在位置356之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置439之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域另包含在位置439之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域另包含在位置356之帶正電荷之殘基，且其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
C H3結構域可衍生自任何天然存在之免疫球蛋白分子。在一些實施例中，C H3結構域衍生自IgG 1分子、IgG 2分子、IgG 3分子或IgG 4分子。在一些實施例中，C H3結構域為人類C H3結構域。在一些實施例中，C H3結構域衍生自人類IgG 1分子。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中：i)第一C H3結構域包含N390C取代且第二C H3結構域包含S400C取代，或第一C H3結構域包含S400C取代且第二C H3結構域包含N390C取代；或ii)第一C H3結構域包含K392C取代且第二C H3結構域包含V397C取代，或第一C H3結構域包含V397C取代且第二C H3結構域包含K392C取代；或iii)第一C H3結構域包含K392C取代且第二C H3結構域包含S400C取代，或第一C H3結構域包含S400C取代且第二C H3結構域包含K392C取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中：i)第一C H3結構域包含E357K及T411K取代且第二C H3結構域包含L351D及K370D取代，或第一C H3結構域包含L351D及K370D取代且第二C H3結構域包含E357K及T411K取代；或ii)第一C H3結構域包含E357K及S364K取代且第二C H3結構域包含L351D及K370D取代，或第一C H3結構域包含L351D及K370D取代且第二C H3結構域包含E357K及S364K取代；或iii)第一C H3結構域包含D356K、E357K及S364K取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D及K439D取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D及K439D取代且第二C H3結構域包含D356K、E357K及S364K取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含E357K、S364K及N390C取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D及S400C取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D及S400C取代且第二C H3結構域包含E357K、S364K及N390C取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含E357K、S364K及S400C取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D及N390C取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D及N390C取代且第二C H3結構域包含E357K、S364K及S400C取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含D356K、E357K、S364K及S400C取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D、N390C及K439D取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D、N390C及K439D取代且第二C H3結構域包含D356K、E357K、S364K及S400C取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含：含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含D356K、E357K、S364K及N390C取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D、K439D及S400C取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D、K439D及S400C取代且第二C H3結構域包含D356K、E357K、S364K及N390C取代。
於一些實施例中，多特異性抗體(例如可活化多特異性抗體)包含含有經工程改造之C H3結構域之IgG Fc區。Fc區可衍生自任何適合之Fc亞類，包括但不限於IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4亞類。 B. 半胱胺酸突變
在一些實施例中，本文所描述之多特異性抗體(例如本文所描述之可活化多特異性抗體)包含含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含第一經工程改造之半胱胺酸殘基且第二C H3結構域包含第二經工程改造之半胱胺酸殘基，其中第一經工程改造之半胱胺酸殘基及第二半胱胺酸殘基形成二硫鍵。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置390之C且第二C H3結構域包含在位置400之C，或第一C H3結構域包含在位置400之C且第二C H3結構域包含在位置390之C。在一些實施例中，第一C H3結構域包含N390C取代且第二C H3結構域包含S400C取代，或第一C H3結構域包含S400C取代且第二C H3結構域包含N390C取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置392之C且第二C H3結構域包含在位置397之C，或第一C H3結構域包含在位置397之C且第二C H3結構域包含在位置392之C。在一些實施例中，第一C H3結構域包含K392C取代且第二C H3結構域包含V397C取代，或第一C H3結構域包含V397C取代且第二C H3結構域包含K392C取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置392之C且第二C H3結構域包含在位置400之C，或第一C H3結構域包含在位置400之C且第二C H3結構域包含在位置392之C。在一些實施例中，第一C H3結構域包含K392C取代且第二C H3結構域包含S400C取代，或第一C H3結構域包含S400C取代且第二C H3結構域包含K392C取代。 C. 鹽橋突變
在一些實施例中，本文所描述之多特異性抗體(例如本文所描述之可活化多特異性抗體)包含含有第一C H3結構域之第一多肽及含有第二C H3結構域之第二多肽，其中第一C H3結構域包含經工程改造之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含經工程改造之帶負電荷之殘基，其中經工程改造之帶正電荷之殘基及經工程改造之帶負電荷之殘基形成鹽橋。相對於野生型C H3結構域，經工程改造之鹽橋可在C H3結構域之間引入新的鹽橋，使兩個或更多個胺基酸殘基間之鹽橋網狀結構重排，或逆轉形成鹽橋之胺基酸殘基上之電荷(亦即，「逆轉」鹽橋)。在一些實施例中，經工程改造之帶正電荷之殘基將野生型C H3結構域中之帶負電荷之殘基用帶正電荷之殘基取代。在一些實施例中，經工程改造之帶正電荷之殘基將野生型C H3結構域中之帶正電荷之殘基用帶負電荷之殘基取代。重排及逆轉鹽橋可使得包含經工程改造之C H3結構域的異二聚體及均二聚體之等電點(PI)改變，由此允許在純化製程中更好地分離異二聚體與均二聚體。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之K且第二C H3結構域包含在位置351之D，或第一C H3結構域包含在位置351之D且第二C H3結構域包含在位置357之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之K且第二C H3結構域包含在位置351之E，或第一C H3結構域包含在位置351之E且第二C H3結構域包含在位置357之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之R且第二C H3結構域包含在位置351之D，或第一C H3結構域包含在位置351之D且第二C H3結構域包含在位置357之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之R且第二C H3結構域包含在位置351之E，或第一C H3結構域包含在位置351之E且第二C H3結構域包含在位置357之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含E357K取代且第二C H3結構域包含L351D取代，或第一C H3結構域包含L351D取代且第二C H3結構域包含E357K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置411之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置411之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置411之K且第二C H3結構域包含在位置370之D，或第一C H3結構域包含在位置370之D且第二C H3結構域包含在位置411之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置411之K且第二C H3結構域包含在位置370之E，或第一C H3結構域包含在位置370之E且第二C H3結構域包含在位置411之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置411之R且第二C H3結構域包含在位置370之D，或第一C H3結構域包含在位置370之D且第二C H3結構域包含在位置411之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置411之R且第二C H3結構域包含在位置370之E，或第一C H3結構域包含在位置370之E且第二C H3結構域包含在位置411之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含T411K取代且第二C H3結構域包含K370D取代，或第一C H3結構域包含K370D取代且第二C H3結構域包含T411K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置364之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置364之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置364之K且第二C H3結構域包含在位置370之D，或第一C H3結構域包含在位置370之D且第二C H3結構域包含在位置364之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置364之K且第二C H3結構域包含在位置370之E，或第一C H3結構域包含在位置370之E且第二C H3結構域包含在位置364之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置364之R且第二C H3結構域包含在位置370之D，或第一C H3結構域包含在位置370之D且第二C H3結構域包含在位置364之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置364之R且第二C H3結構域包含在位置370之E，或第一C H3結構域包含在位置370之E且第二C H3結構域包含在位置364之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含S364K取代且第二C H3結構域包含K370D取代，或第一C H3結構域包含K370D取代且第二C H3結構域包含S364K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置439之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置439之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置356之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之K且第二C H3結構域包含在位置439之D，或第一C H3結構域包含在位置439之D且第二C H3結構域包含在位置356之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之K且第二C H3結構域包含在位置439之E，或第一C H3結構域包含在位置439之E且第二C H3結構域包含在位置356之K。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之R且第二C H3結構域包含在位置439之D，或第一C H3結構域包含在位置439之D且第二C H3結構域包含在位置356之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之R且第二C H3結構域包含在位置439之E，或第一C H3結構域包含在位置439之E且第二C H3結構域包含在位置356之R。在一些實施例中，第一C H3結構域包含D356K取代且第二C H3結構域包含K439D取代，或第一C H3結構域包含K439D取代且第二C H3結構域包含D356K取代。
本文所描述之經工程改造之鹽橋中的任一者可彼此組合。在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基及在位置411之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基及在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基及在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基及在位置411之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含E357K及T411K取代且第二C H3結構域包含L351D及K370D取代，或第一C H3結構域包含L351D及K370D取代且第二C H3結構域包含E357K及T411K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基及在位置364之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基及在位置370之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基及在位置370之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置357之帶正電荷之殘基及在位置364之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含E357K及S364K取代且第二C H3結構域包含L351D及K370D取代，或第一C H3結構域包含L351D及K370D取代且第二C H3結構域包含E357K及S364K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含在位置356之帶正電荷之殘基、在位置357之帶正電荷之殘基及在位置364之帶正電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基、在位置370之帶負電荷之殘基及在位置439之帶負電荷之殘基，或第一C H3結構域包含在位置351之帶負電荷之殘基、在位置370之帶負電荷之殘基及在位置439之帶負電荷之殘基且第二C H3結構域包含在位置356之帶正電荷之殘基、在位置357之帶正電荷之殘基及在位置364之帶正電荷之殘基。在一些實施例中，第一C H3結構域包含D356K、E357K及S364K取代且第二C H3結構域包含L351D、K370D及K439D取代，或第一C H3結構域包含L351D、K370D及K439D取代且第二C H3結構域包含D356K、E357K及S364K取代。 D. 其他突變
本文所描述之C H3結構域或Fc區可另包含下表4中所列經工程改造之二硫鍵及/或鹽橋。 表4. 示例性Fc突變
第一多肽鏈中之突變 第二多肽鏈中之突變
F405L K409R
S364H、F405A Y349T、T394F
S364K、E357Q L368D、K370S
T366W T366S、L368A、Y407V
S354C、T366W Y349C、T366S、L368A、Y407V
T350、L351、F405、Y407 T350為T350V、T350I、T350L或T350M L351為L351Y F450為F450A、F450V、F450T或F450S Y407為Y407V、Y407A或Y407I T350、T366、K392、T394 T350為T350V、T350I、T350L或T350M T366為T366L、T366I、T366V或T366M K392為K392F、K392L或K392M T394為T394W
D399K、E356K K409D、K392D
D221E、P228E、L368E D221R、P228R、K409R
C223E、E225E、P228E、L368E C223R、E225R、P228R、K409R
H435R 無
K196Q、S228P、F296Y、E356K、R409K、H435R、L445P  K196Q、S228P、F296Y、R409K、K439E、L445P
K409W D399V/F405T
K360E Q347R
Y349C/K360E/K409W Q347R/S354C/D399V/F405T
K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
Y349S/S354C/K409W Y349C/E357W/D399V/F405T
T366K L351D
Y349E或D及L368E L351D
Y349C/T366W D356C/T366S/L368A/Y407V/F405K
Y349C/T366W/F405K D356C/T366S/L368A/Y407V
Y349C/T366W/K409E D356C/T366S/L368A/Y407V/F405K
Y349C/T366W/K409A D356C/T366S/L368A/Y407V/F405K
S364K L368D
S364K K370S
F405K K409F
F405R K409F
S364K/K409F L368D/F405R
S364K/K409F K370S/F405R
S364K/K409W K370S/F405R
K370E或E356K及K409R E357K及K409R或K370E
S354I/S364L/Y407V Q347V/Y349I/T350K/L351Q/T366W/L368I/Y407V
Y349I S354I/E357Q/M/G/S364L/T366S/L368A/Y407V
P395K/P396K/V397K T394D/P395D/P396D
F405E/Y407E/K409E F405K/Y407K
M428S/N434S/Y436H H435R
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含在位置392之C且第二C H3結構域包含在位置399之C，或第一C H3結構域包含在位置399之C且第二C H3結構域包含在位置392之C。在一些實施例中，第一C H3結構域另包含K392C取代且第二C H3結構域另包含D399C取代，或第一C H3結構域另包含D399C取代且第二C H3結構域另包含K392C取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含在位置394之C且第二C H3結構域包含在位置354之C，或第一C H3結構域包含在位置354之C且第二C H3結構域包含在位置394之C。在一些實施例中，第一C H3結構域另包含Y394C取代且第二C H3結構域另包含S354C取代，或第一C H3結構域另包含S354C取代且第二C H3結構域另包含Y394C取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含在位置356之C且第二C H3結構域包含在位置349之C，或第一C H3結構域包含在位置349之C且第二C H3結構域包含在位置356之C。在一些實施例中，第一C H3結構域另包含D356C取代且第二C H3結構域另包含Y349C取代，或第一C H3結構域另包含Y349C取代且第二C H3結構域另包含D356C取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含K392D及K409D取代且第二C H3結構域另包含D356K及D399K取代，或第一C H3結構域另包含D356K及D399K取代且第二C H3結構域另包含K392D及K409D取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含L368D及K370S取代且第二C H3結構域另包含E357Q及S364K取代，或第一C H3結構域另包含E357Q及S364K取代且第二C H3結構域另包含L368D及K370S取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含L351K及T366K取代且第二C H3結構域另包含L351D及L368E取代，或第一C H3結構域另包含L351D及L368E取代且第二C H3結構域另包含L351K及T366K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含P395K、P396K及V397K取代且第二C H3結構域包含T394D、P395D及P396D取代，或第一C H3結構域另包含T394D、P395D及P396D取代且第二C H3結構域另包含P395K、P396K及V397K取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含F405E、Y407E及K409E取代且第二C H3結構域包含F405K及Y407K取代，或第一C H3結構域另包含F405K及Y407K取代且第二C H3結構域另包含F405E、Y407E及K409E取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域另包含T336S、L368A及Y407V取代且第二C H3結構域另包含T366W取代，或第一C H3結構域另包含T366W取代且第二C H3結構域另包含T336S、L368A及Y407V取代。
在一些實施例中，第一C H3結構域包含L368V及Y407V取代且第二C H3結構域包含T366W取代，或第一C H3結構域包含T366W取代且第二C H3結構域包含L368V及Y407V取代。 III. CD28結合分子
本揭示案提供結合至人類CD28之經單離結合分子，包括抗CD28抗體及其抗CD28抗原結合片段。於一些實施例中，結合分子包括參照抗原表位結合所描述之抗體以及關於互補決定區(CDR)、可變區(V L、V H)以及IgG (例如，IgG 4)輕鏈及重鏈的具體胺基酸序列所描述之抗體。
於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基34-108內之一個或多個胺基酸殘基結合。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基51-122內之一個或多個胺基酸殘基結合。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與選自由SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基51、52、54、55、98-101、110-111、113-114及118-122組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。量測抗體或抗原結合片段結合靶抗原之能力之方法可使用此項技術中已知之任何方法來進行，包括例如，藉由表面等離子體共振、ELISA、等溫滴定量熱法、過濾結合測定、EMSA等。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合靶抗原之能力藉由ELISA或Octet® RED96量測(參見例如，下述實例3)。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之KD結合至人類CD28。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約100 nM或更低之KD結合至人類CD28。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約50 nM或更低之KD結合至人類CD28。量測抗體或抗原結合片段之K D之方法可使用此項技術中已知之任何方法來進行，包含例如藉由表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、篩檢程式結合檢定法、EMSA等。於一些實施例中，KD藉由Octet® RED96系統來量測(參見例如，下述實例3)。 A. 抗CD28抗體
於一些實施例中，本公開提供一種經單離單克隆抗體，其在SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基33-37、80-83、92-96及100-104之抗原表位上與人類CD28結合。於特定實施例中，本公開提供一種經單離抗體，其在SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基33、34、36及37、80-83、92及93、95及96及100-104代表之抗原表位上與人類CD28結合。於一些實施例中，抗體以10 nM或更小之KD結合人類CD28，如藉由Octet® RED96系統量測。於某些實施例中，除結合人類抗原表位外，本公開之抗體可與選自食蟹獼猴、小鼠、大鼠及狗的至少一種非人類物種交叉反應。於某些實施例中，本公開之抗體具有跨物種結合小鼠、人類及猴子之優點，然而本公開之基準對照TAC2386及TAC2387不具有此範圍之物種交叉反應性。於特定實施例中，基準對照TAC2386及TAC2387結合人類抗原表位但不結合小鼠抗原表位(參見本文表7)。本公開抗體之物種交叉反應性亦能提供使用小鼠模擬抗體安全性、活性及功能之額外優勢。因此，相較於本公開之TAC2386及TAC2387，使用本公開之抗體更易進行動物建模。
於特定實施例中，經單離抗CD28單克隆抗體包含SEQ ID NO: 5之HCDR1、SEQ ID NO: 6之HCDR2及SEQ ID NO: 7之HCDR3，以及SEQ NO ID: 8之LCDR1、SEQ ID NO: 9之LCDR2及SEQ ID NO: 10之LCDR3。於特定實施例中，經單離單克隆抗體包含SEQ ID NO: 11之重鏈可變區及SEQ ID NO: 12之輕鏈可變區。於特定實施例中，經單離單克隆抗體包含SEQ ID NO: 13之重鏈及SEQ ID NO: 14之輕鏈。
本文所述CD28抗體可為任一類別，例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。CD28抗體較佳地系IgG類別，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3或IgG 4子類。抗CD28抗體可使用此項技術中已知之方法自一個類別或子類轉化成另一類別或子類。產生期望類別或子類之抗體之例示性方法包括以下步驟：分離編碼抗CD28抗體重鏈之核酸及編碼CD28抗體輕鏈之核酸，分離編碼V H區之序列，將V H序列聯結至編碼期望類別或子類之重鏈恒定區之序列，在細胞中表現輕鏈基因及重鏈構築物，及收集CD28抗體。
本文所述抗CD28抗體可為任一類別，例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。CD28抗體較佳地系IgG類別，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3或IgG 4子類。抗CD28抗體可使用此項技術中已知之方法自一個類別或子類轉化成另一類別或子類。產生期望類別或子類之抗體之例示性方法包括以下步驟：分離編碼抗CD28抗體重鏈之核酸及編碼抗CD28抗體輕鏈之核酸，分離編碼V H區之序列，將V H序列聯結至編碼期望類別或子類之重鏈恒定區之序列，在細胞中表現輕鏈基因及重鏈構築物，及收集CD28抗體。
此外，本公開提供之抗體可為單克隆或多克隆，但優選為單克隆。
本發明之抗體可藉由此項技術中已知之技術產生，包括習知單株抗體方法學，例如，標準體細胞雜交技術(參見例如，Kohler及Milstein，Nature (1975) 256:495)、B淋巴細胞之病毒或致癌轉形、或如下文中詳細所述之重組抗體技術。
雜交瘤產生為極完善建立之程式。用於製備雜交瘤之常見動物系統為鼠科系統。用於單離經免疫脾細胞用於融合之免疫方案及技術係此項技術中已知。融合搭檔(例如，鼠科骨髓瘤細胞)及融合程式亦已知。可用於製備本發明提供之人類CD28抗體之一種熟知方法涉及使用XenoMouse™動物系統。XenoMouse™小鼠經小鼠株工程改造，該等小鼠株包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之大片段且於小鼠抗體產生中有缺陷。參見例如，Green等人，Nature Genetics (1994) 7:13-21及WO2003/040170。將動物用CD28抗原免疫。該CD28抗原為經單離及/或經純化之CD28，較佳地CD28。其可為CD28之片段，諸如CD28之細胞外域，具體而言包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基34、34、36及37、80-83、92及93、95及96、以及100-104之CD28細胞外結構域片段。動物之免疫可藉由此項技術中已知之任一方法來實施。參見例如Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990。用於免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬)之方法為此項技術中所熟知。參見例如Harlow及Lane，參見上文及美國專利第5,994,619號。CD28抗原可與佐劑一起投與來刺激免疫反應。例示性佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI (胞壁醯二肽)或ISCOM (免疫刺激複合物)。用CD28抗原免疫動物後，自經免疫動物單離之細胞製備產生抗體之永生化細胞株。免疫後，將動物殺死且使淋巴結及/或脾B細胞永生化。使細胞永生化之方法包括(但不限於)將其用致癌基因轉移、將其用致癌病毒感染、將其在選擇永生化細胞之條件下培養、使其經歷致癌或突變化合物、將其與永生化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合及不活化腫瘤阻抑基因。參見例如Harlow及Lane，參見上文。若使用與骨髓瘤細胞之融合物，則骨髓瘤細胞較佳地不會分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞株)。使用CD28、其部分或表現CD28之細胞來篩選永生化細胞。針對期望特徵選擇、選殖且進一步篩選產生CD28抗體之細胞(例如雜交瘤)，包括穩健生長、高抗體產生及期望抗體特徵，如下文進一步論述。可在同基因動物活體內、在缺乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中或在細胞培養物活體外擴增雜交瘤。選擇、選殖及擴增雜交瘤之方法為熟習此項技術者所熟知。
