CN112759629B - 用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的elisa试剂盒及其检测方法 - Google Patents

用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的elisa试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的ELISA试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括抗体捕获剂，固相支持物、第一抗体、酶标记的第二抗体、封闭液、显色液和终止液；其中，所述抗体捕获剂为重组大口黑鲈虹彩病毒LVMCPn蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的试剂盒对LMBV抗体的敏感度和特异性较好，且具有很好的重复性和稳定性。

Description

用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的ELISA试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及用于检测针对大口黑鲈虹彩病毒的抗体的ELISA试剂盒及其检测方法。
背景技术
大口黑鲈(Largemouth bass，Micropterus salmoides)是太阳鱼科、黑鲈属鱼类，俗称加州鲈，是华南区特种鱼养殖重要鱼种。大口黑鲈肉质鲜美、营养价值高，消费量逐年增加。随着生长习性的改变，大口黑鲈养殖逐步形成规模化养殖模式，在无病害的情况下，大口黑鲈亩产万斤，利润可观。然而，高密度养殖条件下，大口黑鲈病害频发，诸多病害中，以蛙虹彩病毒(Ranavirus)引起的“烂身病”危害最为严重，该病毒合并细菌感染导致大口黑鲈严重烂身、生产性能下降、及高死亡率。感染大口黑鲈的蛙病毒被称为大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)。
现在抗体检测的方法众多，除传统的沉淀反应、凝集试验、补体结合试验外，标记免疫测定如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等已成为主要的免疫测定技术。但是，蛙病毒对大口黑鲈的危害此前未受到重视，随着大口黑鲈养殖水平的不断提高，蛙病毒已成为大口黑鲈高密度养殖的最大痛点；蛙病毒基因组较大(80-120Kbp)，致病性较复杂，用于检测LMBV特异性抗体的免疫学原材料制备有一定技术难度，尚无对LMBV特异性抗体准确、简便、灵敏度高的检测手段。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。本发明基于LMBV病毒蛋白、鱼类IgM多克隆抗体等，研制出一种大口黑鲈虹彩病毒特异性抗体的检测方法及试剂盒。本发明的试剂盒可分析检测LMBV野毒感染或人工免疫大口黑鲈所产生的对LMBV特异性抗体，试剂盒的敏感度和特异性好，可满足大口黑鲈LMBV特异性抗体分析检测要求。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了一种抗体捕获剂，所述抗体捕获剂为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽。
本发明又一方面提供了用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的ELISA试剂盒，包括如上所述的抗体捕获剂。
本发明以LMBV主要衣壳蛋白(LMBV MCP)的N-端结构域(LVMCPn)序列为参考，合成了重组序列，并进行表达，将表达后的重组蛋白LVMCPn作为抗体捕获剂，建立了LMBV抗体间接ELISA诊断试剂盒。该试剂盒特异性好、灵敏度高。
本发明人研究了以LMBV衣壳蛋白全序列或以LMBV MCP的C-端结构域合成蛋白作为抗原，发现不同抗原在ELISA反应中识别LMBV特异性抗体的灵敏度有明显差异。
根据本发明的一些实施方式，所述重组大口黑鲈虹彩病毒LVMCPn蛋白的浓度大于或等于8μg/mL，优选为8μg/mL。
在ELISA方法检测过程中，抗原包被浓度对试验结果影响较大，若抗原包被浓度高，由于抗原蛋白分子之间作用力较大而造成蛋白分子的多层化(stacking efect)，容易被洗涤，非特异性增加，若浓度太低，酶标板表面可能留下未吸附抗原但完全封闭的活性表面，非特异性也会增加，因此必须对包被抗原蛋白浓度的进行筛选。
此外，抗体的纯度直接关系到ELISA试验的特异性和敏感性，纯度不高的抗体常常会有超量的与特异性抗原结合的宿主细胞高分子化合物，可与抗原竞争有限的载体表面位置而减少有效的吸附率，因此高纯度的抗体蛋白可以提高反应特异性，但间接ELISA方法通常检测血清中的抗体，血清成分复杂，生产中通常不逐一对被检血清进行纯化，只有通过摸索适当的血清稀释倍数，才能减少非特异结合。
