CN112760230A - 粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的应用。本发明采用的粉红粘帚霉MES72701，保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 3.11519；本发明提供了一种粉红粘帚霉菌液，其中粉红粘帚霉孢子含量为1.8×10⁷个/mL‑2.3×10⁷个/mL，制备方法包括步骤：挑取经活化培养的粉红粘帚霉新鲜菌丝，接种到含固体PDA培养基的平皿上，然后放置在25℃‑30℃恒温培养箱内，培养12‑16天；之后在培养皿内加入20‑30mL含吐温80的无菌水，用涂布器将孢子洗下，并过滤，进行8‑12倍梯度稀释。本发明提供的粉红粘帚霉菌液对引起向日葵菌核病菌的核盘菌拮抗效果明显，能防止或减轻向日葵菌核病的发生，促进向日葵稳产、增收，改善和提高向日葵的产量和品质。

Description

粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的 应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的应用。

背景技术

向日葵是我国重要的油料作物，近年来我国向日葵产区受向日葵菌核病危害大，严重的甚至造成向日葵绝产绝收。影响向日葵产量及品质提升，阻碍向日葵产业的发展。

向日葵菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary)称核盘菌，属子囊菌亚门真菌。病菌以菌核在土壤内、病残体中及种子间越冬。病原菌在0-37℃温度范围内均能生长，生长最适温度为25℃。向日葵菌核病在整个生育期均可发病，造成茎杆、茎基、花盘及种仁腐烂。常见的有根腐型、茎腐型、叶腐型及花腐型4种症状，其中根腐型、花腐型受害严重。春季低温、多雨茎腐重，花期多雨盘腐重。连作田土壤中菌核量大，病害重。

常规防治方法采用轮作、种植抗病品种、清除烧毁田间病残体的方式进行预防及病菌扩散以及采用腐霉利、菌核净等化学农药拌种、花期喷洒纹枯利或农利灵等方法防治病害的发生。通常这些操作较为繁琐且化学农药会造成农药残留等问题，影响向日葵产量和品质的提升，化学防治会造成环境污染，不符合绿色可持续性发展的道路和方向。

微生物能有效防治植物病害的发生，同时利用拮抗微生物进行植物病害的防治符合绿色防控的发展方向。因此，采用何种微生物来有效防治向日葵菌核病，是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的应用。本发明提供的粉红粘帚霉菌液对引起向日葵菌核病菌的核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)拮抗效果明显，能防止或减轻向日葵菌核病的发生，促进向日葵稳产、增收，改善和提高向日葵的产量和品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了粉红粘帚霉在防治向日葵菌核病害中的应用。申请人经检索，目前未见有采用粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)防治向日葵病的相关道，本发明创造性的将粉红粘帚霉用于防治向日葵菌核病，防效明显，并且绿色环保，能降低农药使用量及提高农产品的产量和质量，其大面积推广使用的前景十分广阔。

作为上述方案的进一步改进：优选的，粉红粘帚霉为粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)MES72701，保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号：CGMCC3.11519，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明采用的该株粉红粘帚霉MES72701是2019年12月从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)购买获得，活化培养后在4℃和-80℃冰箱保藏。粉红粘帚霉为半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，粉红粘帚霉。在PDA平板上，菌丝初为白色疏松的匍匐菌丝，气生菌丝不发达，后菌丝变成粉红色，菌落底部有橙红色色素产生。

本发明提供了一种粉红粘帚霉菌液，其中活性成分包括上述粉红粘帚霉。

优选的，粉红粘帚霉菌液中粉红粘帚霉孢子含量为1.8×10⁷个/mL-2.3×10⁷个/mL。

本发明提供了上述粉红粘帚霉菌液在防治向日葵菌核病害中的应用。

本发明提供了一种粉红粘帚霉菌液的制备方法，包括步骤：挑取经活化培养的粉红粘帚霉新鲜菌丝，接种到含固体PDA培养基的平皿上，然后放置在25℃-30℃恒温培养箱内，培养12-16天；之后在培养皿内加入20-30mL含吐温80的无菌水，用涂布器将孢子洗下，并过滤，进行8-12倍梯度稀释。本发明在接种时，接种至少3个平皿。