本揭示案之抗體亦可使用噬菌體展示或酵母菌展示方法製備。此項技術中已建立用於分離人類抗體之此等展示方法，例如Knappik等人，“Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides.” J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86；及Feldhaus等人，“Flow-cytometric isolation of human antibodies from a non-immune Saccharomyces cerevisiae surface display library” Nat Biotechnol (2003) 21:163-170。 B. 抗原結合片段
於一些其他態樣中，本公開提供由本公開提供之CD28抗體中之任一者之抗原結合片段。
抗原結合片段可包含任何抗體序列。於一些實施例中，該抗原結合片段包含以下之胺基酸序列：(1)抗CD28抗體之輕鏈；(2) CD28抗體之重鏈；(3)來自抗CD28抗體輕鏈之可變區；(4)來自CD28抗體重鏈之可變區；(5) CD28抗體之一個或多個CDR (2、3、4、5或6個CDR)；或(6)來自抗CD28抗體之輕鏈之三個CDR及來自CD28抗體之重鏈之三個CDR。
於一些其它特定實施例中，抗CD28抗體之抗原結合片段包括：(i) Fab片段，其為由V L、V H、C L及C H1結構域組成之單價片段；(ii) F(ab′) 2片段，其為包含由鉸鏈區處之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由V H及C H1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之V L及V H結構域組成之Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人，Nature (1989) 341:544-546)，其由V H結構域組成；(vi)經單離CDR，及(vii)單鏈抗體(scFv)，其為包含連接至抗體之V H區之抗體之V L區的多肽。Bird等人，Science (1988) 242:423-426，及Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883)。
於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 11、20、29、39、47、54、62、71、77、84、92、99、107、115、122、130、137、144、151、157及165中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之V H區。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 12、21、30、40、48、55、63、72、78、85、93、100、108、116、123、131、138、145、152、158及166中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之V L區。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 5、15、24、33、43、66、88、103、111、126、134、148及161中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HCDR1胺基酸序列。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 6、51、58、67、89、96、104及155中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HCDR2胺基酸序列。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 7、16、25、35、44、52、59、81、90、97、105、112、119、127、135、141、149及162中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HCDR3胺基酸序列。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 8、17、26、36、45、53、60、76、82、91、98、106、113、120、128、136、142、150、156及163中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之LCDR1胺基酸序列。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 9、18、27、37及300中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之LCDR2胺基酸序列。於一些實施例中，本公開之抗CD28抗體或抗體片段包含與如SEQ ID NO: 10、19、28、38、46、61、70、83、114、121、129、143及164中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之LCDR3胺基酸序列。
於一些實施例中，本公開之抗體包含與如SEQ ID NO: 13、22、31、41、49、56、64、73、79、86、94、101、109、117、124、141、132、139、146、153、159及167中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之重鏈。
於一些實施例中，本公開之抗體包含與如SEQ ID NO: 14、23、32、42、50、57、65、74、80、87、95、102、110、118、125、142、133、140、147、154、160及168中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之輕鏈。 IV. 多特異性抗體
亦提供多特異性抗體，其對應本文所述可活化多特異性抗體或經遮蔽多特異性抗體。本申請案之一個態樣提供可活化之多特異性抗體(包括可活化雙特異性T細胞銜接體(TCE)分子)，其能夠結合至T細胞及靶細胞(諸如腫瘤細胞)二者。由於其中靶脫腫瘤效應，傳統TCE分子與高細胞毒性相關，包括對中樞神經系統(CNS)之毒性及細胞介素風暴。因此，業內需要能結合T細胞及靶細胞(例如具有增強之特異性及降低之副作用之腫瘤細胞)之抗體。
於一些實施例中，多特異性抗體為雙特異性(bsAb)。於一些實施例中，多特異性抗體為三特異性(tsAb)。
於特定實施例中，本公開之雙特異性抗體對T細胞表面CD28具有特異性。於一些實施例中，多特異性抗體為特異性結合TAA及CD28之腫瘤相關抗原(TAA)xCD28雙特異性抗體。於一些實施例中，本公開之抗體為IgG抗體，例如，包含IgG Fc區(例如，人類IgG Fc區)。
於一些實施例中，多特異性抗體結合至T細胞表面之CD28。於一些實施例中，多特異性抗體為特異性結合至TAA及CD28之腫瘤相關抗原(TAA)xCD28雙特異性抗體。於一些實施例中，多特異性抗體不包含任何遮蔽性部分或可裂解部分。於一些實施例中，多特異性抗體為經可裂解部分或可裂解部***解獲得。
於一些實施例中，多特異性抗體結合至T細胞表面之CD3。於一些實施例中，多特異性抗體為特異性結合至TAA及CD3之腫瘤相關抗原(TAA)xCD3雙特異性抗體。於一些實施例中，多特異性抗體以弱親和力特異性結合CD3，例如藉由ELISA檢定測定之EC50至少為10 nM (例如，至少100 nM)，及/或Kd至少為50 nM。於一些實施例中，多特異性抗體不包含任何遮蔽性部分或可裂解部分。於一些實施例中，多特異性抗體為經可裂解部分或可裂解部***解獲得。
於一些實施例中，提供一種多特異性抗體包含：a)第一抗原結合片段，其包含特異性結合靶抗原(例如，腫瘤抗原，如B7-H3、HER2或TROP2)之抗體之VH1及V L1；及b)第二抗原結合片段，其包含特異性結合CD3之抗CD3抗體之VH2及V L2，其中第一及/或第二抗原結合片段融合至第一及/或第二遮蔽性肽(MP1/MP2)。於一些實施例中，提供一種多特異性抗體包含：a)第一抗原結合片段，其包含特異性結合靶抗原(例如，腫瘤抗原，如B7-H3、HER2或TROP2)之抗體之VH1及V L1；及b)第二抗原結合片段，其包含特異性結合CD28之抗CD28抗體之VH2及V L2，其中第一及/或第二抗原結合片段融合至第一及/或第二遮蔽性肽(MP1/MP2)。
於一些實施例中，第一抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。於一些實施例中，第一抗原結合片段為Fab。於一些實施例中，第二抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。於一些實施例中，第二抗原結合片段為scFv，其自N端至C端包含V L2、視情況選用連接子及VH2。於一些實施例中，第一抗原結合片段為Fab及第二抗原結合片段為Fab。於一些實施例中，第一抗原結合片段為Fab及第二抗原結合片段為scFv。
本文所描述之包含經工程改造之C H3結構域二硫鍵及/或鹽橋的抗體可另包含一個或多個杵入臼殘基。「杵入臼」或「KIH」係指此項技術中已知用於製備雙特異性抗體之方法，亦稱為「突起入空腔」法(參見例如美國專利第5,731,168號)。在此方法中，兩個免疫球蛋白多肽(例如重鏈多肽)各包含一介面。一個免疫球蛋白多肽之介面與另一免疫球蛋白多肽上之對應介面相互作用，由此允許兩個免疫球蛋白多肽相締合。此等介面可經工程改造，使得定位於一個免疫球蛋白多肽之介面中的「杵」或「突起」(此等術語在本文中可互換使用)與定位於另一免疫球蛋白多肽之介面中的「臼」或「空腔」(此等術語在本文中可互換使用)對應。在一些實施例中，臼之尺寸與杵相同或類似且適當定位，使得當兩個介面相互作用時，一個介面之杵可安置於另一介面之對應臼中。在不希望受理論約束之情況下，此被認為穩定異多聚體且相較於其他物質(例如均多聚體)有利於形成異多聚體。在一些實施例中，KIH法與本文所描述之經工程改造之二硫鍵及/或鹽橋組合使用，以促進兩種不同免疫球蛋白多肽之異多聚化，從而形成包含對不同抗原表位具有結合特異性之兩個免疫球蛋白多肽的雙特異性抗體。在一些實施例中，本文所描述之可活化多特異性抗體之C H3結構域不包含KIH殘基。
於一些實施例中，提供靶向CD28及腫瘤抗原(例如，B7-H3、HER2、TROP2或PD-L1)之雙特異性抗體，其包含第一多肽、第二多肽及第三多肽，其中： (i)第一多肽包含由下式表示之結構： V H1-C H1-鉸鏈-C H2-第一C H3； (ii)第二多肽包含由下式表示之結構： scFv-鉸鏈-C H2-第二CH3；及 (iii)第三多肽包含由下式表示之結構： V L1-C L； 其中： V L1為第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H1為第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； scFv為單鏈可變片段，包含第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域(V L2)及第二免疫球蛋白重鏈可變結構域(V H2)； C L為免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； C H1為免疫球蛋白重鏈恆定結構域1； C H2為免疫球蛋白重鏈恆定結構域2；及 鉸鏈為連接C H1結構域及C H2結構域之免疫球蛋白鉸鏈區； 其中V L1與VH1相締合以形成特異性結合腫瘤抗原(例如，B7-H3、HER2、TROP2或PD-L1)之第一Fv；及其中scFv特異性結合CD28。於一些實施例中，scFv藉由ELISA測定，以0.1 nM至1000 nM範圍之半最大結合抗體濃度(EC 50)結合CD28 (例如，如實施例3所述)。於一些實施例中，scFv藉由Octet® RED96檢定測定，以低於10 nM (例如，在1 nM至0.1 pM之間)之半最大結合抗體濃度(EC 50)結合CD28 (例如，如實施例3所述)。於特定實施例中，scFv以低於10 nM之解離常數(K d)結合CD28。
於一些實施例中，提供靶向CD28及腫瘤抗原(例如，B7-H3、HER2或TROP2)之雙特異性抗體，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中： (i)第一多肽包含由下式表示之結構： V H1-C H1-鉸鏈-C H2-第一CH3； (ii)第二多肽包含由下式表示之結構： V H2-C H1-鉸鏈-C H2-第二CH3； (iii)第三多肽包含由下式表示之結構： V L1-C L；及 (iv)第四多肽包含由下式表示之結構： V L2-C L； 其中： V L1為第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H1為第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； V L2為第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H2為第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； C L為免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； C H1為免疫球蛋白重鏈恆定結構域1； C H2為免疫球蛋白重鏈恆定結構域2；及 鉸鏈為連接C H1結構域及C H2結構域之免疫球蛋白鉸鏈區； 其中V L1與V H1相締合以形成特異性結合腫瘤抗原(例如，B7-H3、HER2、TROP2或PD-L1)之第一Fv；及其中V L2與V H2相締合以形成特異性結合CD28之第二Fv。於一些實施例中，scFv藉由ELISA檢定測定，以0.1 nM至1000 nM範圍之半最大結合抗體濃度(EC 50)結合CD28 (例如，如實施例3所述)。於一些實施例中，第二Fv藉由Octet® RED96檢定測定，以低於10 nM (例如，在1 nM至0.1 pM之間)之半最大結合抗體濃度(EC 50)結合CD28 (例如，如實施例3所述)。於特定實施例中，第二Fv以低於10 nM之解離常數(K d)結合CD28。
於一些實施例中，提供多特異性抗體，其包含： a)第一抗原結合片段，其包含特異性結合靶抗原(例如，腫瘤抗原，如B7-H3、HER2或TROP2)之抗體之V H1及V L1；及 b)第二抗原結合片段，其包含特異性結合CD28之抗CD28抗體之V H2及V L2，其中第二抗原結合片段融合至第一遮蔽性肽(MP1)。
於一些實施例中，提供多特異性抗體，其包含： a)第一抗原結合片段，其包含特異性結合靶抗原(例如，腫瘤抗原，如B7-H3、HER2或TROP2)之抗體之V H1及V L1，其中第一抗原結合片段融合至第一遮蔽性肽(MP1)；及 b)第二抗原結合片段，其包含特異性結合CD28之抗CD28抗體之V H2及V L2，其中第二抗原結合片段融合至第二遮蔽性肽(MP2)。
於一些實施例中，第一抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。於一些實施例中，第一抗原結合片段為Fab。於一些實施例中，第二抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。於一些實施例中，第二抗原結合片段為scFv，其自N端至C端包含V L2、視情況選用連接子及V H2。
於一些實施例中，提供多特異性抗體，其包含第一多肽、第二多肽及第三多肽，其中： (i)第一多肽包含由下式表示之結構： V H1-C H1-鉸鏈-C H2-第一C H3； (ii)第二多肽包含由下式表示之結構： MP1-V L2-V H2-鉸鏈-C H2-第二C H3；及 (iii)第三多肽包含由下式表示之結構： V L1-C L； 其中： V L1為第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H1為第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； V L2為第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H2為第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； C L為免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； C H1為免疫球蛋白重鏈恆定結構域1； C H2為免疫球蛋白重鏈恆定結構域2； 第一C H3為第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域3； 第二C H3為第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域3； 鉸鏈為連接C H1結構域及C H2結構域之免疫球蛋白鉸鏈區； MP1為第一遮蔽性肽；MP1自N端至C端包含N端單元(NU)、遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)；該遮蔽性肽之LU可不包含裂解位點，或包含至少一個裂解位點。
於一些實施例中，提供多特異性抗體，其包含第一多肽、第二多肽及第三多肽，其中： (i)第一多肽包含由下式表示之結構： V H1-C H1-鉸鏈-C H2-第一C H3； (ii)第二多肽包含由下式表示之結構： MP2-V L2-V H2-鉸鏈-C H2-第二C H3；及 (iii)第三多肽包含由下式表示之結構： MP1-V L1-C L； 其中： V L1為第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H1為第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； V L2為第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； V H2為第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； C L為免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； C H1為免疫球蛋白重鏈恆定結構域1； C H2為免疫球蛋白重鏈恆定結構域2； 第一C H3為第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域3； 第二C H3為第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域3； 鉸鏈為連接C H1結構域及C H2結構域之免疫球蛋白鉸鏈區； MP1為遮蔽性肽；MP1自N端至C端包含N端單元(NU)、遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)；該遮蔽性肽之LU可不包含、包含至少一個或多個裂解位點。 MP2為遮蔽性肽；MP2自N端至C端包含N端單元(NU)、遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)；該遮蔽性肽之LU可不包含裂解位點，或包含至少一個裂解位點。
於一些實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28，及該雙特異性抗體包含包含選自由SEQ ID NOs: 5、15、24、33、43、66、88、103、111、126、134、148及161組成之群之胺基酸序列之HCDR1；包含選自由SEQ ID NOs: 6、51、58、67、89、96、104及155組成之群之胺基酸序列之HCDR2；及包含選自由SEQ ID NOs: 7、16、25、35、44、52、59、81、90、97、105、112、119、127、135、141、149及162之胺基酸序列之HCDR3；以及包含選自由SEQ ID NOs: 8、17、26、36、45、53、60、76、82、91、98、106、113、120、128、136、142、150、156及163組成之群之胺基酸序列之LCDR1；包含選自由SEQ ID NOs: 9、18、27、37及300組成之群之胺基酸序列之LCDR2；及包含選自由SEQ ID NOs: 10、19、28、38、46、61、70、83、114、121、129、143及164組成之群之胺基酸序列之LCDR3。於一些實施方案中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為人類CD28，及其中雙特異性抗體包含包含選自由SEQ ID NOs: 11、20、29、39、47、54、62、71、77、84、92、99、107、115、122、130、137、144、151、157及165組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含選自由SEQ ID NOs: 12、21、30、40、48、55、63、72、78、85、93、100、108、116、123、131、138、145、152、158及166組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為B7H3，其中雙特異性抗體包含CD28結合部分，其包含選自由SEQ ID NOs: 11、12及171組成之群之胺基酸序列，及其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 176中所示之胺基酸序列之重鏈，及含有SEQ ID NO: 175中所示之胺基酸序列之輕鏈。於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為B7H3，其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 171中所示之胺基酸序列之重鏈，含有SEQ ID NO: 176中所示之胺基酸序列之第二重鏈，及含有SEQ ID NO: 175中所示之胺基酸序列之輕鏈。
於一些實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為HER2，其中雙特異性抗體包含CD28結合部分，其包含SEQ ID NO: 172中所示之胺基酸序列，及其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 170中所示之胺基酸序列之重鏈，及含有SEQ ID NO: 169中所示之胺基酸序列之輕鏈。於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為HER2，其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 172中所示之胺基酸序列之重鏈，含有SEQ ID NO: 170中所示之胺基酸序列之第二重鏈，及含有SEQ ID NO: 169中所示之胺基酸序列之輕鏈。
於一些實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為HER2，其中雙特異性抗體包含CD28結合部分，其包含SEQ ID NO: 11、12、171中所示之胺基酸序列，含有SEQ ID NO: 170中所示之胺基酸序列之重鏈，及含有SEQ ID NO: 169中所示之胺基酸序列之輕鏈。於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為HER2，其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 171中所示之胺基酸序列之重鏈，含有SEQ ID NO: 170中所示之胺基酸序列之第二重鏈，及含有SEQ ID NO: 169中所示之胺基酸序列之輕鏈。
於一些實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為人類CD28及第二靶點為TROP2，其中雙特異性抗體包含CD28結合部分，其包含選自由SEQ ID NOs: 13、14及171組成之群之胺基酸序列，及其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 174中所示之胺基酸序列之重鏈，及含有SEQ ID NO: 173中所示之胺基酸序列之輕鏈。於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD28及第二靶點為TROP2，其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 171中所示之胺基酸序列之重鏈，含有SEQ ID NO: 174中所示之胺基酸序列之第二重鏈，及含有SEQ ID NO: 173中所示之胺基酸序列之輕鏈。
於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD3及第二靶點為B7-H3，及其中雙特異性抗體包含含有SEQ ID NO: 177中所示之胺基酸序列之重鏈或SEQ ID NO: 299中所示之scFv融合多肽，含有SEQ ID NO: 176中所示之胺基酸序列之重鏈，及含有SEQ ID NO: 175中所示之胺基酸序列之輕鏈。
於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為CD3及第二靶點為TROP2。
於特定實施例中，雙特異性抗體結合至第一及第二靶點，其中第一靶點為人類CD28，及其中雙特異性抗體包含選自由SEQ ID NOs: 13、22、31、41、49、56、64、73、79、86、94、101、109、117、124、141、132、139、146、153、159及167組成之群之重鏈胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 14、23、32、42、50、57、65、74、80、87、95、102、110、118、125、142、133、140、147、154、160及168組成之群之輕鏈胺基酸序列。 V. 經遮蔽抗體
於一些實施例中，本公開提供經遮蔽抗體，其可為針對特定靶點之經遮蔽單克隆抗體或多特異性(例如，雙特異性)抗體。於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含全長抗體輕鏈，例如，κ或λ輕鏈。此外或者，於一些實施例中，抗體包含全長抗體重鏈。抗體之重鏈可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。於一些實施例中，抗體重鏈為IgG類別，諸如IgG 1、IgG 2、IgG 3或IgG 4子類別。可使用此項技術中已知之方法將抗體重鏈自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。於一些實施例中，經遮蔽抗體係或包含含有Fc區(例如，人類Fc區或其變體)之全長抗體。於一些實施例中，人類Fc區係人類IgG 1Fc區，人類IgG 2Fc區，人類IgG 4Fc區，或前述任一項之變體。於一些實施例中，相對於衍生變體之野生型人類Fc區，Fc區變體包含一個或多個胺基酸取代、***或刪除。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG 1Fc區變體。於一些實施例中，IgG 1Fc變體包含增加Fc變體與FcγRIIb親和力之一個或多個胺基酸取代。於一些實施例中，人類IgG 1Fc區變體包含選自由G236D；L328F；S239D；S267E；G236D及S267E；S239D及S267E；S267E及L328S；以及S267E及L328F組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引(參見，例如Edelman等人，Proc Natl Acad Sci USA （1969) 63: 78-85)。前述取代於Chu等人Mol Immunol. (2008) 45(15):3926-33中描述。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 1Fc區變體包含選自由E233D及P238D；G237D及P238D；H268D及P238D；P271G及P238D；A330R及P238D；E233D，P238D及A330R；E233D，P231G，P238D及A330R；G237D，H268D，P238D及P271G；G237D，P238D，P271G及A330R；E233D，H268D，P238D，P271G及A330R；G237D，H268D，P238D，P271G及A330R；以及E233D，G237D，P238D，H268D，P271G及A330R組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引。前述取代於Mimoto等人Protein Eng Des Sel. (2013) 26(10):589-98中描述。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 1Fc區變體包含S2657A取代(參見Buschor等人Int Arch Allergy Immunol. (2014) 163(3):206-14)，其中胺基酸編號根據EU索引。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 1Fc區變體包含T437R及/或K248E取代(參見Zhang等人MAbs. (2017) 9(7):1129-1142)，其中胺基酸編號根據EU索引。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG 4Fc區變體。於一些實施例中，IgG 4Fc變體包含增加Fc變體與FcγRIIb親和力之一個或多個胺基酸取代。於一些實施例中，人類IgG 4Fc區變體包含選自由G236D；L328F；S239D；S267E；G236D及S267E；S239D及S267E；S267E及L328S；以及S267E及L328F組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 4Fc區變體包含選自由E233D及P238D；G237D及P238D；H268D及P238D；P271G及P238D；A330R及P238D；E233D，P238D及A330R；E233D，P231G，P238D及A330R；G237D，H268D，P238D及P271G；G237D，P238D，P271G及A330R；E233D，H268D，P238D，P271G及A330R；G237D，H268D，P238D，P271G及A330R；以及E233D，G237D，P238D，H268D，P271G及A330R組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 4Fc區變體包含S2657A取代，其中胺基酸編號根據EU索引。此外或者，於一些實施例中，人類IgG 1Fc區變體包含T437R及/或K248E取代，其中胺基酸編號根據EU索引。
於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗體另包含人類IgG 1結構域或其變體含有一個或多個取代突變。於一些實施例中，IgG 1變體包含選自由G236D；L328F；S239D；S267E；G236D及S267E；S239D及S267E；S267E及L328S；以及S267E及L328F；E233D及P238D；G237D及P238D；H268D及P238D；P271G及P238D；A330R及P238D；E233D，P238D及A330R；E233D，P231G，P238D及A330R；G237D，H268D，P238D及P271G；G237D，P238D，P271G及A330R；E233D，H268D，P238D，P271G及A330R；G237D，H268D，P238D，P271G及A330R；以及E233D，G237D，P238D，H268D，P271G及A330R；S2657A；T437R；K248E；以及T437R及K248E組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗體另包含人類IgG 4結構域或其變體含有一個或多個取代突變。於一些實施例中，IgG 4變體包含選自由G236D；L328F；S239D；S267E；G236D及S267E；S239D及S267E；S267E及L328S；以及S267E及L328F；E233D及P238D；G237D及P238D；H268D及P238D；P271G及P238D；A330R及P238D；E233D，P238D及A330R；E233D，P231G，P238D及A330R；G237D，H268D，P238D及P271G；G237D，P238D，P271G及A330R；E233D，H268D，P238D，P271G及A330R；G237D，H268D，P238D，P271G及A330R；以及E233D，G237D，P238D，H268D，P271G及A330R；S2657A；T437R；K248E；以及T437R及K248E組成之群之取代，其中胺基酸編號根據EU索引。