本发明经过大量科学实验，确定血清(待测样品)的最佳稀释倍数为20～40倍，优选20倍；最佳抗原包被浓度为4～16μg/mL，优选为8μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒还包括固相支持物、第一抗体、酶标记的第二抗体、封闭液、显色液和终止液。
根据本发明的一些实施方式，所述固相支持物选自聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、拨片、芯片、塑料、薄膜等。优选为聚苯乙烯酶标板。
固相支持物是ELISA测定过程中的吸附剂和容器，不参与化学反应，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
根据本发明的一些实施方式，所述第一抗体为抗大口黑鲈IgM的多克隆抗体，优选是兔抗大口黑鲈IgM的多克隆抗体。所述第一抗体用来识别大口黑鲈血清样品中被固相抗原吸附的大口黑鲈抗LMBV的IgM抗体(即大口黑鲈LMBV特异性IgM抗体)。
根据本发明的一些实施方式，所述第一抗体的体积稀释倍数为2000～6000倍，优选为4000倍。
根据本发明的一些实施方式，所述酶标记的第二抗体选自HRP(辣根过氧化酶)标记的山羊抗兔IgG。
据本发明的一些实施方式，所述酶标记的第二抗体的体积稀释倍数为4000倍或8000倍。
酶标记的第二抗体浓度的高低对试验结果也有较大的影响，浓度太高，非特异性结合的机会增多，可能出现假阳性，浓度太低，没有有效结合，则可能出现假阴性等现象。本发明经过科学实验，确定出酶标记的第二抗体的最佳稀释倍数为1:4000或8000。
根据本发明的一些实施方式，所述封闭液选自无蛋白封闭液。
根据本发明的一些实施方式，所述封闭液选自含0.1％BSA或马血清的蛋白类封闭液，或含一定浓度糖分子的无蛋白封闭液。
封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
根据本发明的一些实施方式，所述显色液选自四甲基联苯胺(TMB)，邻苯二胺，2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)或其他HRP有色结合物。
显色液的作用是与酶标记的第二抗体上的标记物结合显色，可以根据实际需要选择。
根据本发明的一些实施方式，所述终止液为硫酸。
终止液的目的是终止酶促反应(或免疫学反应)的进行，可以根据实际选择的酶标记物，选择合适的终止液。
本发明另一方面还提供了上述试剂盒检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的方法，包括如下步骤：
1)固相包被：将固相支持物先用抗体捕获剂包被，再用封闭液封闭；
2)加样：加入稀释后待测样品；
3)加第一抗体：加入稀释后的第一抗体；
4)加酶标记的第二抗体：加入稀释后的酶标记的第二抗体；
5)显色：加入显色液；
6)终止：加入终止液；
7)检测并判定：将步骤6)得到的最终样品液用酶标仪测OD450nm值，判断结果。
根据本发明的一些是实施方式，所述待测样品为待测血清。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括阳性对照试验和阴性对照试验；当进行阳性对照试验时，将步骤2)中的待测样品替换为阳性对照品；当进行阴性对照试验时，将步骤2)中的待测样品替换为阴性对照品。
根据本发明的一些实施方式，P/N>3时，试验结果成立；S≥2.1×N时，判定为阳性；其中，P为阳性对照OD450nm值，N为阴性对照OD450nm值，S为待测样品OD450nm值；当N不足0.05时，按0.05计。
根据本发明的一些实施方式，所述阳性对照品为LBMV灭活病毒免疫大口黑鲈后制备的抗体；所述阴性对照品为不含LBMV抗体的大口黑鲈血清。
根据本发明的一些实施方式，所述抗体捕获剂、所述第一抗体和所述酶标记的第二抗体的加入量为等体积。
本发明的有益效果：
本发明对LMBV MCPN端结构域(LVMCPn)进行优化，合成并表达重组蛋白rLVMCPn，通过rLVMCPn包被抗原，利用制备的阳性血清和阴性血清、及大口黑鲈IgM多克隆抗体、确定了抗原包被浓度和血清稀释度、确定了试剂盒的组装等步骤，建立LMBV抗体间接ELISA诊断试剂盒，用于检测大口黑鲈血清中LMBV抗体水平。本发明的试剂盒可分析检测LMBV野毒感染或人工免疫大口黑鲈所产生的对LMBV特异性抗体，试剂盒的敏感度和特异性好，可满足大口黑鲈LMBV特异性抗体分析检测要求。
附图说明
图1为LMBV MCP序列结构分析图；
图2为LMBV MCP三种表达蛋白Western Blot结果图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