优选的，固体PDA培养基配方包括：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂19g/L，水1000mL；含吐温80的无菌水中，吐温80的质量浓度为0.02％-0.08％；过滤是采用纱布进行，纱布的层数为四层。本发明采用的固体PDA培养基的pH值不需要进行调节，按上述比例配制完成即可；PDA培养基的配置方法参考常规马铃薯葡萄糖培养基的配制即可。

本发明提供了根据上述方法制备得到的粉红粘帚霉菌液。

本发明提供了上述粉红粘帚霉菌液在防治向日葵菌核病害中的应用。

本发明提供的粉红粘帚霉菌液在防治向日葵菌核病害中的应用方法包括步骤：将粉红粘帚霉菌液按照1：(1-5)的比例用水稀释，之后均匀浇在植物根部。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液对引起向日葵菌核病菌的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary)拮抗效果明显，能防止或减轻向日葵菌核病的发生，促进向日葵稳产、增收，改善和提高向日葵的产量和品质；(2)将本发明提供的粉红粘帚霉菌液进行苗期盆栽防治向日葵菌核病，防治效果达80％以上，防效明显，并且属于绿色环保制剂、能降低农药使用量及提高农产品的产量和质量，其大面积推广使用的前景十分广阔。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例2中粉红粘帚霉拮抗向日葵菌核病菌效果图；

图2为本发明实施例2中的仅接种向日葵菌核病对照效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明涉及的菌株来源具体如下：

(1)本发明使用的向日葵菌核病菌是申请人从内蒙古赤峰发病田块菌核上分离纯化获得的，经16S rDNA鉴定为向日葵菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary)；

(2)本发明使用的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)MES72701是2019年12月从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)购买获得，保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 3.11519，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。活化培养后在4℃和-80℃冰箱保藏。

实施例1：粉红粘帚霉MES72701菌液的制备

本实施例提供一种粉红粘帚霉MES72701菌液的制备方法，包括如下步骤。

1、接种及培养

挑取经活化培养的MES72701新鲜菌丝，接种到固体PDA培养基上，接种3个平皿，然后放置在28℃恒温培养箱内，培养15天。PDA培养基配方为：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂19g/L，水1000mL，自然pH；PDA培养基的配置方法参考常规马铃薯葡萄糖培养基的配制。

2、孢子液的制备

15天后，在每个培养皿内加入25mL的无菌水中(含有0.05％的吐温80)，用涂布器将孢子洗下，并用四层纱布过滤，进行10倍梯度稀释。

3、孢子含量检测

用血球计数板数出孢子悬浮液中孢子的浓度。最终测定孢子悬浮液的浓度为2×10⁷个/mL。

实施例2：粉红粘帚霉MES72701菌液对向日葵菌核病的抑菌试验

1、试验时间和地点：2019年12月在公司研发中心实验室内进行。

2、试验方法：

(1)供试菌种来源

向日葵菌核病菌分离自内蒙古赤峰市向日葵菌核病发病田，由公司研发人员培养纯化，经16S rDNA最终鉴定为向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary)，经致病力测定鉴定为强致病力。

粉红粘帚霉菌液由实施例1所述菌种经过接种及培养、孢子液的制备获得。

(2)平板拮抗实验

制备PDA固体平板，将实施例1中所制得的孢子悬浮液用移液器吸取200μL均匀涂布在PDA平板上，三次重复，以无菌水做对照处理。再把上述培养皿放在28℃恒温培养箱中培养，2天后再用打孔器打取新鲜的菌核病菌丝块，放置在涂布有粉红粘帚霉孢子液的培养基及对照培养基上，再在25℃培养箱里待对照平板上的向日葵菌核病菌丝长满整个平板后，测量处理及对照菌株的向日葵菌核病菌丝生长半径，计算抑菌率。