於一些實施例中，術語「經遮蔽抗體」係指抗體片段，例如，經遮蔽抗CD28抗體之經遮蔽抗原結合片段。於一些實施例中，該抗體片段係或包含Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、scFv (參見Bird等人(1988) Science 242:423-426及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)、(scFv) 2、線性抗體、單鏈抗體、微型抗體(minibody)或雙特異抗體(diabody)。
於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體與來自不同物種之CD28交叉反應，從而允許經遮蔽抗CD28抗體用於臨床前及臨床研究。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體活化後(例如，經遮蔽抗體藉由裂解(例如，蛋白酶裂解)活化後)結合至人類CD28、食蟹獼猴CD28、鼠類(小鼠) CD28及/或大鼠CD28中之兩種或更多種。於一些實施例中，經遮蔽抗CD28抗體活化後(例如，經遮蔽抗體藉由裂解(例如，蛋白酶裂解)活化後)結合人類CD28、食蟹獼猴CD28、鼠類(小鼠) CD28及大鼠CD28。
於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體具有背景依賴性(例如，於某些背景下(諸如於蛋白酶濃化腫瘤微環境中)經活化(僅能結合其靶))。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體提供超過更多傳統非遮蔽抗體之提高之安全性(例如，顯示降低之毒性，不誘導許多器官之重量之顯著改變，不改變肝臟組織病理學、血液學及/或血液生物化學等)。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體展示出與傳統非遮蔽抗CD28抗體類似之藥物動力學性質(例如，具有類似之活體內半衰期)。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體相較於更多傳統非遮蔽抗CD28抗體展示改善之藥物動力學性質(例如，具有更長活體內半衰期)。
於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體之抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L)形成結合hCD28之抗原結合域(ABD)。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體之遮蔽性單元(MU)結合至ABD及相較於缺少MU之對應抗CD28抗體結合至hCD28及/或相較於ABD結合至hCD28減少或抑制經遮蔽抗CD28抗體結合至hCD28。
於一些實施例中，在從本文提供之經遮蔽抗體中去除MU之前，遮蔽性單元具有至少約2.0之遮蔽效率(例如，至少約2.0，至少約3.0，至少約4.0，至少約5.0，至少約6.0，至少約7.0，至少約8.0，至少約9.0，至少約10，至少約25，至少約50，至少約75，至少約100，至少約150，至少約200，至少約300，至少約400，至少約500，至少約600，至少約700，至少約800，至少約900，至少約1000，至少約1100，至少約1200，至少約1300，至少約1400，至少約1500等，包括這些值之間之任何範圍)。例如，於一些實施例中，經遮蔽抗CD28抗體之遮蔽效率量測為包含遮蔽性單元(MU)之經遮蔽抗CD28抗體與hCD28結合(例如，在經遮蔽抗體活化前)相對於缺少MU之抗CD28抗體結合hCD28之親和力差異。於另一實例中，遮蔽效率量測為包含MU之經遮蔽抗CD28抗體對hCD28之親和力(例如，在經由裂解(例如，蛋白酶裂解)活化經遮蔽抗體前)相對於未遮蔽抗CD28抗體(例如，經由裂解(例如，蛋白酶裂解)活化經遮蔽抗體後)對hCD28之親和力差異。於一些實施例中，遮蔽效率可以藉由包含MU之經遮蔽抗體(例如，在活化前)之EC 50除以對相同靶點特異性缺少遮蔽性肽或經遮蔽單元之相應抗體之EC 50來量測。於一些實施例中，EC 50藉由ELISA來量測。於一些實施例中，經遮蔽抗體之遮蔽性單元(MU)結合至ABD，及預防經遮蔽多肽結合至其靶點。於特定實施例中，靶點為CD28。於其它實施例中，靶點為CD3、B7-H3、HER2、或TROP2。
於一些實施例中，相較於同一靶標但缺少遮蔽性肽或遮蔽性單元之相應特異性抗體，當遮蔽性單元從抗體中去除時(例如，藉由一種或多種連接單元內裂解之蛋白酶處理活化後)，本揭示案之經遮蔽抗體之親和力增加至少約2倍(例如，至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍、或更多，包括前述值之間之任何範圍)。於一些實施例中，本文所述經遮蔽抗體之EC 50藉由一種或多種連接單元內裂解之蛋白酶處理活化後減少至少約2倍(例如，至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍、或更多，包括前述值之間之任何範圍) (例如，藉由ELISA或FACS檢定量測)。
於一些實施例中，當遮蔽性單元結合至本文所述經遮蔽抗體之ABD時，抗體對其靶之K D約為遮蔽性單元從經遮蔽抗CD28抗體之ABD去除時(例如經連接單元內裂解之蛋白酶處理後)抗體之K D之2倍(例如，約2，約2.5，約3，約3.5，約4，約4.5，約5，約5.5，約6，約6.5，約7，約7.5，約8，約8.5，約9，約9.5，約10，約25，約50，約75，約100，約250，約500，約750，或約1000或更多，包括前述值之間之任何範圍)。於一些實施例中，當遮蔽性單元結合至本文所述經遮蔽抗體之ABD時，抗體對其靶之K D約為對相同靶點特異性缺少遮蔽性肽或遮蔽性單元之相應抗體之K D之2倍(例如，約2，約2.5，約3，約3.5，約4，約4.5，約5，約5.5，約6，約6.5，約7，約7.5，約8，約8.5，約9，約9.5，約10，約25，約50，約75，約100，約250，約500，約750，或約1000或更多，包括前述值之間之任何範圍)。
於一些實施例中，該遮蔽性單元空間阻礙經遮蔽結合多肽結合至其靶及/或變構阻礙經遮蔽結合多肽結合至其靶。
於一些實施例中，遮蔽性單元對本文所述經遮蔽抗體(例如，抗CD28)對ABD之解離常數高於經遮蔽抗體對其靶點之解離常數(例如，hCD28，當經遮蔽抗體處於活化形式，例如經由蛋白酶處理後)。於一些實施例中，遮蔽性單元對本文所述經遮蔽抗體之ABD之解離常數高於經遮蔽抗體(例如，抗CD28)對其靶點之解離常數(例如，hCD28，當經遮蔽抗體處於活化形式，例如經由蛋白酶處理後)約2 (例如，約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750、或約1000或更多，包括前述值之間之任何範圍)倍。於一些實施例中，遮蔽性單元對本文所述經遮蔽抗體(例如，抗CD28)對ABD之解離常數約等於經遮蔽抗體對其靶點之解離常數(例如，hCD28，當經遮蔽抗體處於活化形式，例如經由蛋白酶處理後)。於一些實施例中，當經遮蔽抗體尚未被活化(例如，藉由一種或多種在連接單元內裂解之蛋白酶處理後)時，遮蔽性單元(MU)結合至本文所述經遮蔽抗體(例如，抗CD28)之ABD及預防抗體結合至其靶點(例如，hCD28)。於一些實施例中，活化誘導裂解位點內之多肽之裂解。於一些實施例中，活化誘導多肽之構形變化(例如，遮蔽性單元(MU)之置換)，其導致遮蔽性肽不再防止多肽結合至其靶。 A. 單臂經遮蔽之抗體
於一些實施例中，提供經遮蔽單克隆抗體，其包含遮蔽性肽(MP)及結合CD28之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)，其中MP連接至V L之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)，及連接單元(LU)，其中MP包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列；及其中抗體V H區包含選自由SEQ ID NOs: 5、15、24、33、43、66、88、103、111、126、134、148及161組成之群之HCDR1胺基酸序列；選自由SEQ ID NOs: 6、51、58、67、89、96、104及155組成之群之HCDR2胺基酸序列；及選自由SEQ ID NOs: 7、16、25、35、44、52、59、81、90、97、105、112、119、127、135、141、149及162組成之群之HCDR3胺基酸序列；以及抗體V L區包含選自由SEQ ID NOs: 8、17、26、36、45、53、60、76、82、91、98、106、113、120、128、136、142、150、156及163組成之群之LCDR1胺基酸序列；選自由SEQ ID NOs: 9、18、27、37及300組成之群之LCDR2胺基酸序列；及選自由SEQ ID NOs: 10、19、28、38、46、61、70、83、114、121、129、143及164組成之群之LCDR3胺基酸序列。
於一些實施例中，提供經遮蔽單克隆抗體，其包含遮蔽性肽(MP)及結合CD28之抗體，其中抗體包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)，其中MP連接至V L之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)，及連接單元(LU)，其中MP包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列；及其中抗體重鏈可變區包含選自由SEQ ID NOs: 11、20、29、39、47、54、62、71、77、84、92、99、107、115、122、130、137、144、151、157及165組成之群之胺基酸序列；及輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NOs: 12、21、30、40、48、55、63、72、78、85、93、100、108、116、123、131、138、145、152、158及166組成之群之胺基酸序列。於一些實施例中，提供經遮蔽單克隆抗體，其包含遮蔽性肽(MP)及結合人類CD28之抗體，其中抗體包含重鏈及輕鏈，其中MP連接至LC之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)，及連接單元(LU)，其中MP包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列，其中抗體HC包含選自由SEQ ID NOs: 13、22、31、41、49、56、64、73、79、86、94、101、109、117、124、141、132、139、146、153、159及167組成之群之胺基酸序列，及其中抗體LC包含選自由SEQ ID NOs: 14、23、32、42、50、57、65、74、80、87、95、102、110、118、125、142、133、140、147、154、160及168組成之群之胺基酸序列。 B. 單臂經遮蔽之多特異性抗體
於一些實施例中，亦提供對第一及第二靶點特異性之經遮蔽雙特異性單克隆抗體，其中第一靶點為CD28，其中抗體包含遮蔽性肽(MP)及CD28結合部分，其中抗體包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)，其中MP連接至V L之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)，其中MP包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列，其中CD28結合部分包含V H區，其含有SEQ ID NO: 5之HCDR1、SEQ ID NO: 6之HCDR2及SEQ ID NO: 7之HCDR3，以及V L區，其含有SEQ ID NO: 8之LDR1、SEQ ID NO: 9之LCDR2及SEQ ID NO: 10之LCDR3，及其中第二靶點為B7-H3、HER2或TROP2蛋白。
於一些實施例中，亦提供對第一及第二靶點特異性之經遮蔽雙特異性單克隆抗體，其中第一靶點為CD28，其中抗體包含遮蔽性肽(MP)及CD28結合部分，其中抗體包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)，其中MP連接至V L之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)及連接單元(LU)，其中MP包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列，及其中CD28結合部分包含包含選自由SEQ ID NOs: 11、20、29、39、47、54、62、71、77、84、92、99、107、115、122、130、137、144、151、157及165組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NOs: 12、21、30、40、48、55、63、72、78、85、93、100、108、116、123、131、138、145、152、158及166組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區，及其中第二靶點為B7-H3、HER2或TROP2蛋白。 C. 雙臂經遮蔽之多特異性抗體
於特定實施例中，亦提供對第一及第二靶點特異性之經遮蔽雙特異性單克隆抗體，其中第一靶點為CD28及第二靶點為選自HER2、B7-H3及TROP2之腫瘤相關抗原，其中抗體包含兩個遮蔽性肽(MP)。 VI. 遮蔽性肽
於一些實施例中，MP另包含N端單元。於一些實施例中，N端單元長度在約1至10個胺基酸之間。於一些實施例中，N端單元包含SEQ ID NO: 210。於一些實施例中，LU包含至少一個第一裂解位點(CS 1) (例如第一蛋白酶裂解位點)。於一些實施例中，LU另包含第二裂解位點(CS 2)。於一些實施例中，第一及/或第二裂解位點為蛋白酶裂解位點。於一些實施例中，第一及第二裂解位點相同。於一些實施例中，第一及第二裂解位點不同。可使用藉由此項技術中已知之任何蛋白酶(例如，已知與包含裂解位點之可活化抗體之靶共定位之蛋白酶)識別及/或裂解之任何適宜蛋白酶裂解位點，包含例如，藉由以下識別及/或裂解之蛋白酶裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數(uPA)、基質金屬蛋白酶(例如，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26及/或MMP-27)、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、PSA、PSMA、ADAMS/ADAMTS (例如，ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM 12、ADAM 15、ADAM 17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4及/或ADAMTS5)、卡斯蛋白酶(例如，卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13及/或卡斯蛋白酶-14)、天冬胺酸蛋白酶(例如，RACE及/或腎素(Renin))；天冬胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶D及/或組織蛋白酶E)、半胱胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2及/或組織蛋白酶X/Z/P)、半胱胺酸蛋白酶(例如，Cruzipain、Legumain及/或Otubain-2)、KLK (例如，KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13及/或KLK14)、金屬蛋白酶(例如，Meprin、奈溶酶(Neprilysin)、PSMA及/或BMP-1)、絲胺酸蛋白酶(例如，經活化之蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)及/或凝血因數蛋白酶(諸如FVIIa、FIXa、Fxa、FXIa、FXIIa))、彈性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶(guanidino-benzoatase)、HtrA1、人類嗜中性白血球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白(lactoferrin)、marapsin、NS3/4A、PACE4、tPA、類胰蛋白酶(tryptase)、II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如，DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶(Matriptase)-2、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3及/或TMPRSS4)等。於一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點為選自uPA、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、TEV蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因數X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14及TACE蛋白酶之裂解位點。於一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點選自uPA、MMP-2、MMP-9及/或TEV蛋白酶之裂解位點。
於一些實施例中，LU另包含第一連接子(L 1)。於一些實施例中，第一連接子(L 1)為第一裂解位點(CS 1) (例如，第一蛋白酶裂解位點)之C端。於一些實施例中，LU自N端至C端包含(CS 1)-L1之結構。於一些實施例中，LU另包含第二連接子(L 2)。於一些實施例中，L 2為第二裂解位點之C端。於一些實施例中，LU自N端至C端包含(CS 1)-L 1-(CS 2)-L 2之結構。於一些實施例中，L 1及L 2為此項技術中已知之任何適宜連接子(例如，可撓性連接子)，包括但不限於例如，甘胺酸聚合物(G)n，其中n為至少1 (例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)之整數；甘胺酸-絲胺酸聚合物(GS)n，其中n為至少1 (例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)之整數，諸如SEQ ID NOs: 249-257；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及類似者。連接子序列可為任何長度，諸如約1個胺基酸(例如，甘胺酸或絲胺酸)至約20個胺基酸(例如，20個胺基酸甘胺酸聚合物或甘胺酸-絲胺酸聚合物)、約1個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約12個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸等。於一些實施例中，連接子為長度約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸中之任一者。
於一些實施例中，LU包含選自由SEQ ID NOs: 213及214組成之群之胺基酸序列。於一些實施例中，遮蔽性肽(MP)自N端至C端包含(MU)-(LU)之結構，其中LU包含(CS 1)-L 1或(CS 1)-L 1-(CS 2)-L 2之結構。於一些實施例中，本揭示案之遮蔽性肽包含選自由SEQ ID NOs: 215-248組成之群之胺基酸序列。
於一些實施例中，遮蔽性肽(MP)包含SEQ ID NOs: 178-211中任一者所示之MU及SEQ ID NO: 213或214中所示之LU。於一些實施例中，MP包含SEQ ID NOs: 215-248中任一者所示之序列。 VII. 抗體產生
本發明之另一態樣提供一種或多種經單離核酸分子，其包含編碼本文中所描述之經遮蔽抗CD28抗體之胺基酸序列之核苷酸序列，包括經遮蔽抗CD28抗體。於一些實施例中，提供一種或多種經單離核酸分子，其包含編碼本文中所描述之多特異性抗體之胺基酸序列之核苷酸序列，包括經遮蔽多特異性抗體。藉由核苷酸序列編碼之胺基酸序列可為抗體之任何部分(諸如CDR、包含1、2或3個CDR之序列、重鏈可變區、輕鏈可變區)，或可為全長重鏈或全長輕鏈。本發明之核酸可為例如DNA或RNA，且可含或可不含內含子序列。通常，核酸為cDNA分子。
於一些實施例中，本發明提供經單離核酸分子，其包含編碼胺基酸序列之核苷酸序列或由該核苷酸序列組成，例如，本文中所述抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，或例如，本文中所述抗體之全長重鏈或全長輕鏈。
可使用任何適宜分子生物技術(例如，PCR擴增或cDNA選殖技術)獲得本發明之核酸。針對獲自文庫篩選之本文所述抗體，編碼該抗體之核酸可自該庫恢復。
編碼V H區之經單離DNA可藉由將編碼V H之DNA可操作連接至編碼重鏈恆定區(C H1、C H2及C H3)之另一DNA分子轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部，NIH出版物第91-3242號)，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳地為不具ADCC效應之IgG 4或IgG 2恆定區。IgG 4恆定區序列可為已知出現在不同個體中之多種對偶基因或異型中之任一者。該等異型代表IgG 4恆定區中之天然胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因，編碼V H之DNA可操作連接至僅編碼重鏈C H1恆定區之另一DNA分子。
編碼V L區之經單離DNA可藉由將編碼V L之DNA可操作連接至編碼輕鏈恆定區C L之另一DNA分子轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部，NIH出版物第91-3242號)，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，將編碼V H及V L之DNA片段可操作連接至編碼撓性連接體(例如編碼胺基酸序列(Gly 4-Ser) 3)之另一片段，使得V H及V L序列可表現為連續單鏈蛋白，且V L區及V H區藉由撓性連接體連結(參見例如Bird等人，Science (1988) 242:423-426；Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883；及McCafferty等人，Nature (1990) 348:552-554)。
本揭示案另提供包含本文中所述之一種或多種核酸分子之載體。於一些實施例中，載體係可用於表現本文所述抗體或此種抗體之抗原結合片段之表現載體。於一些實施例中，本文提供載體，其中第一載體包含編碼如本文所述重鏈可變區之多核苷酸序列，且第二載體包含編碼如本文所述輕鏈可變區之多核苷酸序列。於一些實施例中，單一載體包含編碼如本文所述重鏈可變區及如本文所述輕鏈可變區之多核苷酸。
為表現本揭示案之結合分子，將編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA***表現載體中，使得DNA分子可操作連接至轉錄及轉譯控制序列。在此上下文中，術語「可操作連接」意指抗體基因聯結至載體中，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控DNA分子之轉錄及轉譯之預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可***單獨載體中，或更通常，將兩種基因***同一表現載體中。抗體基因係藉由任何適宜方法(例如聯結抗體基因片段及載體上之互補限制位點或基於同源重組之DNA聯結)***表現載體中。本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區可藉由將其***已編碼期望同型及子類之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，使得V H區段可操作連接至載體內之C H區段且V L區段可操作連接至載體內之C L區段，用於產生任一抗體同型及子類之全長抗體基因。另外或替代地，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，使得信號肽框內連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白之信號肽)。
除抗體鏈基因外，本揭示案之表現載體通常攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現之調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、增強子及控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如多腺苷酸化信號)。此等調控序列闡述於例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可端視諸如欲轉型宿主細胞之選擇、期望蛋白質之表現水準等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列之實例包括引導哺乳動物細胞中之高蛋白質表現水準之病毒元件，例如衍生自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或增強子。替代地，可使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。另外，調控元件由不同來源之序列構成，例如SR啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複之序列(Takebe, Y.等人Mol. Cell. Biol. (1988) 8:466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列外，表現載體可攜帶其他序列，例如增強子元件，轉錄終止序列，調控載體在宿主細胞中之複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、美國專利第4,634,665號及美國專利第5,179,017號，其皆來自Axel等人)。舉例而言，可選擇標記基因通常賦予其中已引入載體之宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤(methotrexate))之抗性。可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於利用胺甲喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，藉由任何適宜技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之眾多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及諸如此類。儘管可在原核或真核宿主細胞中表現本文所述抗體，但在真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞中表現抗體係最典型。
本揭示案進一步提供含有本揭示案所提供之核酸分子或載體之宿主細胞。宿主細胞實質上可為表現載體可用之任何細胞。其可為例如較高等真核宿主細胞(例如哺乳動物細胞)、較低等真核宿主細胞(例如酵母菌細胞)，且可為原核細胞(例如細菌細胞)。將重組核酸構築物引入宿主細胞中可藉由磷酸鈣轉染、DEAE、葡聚糖介導之轉染、電穿孔或噬菌體感染來實現。
適用於轉型之原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌( Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬( Pseudomonas)、鏈黴菌屬( Streptomyces)及葡萄球菌屬( Staphylococcus)內之各個物種。
用於表現本揭示案之結合分子之哺乳動物宿主細胞包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，闡述於Urlaub及Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:4216-4220中，與DHFR可選擇標記物一起使用，例如如Kaufman及Sharp, J. Mol. Biol. (1982) 159:601-621中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及Sp2細胞。具體而言，為與NS0骨髓瘤或CHO細胞一起使用，另一表現系統係WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所揭示之GS (麩醯胺酸合成酶)基因表現系統。
本揭示案之抗體(或其抗原結合片段)可藉由此項技術中任何已知方法來產生。抗體產生之例示性技術見美國專利第4,816,567號；然而僅出於說明目的提供此例示性技術，且不旨在限制。當將編碼本文所述抗體之核酸或表現載體引入到宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養一段足以允許抗體在宿主細胞中表現或使抗體分泌到宿主細胞所生長的培養基中的時間來產生抗體。因此，於一些實施例中，提供一種產生本文所述抗體之方法，此方法包括在適宜抗體表現之條件下培養包含一種或多種編碼抗體(例如，上文中提供)之核酸或載體之宿主細胞。於一些實施例中，該方法另包含從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。可使用任何適宜蛋白質純化之方法自培養基中回收抗體。 VIII. 藥物組合物
於一些實施例中，本發明提供含有本文所述一種或多種抗體之組合物。於一些實施例中，該組合物為包含本文所述抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。該等組合物可藉由此項技術中已知之習知方法製備。
術語「醫藥學上可接受之載劑」係指適用於調配物中以遞送多肽(例如本文所述抗體)之任何無活性物質。載劑可為抗黏劑、黏合劑、包衣、崩解劑、填充劑或稀釋劑、防腐劑(例如抗氧化劑、抗細菌劑或抗真菌劑)、甜味劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑及諸如此類。適宜醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)、右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝劑、緩衝鹽水及等滲劑(例如糖、多元醇、山梨醇及氯化鈉)。
組合物可呈任何適宜形式，例如液體、半固體及固體劑量形式。液體劑量形式之實例包括溶液(例如可注射及可輸注溶液)、微乳液、脂質體、分散液或懸浮液。固體劑量形式之實例包括錠劑、丸劑、膠囊、微膠囊及粉末。適用於遞送本文所述抗體之組合物之特定形式係注射或輸注用無菌液體，例如溶液、懸浮液或分散液。無菌溶液可藉由將所需量之抗體納入適當載劑中、然後無菌微過濾來製備。分散液可藉由將抗體納入含有鹼性分散介質及其他載劑之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌液體之無菌粉末之情形下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，以產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何其他期望成分的粉末。組合物之各種劑量形式可藉由此項技術中已知之習用技術來製備。
組合物中所包括之抗體之相對量將端視多種因素而變化，例如所用之具體多肽及載劑、劑量形式及期望釋放及藥效學特徵。單一劑量形式中抗體之量通常為產生治療效應之量，但亦可為更小量。通常，相對於劑量形式之總重量，此量將介於約0.01%至約99%、約0.1%至約70%、或約1%至約30%範圍內。
除了本文所述抗體外，一種或多種另外治療劑可包含於組合物中。於一些實施例中，該至少一種另外治療劑係選自由病毒基因療法、免疫檢查點抑制劑、靶療法、放射療法及化療組成之群。於一些實施例中，該至少一種另外治療劑係選自由以下組成之群：鉑美特(pomalyst)、瑞復美(revlimid)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、DNA烷基化含鉑衍生物、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗DR5抗體、抗CD1d抗體、抗TIM3抗體、抗SLAMF7抗體、抗KIR受體抗體、抗OX40抗體、抗HER2抗體、抗ErbB-2抗體、抗EGFR抗體、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、放射療法、單劑量輻射、分次輻射、焦點輻射、全器官輻射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受體、授受性轉移之T細胞、抗癌疫苗及溶瘤病毒。待包含於組合物中之另外治療劑之適宜量可由熟習此項技術者容易選擇，且將取決於許多因素(諸如使用之特定劑及載劑、劑型及所需釋放及藥效動力學特性)變化。包含於單一劑型中之另外治療劑之量一般將為產生治療效應之劑之量，但是亦可為更少量。
本文中所述之抗體可經進一步修飾。於一些實施例中，該等抗體連接至另外分子實體。另外分子實體之實例包括醫藥劑、肽或蛋白質、檢測劑或標籤及抗體。
於一些實施例中，本文所述抗體連接至醫藥劑。醫藥劑之實例包括細胞毒性劑或其他癌症治療劑及放射性同位素。細胞毒性劑之特定實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾及嘌呤黴素及其類似物或同系物。治療劑亦包括例如抗代謝劑(例如，胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷基化劑(例如，二氯甲基二乙胺、噻替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環黴素(例如，柔紅黴素(先前稱作道諾黴素)及多柔比星)、抗生素(例如，更生黴素(先前稱作放線菌素)、博來黴素、光神黴素及安麯黴素(AMC))及抗有絲***劑(例如，長春新鹼及長春鹼)。可與抗體共軛用於診斷或治療使用之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘 131、銦 111、釔 90及鑥 177。用於將多肽連接至醫藥劑之方法係此項技術中已知，諸如使用各種連接子技術。連接子類型之實例包括腙、硫醚、酯、二硫醚及含肽連接子。將治療劑連接至抗體之連接子及方法之進一步討論參見例如，Saito等人，Adv. Drug Deliv. Rev. (2003) 55:199-15；Trail等人，Cancer Immunol. Immunother. (2003) 52:328-37；Payne, Cancer Cell (2003) 3:207-12；Allen, Nat. Rev. Cancer (2002) 2:750-63；Pastan及Kreitman, Curr. Opin. Investig. Drugs (2002) 3:1089-91；Senter及Springer Adv. Drug Deliv. Rev. (2001) 53:247-64。
本文中所述之抗體及/或組合物(例如，醫藥組合物)中之任一者可用於製備藥劑(例如，用於治療有需要受試者之癌症或延遲該癌症進展之藥劑)。 IX. 治療方法
本文所述抗體及醫藥組合物可用於治療目的，諸如治療癌症或增強其他癌症療法之功效。因此，於一些實施例中，本發明提供使用本文所述抗體或醫藥組合物之方法。於一些實施例中，本發明提供一種治療受試者(例如，人類受試者)癌症之方法，包括對受試者投與有效量之本文所述抗體。於一些實施例中，該癌症為乳癌、肝癌、或結腸直腸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、或腎癌。
於實踐治療方法中，本文所述經遮蔽抗CD28抗體可單獨投與，例如，作為單藥療法或與一種或多種另外治療劑或療法組合投與。因此，於另一態樣中，本發明提供一種組合療法，其包含結合分子與一種或多種另外療法或治療劑組合用於分開、依序或同時投與。於一些實施例中，術語「附加療法」是指不採用本文所述抗體作為治療劑之療法。於一些實施例中，術語「另外的治療劑」係指除了本文所述抗體外之任何治療劑。於一些實施例中，本發明提供一種治療受試者(例如，人類受試者)癌症之方法，其包含對該受試者投與有效量之本文中所述之抗體(例如，抗CD28抗體或靶向CD28及一個或多個其它靶點之多特異性抗體)及有效量之抗PD-1抗體。於一些實施例中，本發明提供一種治療受試者(例如，人類受試者)癌症之方法，其包含對該受試者投與有效量之本文中所述之抗體(例如，抗CD28抗體或靶向CD28及一個或多個其它靶點之多特異性抗體)及有效量之抗CTLA4抗體。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體為經遮蔽抗CTLA4抗體。 X. 套組及製品
於一些實施例中，提供一種套組，其包含一個或多個本文所述抗體(例如，抗CD28抗體或靶向CD28及一個或多個其它靶點之多特異性抗體)。於一些實施例中，該套組另包含一種包裝***物，其包含本文所述抗體之使用說明。於一些實施例中，製品或套組包含一種容器，其包含一個或多個本文所述經遮蔽抗體或組合物。於某些實施例中，製品或套組包含一種容器，其包含編碼一個(或多個)本文所述經遮蔽抗體之核酸。於一些實施例中，套組包括生產本文所述抗體之細胞株之細胞。於一些實施例中，套組包括一個或多個CD28 (例如人類CD28、食蟹獼猴CD28、小鼠CD28、大鼠CD28或前述任一片段)或CD28+細胞之陽性對照。於一些實施例中，套組包括陰性對照，例如幾乎不含CD28之表面或溶液，或不表現CD28之細胞。
於某些實施例中，製品或套組包含容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。適宜容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋、試管等。容器可由多種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器容納本文所用之抗體(或包含此抗體之組合物)，該抗體本身或與另一組合物組合投與，可有效治療，延緩進程，及/或預防受試者(例如，人類受試者)癌症。容器可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。於一些實施例中，所述標籤或包裝插頁指示所述組合物用於治療受試者(例如，人類受試者)乳癌、肝癌、或結腸直腸癌。
另外，製品或套組可包含(a)含有組合物在內之第一容器，其中組合物包含本文所述抗體(或其免疫活性片段)；及(b)含有組合物在內之第二容器，其中組合物包含另外之細胞毒性劑或其他治療劑。於一些實施例中，第二容器含有包含抗PD-1抗體之組合物，及包含指示抗體及抗PD-L1用於治療有需要之受試者(例如，人類受試者)結腸癌之標籤或包裝插頁之製品，例如，根據本文提供之方法。於一些實施例中，第二容器含有包含抗CTLA4抗體(例如，經遮蔽抗CTLA4抗體)之組合物，及包含指示本文所述抗體及抗CTLA4抗體(例如，經遮蔽抗CTLA-4抗體)用於治療有需要之受試者(例如，人類受試者)結腸癌之標籤或包裝插頁之製品，例如，根據本文提供之方法。
另外，製品可另包含其他容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
認為上述書面描述足以使熟習此項技術者能實踐本發明。僅出於說明目的提供下列實例，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。的確，除了本文中所示及所述之彼等外之本發明之各種修改將自上述描述對熟習此項技術者變得顯而易見且落於隨附申請專利範圍之範圍內。
除非本文另外定義，否則與本揭示案結合使用之科學及技術術語應具有普通熟習此項技術者通常理解之含義。例示性方法及材料描述如下，儘管與本文所述方法及材料相似或等效之方法及材料亦可用於本公開之實踐或測試。如有衝突，以本說明書(包括定義)為准。此外，除非上下文另外要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。於本說明書及實施例中，字語「具有(have)」及「包含(comprise)」，或變體諸如「具有(has)」、「具有(having)」、「包含(comprises)」或「包含(comprising)」應被理解為包含所述整數或整數組，但不包含任何其它整數或整數組。本文中所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利及非專利公開案及UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號)之全文以引用的方式併入本文中，如同各個別參考文獻明確且個別地指示為以整體引用的方式併入般。僅管本文引用了許多文獻，但該引用並不構成承認此等文獻中之任何一個構成本領域公知常識的一部分。如本文中所用，術語「近似」或「大約」被應用於一個或多個感興趣之值是指類似於所述參考值的值。於某些實施例中，除非另有說明或從上下文中看出，術語係指在所述參考值任一方向(大於或小於)，落在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小範圍內之值。
根據本公開，從屬權利要求中之反向引用係指對反向引用所指示之每一項權利要求組合進行直接及明確披露之速記。本文公開之任何化合物皆可用於此處之任何治療方法，其中待治療個體如本文任何地方所定義。此外，本文標題為便於組織而創建，並不旨在以任何方式限制要求保護之發明之範圍。
為更好地理解本發明，列舉下述實施例。僅出於說明目的提供此等實例，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。 實例 實例1：特異性結合至人類CD28之初級Fab之產生
採用專有噬菌粒庫篩選人類CD28抗原。進行總共3或4輪篩選。於最後一輪篩選後，進行個別純系培養上清液ELISA以識別特異性識別人類CD28 (例如，主要命中)。當ELISA信號為背景至少兩倍時，純系被定義為陽性。陽性純系被挑選定序，及將獨特命中相應之Fab於大腸桿菌中表現及親和純化。其對人類CD28之親和力藉由Octet® RED96系統(ForteBio)量測。簡言之，使用浸及讀取抗人類IgG Fc捕獲(AHC)生物感測器(ForteBio)捕獲人類或小鼠CD28-Fc融合蛋白，及浸入含有經純化Fab之孔中，該等Fab於ForteBio動態緩衝液(10 mM HEPES，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.005% v/v Surfactant P20，pH 7.4)中稀釋5至10倍。將獲取之資料用Octet資料分析軟體7.1 (ForteBio)處理，及將動力學資料擬合至1:1朗繆爾(Langmuir)結合模型。
藉由ELISA進一步表徵人類及小鼠CD28物種交叉反應之主要Fab命中，且自該等主要命中，將一組46個獨特序列Fab轉化成具有核心鉸鏈突變S241P (Kabat編號方案)之IgG4同型mAb，以進行詳細之生物物理及功能表徵(表5)。 實例2：IgG 4轉變及表現
將表5所列經工程改造之人類抗CD28 IgG 4同型mAb之重鏈及輕鏈選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.3 (ThermoFisher Scientific)中。根據製造商之方案，將攜帶一條重鏈及一條輕鏈之質粒對短暫轉染至HEK293細胞。孵育後，收集上清液，離心及過濾澄清，及將IgG 4同型mAb藉由MabSelect TMSuRe TM蛋白A親和層析法(GE Healthcare)捕獲。
將mAb溶離及中和，及洗脫緩衝液交換至恢復緩衝液(20 mM組胺酸，pH 5.5)中。藉由UV-分光光度法測定蛋白質濃度，及在變性、還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE或SEC-HPLC分析IgG純度。 表5. 人類抗CD28 IgG 4單克隆抗體列表
序號 IgG ID 同型/突變
1 TY24853 hIgG 4/ S241P
2 TY24854 hIgG 4/ S241P
3 TY24855 hIgG 4/ S241P
4 TY24856 hIgG 4/ S241P
5 TY24857 hIgG 4/ S241P
6 TY24858 hIgG 4/ S241P
7 TY24859 hIgG 4/ S241P
8 TY24860 hIgG 4/ S241P
9 TY24861 hIgG 4/ S241P
10 TY24862 hIgG 4/ S241P
11 TY24863 hIgG 4/ S241P
12 TY24864 hIgG 4/ S241P
13 TY24865 hIgG 4/ S241P
14 TY24866 hIgG 4/ S241P
15 TY24867 hIgG 4/ S241P
16 TY24868 hIgG 4/ S241P
17 TY24869 hIgG 4/ S241P
18 TY24870 hIgG 4/ S241P
19 TY24871 hIgG 4/ S241P
20 TY24872 hIgG 4/ S241P
21 TY24873 hIgG 4/ S241P
22 TY24874 hIgG 4/ S241P
23 TY24875 hIgG 4/ S241P
24 TY24876 hIgG 4/ S241P
25 TY24877 hIgG 4/ S241P
26 TY24878 hIgG 4/ S241P
27 TY24879 hIgG 4/ S241P
28 TY24880 hIgG 4/ S241P
29 TY24881 hIgG 4/ S241P
30 TY24882 hIgG 4/ S241P
31 TY24883 hIgG 4/ S241P
32 TY24884 hIgG 4/ S241P
33 TY24885 hIgG 4/ S241P
34 TY24886 hIgG 4/ S241P
35 TY24887 hIgG 4/ S241P
36 TY24888 hIgG 4/ S241P
37 TY24889 hIgG 4/ S241P
38 TY24890 hIgG 4/ S241P
39 TY24891 hIgG 4/ S241P
40 TY24892 hIgG 4/ S241P
41 TY24772 hIgG 4/ S241P
42 TY24773 hIgG 4/ S241P
43 TY24774 hIgG 4/ S241P
44 TY24775 hIgG 4/ S241P
45 TY24776 hIgG 4/ S241P
46 TY24777 hIgG 4/ S241P
實例3：抗CD28抗體之結合特性
藉由Octet® RED96系統(ForteBio)、ELISA及CytoFlex流式細胞儀(Beckman)量測抗CD28 mAb組與人類、食蟹獼猴及小鼠CD28以及人類CTLA4之結合親和力。抗CD28抗體TAC2386 (亦稱為TGN1412，如WO2006/050949A2專利所述)及TAC2387 (如WO2019/246514A2專利所述)被用作基準對照。 藉由Octet RED96系統與人類CD28及CTLA4之結合親和力
使用Octet® RED96系統(ForteBio)評估抗CD28 mAb組與人類CD28及CTLA4之結合動力學。簡而言之，將mAb在動力學緩衝液(補充有0.02% Tween 20及0.1% BSA之PBS)中稀釋至15 μg/mL，及藉由浸及讀取AHC生物感測器(ForteBio)平行捕獲。然後允許將感測器與His標記之人類CD28及CTLA4蛋白質(100 nM)締合300秒，及於動力學緩衝液中再締合300秒。使用Octet®資料分析軟體7.1 (ForteBio)將締合及解離曲線擬合至1:1朗繆爾結合模型。
如表6所示，藉由Octet® RED96系統量測，抗CD28測試組及基準mAb對人類CD28展示出高結合親和力(＜10 nM)。此外，測試mAb TY24773、TY24853、TY24854、TY24860、TY24865及TY24871以及基準對照mAb未對人類CTLA4展示出可偵測之親和力。 表6. 與人類CD28及CTLA4之結合親和力
mAb ID 人類CD28 人類CTLA4
KD (nM) Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (nM) Kon (1/Ms) Koff (1/s)
TAC2386 ＜0.001 9.625E+04 ＜1.0E-07 ND
TAC2387 4.873 7.071E+04 3.446E-04
TY24773 8.285 3.848E+04 3.188E-04
TY24853 3.955 4.159E+04 1.645E-04
TY24854 5.434 6.488E+04 3.526E-04
TY24855 7.927 7.918E+04 6.277E-04 4.022 7.596E+05 3.055E-03
TY24856 7.805 6.887E+04 5.376E-04 5.127 3.036E+05 1.557E-03
TY24857 8.639 7.294E+04 6.301E-04 5.442 6.515E+05 3.546E-03
TY24858 9.882 7.101E+04 7.017E-04 7.904 3.055E+05 2.415E-03
TY24859 2.684 7.081E+04 1.900E-04 6.631 4.687E+05 3.108E-03
TY24860 6.664 6.323E+04 4.213E-04 ND
TY24864 4.413 9.418E+04 4.157E-04 5.501 5.168E+05 2.843E-03
TY24865 ＜0.001 5.958E+04 ＜1.0E-07 ND
TY24866 ＜0.001 5.804E+04 ＜1.0E-07 7.645 5.238E+05 4.004E-03
TY24869 2.733 4.676E+04 1.278E-04 1.198 3.793E+05 4.544E-04
TY24871 4.993 7.011E+04 3.501E-04 ND
TY24876 ＜0.001 3.251E+04 ＜1.0E-07 4.280 1.366E+05 5.848E-04
TY24877 7.191 2.686E+04 1.931E-04 13.20 2.353E+05 3.105E-03
TY24878 4.214 9.747E+04 4.108E-04 0.9686 4.233E+05 4.100E-04
TY24879 ＜0.001 5.939E+04 ＜1.0E-07 7.165 4.369E+05 3.130E-03
TY24881 5.246 1.262E+05 6.618E-04 2.353 1.114E+06 2.622E-03
TY24884 2.420 6.836E+04 1.655E-04 6.359 6.409E+05 4.076E-03
TY24890 4.440 9.846E+04 4.371E-04 3.133 1.099E+06 3.444E-03
ND: 未偵測到 使用ELISA量測與人類及小鼠CD28之親和力
將重組人類及小鼠CD28-Fc於PBS中稀釋至2 μg/mL及在4°C下塗覆在Nunc MaxiSorp TM高蛋白結合能力96孔ELISA板(ThermoFisher Scientific)上過夜。在37°C下將板用補充有3%脫脂乳之PBS阻斷1小時。於洗滌後，將50 μL抗CD28測試mAb組之3倍連續稀釋添加至各孔。於37°C下培育1小時後，將板洗滌4次，及將100 μL辣根過氧化物酶(HRP)-結合之抗人類IgG (Fab特異性) (1：6000稀釋)二抗添加至各孔。將板在37℃下培育1小時，洗滌四次，及然後將50 μL TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液添加至各孔，及將板在室溫下培育。向每孔中加入50 μL硫酸終止液停止反應後，量測450 nm處之吸亮度。藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com)之非對稱S形(四參數邏輯方程)模型擬合ELISA資料評價EC 50。
如表7及圖1所示，抗CD28測試mAb組與兩個基準對照對人類CD28展示出相似之親和力。此外，測試mAb (除TY24890外)與小鼠CD28結合，而兩個基準對照不與小鼠CD28結合。 表7. 藉由ELISA量測與重組CD28之結合親和力
mAb ID EC 50(nM)
人類CD28 小鼠CD28
TAC2386 0.78 ND
TAC2387 ＞1.65 ND
TY24859 1.34 ＞44.44
TY24865 0.58 ＞4.94
TY24866 0.57 ＞1.65
TY24869 0.87 ＞14.81
TY24876 1.02 3.93
TY24878 1.06 ＞14.81
TY24879 0.9 ＞1.65
TY24884 1.02 ＞44.44
TY24890 1.55 ND
ND: 未偵測到 抗CD28抗體於Jurkat細胞之結合活性
將Jurkat (克隆E6-1)細胞以1.0×10 5(50 μL/孔)接種於96孔板中，與連續稀釋之基準陽性對照、同型陰性對照抗體及一組抗CD28測試mAb (100、20、4、0.8、0.16及0.032 nM)於2%胎牛血清/Dulbecco之PBS (FBS/DPBS)中在4°C下培育30分鐘。接下來，將細胞用DPBS洗滌兩次並在4°C下與APC-抗人類IgG Fc二抗(1 μg/mL，100 μL/孔，Biolegend)進一步培育30分鐘。最後，將細胞用DPBS洗滌兩次並懸浮於FACS緩衝液中用於流式細胞術分析。為進行分析，使用FlowJo 10軟體(FlowJo LLC)繪製平均螢光強度(MFI)值與濃度圖，並藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com）之四參數非線性回歸進一步擬合資料以獲取EC 50值。
如表8所示，除TY24775及TY24867外，於Jurkat細胞上，其他所有抗CD28測試mAb均與CD28分子展示出高結合活性(EC 50值範圍為0.38至10.42 nM)。此外，量測之結合活性與兩個基準對照相當。 表8. 藉由流式細胞術量測與表現於Jurkat細胞之CD28之結合親和力
Ab ID EC 50(nM) Ab ID EC 50(nM) Ab ID EC 50(nM)
TAC2386 1.10 TY24863 2.60 TY24881 0.38
TAC2387 0.81 TY24864 0.54 TY24882 2.24
TY24772 0.74 TY24865 0.46 TY24883 5.92
TY24773 0.71 TY24866 0.70 TY24884 1.09
TY24774 3.35 TY24867 ND TY24885 5.77
TY24775 ND TY24868 2.08 TY24886 10.42
TY24776 1.83 TY24869 1.07 TY24887 3.17
TY24777 1.50 TY24870 3.95 TY24888 0.58
TY24853 0.43 TY24871 0.89 TY24889 2.32
TY24854 0.60 TY24872 1.07 TY24890 0.59
TY24855 0.61 TY24873 2.08 TY24891 0.62
TY24856 0.76 TY24874 1.65 TY24892 1.30
TY24857 0.75 TY24875 1.72 同型對照 ND
TY24858 0.70 TY24876 0.38      
TY24859 0.97 TY24877 0.79      
TY24860 0.78 TY24878 0.39      
TY24861 2.25 TY24879 1.17      
TY24862 2.82 TY24880 1.62      
ND：未偵測到 藉由流式細胞術量測抗CD28抗體與人類T細胞之體外結合
使用EasySep™人類初始總T細胞單離套組(STEMCELL Technologies)將人類CD3 +T細胞自冷凍保存之外周血單核細胞(PBMC)中單離。將經單離人類T細胞以1.0×10 5個細胞/孔添加至96孔板，並在冰上將100 nM基準對照、同型陰性對照抗體及一組抗CD28測試mAb於FACS緩衝液中培育30分鐘。接下來，將細胞用PBS洗滌三次並在冰上與PE標記之二抗進一步培育30分鐘。最後，將細胞用PBS洗滌三次並重懸浮於FACS緩衝液中用於流式細胞術分析。為進行分析，使用FlowJo 10軟體(FlowJo LLC)計算MFI值，並藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com)繪製幾何平均MFI值與mAb圖。
如圖2所示，相較於基準對照TAC2386及TAC2387，除TY24772外，所有測試mAb均展示相當之MFI值。TY24772結合約為基準對照之兩倍。 實例4： 使用Elisa之配體競爭
藉由ELISA測試抗體阻斷CD28或CTLA4結合至其天然配體CD80之能力。
如圖3及表9所示，相較於對照抗CTLA4抗體TY21580，基準對照TAC2386及TAC2387以及所有經測試抗CD28測試mAb均阻斷CD28與CD80之結合，而不阻斷CTLA4與CD80之結合。 表9. 抗CD28或抗CTLA4抗體對人類CD28-CD80及CTLA4-CD80對之IC 50
樣品ID IC 50(nM)
CD28/CD80 CTLA4/CD80
TAC2386 0.48 -
TAC2387 0.12 -
TY24859 0.42 -
TY24865 0.68 -
TY24866 0.27 -
TY24890 0.21 -
TY24869 0.55 ND
TY24876 0.54 ND
TY24878 0.35 ND
TY24879 0.42 ND
TY24884 0.28 ND
TY21580 ND 37.24
實例5：幹式塗覆人類T細胞增殖檢定中超促效劑之評估
藉由CellTiter-Glo ®螢光細胞活力檢定(Promega)量測基準對照TAC2386及TAC2387、同型陰性對照抗體、以及一組抗CD28測試mAb誘導淋巴細胞增殖之水準。於此測定中，將100 nM測試mAb以50 μL/孔一式三份添加至96孔微孔板，並直接風乾到孔壁上。接下來，將微孔板用PBS洗滌兩次。將極冷保藏之PBMC恢復，並用10% FBS/RPMI1640將細胞密度調節至5.0×10 5個細胞/mL，並將1.0×10 5PBMC (200 μL/孔)添加至預包被微孔板。將細胞於37°C、5% CO 2中培育72小時，及然後使用CellTiter-Glo ®檢定評估淋巴細胞增殖。
如圖4A所示，固定之基準對照TAC2386 (一種已知的CD28超促效劑)誘導淋巴細胞增殖之水準明顯高於所有測試mAb。相較於TAC2386，基準對照TAC2387及抗CD28測試mAb (包括TAC2387、TY24865、TY24866、TY24876、TY24878、TY24879及TY24884)於體外展示出較弱之超促效活性。 實例6：抗CD28抗體對體外人類T細胞活化之影響 T細胞活化共刺激檢定：IFN-Γ釋放
藉由ELISA檢測IFN-γ細胞介素分泌量測抗CD28 mAb作為促效型T細胞共刺激劑在體外活化人類T細胞之生物活性。Ultra-LEAF TM純化抗人類CD28抗體(Biolegend)用作陽性對照。
使用EasySep™人類初始總T細胞單離套組(STEMCELL Technologies)將人類CD3 +T細胞自冷凍保存之PBMC中單離。將經單離細胞在連續稀釋之基準對照、同型陰性對照抗體、商業化抗人類CD28陽性對照抗體及一組抗CD28測試mAb (0.1、1、10及100 nM)之存在下於預包被次優濃度(10 nM，50 μL/孔)抗人類CD3抗體(OKT3)之96孔組織培養板(1.0×10 5/孔)中培養。將細胞於37°C、5% CO 2中培育120小時，及然後收集細胞上清液藉由ELISA進行IFN-γ細胞介素分析，藉由CellTiter-Glo ®量測T細胞增殖。
如圖4B及4C所示，相較於同型對照抗體，抗CD28 mAb顯示出濃度依賴性生物活性，包括T細胞增殖及IFN-γ細胞介素分泌。通常，抗CD28 mAb對人類T細胞活化之影響與兩種基準對照抗體相當或更有效。 T細胞活化共刺激檢定：IL-2釋放
藉由CellTiter-Glo®螢光細胞活力檢定(Promega)量測T細胞增殖及ELISA量測IL-2細胞介素分泌量測抗CD28 mAb作為促效型T細胞共刺激劑在體外活化人類T細胞之生物活性。Ultra-LEAF TM純化抗人類CD28抗體(Biolegend)用作陽性對照。
使用EasySep TM人類初始總T細胞單離套組(STEMCELL Technologies)將人類T細胞自亞洲供體之新鮮PBMC中單離。將細胞在連續稀釋之基準對照TAC2387、同型陰性對照抗體、商業化抗人類CD28陽性對照抗體及一組抗CD28測試mAb之存在下於預包被次優濃度(5 nM)抗人類CD3抗體(OKT3)之96孔組織培養板(1.0×10 5個細胞/孔)中培養。將細胞於37°C、5% CO 2中培育72小時，及然後收集細胞上清液藉由ELISA進行IL-2細胞介素分析，並使用CellTiter-Glo ®檢定量測T細胞增殖水準。
如圖5A至B所示，相較於同型對照抗體，抗CD28抗體顯示出濃度依賴性生物活性，包括T細胞增殖及IL-2細胞介素分泌。TY24859、TY24865、TY24866及TY24890對人類T細胞活化之影響與基準對照TAC2387相當。未預包被之抗CD3陰性對照組未顯示出可偵測之T細胞增殖及IL-2細胞介素分泌。 實例7：抗HER2×CD28雙特異性抗體構築及功能表征 抗HER2×CD28雙特異性抗體之產生
使用TYM13 Fc突變(D或E356K：E357K：S364K：S400C L351'D：K370'D：N390'C：K439'D；根據IgG1 C H3結構域之Kabat編號方案)對異二聚雙特異性框架進行工程改造。將輕鏈-重鏈半抗體及單鏈可變片段(scFv)-Fc鏈組合形成具有TYM13突變之異-Fc結構域之雙特異性抗體(BsAb)。
將編碼BsAb重鏈、輕鏈及scFv-Fc鏈之質粒短暫轉染至哺乳動物細胞中。轉染7天後，於14000 g下離心30分鐘收穫含有雙特異性抗體之細胞，培養上清液且經無菌篩檢程式(0.22 μm)過濾。使用MabSelect TMSuRe TM預填充管柱(GE Healthcare)藉由蛋白A親和層析將抗體純化且隨後於20 mM組胺酸(pH 5.5)緩衝液中進行緩衝液交換。
選擇使用TY24865(高親和力CD28)及TY24865突變體(低親和力CD28)框架構築CD28 BsAb。構築體描述於表10中。 表10. 抗HER2×CD28雙特異性抗體設計
BsAb ID Fab臂(抗HER2) scFv臂(抗CD28)
TY27566 Perjeta® TY24865
TY27881 Perjeta® TY24865突變體
TY27807 Herceptin® TY24865
藉由FACS量測與SK-OV-3細胞之結合
使用流式細胞術量測抗HER2×CD28 BsAb (TY27566)、抗HER2×CD3 BsAb (TY25238，亦描述於PCT/CN2021/076626中，其全文以引用的方式併入本文中)及抗HER2 mAb對Perjeta ®(TAC2319)或Herceptin ®(TAC2320)之濃度依賴性結合活性。Perjeta ®(TAC2319)與Herceptin ®(TAC2320)結合至不同HER2二聚化結構域之抗原表位。
培養SK-OV-3細胞並以8.0×10 4個細胞/孔添加至96孔板中，並在4°C下與連續稀釋之測試BsAb於2% FBS/RPMI1640緩衝液中培育60分鐘。接下來，將細胞用DPBS洗滌兩次，並在4°C下與二級APC-抗人類IgG Fc抗體(1：400稀釋)進一步培育30分鐘。最後，將細胞用DPBS洗滌兩次並重懸浮於FACS緩衝液中用於流式細胞術分析。為進行分析，使用FlowJo 10軟體(FlowJo LLC)繪製MFI值與濃度圖，並藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com)之四參數非線性回歸進一步擬合資料以獲取EC 50值。同型抗體用作陰性對照。
如圖6所示，相較於抗HER2 mAb與Perjeta®(TAC2319)或Herceptin®(TAC2320)，抗HER2×CD28或抗HER2×CD3 BsAb與SK-OV-3細胞展示出非常相似之結合親和力。 T細胞受體及CD28受體信號傳導之刺激活性
藉由抗HER2×CD3 BsAb、抗HER2×CD28 BsAb或其組合評價T細胞受體(TCR)及CD28受體信號傳導之刺激活性。於此測定中，TCR及CD28同時活化導致NFkB之轉錄活性增強，進而誘導報告基因之產生。同型抗體作為陰性對照。