抑菌率＝(对照菌落生长半径-处理菌落生长半径)×100/对照菌落生长半径。

(3)拮抗效果

通过本实验发现粉红粘帚霉MES72701对向日葵菌核病的拮抗效果达80.79％；对照平均菌落半径为4.5cm，接种粉红粘帚霉的平均菌落半径为2.8cm(如图1和图2所示)。说明粉红粘帚霉MES72701对向日葵菌核病具有明显的抑制作用，具有防治向日葵菌核病的生防潜力。

实施例3：粉红粘帚霉MES72701菌液对向日葵菌核病的盆栽防治效果

1、试验药剂

(1)微生物菌剂

实施例1制备的粉红粘帚霉MES72701菌液(MES72701孢子悬浮液)，孢子含量为2×10⁷个/mL。

(2)化学药剂

50％腐霉利可湿性粉剂2000倍液(山东海讯生物化学有限公司)。

(3)空白对照

设置清水处理为空白对照。

2、试验时间和地点

试验于2019年12月在公司育苗室进行。

3、试验方法

处理设置：向日葵品种为龙食葵2号，试验设置5个处理，分别为实施例1中所述孢子悬浮液原浓度、稀释1倍、稀释3倍、稀释5倍和加清水不加菌对照、50％腐霉利可湿性粉剂2000倍液处理。

实验方法：每个处理取4粒向日葵种子，放入培养皿里，加入10mL纯水浸没种子，在30℃培养箱里浸种并待向日葵种子露白后种植在育苗盆里生长，出苗后间苗保留一株幼苗。观察变化。每隔5天浇40mL自来水或者40mL各浓度孢子悬浮液，均匀浇在植株根部。30天后观察效果。

4、试验结果

试验结果见表1，从结果可以看出，添加粉红粘帚霉MES72701菌粉的处理病情指数(8.16-8.35)显著低于空白对照处理后的病情指数(87.29)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.25)差异不显著，MES72701对向日葵菌核病的防治效果达90.20％-91.49％。说明粉红粘帚霉MES72701可作为防治向日葵菌核病的生防菌种，具有广阔的开发利用前景。

表1不同处理对向日葵菌核病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			MES72701孢子悬液：水比1：1	8.16bc	91.49
MES72701孢子悬液：水比1：3	8.25bc	90.65
			MES72701孢子悬液：水比1：5	8.35bc	90.20
腐霉利	7.25b	92.69
			空白对照	87.29a	0.00

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的发明内容。

Claims (10)

1.粉红粘帚霉在防治向日葵菌核病害中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述粉红粘帚霉为粉红粘帚霉MES72701，保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 3.11519。

3.一种粉红粘帚霉菌液，其特征在于：包括权利要求1或2所述的粉红粘帚霉。

4.根据权利要求3所述的粉红粘帚霉菌液，其特征在于：粉红粘帚霉孢子含量为1.8×10⁷个/mL -2.3×10⁷ 个/mL。

5.权利要求3所述的粉红粘帚霉菌液在防治向日葵菌核病害中的应用。

6.一种粉红粘帚霉菌液的制备方法，其特征在于，包括步骤：挑取经活化培养的粉红粘帚霉新鲜菌丝，接种到含固体PDA培养基的平皿上，然后放置在25℃-30℃恒温培养箱内，培养12-16天；之后在培养皿内加入20-30mL含吐温80的无菌水，用涂布器将孢子洗下，并过滤，进行8-12倍梯度稀释。

7.根据权利要求6所述的粉红粘帚霉菌液的制备方法，其特征在于：所述固体PDA培养基配方包括：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂19g/L，水1000mL；所述含吐温80的无菌水中，吐温80的质量浓度为0.02%-0.08%；所述过滤是采用纱布进行，所述纱布的层数为四层。

8.权利要求6或7所述的方法制备得到的粉红粘帚霉菌液。

9.权利要求8所述的粉红粘帚霉菌液在防治向日葵菌核病害中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将所述粉红粘帚霉菌液按照1：（1-5）的比例用水稀释，之后均匀浇在植物根部。

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