將Jurkat-NFkB-Nluc效應(E)報告細胞(5×10 4個細胞/孔)與SK-OV-3靶(T)細胞(1×10 4個細胞/孔，E：T=5：1)共培養，內源性表現HER2抗原。將連續稀釋之抗HER2×CD3 BsAb或具有固定濃度之抗HER2×CD28 BsAb (10 nM)之同型對照抗體，或相反，將連續稀釋之抗HER2xCD28 BsAb或具有固定濃度之抗HER2×CD3 BsAb (0.01 nM)之同型對照抗體，添加至報告細胞系統中，以評估其在刺激下游螢光素酶活性方面之綜合效應。將共培養細胞於37°C、5% CO 2中培育6小時。然後，將100 μL Nano-Glo ®螢光素酶檢定系統(Promega)試劑添加至細胞中，並將細胞裂解10分鐘。收集上清液(100 μL)用於使用SpectraMax® i3x多模式微孔板讀取器(分子元件)之發光量測。
如圖7所示，抗HER2×CD28 BsAb (TY27566)與固定濃度之抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)組合，及抗HER2×CD3 BsAb與固定濃度之抗HER2×CD28 BsAb組合，在最大信號值及EC 50值方面展示出協同或增強刺激效應。 具有相同或不同TAA抗原表位之抗HER2×CD28 BsAb及抗HER2×CD3 BsAb之細胞毒性
使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢定法量測MCF-7腫瘤細胞株上抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)單獨或與抗HER2×CD28 BsAb (TY27566或TY27807)組合之體外細胞毒性活性。TY25238與TY27566結合至不同HER2二聚化結構域之腫瘤相關抗原(TAA)抗原表位，但與TY27807結合至相同之TAA抗原表位。
將人類T細胞自冷凍保存之PBMC中單離。在37℃下將培養之MCF-7腫瘤靶細胞(1×10 4個細胞/孔)與連續稀釋之抗CD3 BsAb FG14127單獨或與固定濃度(1 μg/mL)之結合不同TAA抗原表位之兩種抗CD28 BsAb (TY27566或TY27807)組合培育30分鐘。然後，添加經單離人類T效應細胞(2×10 4個細胞/孔)，並在37°C、5% CO 2下培育72小時(E：T=2：1)。藉由CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega)定量基於殺傷MCF-7靶細胞釋放LDH至上清液中之細胞毒性。
如圖8所示，作為單藥劑，抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)在MCF-7靶細胞上引發有效濃度依賴性細胞毒性。針對不同TAA抗原表位之抗HER2×CD28 BsAb (TY27566)及抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)之組合，進一步增強體外腫瘤殺傷活性之EC 50。然而，相較於單獨使用抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)處理，添加具有相同TAA抗原表位之抗HER2×CD28 BsAb (TY27807)顯著降低MCF-7腫瘤細胞之EC 50及最大裂解。同型抗體作為單藥檢定之陰性對照。 實例8：抗TROP2×CD28或抗TROP2×CD3 BsAb構築及功能表征
使用如實例7所述之TYM13 Fc突變體對抗腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2 (TROP2)×CD28或抗TROP2×CD3異二聚雙特異性框架進行設計。抗TROP2×CD28 BsAb之構築體描述於表11中。
抗TROP2×CD3 BsAb之構築體描述於表12中。 表11. 抗TROP2×CD28雙特異性抗體設計
BsAb ID Fab臂(抗TROP2) scFv臂(抗CD28)
TY27571 TY25616 TY24865
表12. 抗TROP2×CD3雙特異性抗體設計
BsAb ID Fab臂(抗TROP2) scFv臂(抗CD3)
TY25839 TY25616 TY24742
基於CD3或CD28之雙特異性與具有高、中或低TROP2表現之腫瘤細胞株之結合
使用流式細胞術量測抗TROP2 BsAb在具有高、中或低TROP2表現之不同腫瘤細胞株上之濃度依賴性結合活性。同型抗體作為陰性對照。
將H292、NCI-N87或HT29細胞培養並以1.0×10 5個細胞/孔接種於96孔板中，並在4°C下與連續稀釋之測試抗TROP2 BsAb於2% FBS/RPMI1640緩衝液中培育30分鐘。接下來，將細胞用DPBS洗滌兩次，並在4°C下與二級抗人類IgG抗體(APC-抗人類IgG Fc抗體，H292細胞1:300稀釋；APC-F(ab’)2片段山羊抗人類IgG (H+L)，NCI-N87及HT29細胞1:500稀釋)進一步培育30分鐘。最後，將細胞用DPBS洗滌兩次並重懸浮於FACS緩衝液中用於流式細胞術分析。為進行分析，使用FlowJo 10軟體(FlowJo LLC)繪製MFI值與濃度圖，並藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本)之四參數非線性回歸進一步擬合資料以獲取EC 50值。
如圖9及表13所示，TY25839及TY27571於具有高、中或低TROP2表現之三種不同腫瘤細胞株上TROP2臂結合活性相似。 表13. 抗TROP2雙特異性抗體於腫瘤細胞株上之EC 50值
BsAb ID H292 NCI-N87 HT-29
EC 50(nM) 範圍 AUC EC 50(nM) 範圍 AUC EC 50(nM) 範圍 AUC
TY25839 0.813 149008 418398 0.901 612873 1715321 0.693 52548 156975
TY27571 0.822 156304 465058 0.911 589022 1644423 0.559 52992 162739
TCR及CD28受體信號傳導之刺激活性
藉由抗TROP2×CD3 BsAb、抗TROP2×CD28 BsAb或其組合評價TCR及CD28受體信號傳導之刺激活性。TCR及CD28同時活化導致NFkB之轉錄活性增強，進而誘導報告基因之產生。
將Jurkat-NFkB-Nluc效應報告細胞(5×10 4個細胞/孔)與H292靶細胞(E：T=5：1)共培養。將連續稀釋之抗TROP2×CD3 BsAb與固定濃度之抗TROP2×CD28 BsAb (5 nM)，或相反，將連續稀釋之抗TROP2xCD28 BsAb與固定濃度之抗TROP2×CD3 BsAb (0.01 nM)添加至報告細胞系統中，以評估其在刺激下游螢光素酶活性方面之綜合活性。將共培養細胞於37°C、5% CO 2中培育6小時。然後，將100 μL Nano-Glo螢光素酶檢定系統(Promega)試劑添加至細胞中，並將細胞裂解10分鐘。收集上清液(100 μL)用於使用SpectraMax i3x多模式微孔板讀取器(分子元件)之發光量測。
如圖10所示，基於CD28 BsAb之單藥劑展示出非常弱之報告基因活性。然而，抗TROP2×CD3及抗TROP2×CD28 BsAb之組合在最大信號值或EC 50值方面展示出協同或增強刺激效應。 實例9：B7H3×CD28雙特異性抗體構築及功能表征
構築了B7H3×CD28 BsAb。構築體描述於表14中。
B7H3×CD3 BsAb構築體描述於表15中。 表14. B7H3×CD28雙特異性抗體設計
BsAb ID Fab臂(抗B7H3) scFv臂(抗CD28)
TY27556 TY21601 TY24865
表15. B7H3×CD3雙特異性抗體設計
BsAb ID Fab臂(抗B7H3) scFv臂(抗CD3)
TY26999 TY21601 中等親和力CD3
藉由FACS量測與MDA-MB-231細胞之結合
使用流式細胞術(圖11)量測抗B7H3×CD28 BsAb TY27556及其親本抗B7H3 mAb TY21601於MDA-MB-231細胞之濃度依賴性結合活性。同型抗體作為陰性對照。
將MDA-MB-231細胞培養並以1.0×10 5個細胞/孔接種於96孔板中，並在4°C下與連續稀釋之測試BsAb於2% FBS/RPMI1640緩衝液中培育60分鐘。接下來，將細胞用DPBS洗滌兩次，並在4°C下與二級APC-抗人類IgG Fc抗體(1：400稀釋)進一步培育30分鐘。最後，將細胞用DPBS洗滌兩次並重懸浮於FACS緩衝液中用於流式細胞術分析。為進行分析，使用FlowJo 10軟體(FlowJo LLC)繪製MFI值與濃度圖，並藉由GraphPad Prism 7 (Windows版本)之四參數非線性回歸進一步擬合資料以獲取EC 50值。
如圖12所示，抗B7H3 mAb TY21601對MDA-MB-231靶細胞顯示出次-nM (0.4525 nM)之結合親和力，且BsAb TY27556對靶細胞之結合活性降低了約28倍(12.84 nM)。 B7H3xCD28雙特異性抗體增強PD-1或PD-L1阻斷體外誘導T細胞活化之能力
抗PD-1阻斷mAb與B7H3xCD28雙特異性Ab組合對體外原代人類T細胞活化之影響藉由ELISA量測IFN-γ及IL-2之分泌。本文使用改良之混合淋巴細胞反應(MLR)模擬生理PD-L1表現及TCR/CD3刺激。為產生單向MLR檢定，將來自健康供體(D#XC11147W)之人類T細胞(1×10 5個細胞/孔)在單獨存在不同測試抗體(B7H3xCD28或同型對照)或與抗PD-1 (pembrolizumab，Keytruda®)或抗PD-L1 (atezolizumab，Tecentriq®)組合之情況下與異基因MDA-MB-231細胞(E：T=5：1)培育。然後將細胞於37°C、5% CO 2培養箱中共培養120小時。用Elisa套組定量由經活化T細胞上清液中分泌之IL-2 (72小時)及IFN-γ (120小時)細胞介素。
如圖13A至13B所示，於該MLR檢定中，添加100 nM PD-1/PD-L1 mAb或滴定B7H3xCD28導致無或僅有輕微細胞介素釋放。然而，相較於單藥療法，B7H3xCD28與100 nM PD-1/PD-L1 mAb組合顯著增加T細胞活化。此等結果證明，B7H3xCD28雙特異性在腫瘤細胞存在下能協同結合PD-1/PD-L1阻斷劑，以促進T細胞活化，內源性表現PD-L1及B7H3。 共刺激雙特異性抗體在雙向結合時在體外增強對MCF-7細胞之T細胞細胞毒性
使用LDH釋放細胞毒性檢定法量測基於抗CD3，或基於抗CD28 BsAb或其組合在MCF-7腫瘤細胞株上之體外腫瘤細胞殺傷活性。
將人類T細胞自冷凍保存之PBMC中單離。在37℃下將MCF-7細胞(1×10 4個細胞/孔)與連續稀釋之抗HER2×CD3 BsAb TY25238或與固定濃度之高親和力CD28臂抗HER2×CD28 BsAb TY27566、抗CD28×B7H3 TY27556、或低親和力CD28臂抗HER2×CD28 BsAb TY27881 (1 ug/mL或10 ug/mL)組合培育30分鐘，並加入人類T細胞(2×10 4個細胞/孔)於37°C、5% CO 2中培育72小時(E：T=2：1)。使用CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega)定量基於殺傷MCF-7靶細胞上清液中釋放LDH之細胞毒性。
如圖14所示，作為單藥劑，基於CD28 BsAb在MCF-7靶細胞上未引起細胞毒性。相反，作為單藥劑，抗CD3 BsAb TY25238顯示出濃度依賴性效應，且針對HER2之BsAb引起最高細胞毒性，伴隨54.47%之MCF-7細胞裂解。抗CD3及抗CD28 BsAb之組合進一步增強了體外腫瘤細胞殺傷活性，表現為EC 50降低。相較於單獨使用抗CD3 BsAb TY25238處理，添加具有高親和力CD28臂之抗CD28 BsAb TY27566顯著增強約10倍(EC 50)之腫瘤細胞裂解。然而，當與具有低親和力CD28臂之抗CD28 BsAb TY27881組合時，未偵測到增強之細胞毒性。 共刺激雙特異性抗體在雙向結合時在體外增強對EMT-6-HER2細胞之T細胞細胞毒性
使用LDH釋放細胞毒性檢定法量測基於抗CD3或基於抗CD28 BsAb或其組合在EMT-6-HER2腫瘤細胞株上之體外腫瘤細胞殺傷活性。
使用EasySep TM人類初始總T細胞單離套組(STEMCELL Technologies)將人類T細胞自新鮮PBMC中單離。在37℃下將EMT-6-HER2 (5×10 3個細胞/孔)靶細胞與連續稀釋之抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)或與固定濃度之抗B7H3×CD3 BsAb TY27556 (8 nM)組合培育30分鐘，或相反，在37℃下將EMT-6-HER2 (5×10 3個細胞/孔)細胞與連續稀釋之抗B7H3×CD3 BsAb (TY26999)或與固定濃度之抗HER2×CD28 BsAb TY27566 (8或0.8 nM)組合培育30分鐘。接下來，加入經單離人類T效應細胞(2×10 4個細胞/孔)並於37°C、5% CO 2中培育72小時(E：T=2：1)。使用CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega)定量基於殺傷EMT-6-HER2靶細胞上清液中釋放LDH之細胞毒性。同型抗體作為陰性對照用於單藥劑檢定。
如圖15所示，作為單藥劑，TY27556 (抗B7H3×CD28)或TY27566 (抗HER2×CD28)未對EMT-6-HER2細胞展示出殺傷效能。相較於TY25238，TY25238與TY27556組合導致EC 50降低約2倍，及最大殺傷增加約3倍(從17%增加至50%)。
相較於TY26999，TY26999與TY27566組合導致EC 50降低約1.3倍，及最大殺傷增加約2倍(從23%增加至47%)。 基於抗CD3或抗CD28之雙特異性抗體或其組合之體內全身細胞介素釋放風險
使用ELISA量測基於抗小鼠CD3或抗CD28 BsAb單獨或組合在BALB/c小鼠模型中體內全身細胞介素釋放風險(IL-6及IFN-γ)。
將BALB/c小鼠隨機分為四組(每組3隻小鼠)，並分別注射抗小鼠CD3 mAb (145-2C11克隆，1 mg/kg)、抗B7H3×CD28 (TY27556，2 mg/kg)、抗B7H3×CD3 (TY27042，其中CD3臂衍生自小鼠特異性145-2C11克隆，2 mg/kg)或其組合(TY27556，2 mg/kg與TY27042，2 mg/kg)。在注射前及注射後之不同時間點(給藥前3.5及24小時)收集小鼠血清及全血。藉由ELISA經IL-6及IFN-γ評估全身細胞介素釋放風險。藉由流式細胞術於每個時間點測定CD3 +T細胞與總外周T細胞之百分比。
如圖16所示，測試抗體處理3.5小時後，小鼠投與抗mCD3或抗B7H3×CD3 (TY27042)導致細胞介素釋放(IL-6及IFN-γ)顯著降低。測試抗體處理後，抗B7H3×CD28 (TY27556)處理之小鼠未顯示出可偵測之細胞介素釋放。此外，與單藥劑抗B7H3×CD3 (TY27042)相比，抗B7H3×CD3 (TY27042)與抗B7H3×CD28 (TY27556)組合未顯示出增強之細胞介素釋放風險。在單藥劑抗小鼠CD3、抗B7H3×CD3 (TY27042)及抗B7H3×CD28 (TY27556)組以及抗B7H3×CD3 (TY27042)與抗B7H3×CD28 (TY27556)組合組中，外周CD3 +T細胞急劇減少至幾乎為零。注射後3.5小時，僅有約2%至3%之CD3 +T細胞保留在外周血中。 實例10： 體內功效研究 SK-OV3模型中B7H3xCD28 BsAb單藥療法及與HER2xCD3 BsAb組合療法體內功效研究
藉由腹膜注射向免疫缺陷M-NSG小鼠(n=8隻/組，雌性，7至8周齡)移植5×10 6個PBMC。7天后，向小鼠皮下接種2×10 6個SK-OV3細胞。當腫瘤接種後第8天平均腫瘤體積達到約90 mm 3時，開始治療。藉由腹膜注射向小鼠投與5 mg/kg hIgG 1同型對照、0.2 mg/kg抗HER2×CD3雙特異性雙鏈經遮蔽抗體、5 mg/kg抗B7H3×CD28雙特異性抗體TY27556或0.2 mg/kg TY27151與5 mg/kg TY27556之組合。TY27151先前於PCT/CN2021/076626中描述。每週兩次向小鼠投與該Ab，達總計五個劑量。一周兩次監測腫瘤生長，並報告為隨時間之平均腫瘤體積±s.e.m。
如圖17所示，雙鏈經遮蔽抗HER2×CD3雙特異性抗體TY27151與抗B7H3×CD28雙特異性抗體TY27556於該模型中顯示出較強之協同抗腫瘤效應。 EMT6-HER2小鼠乳癌同源模型中CD28 BsAb體內功效研究
向BALB/c小鼠(n=5隻/組，雌性，8至9周齡)皮下接種5×10 5個EMT-HER2細胞。當腫瘤接種後第7天平均腫瘤體積達到約110 mm 3時，開始治療。藉由腹膜注射向小鼠投與媒劑、0.5 mg/kg及0.05 mg/kg抗B7H3×CD28 BsAb TY27556，或0.2 mg/kg抗HER2×CD28雙特異性抗體TY27566。每週兩次向小鼠投與該Ab，達總計四個劑量。一周兩次監測腫瘤生長，並報告為隨時間之平均腫瘤體積±s.e.m。
如圖18所示，抗B7H3×CD28雙特異性抗體TY27556於該模型中顯示出劑量依賴性抗腫瘤效應。如圖18所示，抗HER2×CD28雙特異性抗體TY27566顯示出較強之抗腫瘤效應。 實例11：識別經遮蔽抗CD28抗體之自阻斷肽的方法 經遮蔽抗CD28抗體之產生
已設計並執行了一種篩選系統，其用於有效發現具有良好可展性之可有效遮蔽未經遮蔽親本抗CD28抗體之遮蔽性部分。於此系統中，靶抗CD28 scFv首先在酵母表面展示，及經證實功能結合至其CD28抗原。然後將來自改良MP肽庫之遮蔽性肽(MP)直接融合至靶抗CD28 scFv之輕鏈之N端，及構築在酵母表面上展示融合蛋白之酵母庫。然後該酵母庫經歷若干輪基於FACS之篩選：1)將具有與抗原低結合之酵母純系濃化，2)將經濃化酵母純系用蛋白酶處理以移除N端MP，及3)選擇展示與抗原高結合之純系。於5至6輪分選後，自此等純系提取質粒及通過DNA定序證實MP序列。在MP之存在下，呈scFv形式之選定經遮蔽抗CD28抗體純系展示與抗原之少結合。然而，當將酵母細胞用煙草蝕紋病毒核酸內含物——一種內肽酶(TEV)處理以移除MP時，與抗原之結合急劇增加。將作為裂解位點之TEV識別位點併入MP中，與應用TEV蛋白酶組合驗證選定純系顯著增加MP選擇之成功率。
為識別MP序列，使用質粒提取套組(Generay)自選定酵母純系提取穿梭質粒，及轉形至活性大腸桿菌細胞。製備質粒，及將編碼MP之區域定序及比對。如所預期，可將此等序列分成若干組，指示通過分選輪之清除濃化。選定MP之遮蔽效率如下表16所示，及每個MP之序列如下述序列部分所示。
將經遮蔽抗CD28 scFv蛋白轉變成IgG 4同型mAb。經遮蔽IgG 4mAb被改造為包括MP，該MP具有單個不變基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點，其以與在酵母表面上展示相同之方式融合至輕鏈之N端。將重鏈及輕鏈分開選殖至哺乳動物表現載體pCDNA3.3(Thermo Fisher Scientific)。親本抗CD28抗體(TY24865)之V H及V L序列列於以下序列部分。
將質粒對短暫轉染至HEK293F細胞中。於6天后，收集上清液，藉由離心及過濾澄清，及將IgG用標準蛋白A親和層析法(MabSelect SuRe, GE Healthcare)純化。將IgG溶離及中和，及緩衝交換至20 mM組胺酸，pH 5.5緩衝液中。藉由UV-分光亮度法測定蛋白質濃度，及在變性、還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE或EC-HPLC分析IgG純度。重要的是，經遮蔽抗體於HEK293細胞中之表現水準類似於或低於其親本抗體，且其於蛋白A樹脂後之純化產率亦相似，表明遮蔽性肽及裂解肽之存在對哺乳動物細胞中之抗體表現不具有顯著負面影響。 表16. 遮蔽性肽
IgG ID ELISA遮蔽效率 IgG ID ELISA遮蔽效率 IgG ID ELISA遮蔽效率
TY26142 3062 TY26152 1867 TY26162 ND
TY26143 ND TY26153 1825 TY26163 ND
TY26144 ND TY26154 ND TY26164 ND
TY26145 1430 TY26155 368 TY26165 ND
TY26146 2179 TY26156 670 TY26166 ND
TY26147 4882 TY26157 ND TY26167 1427
TY26148 ND TY26158 887 TY26168 2567
TY26149 3841 TY26159 468 TY26169 1818
TY26150 1027 TY26160 1461 TY26170 ND
TY26151 2476 TY26161 1484 TY26171 406
遮蔽效率之量測
當藉由ELISA量測遮蔽效率時，將重組人類CD28-Fc於PBS中稀釋至2 μg/mL及在4°C下塗覆在MaxiSorp TM高蛋白結合能力96孔ELISA板(ThermoFisher Scientific)上過夜。在37°C下將板用補充有3%脫脂乳之PBS阻斷1小時。於洗滌後，將100 μL抗CD28測試mAb之3倍連續稀釋添加至各孔。於37°C下培育1小時後，將板洗滌四次，及將100 μL辣根過氧化物酶(HRP)結合之抗人類IgG (Fab特異性) (1：6000稀釋)二抗添加至個孔。將板在37°C下培育1小時，洗滌四次，及然後將50 μL TMB受質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液添加至各孔，及將板在室溫下培育。向每孔中加入50 μL硫酸終止液停止反應後，量測450 nm處之吸亮度。使用GraphPad Prism 6 (Windows版本，GraphPad Software，La Jolla California USA，www.graphpad.com)之S形(四參數邏輯方程)模型擬合ELISA資料來評價EC 50。
選定經遮蔽抗CD28測試mAb之遮蔽效率藉由經遮蔽mAb之結合之EC 50除以未經遮蔽親本mAb (TY24865)之EC 50來計算，並於表17中列出。如圖19所示，相較於親本mAb，所有可活化mAb顯示與其抗原之急劇減少之結合，及經計算之遮蔽效率範圍自368至高於4000。此等結果指示當於哺乳動物細胞中表現時，自改良之MP肽庫識別之多個MP維持其遮蔽效率且作為全IgG分子之部分。 表17. 經遮蔽抗CD28抗體之SEC純度及遮蔽效率
IgG ID SEC純度 遮蔽效率
HMW(%) LMW(%)
TY26142 2 0 3062
TY26143 ＞2.0 0 ND
TY26144 24.6 0 ND
TY26145 4.5 0 1430
TY26146 3.6 0.2 2179
TY26147 1.9 0 4882
TY26148 1.9 0.1 ND
TY26149 1.4 0.1 3841
TY26150 1.9 0 1027
TY26151 1.7 0 2476
TY26152 2.1 0 1867
TY26153 1.7 0 1825
TY26154 14.2 0 ND
TY26155 1.8 0 368
TY26156 2.7 0 670
TY26157 無主峰 ND
TY26158 低峰 887
TY26159 36.6 0 468
TY26160 1.4 0 1461
TY26161 1.8 0 1484
TY26162 0.9 0 ND
TY26163 1.1 0 ND
TY26164 2.5 0 ND
TY26165 2.8 0 ND
TY26166 58.5 0 ND
TY26167 2.2 0.3 1427
TY26168 20.8 0 2567
TY26169 非對稱主峰 1818
TY26170 3.9 0.8 ND
TY26171 5.9 0 406
選定抗CD28可活化抗體之優化
對於兩個先導經遮蔽抗CD28 mAb (TY26149及TY26152)，在其MP上進行了修飾，包括去除一些N端殘基，並在TY26149序列之「D」及「G」殘基之間添加「S」胺基酸殘基(表18中TY26149之粗體及底線殘基)。如圖20所示，新型經遮蔽抗體之表現及遮蔽效率未受到顯著影響。 表18. 遮蔽性肽序列之修飾
IgG ID 遮蔽性肽+裂解肽序列： SEQ ID NO:
TY26149 EVGSYAATYSDCYSDPYACH DGGGPLGLAGSGGS 301
TY28338 EAATYSDCYSDPYACHDSGGGPLGLAGSGGS 302
TY28339 EYSDCYSDPYACHDSGGGPLGLAGSGGS 303
TY26152 EVGSYAAFSPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS 304
TY28341 EAAFSPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS 305
TY28342 ESPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS 306
實例12：表位作圖
為了確定測試抗體在胺基酸殘基水準上之結合區域，製備了一系列之人類CD28細胞外結構域之突變體(表19)。使用這些CD28突變質粒轉染HEK293F細胞。抗體與人類CD28突變體之結合藉由流式細胞術分析進行評估。結果匯總於表19中，連同這些抗體與處於感興趣之差異(differentiation)之人類、猴及小鼠CD28之交叉反應性。TY24865與人類、猴及小鼠CD28交叉反應，然而TAC2386及TAC2387不結合至小鼠CD28。突變構建體意在將TY24863所結合之表位與參考抗體TAC2386及TAC2387區分開。清楚地是，TY24865保持與RE49AA、VY68AA、YS79AA及KT81AA之結合能力，其指示TY24865不結合至RE49、VY68、YS79及KT81殘基，且該等殘基位於人類及小鼠CD28非保守區域。然而TY24865喪失對FR51AA、SL54AA、YL98AA、QN100AA、YF110AA、KI113AA、YP118AA、PPP119AAA、PP120AA、PY121AA及Y122A突變之結合能力，表明其結合抗原表位在這些區域內，例如SEQ ID NO.: 1之胺基酸殘基51、52、54、55、98-101、110-111、113-114、118-122。 表19. 表位作圖
突變體 TY24865 TAC2386 TAC2387
Hu_WT + + +
Cyno_WT + + +
小鼠_WT + - -
Hu_RE49AA + + -
Hu_FR51AA - - -
Hu_SL54AA - - -
Hu_VY68AA + + -
Hu_Y69A + + -
Hu_YS79AA + - +
Hu_KT81AA + - +
Hu_YL98AA - - -
Hu_QN100AA - - -
Hu_YF110AA - - -
Hu_KI113AA - - -
Hu_M117A + + -
Hu_YP118AA - + -
Hu_PPP119AAA - + -
Hu_PP120AA - + -
Hu_PY121AA - + -
Hu_Y122A - + +
實例13：TY24865變體
採用兩種方法產生TY24865變體。將不同點突變引入TY24865 scFv之YYYY序列中，及通過基於酵母之成熟文庫篩選發現新批次TY24865 scFv變體。以Fab-scFv-Fc形式構建抗TAA×CD28雙特異性抗體，並使用ELISA量測該等bsAb之CD28親和力。
以抗PD-L1 TY21421 Fab (見WO 2019/185035)及TY24865 scFv (VH-VL形式)或其變體之Fab-scFv-Fc形式構建抗PD-L1×CD28雙特異性抗體。該等bsAb中部分與CD28之親和力匯總於表20以及圖22A及22B中；TY29815為野生型bsAb，且TY30413與TY29815具有相似之親和力，然而其他bsAb具有更高或更低之親和力。 表20. 具有TY24865變體之抗PD-L1×CD28 BsAb之構築及表徵
BsAb CD28 scFv 表現量 (mg/L) SEC純度 單點ELISA ELISA EC 50(nM)
HMW(%) LMW(%)
TY29815 VH-VL(YYYY) 54.1 6.4 0.6 22.26
TY30406 VH-VL(YDYY) 37.5 7.2 1.6 更高
TY30410 VH-VL(YYEY) 23.2 9.5 1.7 更低
TY30413 VH-VL(YYHY) 60.2 2.8 0.5 未改變 26.81
使用VH-VL或VL-VH形式之TY24865 scFv變體構築抗HER2×CD28 bsAb或抗B7-H3×CD28 bsAb。如表21所示，該等bsAb顯示出正常表現量及SEC純度。如圖23A及23B所示，藉由ELISA量測該等bsAb之CD28親和力。該等scFv變體顯示出多變之親和力，範圍自0.954至417 nM，且VL-VH形式之scFv比VH-VL形式之scFv具有更高之親和力。表22以及圖24A及24B中，一些變體顯示出對人類及小鼠高親和力，且該親和力於小鼠T細胞結合檢定中得到進一步證實(圖25)。 表21. 具有TY24865變體之抗HER2×CD28 BsAb之構築及表徵
BsAb ID CD28 scFv (VL-VH) 表現量 (mg/L) SEC純度 EC 50(nM)
HMW(%) LMW(%)
TY27566 WT 61.7 4.4 0.0 3.89
TY28652 BC8227 60.5 NA NAA 3.68
TY28653 BC8228 42.2 6.8 0.1 7.30
TY28654 BC8230 59.6 3 0 68.41
TY28655 BC8233 55.2 3.4 0.2 8.14
TY28656 BC8235 70.6 2.7 0 127.7
TY28657 BC8237 67.1 3.3 0 5.29
TY28658 BC8240 67.3 4.9 0 78.02
TY28659 BC8242 64 3.4 0.3 0.954
TY28660 BC8257 67.5 4.9 0.4 3.77
TY28661 BC8263 62.8 4.9 0 52.57
BsAb ID CD28 scFv (VH-VL) 表現量 (mg/L) SEC純度 EC 50(nM)
HMW(%) LMW(%)
TY29109 WT 73.4 5.1 0.0 30.33
TY29306 BC8227 63.7 1.4 0.6 9.27
TY29307 BC8228 69.3 1.4 0 27.79
TY29308 BC8230 34.1 2.4 0 417.3
TY29309 BC8233 38.6 2 0 27.7
TY29310 BC8235 50.4 2.7 0 348.9
TY29311 BC8237 25.4 3 2.1 91.28
TY29312 BC8240 43.0 2.6 0 624.1
TY29313 BC8242 36.0 2.4 1.8 6.97
TY29314 BC8257 96.5 4 0.9 27.51
TY29315 BC8263 60.5 1.3 0 291.2
表22. 具有TY24865變體之抗B7-H3×CD28 BsAb之構築及表徵
BsAb ID CD28 scFv (VH-VL) 人類CD28 EC 50(nM) 小鼠CD28 EC 50(nM)
TY29021 WT 36.39 NM
TY30120 BC10599 3.026 74.18
TY30121 BC10601 5.731 108.3
TY30123 BC10621 3.588 96.41
僅出於說明目的提供上述非限制性實例，以便更全面地理解所公開之主題。該等實例不應被解釋為限制本說明書中描述之任何實施例，包括那些涉及抗體、醫藥組合物或用於治療癌症、神經退行性疾病或傳染病之方法及用途。 序列
本文公開之序列於下表中列出及SEQ ID NOs (SEQ)於左欄中顯示。
SEQ 描述 序列
1 人類CD28 MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS   
2 恆河猴CD28 MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS   
3 食蟹獼猴CD28 MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS   
4 小鼠CD28 MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP   
未經遮蔽抗CD28抗體
抗CD28 mAb (TY24865)
5 HCDR1 TGGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
7 HCDR3 YEYYYYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
11 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
13 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
14 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24853)
15 HCDR1 SGHHWS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
16 HCDR3 KDDYYAFDY
17 LCDR1 RASESVDFYGISFLH
18 LCDR2 AASTLQS
19 LCDR3 QQSYRTPIT
20 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDDYYAFDYWGQGTLVTVSS
21 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPITFGQGTKVEIK
22 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDDYYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
23 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24854)
24 HCDR1 SGYHWG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
25 HCDR3 RRGDGYFDF
26 LCDR1 RASQSVDFLGISFLH
27 LCDR2 DASNRAT
28 LCDR3 QQSYRTPLT
29 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRRGDGYFDFWGQGTLVTVSS
30 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFLGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIK
31 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRRGDGYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
32 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFLGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24859)
33 HCDR1 TGGVGVG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
35 HCDR3 YGYSYYALDY
36 LCDR1 SASSSVGYVQ
37 LCDR2 DASNLET
38 LCDR3 QQSYTSPRT
39 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYSYYALDYWGQGTLVTVSS
40 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYVQWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPRTFGQGTKVEIK
41 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYSYYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
42 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYVQWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24860)
43 HCDR1 TSGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
44 HCDR3 KGYYYYAFDY
45 LCDR1 RASQDIGSFLA
9 LCDR2 AASSLQS
46 LCDR3 QQSYRSPPT
47 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKGYYYYAFDYWGPGTLVTVSS
48 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPPTFGQGTKVEIK
49 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKGYYYYAFDYWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
50 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24866)
33 HCDR1 TGGVGVG
51 HCDR2 EIYHSGSTYYPPSLKS
52 HCDR3 YEYSSYGLDY
53 LCDR1 RASQDIRKFLA
300 LCDR2 DASSLES
10 LCDR3 QQSYRSPRT
54 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYPPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYSSYGLDYWGQGTLVTVSS
55 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRKFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
56 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYPPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYSSYGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
57 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRKFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24869)
24 HCDR1 SGYHWG
58 HCDR2 AIYHSGSTYYSPSLKS
59 HCDR3 SGLVYYAFDY
60 LCDR1 RASQGIGSYLA
300 LCDR2 DASSLES
61 LCDR3 QQYSTSPLT
62 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGLVYYAFDYWGQGTLVTVSS
63 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTSPLTFGQGTKVEIK
64 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGLVYYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
65 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24871)
66 HCDR1 SYAIH
67 HCDR2 SIYHSGSTYYSPSLKS
68 HCDR3 DVYGSYALDV
69 LCDR1 RASQSVDFDGISFLH
300 LCDR2 DASSLES
70 LCDR3 QQSYRSPIT
71 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSSYAIHWVRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDVYGSYALDVWGQGTLVTVSS
72 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFDGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIK
73 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSSYAIHWVRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDVYGSYALDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
74 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFDGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24773)
24 HCDR1 SGYHWG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
75 HCDR3 KDYYYALDY
76 LCDR1 RASQSVDFYGKSFLH
18 LCDR2 AASTLQS
28 LCDR3 QQSYRTPLT
77 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDYYYALDYWGQGTLVTVSS
78 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIK
79 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDYYYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
80 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24876)
24 HCDR1 SGYHWG
58 HCDR2 AIYHSGSTYYSPSLKS
81 HCDR3 GPLSYYAFDY
82 LCDR1 RASQSVSRYLA
27 LCDR2 DASNRAT
83 LCDR3 QQYYRSPIT
84 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSITSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPLSYYAFDYWGQGTLVTVSS
85 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIK
86 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSITSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPLSYYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
87 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24878)
88 HCDR1 TGGVAVA
89 HCDR2 QIYYSGSTYYNPSLKS
90 HCDR3 SSAHYYFDV
91 LCDR1 RASESVDFQGISFLD
300 LCDR2 DASSLES
70 LCDR3 QQSYRSPIT
92 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLSTGGVAVAWIRQAPGQGLEWIGQIYYSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSAHYYFDVWGQGTLVTVSS
93 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFQGISFLDWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIK
94 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLSTGGVAVAWIRQAPGQGLEWIGQIYYSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSAHYYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
95 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFQGISFLDWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24879)
24 HCDR1 SGYHWG
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
97 HCDR3 SGLRYYAFDV
98 LCDR1 AASQDVSTAVA
9 LCDR2 AASSLQS
70 LCDR3 QQSYRSPIT
99 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGLRYYAFDVWGQGTLVTVSS
100 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCAASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIK
101 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGYHWGWIRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGLRYYAFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
102 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCAASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24884)
103 HCDR1 GYAIH
104 HCDR2 QIYHSGSTYYNPSLKS
105 HCDR3 SGYGGYDFDY
106 LCDR1 RASQSVPRRYLA
18 LCDR2 AASTLQS
83 LCDR3 QQYYRSPIT
107 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSGYAIHWVRQAPGQGLEWIGQIYHSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYGGYDFDYWGQGTLVTVSS
108 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVPRRYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIK
109 HC                QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSGYAIHWVRQAPGQGLEWIGQIYHSGSTYYNPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYGGYDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
110 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVPRRYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24890)
111 HCDR1 SGHHWG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
112 HCDR3 RELGYAYFDY
113 LCDR1 RASQDIRKYLA
18 LCDR2 AASTLQS
114 LCDR3 QQYYRTPLT
115 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRELGYAYFDYWGQGTLVTVSS
116 VL    EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIRKYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYYRTPLTFGQGTKVEIK
117 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRELGYAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
118 LC    EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDIRKYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASTLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYYRTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24856)
15 HCDR1 SGHHWS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
119 HCDR3 RDFGASYFDY
120 LCDR1 RASQGVGPWLA
9 LCDR2 AASSLQS
121 LCDR3 QQYYSYST
122 VH    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRDFGASYFDYWGQGTLVTVSS
123 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGPWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYSTFGQGTKVEIK
124 HC    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRDFGASYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
125 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGPWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24881)
126 HCDR1 TGGVGVT
67 HCDR2 SIYHSGSTYYSPSLKS
127 HCDR3 YDYGYYSFDV
128 LCDR1 RASQSVDFDAFSFLA
18 LCDR2 AASTLQS
129 LCDR3 QQSYSAST
130 VH    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLSTGGVGVTWIRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYGYYSFDVWGQGTLVTVSS
131 VL    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFDAFSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSASTFGQGTKVEIK
132 HC    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLSTGGVGVTWIRQAPGQGLEWIGSIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYGYYSFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
133 LC    DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFDAFSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSASTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24858)
134 HCDR1 SGHHWT
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
135 HCDR3 RDYGSSYFDY
136 LCDR1 RASQSVSRSFLA
27 LCDR2 DASNRAT
83 LCDR3 QQYYRSPIT
137 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWTWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRDYGSSYFDYWGQGTLVTVSS
138 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSRSFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIK
139 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGHHWTWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRDYGSSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
140 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSRSFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24864)
43 HCDR1 TSGVGVS
58 HCDR2 AIYHSGSTYYSPSLKS
141 HCDR3 YGYSYYAFDY
142 LCDR1 RASQTIGSFLN
300 LCDR2 DASSLES
143 LCDR3 QQSYSYQT
144 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYSYYAFDYWGQGTLVTVSS
145 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGSFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYQTFGQGTKVEIK
146 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGAIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYSYYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
147 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGSFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSYQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24877)
148 HCDR1 NYGIH
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
149 HCDR3 GPLSYYALDY
150 LCDR1 RASQSIRRFLN
300 LCDR2 DASSLES
83 LCDR3 QQYYRSPIT
151 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGIHWVRQAPGQGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPLSYYALDYWGQGTLVTVSS
152 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRRFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIK
153 HC QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGIHWVRQAPGQGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPLSYYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
154 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRRFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24855)
15 HCDR1 SGHHWS
155 HCDR2 DIYHSGSTYYNPSLKS
16 HCDR3 KDDYYAFDY
156 LCDR1 RAPQSVDFHGKSFLH
27 LCDR2 DASNRAT
70 LCDR3 QQSYRSPIT
157 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGDIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDDYYAFDYWGQGTLVTVSS
158 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAPQSVDFHGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIK
159 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHHWSWIRQAPGKGLEWIGDIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARKDDYYAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
160 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAPQSVDFHGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CD28 mAb (TY24857)
161 HCDR1 TSGVAVG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
162 HCDR3 HGYHYYALDY
163 LCDR1 PASQDVGTAVA
300 LCDR2 DASSLES
164 LCDR3 QQYYSSPPT
165 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVAVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARHGYHYYALDYWGQGTLVTVSS
166 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCPASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPPTFGQGTKVEIK
167 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVAVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARHGYHYYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
168 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCPASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
未經遮蔽雙特異性抗體
HER2×CD28雙特異性抗體—(親本—TY24865)
TY27566
169 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
170 HC-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
171 HC-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
TY27881
169 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
170 HC-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
172 HC-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPLTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRVEDTAVYYCARDEYDYYAFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
TROP2×CD28雙特異性抗體
TY27571
173 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
174 HC-A QVQLLQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWLGWIHTYTGEPTYTDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
171 HC-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
B7H3×CD28雙特異性抗體
TY27556
175 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQGTHVPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
176 HC-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWISPSGGDTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGTVVYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
171 HC-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
TY26999
175 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQGTHVPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
176 HC-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWISPSGGDTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGTVVYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
177 HC-B QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAINWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCVRHGNFGTSYVSWFAYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
遮蔽性單元(MU)
SEQ ID NO: 序列
178 ASDLYVCAHDPYFCHS
179 PNVFDTCYVDPYSCTI
180 YAAAPSCPPANYYCAD
181 HHADPLCFAQHSACNT
182 YDTHDYCLIHYHSCDT
183 ADFAPYCYADPYYCHD
184 DIASDSCYYHPNHCDT
185 AATYSDCYSDPYACHD
186 PTYDHDCAVYNNFCNA
187 HNHALTCYTDPYACHS
188 AAFSPACYTDPYSCHA
189 TPHPDACFVDPYHCHT
190 APSDAYCYADPYACHT
191 AVDDDPCYTDPYQCTA
192 THSDAVCAPDHAYCLY
193 PYIYVDCYAPPFFCAY
194 YFCAEGVPIVLCIG
195 DYCEGPPAFFYCAK
196 FPCEPLADPFLCRQ
197 LVCEDVPFPAACRA
198 ALCEFYAFPYFCAR
199 IVCKYFDDPFLCRR
200 YFCPVRVPLAVCLR
201 PSCPDYVPFPVCAQ
202 VACAKAFAYVYCLV 
203 VLCGDSVPFLLCEP
204 ILCPEGVPVVFCVL
205 SDCGLGVPLLVCLK
206 TDCGIPFPVDDCLS 
207 HIPDHYCAADHHYCYY
208 AATYSDCYSDPYACHD
209 YSDCYSDPYACHD
210 AAFSPACYTDPYSCHA
211 SPACYTDPYSCHA
遮蔽性肽組分
SEQ ID NO: 描述 序列
212 N-terminal Unit EVGSY
213 Linkage Unit(LU) GGGPLGLAGSGGS
214 Linkage Unit(LU) SGGGPLGLAGSGGS
SEQ ID NO: 樣本ID名稱 遮蔽性肽+裂解肽序列：: SEQ ID NO
         LC HC MU LU
215 TY26142 EVGSYASDLYVCAHDPYFCHS GGGPLGLAGSGGS 14 13  171 213
216 TY26143 EVGSYPNVFDTCYVDPYSCTI GGGPLGLAGSGGS 14 13 172 213
217 TY26144 EVGSYYAAAPSCPPANYYCAD GGGPLGLAGSGGS 14 13 173 213
218 TY26145 EVGSYHHADPLCFAQHSACNT GGGPLGLAGSGGS 14 13 174 213
219 TY26146 EVGSYYDTHDYCLIHYHSCDT GGGPLGLAGSGGS 14 13 175 213
220 TY26147 EVGSYADFAPYCYADPYYCHD GGGPLGLAGSGGS 14 13 176 213
221 TY26148 EVGSYDIASDSCYYHPNHCDT GGGPLGLAGSGGS 14 13 177 213
222 TY26149 EVGSYAATYSDCYSDPYACHD GGGPLGLAGSGGS 14 13 178 213
223 TY26150 EVGSYPTYDHDCAVYNNFCNA GGGPLGLAGSGGS 14 13 179 213
224 TY26151 EVGSYHNHALTCYTDPYACHS GGGPLGLAGSGGS 14 13 180 213
225 TY26152 EVGSYAAFSPACYTDPYSCHA GGGPLGLAGSGGS 14 13 181 213
226 TY26153 EVGSYTPHPDACFVDPYHCHT GGGPLGLAGSGGS 14 13 182 213
227 TY26154 EVGSYAPSDAYCYADPYACHT GGGPLGLAGSGGS 14 13 183 213
228 TY26155 EVGSYAVDDDPCYTDPYQCTA GGGPLGLAGSGGS 14 13 184 213
229 TY26156 EVGSYTHSDAVCAPDHAYCLY GGGPLGLAGSGGS 14 13 185 213
230 TY26157 EVGSYPYIYVDCYAPPFFCAY GGGPLGLAGSGGS 14 13 186 213
231 TY26158 EVGSYYFCAEGVPIVLCIG GGGPLGLAGSGGS 14 13 187 213
232 TY26159 EVGSYDYCEGPPAFFYCAK GGGPLGLAGSGGS 14 13 188 213
233 TY26160 EVGSYFPCEPLADPFLCRQ GGGPLGLAGSGGS 14 13 189 213
234 TY26161 EVGSYLVCEDVPFPAACRA GGGPLGLAGSGGS 14 13 190 213
235 TY26162 EVGSYALCEFYAFPYFCAR GGGPLGLAGSGGS 14 13 191 213
236 TY26163 EVGSYIVCKYFDDPFLCRR GGGPLGLAGSGGS 14 13 192 213
237 TY26164 EVGSYYFCPVRVPLAVCLR GGGPLGLAGSGGS 14 13 193 213
238 TY26165 EVGSYPSCPDYVPFPVCAQ GGGPLGLAGSGGS 14 13 194 213
239 TY26166 EVGSYVACAKAFAYVYCLV GGGPLGLAGSGGS 14 13 195 213
240 TY26167 EVGSYVLCGDSVPFLLCEP GGGPLGLAGSGGS 14 13 196 213
241 TY26168 EVGSYILCPEGVPVVFCVL GGGPLGLAGSGGS 14 13 197 213
242 TY26169 EVGSYSDCGLGVPLLVCLK GGGPLGLAGSGGS 14 13 198 213
243 TY26170 EVGSYTDCGIPFPVDDCLS GGGPLGLAGSGGS 14 13 199 213
244 TY26171 EVGSYHIPDHYCAADHHYCYY GGGPLGLAGSGGS 14 13 200 213
245 TY28338 EAATYSDCYSDPYACHD SGGGPLGLAGSGGS 14 13 201 214
246 TY28339 EYSDCYSDPYACHD SGGGPLGLAGSGGS 14 13 202 214
247 TY28341 EAAFSPACYTDPYSCHA GGGPLGLAGSGGS 14 13 203 213
248 TY28342 ESPACYTDPYSCHA GGGPLGLAGSGGS 14 13 204 213
SEQ 撓性連接子
249 GGGGS
250 GGGGT
251 SGGS
252 GGSG
253 GGSGG
254 GSGSG
255 GSGGG
256 GGGSG
257 GSSSG
經遮蔽雙特異性抗體
HER2×CD28雙特異性抗體—(親本—TY24865)
TY27566
258 LCDR1 KASQDVSIGVA
259 LCDR2 SASYRYT
260 LCDR3 QQYYIYPYT
261 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK
262 HCDR1-A DYTMD
263 HCDR2-A DVNPNSGGSIYNQRFKG
264 HCDR3-A NLGPSFYFDY
265 VH-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS
5 HCDR1-B TGGVGVS
6 HCDR2-B EIYHSGSTYYSPSLKS
7 HCDR3-B YEYYYYDFDY
8 LCDR1-B RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2-B AASSLQS
10 LCDR3-B QQSYRSPRT
266 scFv-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
TY27807
267 LCDR1 RASQDVNTAVA
268 LCDR2 SASFLYS
269 LCDR3 QQHYTTPPT
270 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
271 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
272 HCDR1-A DTYIH
273 HCDR2-A RIYPTNGYTRYADSVKG
274 HCDR3-A WGGDGFYAMDY
275 VH-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
276 HC-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
5 HCDR1-B TGGVGVS
6 HCDR2-B EIYHSGSTYYSPSLKS
7 HCDR3-B YEYYYYDFDY
8 LCDR1-B RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2-B AASSLQS
10 LCDR3-B QQSYRSPRT
266 scFv-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
171 HC-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK
TROP2×CD28雙特異性抗體
TY27571
277 LCDR1-A RASQDVSIAVA
259 LCDR2-A SASYRYT
278 LCDR3-A QQHYITPLT
279 VL-A DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPLTFGQGTKVEIK
280 HCDR1-A NYGIN
281 HCDR2-A WIHTYTGEPTYTDDFKG
282 HCDR3-A GGFGSSYWYFDV
283 VH-A QVQLLQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWLGWIHTYTGEPTYTDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYYCARGGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS
5 HCDR1-B TGGVGVS
6 HCDR2-B EIYHSGSTYYSPSLKS
7 HCDR3-B YEYYYYDFDY
8 LCDR1-B RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2-B AASSLQS
10 LCDR3-B QQSYRSPRT
266 scFv-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
B7H3×CD28雙特異性抗體
TY27556
287 LCDR1-A RASQSIRKYLN
18 LCDR2-A AASTLQS
288 LCDR3-A QGTHVPFT
289 VL-A DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQGTHVPFTFGQGTKVEIK
290 HCDR1-A GYGIH
291 HCDR2-A WISPSGGDTKYAQKFQG
292 HCDR3-A GGTVVYFDY
293 VH-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWISPSGGDTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGTVVYFDYWGQGTLVTVSS
5 HCDR1-B TGGVGVS
6 HCDR2-B EIYHSGSTYYSPSLKS
7 HCDR3-B YEYYYYDFDY
8 LCDR1-B RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2-B AASSLQS
10 LCDR3-B QQSYRSPRT
266 scFv-B DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
B7H3×CD3雙特異性抗體
TY26999
287 LCDR1-A RASQSIRKYLN
18 LCDR2-A AASTLQS
288 LCDR3-A QGTHVPFT
289 VL-A DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQGTHVPFTFGQGTKVEIK
290 HCDR1-A GYGIH
291 HCDR2-A WISPSGGDTKYAQKFQG
292 HCDR3-A GGTVVYFDY
293 VH-A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWISPSGGDTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGTVVYFDYWGQGTLVTVSS
5 HCDR1-B TYAIN
294 HCDR2-B RIRSKYNNYATYYAESVKG
295 HCDR3-B HGNFGTSYVSWFAY
296 LCDR1-B GSSTGAVTTSNYPN
297 LCDR2-B GTNKRAP
298 LCDR3-B ALWYSNLWV
299 scFv-B QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAINWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCVRHGNFGTSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: IgG ID 遮蔽性肽+裂解肽序列：
301 TY26149 EVGSYAATYSDCYSDPYACH DGGGPLGLAGSGGS
302 TY28338 EAATYSDCYSDPYACHDSGGGPLGLAGSGGS
303 TY28339 EYSDCYSDPYACHDSGGGPLGLAGSGGS
304 TY26152 EVGSYAAFSPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS
305 TY28341 EAAFSPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS
306 TY28342 ESPACYTDPYSCHAGGGPLGLAGSGGS
TY24865變體
SEQ ID NO: 描述 序列
TY28652
5 HCDR1 TGGVGVS
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
307 HCDR3 YEYDYYAFDY
76 LCDR1 RASQSVDFYGKSFLH
308 LCDR2 AASSLES
46 LCDR3 QQSYRSPPT
362 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYAFDYWGQGTLVTVSS
363 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPPTFGQGTKVEIK
TY28653
5 HCDR1 TGGVGVS
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
309 HCDR3 YEYGYYALDY
310 LCDR1 RASQSVDFYGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
311 LCDR3 QQSYRTPPT
364 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYGYYALDYWGQGTLVTVSS
365 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPPTFGQGTKVEIK
TY28654
43 HCDR1 TSGVGVS
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
312 HCDR3 YEYGYYAFDY
76 LCDR1 RASQSVDFYGKSFLH
9 LCDR2 AASSLQS
28 LCDR3 QQSYRTPLT
366 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYGYYAFDYWGQGTLVTVSS
367 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIK
TY28655
43 HCDR1 TSGVGVS
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
307 HCDR3 YEYDYYAFDY
310 LCDR1 RASQSVDFYGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
313 LCDR3 QQSYRTPRT
368 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYAFDYWGQGTLVTVSS
369 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPRTFGQGTKVEIK
TY28656
314 HCDR1 TSGVGVG
315 HCDR2 EIYHSGSTNYNPSLKS
309 HCDR3 YEYGYYALDY
76 LCDR1 RASQSVDFYGKSFLH
9 LCDR2 AASSLQS
313 LCDR3 QQSYRTPRT
370 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYGYYALDYWGQGTLVTVSS
371 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPRTFGQGTKVEIK
TY28657
33 HCDR1 TGGVGVG
316 HCDR2 EIYHSGSTYYNPSLKS
312 HCDR3 YEYGYYAFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
308 LCDR2 AASSLES
313 LCDR3 QQSYRTPRT
372 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYGYYAFDYWGQGTLVTVSS
373 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPRTFGQGTKVEIK
TY28658
314 HCDR1 TSGVGVG
96 HCDR2 SIYHSGSTYYNPSLKS
317 HCDR3 YEYDYYDFDY
76 LCDR1 RASQSVDFYGKSFLH
308 LCDR2 AASSLES
318 LCDR3 QQSYRSPLT
374 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVGWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYDFDYWGQGTLVTVSS
375 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPLTFGQGTKVEIK
TY28659
43 HCDR1 TSGVGVS
316 HCDR2 EIYHSGSTYYNPSLKS
312 HCDR3 YEYGYYAFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
376 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYGYYAFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY28660
43 HCDR1 TSGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
319 HCDR3 YEYYSYAFDY
320 LCDR1 RASQSVDFHGKSFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
377 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYSYAFDYWGQGTLVTVSS
378 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY28661
5 HCDR1 TGGVGVS
67 HCDR2 SIYHSGSTYYSPSLKS
307 HCDR3 YEYDYYAFDY
310 LCDR1 RASQSVDFYGISFLH
308 LCDR2 AASSLES
28 LCDR3 QQSYRTPLT
379 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYAFDYWGQGTLVTVSS
380 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIK
TY30120
43 HCDR1 TSGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
321 HCDR3 YGYYYYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
381 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY30121
314 HCDR1 TSGVGVG
316 HCDR2 EIYHSGSTYYNPSLKS
322 HCDR3 YKYDYYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
382 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTSGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYKYDYYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY30123
33 HCDR1 TGGVGVG
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
321 HCDR3 YGYYYYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
383 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYYYYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY30406
5 HCDR1 TGGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
317 HCDR3 YEYDYYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
384 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY30410
5 HCDR1 TGGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
323 HCDR3 YEYYEYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
385 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYEYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
TY30413
5 HCDR1 TGGVGVS
6 HCDR2 EIYHSGSTYYSPSLKS
324 HCDR3 YEYYHYDFDY
8 LCDR1 RASQSVDFHGISFLH
9 LCDR2 AASSLQS
10 LCDR3 QQSYRSPRT
386 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYHYDFDYWGQGTLVTVSS
12 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: PD-L1xCD28雙特異性抗體(VH-VL)
TY29815(WT)
325 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIPSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYISWPRQFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
326 HC_A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYYWGWIRQAPGKGLEWIGIIYPSGGGTNYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGGLGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
327 HC_B EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYYYDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK*
TY30406
325 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIPSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYISWPRQFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
326 HC_A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYYWGWIRQAPGKGLEWIGIIYPSGGGTNYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGGLGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
328 HC_B EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYDYYDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK*
TY30410
325 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIPSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYISWPRQFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
326 HC_A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYYWGWIRQAPGKGLEWIGIIYPSGGGTNYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGGLGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
329 HC_B EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYEYDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK*
TY30413
325 LC DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIPSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYISWPRQFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
326 HC_A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYYWGWIRQAPGKGLEWIGIIYPSGGGTNYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGGLGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKKLTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDCDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
330 HC_B EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYEYYHYDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK*
HER2xCD28雙特異性抗體(VL-VH)
TY27566(WT)
331 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
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TY29308
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TY29309
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TY29312
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B7H3XCD28雙特異性抗體(VH-VL)
TY29021(WT)
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TY30120
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TY30121
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TY30123
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358 HC_B EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARYGYYYYDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENCYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQDSLSLSPGK*
無
圖1為一組顯示抗CD28抗體與重組CD28 (人類及小鼠)蛋白結合親和力檢定之圖表。 圖2為顯示抗CD28 IgG與人類CD3+ T細胞結合之圖表。 圖3為一組顯示IgG與人類CD28-CD80 (圖表右上及左上)及CTLA-4 CD80對(圖表底部)配體阻斷檢定之圖表。 圖4A為顯示T細胞增殖檢定之圖表，其顯示相較於CD28超促效劑TAC2386 (TGN1412)，IgG不會誘導系統性T細胞活化。 圖4B為顯示藉由CellTiter-Glo® (CTG)讀出T細胞活化共刺激檢定-增殖之圖表。 圖4C為顯示T細胞活化共刺激檢定IFN-γ釋放之圖表。 圖5A為顯示使用OKT3抗CD28測試抗體藉由CTG讀出T細胞活化及增殖檢定-增殖之圖表。 圖5B為顯示T細胞活化及增殖檢定IL-2釋放之圖表。 圖6為顯示抗HER2抗體及雙特異性抗體(BsAb)與SK-OV3細胞結合之圖表。亦顯示包含標繪值之表。 圖7為顯示Jurkat-NFκB螢光素酶報告基因檢定量測抗HER2×CD28 BsAb (TY27566或TY27807)與固定濃度之抗HER2×CD3 BsAb (TY25238)組合，及抗HER2×CD3 BsAb與固定濃度之抗HER2×CD28 BsAb組合時在最大信號值及EC 50值對NFκB信號傳導刺激效應之圖表。亦顯示包含標繪值之表。 圖8為顯示具有相同或不同HER2抗原表位之CD28 BsAb及CD3 BsAb之MCF-7細胞之殺傷檢定圖表以及包含標繪值之表。 圖9為一組顯示於腫瘤細胞株上量測抗TROP2雙特異性抗體濃度-依賴性結合活性之檢定圖表。 圖10A為顯示Jurkat-NFκB螢光素酶報告子檢定於H292細胞量測雙特異性抗體在最大信號值及EC 50值對NFκB信號傳導刺激效應之圖表。亦顯示包含標繪值之表。 圖10B為顯示Jurkat-NFκB螢光素酶報告子檢定於H292細胞量測雙特異性抗體在最大信號值及EC 50值對NFκB信號傳導刺激效應之圖表。亦顯示包含標繪值之表。 圖11為一組顯示PD-L1及B7H3於MDA-MB-231細胞上共表現之流式細胞術圖。 圖12為顯示B7H3 IgG及B7H3xCD28 bsAb與MDA-MB-231細胞之結合檢定圖表。亦顯示包含標繪值之表。 圖13A及13B為顯示單向MLR檢定測試B7H3xCD28 bsAb與抗PD-1或抗PD-L1組合阻斷mAb對原代人類T細胞活化活性之圖表，藉由IL-2分泌(圖13A)及IFN-γ分泌(圖13B)量測。 圖14為顯示體外檢定之圖表，其於MCF-7腫瘤細胞株上量測基於抗CD3或基於抗CD28靶向HER2之bsAb或其組合腫瘤殺傷活性。亦顯示包含標繪值之表。 圖15為顯示體外檢定之圖表，其於EMT6-HER2腫瘤細胞株上量測基於抗CD3或基於抗CD28靶向HER2之bsAb或其組合之腫瘤殺傷活性。亦顯示包含標繪值之表。 圖16為一組顯示量測IL-6及IFN-γ全身細胞介素釋放(分別為圖表左上及右上)，及量測CD3+ T細胞與總CD45+ T細胞之百分比(圖表底部)之檢定圖表，WT小鼠用TCE處理。 圖17顯示SK-OV3+ PBMC異種移植腫瘤模型中HER2xCD3 bsAb及B7H3xCD28 bsAb單獨或組合體內功效研究及圖表。 圖18為一組顯示EMT6-HER2模型中B7H3xCD28或HER2xCD28 bsAb體內功效研究圖表。 圖19為顯示抗CD28可活化抗體結合至重組人類CD28遮蔽效率之ELISA量測值圖表。 圖20為顯示抗CD28可活化抗體結合至重組人類CD28遮蔽效率之ELISA量測值圖表。 圖21 (SEQ ID NOs: 359-361)為顯示人類與小鼠CD28不同結合殘基之表。 圖22A為顯示抗PD-L1×CD28 bsAb TY29815及TY30413與人類CD28結合之圖表。 圖22B為顯示抗PD-L1×CD28 bsAb TY29815、TY30406、TY30410及TY30413與小鼠CD28結合之圖表。 圖23A為顯示抗HER2×CD28 bsAb TY27566、TY28652、TY28653、TY28654、TY28655、TY28656、TY28657、TY28658、TY28659、TY28660及TY28661與人類CD28結合之圖表。 圖23B為顯示抗HER2×CD28 bsAb TY29109、TY29306、TY29307、TY29308、TY29309、TY29310、TY29311、TY29312、TY29313、TY29314及TY29315與人類CD28結合之圖表。 圖24A為顯示抗B7H3×CD28 bsAb TY29021、TY30120、TY30121及TY30123與人類CD28結合之圖表。 圖24B為顯示抗B7H3×CD28 bsAb TY29021、TY30120、TY30121及TY30123與小鼠CD28結合之圖表。 圖25為顯示小鼠T細胞結合檢定量測抗B7H3×CD28 bsAb TY29021、TY30120、TY30121及TY30123在最大信號值、EC 50值及AUC值對T細胞結合效應之圖表。亦顯示包含標繪值之表。
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Claims (80)

  1. 一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含CD28結合部分，其中CD28結合部分結合人類CD28並與食蟹獼猴及小鼠CD28交叉反應。
  2. 如請求項1之抗原結合蛋白或其片段，其中CD28結合部分結合至CD28抗原表位，其包含人類CD28 (SEQ ID NO: 1)之51-122胺基酸殘基。
  3. 如請求項1之抗原結合蛋白或其片段，其中CD28抗原表位包含SEQ ID NO: 1之51、52、54、55、98-101、110-111、113-114及118-122胺基酸殘基。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中CD28結合部分包含抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L)，及其中V H及V L包含所示之重鏈互補決定區(CDRs) 1-3及輕鏈CDR1-3， 分別為SEQ ID NOs: 5-10， 分別為SEQ ID NOs: 15、6、16、17-19， 分別為SEQ ID NOs: 24、6、25、26-28， 分別為SEQ ID NOs: 33、6、35-38， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、44、45、9及46， 分別為 SEQ ID NOs: 33、51-53、300及10， 分別為SEQ ID NOs: 24、58、59、60、300及61， 分別為SEQ ID NOs: 66-69、300及70， 分別為SEQ ID NOs: 24、6、75、76、18及28， 分別為SEQ ID NOs: 24、58、81、82、27及83， 分別為SEQ ID NOs: 88-91、300及70， 分別為SEQ ID NOs: 24、96-98、9及70， 分別為SEQ ID NOs: 103-106、18及83， 分別為SEQ ID NOs: 111、6、112、113、18及114， 分別為SEQ ID NOs: 15、6、119、120、9及121， 分別為SEQ ID NOs: 126、67、127、128、18及129， 分別為SEQ ID NOs: 134、6、135、136、27及83， 分別為SEQ ID NOs: 43、58、141、142、300及143， 分別為SEQ ID NOs: 148、6、149、150、300及83， 分別為SEQ ID NOs: 15、155、16、156、27及70， 分別為SEQ ID NOs: 161、6、162、163、300及164， 分別為SEQ ID NOs: 5、96、307、76、308及46， 分別為SEQ ID NOs: 5、96、309、310、9及311， 分別為SEQ ID NOs: 43、96、312、76、9及28， 分別為SEQ ID NOs: 43、96、307、310、9及313， 分別為SEQ ID NOs: 314、315、309、76、9及313， 分別為SEQ ID NOs: 33、316、312、8、308及313， 分別為SEQ ID NOs: 314、96、317、76、308及318， 分別為SEQ ID NOs: 43、316、312、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、319、320、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、67、307、310、308及28， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、321、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 314、316、322、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 33、6、321、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、6、317、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、6、323、8、9及10，或 分別為SEQ ID NOs: 5、6、324、8、9及10。
  5. 抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含結合人類CD28之CD28結合部分，其中CD28結合部分包含抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L)，及其中V H及V L包含所示之重鏈互補決定區(CDRs) 1-3及輕鏈CDR1-3， 分別為SEQ ID NOs: 5-10， 分別為SEQ ID NOs: 15、6、16、17-19， 分別為SEQ ID NOs: 24、6、25、26-28， 分別為SEQ ID NOs: 33、6、35-38， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、44、45、9及46， 分別為 SEQ ID NOs: 33、51-53、300及10， 分別為SEQ ID NOs: 24、58、59、60、300及61， 分別為SEQ ID NOs: 66-69、300及70， 分別為SEQ ID NOs: 24、6、75、76、18及28， 分別為SEQ ID NOs: 24、58、81、82、27及83， 分別為SEQ ID NOs: 88-91、300及70， 分別為SEQ ID NOs: 24、96-98、9及70， 分別為SEQ ID NOs: 103-106、18及83， 分別為SEQ ID NOs: 111、6、112、113、18及114， 分別為SEQ ID NOs: 15、6、119、120、9及121， 分別為SEQ ID NOs: 126、67、127、128、18及129， 分別為SEQ ID NOs: 134、6、135、136、27及83， 分別為SEQ ID NOs: 43、58、141、142、300及143， 分別為SEQ ID NOs: 148、6、149、150、300及83， 分別為SEQ ID NOs: 15、155、16、156、27及70， 分別為SEQ ID NOs: 161、6、162、163、300及164， 分別為SEQ ID NOs: 5、96、307、76、308及46， 分別為SEQ ID NOs: 5、96、309、310、9及311， 分別為SEQ ID NOs: 43、96、312、76、9及28， 分別為SEQ ID NOs: 43、96、307、310、9及313， 分別為SEQ ID NOs: 314、315、309、76、9及313， 分別為SEQ ID NOs: 33、316、312、8、308及313， 分別為SEQ ID NOs: 314、96、317、76、308及318， 分別為SEQ ID NOs: 43、316、312、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、319、320、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、67、307、310、308及28， 分別為SEQ ID NOs: 43、6、321、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 314、316、322、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 33、6、321、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、6、317、8、9及10， 分別為SEQ ID NOs: 5、6、323、8、9及10，或 分別為SEQ ID NOs: 5、6、324、8、9及10。
  6. 如請求項4或5之抗原結合蛋白或其片段，其中CD28結合部分包含所示之V H及V L， 分別為SEQ ID NOs: 11及12， 分別為SEQ ID NOs: 20及21， 分別為SEQ ID NOs: 29及30， 分別為SEQ ID NOs: 39及40， 分別為SEQ ID NOs: 47及48， 分別為SEQ ID NOs: 54及55， 分別為SEQ ID NOs: 62及63， 分別為SEQ ID NOs: 71及72， 分別為SEQ ID NOs: 77及78， 分別為SEQ ID NOs: 84及85， 分別為SEQ ID NOs: 92及93， 分別為SEQ ID NOs: 99及100， 分別為SEQ ID NOs: 107及108， 分別為SEQ ID NOs: 115及116， 分別為SEQ ID NOs: 122及123， 分別為SEQ ID NOs: 130及131， 分別為SEQ ID NOs: 137及138， 分別為SEQ ID NOs: 144及145， 分別為SEQ ID NOs: 151及152， 分別為SEQ ID NOs: 157及158， 分別為SEQ ID NOs: 165及166， 分別為SEQ ID NOs: 362及363， 分別為SEQ ID NOs: 364及365， 分別為SEQ ID NOs: 366及367， 分別為SEQ ID NOs: 368及369， 分別為SEQ ID NOs: 370及371， 分別為SEQ ID NOs: 372及373， 分別為SEQ ID NOs: 374及375， 分別為SEQ ID NOs: 376及12， 分別為SEQ ID NOs: 377及378， 分別為SEQ ID NOs: 379及380， 分別為SEQ ID NOs: 381及12， 分別為SEQ ID NOs: 382及12， 分別為SEQ ID NOs: 383及12， 分別為SEQ ID NOs: 384及12， 分別為SEQ ID NOs: 385及12，或 分別為SEQ ID NOs: 386及12。
  7. 如請求項4或5之抗原結合蛋白，包含所示之抗體重鏈及抗體輕鏈， 分別為SEQ ID NOs: 13及14， 分別為SEQ ID NOs: 22及23， 分別為SEQ ID NOs: 31及32， 分別為SEQ ID NOs: 41及42， 分別為SEQ ID NOs: 49及50， 分別為SEQ ID NOs: 56及57， 分別為SEQ ID NOs: 64及65， 分別為SEQ ID NOs: 73及74， 分別為SEQ ID NOs: 79及80， 分別為SEQ ID NOs: 86及87， 分別為SEQ ID NOs: 94及95， 分別為SEQ ID NOs: 101及102， 分別為SEQ ID NOs: 109及110， 分別為SEQ ID NOs: 117及118， 分別為SEQ ID NOs: 124及125， 分別為SEQ ID NOs: 141及142， 分別為SEQ ID NOs: 132及133， 分別為SEQ ID NOs: 139及140， 分別為SEQ ID NOs: 146及147， 分別為SEQ ID NOs: 153及154， 分別為SEQ ID NOs: 159及160，或 分別為SEQ ID NOs: 167及168。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中抗原結合部分或其片段無超促效活性。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗原結合蛋白或其片段，另包含靶向腫瘤相關抗原(TAA)之第二抗原結合部分。
  10. 如請求項9之抗原結合蛋白或其片段，其中TAA為HER2、B7-H3或TROP-2。
  11. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，包含HER2結合部分，其含有 分別如SEQ ID NOs: 262-264及258-260中所示之HCDR1-3及LCDR1-3，或 分別如SEQ ID NOs: 265及261中所示之VH及VL。
  12. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，包含B7-H3結合部分，其含有 分別如SEQ ID NOs: 290-292以及287、18及288中所示之HCDR1-3及LCDR1-3，或 分別如SEQ ID NOs: 293及289中所示之VH及VL。
  13. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，包含TROP-2結合部分，其含有 分別如SEQ ID NOs: 280-282以及277、259及278中所示之HCDR1-3及LCDR1-3，或 分別如SEQ ID NOs: 283及279中所示之VH及VL。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中CD28結合部分及TAA結合部分之任意一個或兩個為單鏈Fv (scFv)、Fv、 scFab或Fab。
  15. 如請求項11之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 169及170之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 171之重鏈或含有SEQ ID NO: 266之scFv融合多肽。
  16. 如請求項11之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 169及170之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 172之重鏈或含有SEQ ID NO: 266之scFv融合多肽。
  17. 如請求項11之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 271及276之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 171之重鏈或含有SEQ ID NO: 266之scFv融合多肽。
  18. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 327之重鏈。
  19. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 333之重鏈。
  20. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 334之重鏈。
  21. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 335之重鏈。
  22. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 336之重鏈。
  23. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 337之重鏈。
  24. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 338之重鏈。
  25. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 339之重鏈。
  26. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 340之重鏈。
  27. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 341之重鏈。
  28. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 342之重鏈。
  29. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 343之重鏈。
  30. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 344之重鏈。
  31. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 345之重鏈。
  32. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 346之重鏈。
  33. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 347之重鏈。
  34. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 348之重鏈。
  35. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 349之重鏈。
  36. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 350之重鏈。
  37. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 351之重鏈。
  38. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 352之重鏈。
  39. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中HER2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 331及332之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 353之重鏈。
  40. 如請求項12之抗原結合蛋白或其片段，其中B7-H3結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 175及176之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 171之重鏈或含有SEQ ID NO: 266之scFv融合多肽。
  41. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中B7-H3結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 354及355之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 327之重鏈。
  42. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中B7-H3結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 354及355之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 356之重鏈。
  43. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中B7-H3結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 354及355之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 357之重鏈。
  44. 如請求項10之抗原結合蛋白或其片段，其中B7-H3結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 354及355之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 358之重鏈。
  45. 如請求項13之抗原結合蛋白或其片段，其中TROP2結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 173及174之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 171之重鏈或含有SEQ ID NO: 266之scFv融合多肽。
  46. 如請求項1至45中任一項之抗原結合蛋白或其片段，另包含靶向免疫檢查點抑制劑之另一抗原結合部分。
  47. 如請求項46之抗原結合蛋白，其中免疫檢查點抑制劑為PD-L1。
  48. 如請求項47之抗原結合蛋白或其片段，其中PD-L1結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 325及326之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 327之重鏈。
  49. 如請求項47之抗原結合蛋白或其片段，其中PD-L1結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 325及326之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 328之重鏈。
  50. 如請求項47之抗原結合蛋白或其片段，其中PD-L1結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 325及326之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 329之重鏈。
  51. 如請求項47之抗原結合蛋白或其片段，其中PD-L1結合部分包含分別含有SEQ ID NOs: 325及326之抗體輕鏈及抗體重鏈，及其中CD28結合部分包含含有SEQ ID NO: 330之重鏈。
  52. 如請求項1至51中任一項之抗原結合蛋白或其片段，另包含Fc區。
  53. 如請求項52之抗原結合蛋白或其片段，其中Fc區為人類IgG1子類。
  54. 如請求項52之抗原結合蛋白或其片段，其中Fc區為人類IgG4子類。
  55. 如請求項52至54中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中Fc區具有降低或無效應功能、降低或無抗體依賴性細胞毒性(ADCC)效應及/或降低或無交聯效應。
  56. 如請求項1至55中任一項之抗原結合蛋白或其片段，包含第一CH3結構域及第二CH3結構域，其中 i)第一CH3結構域包含在位置390之半胱胺酸(C)殘基且第二CH3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一CH3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二CH3結構域包含在位置390之半胱胺酸殘基；或 ii)第一CH3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二CH3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基，或第一CH3結構域包含在位置397之半胱胺酸殘基且第二CH3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；或 iii)第一CH3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基且第二CH3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基，或第一CH3結構域包含在位置400之半胱胺酸殘基且第二CH3結構域包含在位置392之半胱胺酸殘基；且其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
  57. 如請求項56之抗原結合蛋白或其片段，其中 i)第一CH3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基，或第一CH3結構域另包含在位置351之帶負電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置357之帶正電荷之殘基；或 ii)第一CH3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一CH3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置411之帶正電荷之殘基；或 iii)第一CH3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基，或第一CH3結構域另包含在位置370之帶負電荷之殘基且第二CH3結構域另包含在位置364之帶正電荷之殘基；或i)與ii)之組合，或i)與iii)之組合；且其中胺基酸殘基編號係基於EU編號。
  58. 如請求項57之抗原結合蛋白或其片段，其中第一CH3結構域包含D/E356K、E357K、S364K及S400C取代以及第二CH3結構域包含L351D、K370D、N390C及K439D取代，或第一CH3結構域包含L351D、K370D、N390C及K439D取代以及第二CH3結構域包含D/E356K、E357K、S364K及S400C取代(Eu編號)。
  59. 如請求項58之抗原結合蛋白或其片段，其中CH3結構域另包含N297A取代(Eu編號)。
  60. 如請求項1至60中任一項之抗原結合蛋白或其片段，另包含至少一個遮蔽性肽，其中遮蔽性肽(MP)連接至VL之N端，其中MP自N端至C端包含遮蔽性單元(MU)及具有或不具有裂解位點之連接單元(LU)。
  61. 如請求項60之抗原結合蛋白或其片段，及其中MU包含選自由SEQ ID NOs: 173-206組成之群之序列。
  62. 如請求項61之抗原結合蛋白或其片段，其中MP另包含與MU之N端連接之N端單元(NU)。
  63. 如請求項62之抗原結合蛋白或其片段，其中N端單元長約1-10個胺基酸殘基。
  64. 如請求項63之抗原結合蛋白或其片段，其中N端單元包含E或EVGSY。
  65. 如請求項60至64中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中LU包含裂解位點。
  66. 如請求項65之抗原結合蛋白或其片段，其中第一裂解位點為選自由尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數/uPA、基質金屬蛋白酶-1/MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、煙草蝕紋病毒蛋白酶/TEV蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因數X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14及TACE蛋白酶組成之群之蛋白酶裂解位點。
  67. 如請求項60至66中任一項之抗原結合蛋白或其片段，其中至少一個遮蔽性肽連接至B7-H3、HER2或TROP2結合部分或CD28結合部分，其中抗原結合蛋白或其片段視情況包含分別結合B7-H3、HER2或TROP2結合部分及CD28結合部分之兩個遮蔽性肽。
  68. 如請求項1至67中任一項之抗原結合蛋白或其片段，另包含綴合治療劑部分，其中治療劑部分視情況為放射性部分或細胞毒性部分。
  69. 醫藥組合物包含如請求項1至68中任一項之抗原結合蛋白或其片段及醫藥上可接受之載劑。
  70. 核酸分子或編碼如請求項1至68中任一項之抗原結合蛋白或其片段之核酸分子。
  71. 一種宿主細胞包含如請求項70之核苷酸序列。
  72. 一種產生抗原結合蛋白或其抗原結合片段之方法，包括： 在允許抗原結合蛋白或其片段表現之條件下培養如請求項71之宿主細胞，及 自培養基中單離抗原結合蛋白或其片段。
  73. 一種治療有需要患者癌症之方法，包括向患者投與治療有效量之如請求項1至68中任一項之抗原結合蛋白或其片段或如請求項69之醫藥組合物。
  74. 如請求項73之方法，另包括向患者投與另外抗癌症治療劑。
  75. 如請求項74之方法，其中另外抗癌症治療劑為靶向CD3及腫瘤抗原之雙特異性抗體，其中腫瘤抗原視情況與TAA相同或不同。
  76. 如請求項75之抗原結合蛋白或其片段，其中TAA為B7-H3、HER2或TROP2。
  77. 如請求項74之方法，其中另外抗癌症治療劑為免疫檢查點抑制劑，視情況為抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1抗體。
  78. 如請求項73至77中任一項之方法，其中患者具有實體瘤或血液惡性腫瘤，視情況選自乳癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌及結腸癌。
  79. 使用如請求項1至68中任一項之抗原結合蛋白或其片段製造用於治療癌症之藥物，視情況如請求項73至78中任一項之方法。
  80. 如請求項1至68中任一項之抗原結合蛋白或其片段，或如請求項69之醫藥組合物，用於治療癌症，視情況如請求項73至78中任一項之方法。
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