其中，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体由广东海大畜牧兽医研究院有限公司提供。实验中使用的封闭液为含一定浓度糖分子的无蛋白封闭液，购自广东海大畜牧兽医研究院有限公司。实验中使用的终止液为2M硫酸。
鰤鱼诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌、嗜水气单胞菌分别从广东江门某大口黑鲈养殖场分离得到，并经过经形态学特征、生理生化特征和分子生物学特征鉴定为Nocardiaseriolea、Aeromonas schubertii、Aeromonas hydrophila。
大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)，从广东江门某大口黑鲈养殖场分离；鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鳜鱼弹状病毒(SCRV)从广东顺德某鳜鱼养殖场分离。三种病毒均利用全基因组测序进行鉴定。
实施例1重组蛋白的表达纯化
构建LMBV MCP全序列(LVMCP)、LMBV的MCP蛋白的N-端结构域(LVMCPn)和LMBV MCP的C-端结构域(LVMCPc)的表达质粒，转化到大肠杆菌表达菌Rosetta(DE3)pLysS进行表达，得到重组蛋白LVMCP、LVMCPn和LVMCPc。
其中，LVMCP、LVMCPn和LVMCPc的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；LMBV MCP蛋白序列结构分析如图1所示。
对3种工程菌表达情况用Western Blot鉴定，结果如图2所示，其中，M为蛋白Ladder，泳道1-3分别为LVMCP、LVMCPn和LVMCPc蛋白印迹。
用亲和层析对3种重组蛋白进行纯化，并用商品化BCA蛋白定量化试剂盒标定蛋白浓度。
实施例2LMBV抗体阳性、阴性血清和质控品
1、LMBV抗体阳性血清制备
利用鲤鱼上皮细胞(EPC)上培养LMBV病毒，加入终浓度为0.2％的甲醛灭活病毒、质检后用VSA201佐剂乳化病毒原液制备疫苗，质检后4℃保存。选200-300克健康大口黑鲈50尾，用制得的LMBV灭活疫苗腹腔免疫，免疫剂量为200μL/只，免疫2次，每次免疫间隔15天。所有鱼尾鳍根部静脉采血，结合ELISA试验评估抗体效价。选择效价相对较高的血清样品(血清稀释40倍，OD450nm值在1.0左右的血清样品)作为LMBV抗体阳性血清，-20℃保存、备用。
2、LMBV抗体阴性血清制备
选200-300克健康大口黑鲈50尾，用VSA201佐剂乳化的PBS作为对照疫苗腹腔免疫，免疫及检验方法同阳性血清制备。选择无免疫反应的血清样品作为LMBV抗体阴性血清，-20℃保存、备用。
3、LMBV抗体检测质控品
以5种大口黑鲈养殖常见病原的抗体阳性血清作为质控品，评估本发明的LMBV抗体ELISA检测法的特异性。
质控品制备和检验方法：分别培养(1)弹状病毒、(2)鳜传染性脾肾坏死病毒及(3)鰤鱼诺卡氏菌、(4)舒伯特气单胞菌、(5)嗜水气单胞菌，病毒或细菌灭活、质检后用VSA201佐剂乳化灭活物制备疫苗。选200-300克健康大口黑鲈50尾，用制得的灭活苗腹腔免疫，免疫剂量为200μL/只，免疫3-4次，每次免疫间隔15天。所有免疫鱼尾鳍根部静脉采血，结合中和试验、或乳胶凝集试验评估抗体效价。选择菌或毒抗体效价相对较高的血清样品(中和试验(弹状病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒)或乳胶凝集试验(鰤鱼诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌、嗜水气单胞菌)，抗体效价大于8的血清样品。)作为质控品，-20℃保存。
实施例3三种重组蛋白的ELISA反应性
使用间接ELISA方法检测大口黑鲈血清抗体与3种重组蛋白(实施例1制备)的免疫学反应。ELISA检测固相包被物分别选择：LVMCP，LVMCPn和LVMCPc。具体方法：
(1)分别将3种重组蛋白用0.05mol/L碳酸盐(PH＝9.6)稀释至2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL包被酶标板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜；
(2)用0.05％Tween-20(PBST)洗涤酶标板3次，5分钟/次；每孔加入5％脱脂奶粉100μL封闭液，37℃封闭1小时；
(3)用PBST洗涤3次，3分钟/次；将实施例2制备的大口黑鲈血清(LMBV抗体阳性血清或LMBV抗体阴性血清)按照1:20倍稀释、加入孔中，37℃孵育30分钟；
(4)用PBST洗涤3次，3分钟/次；加入兔抗加州鲈IgM多抗(第一抗体)，1:4000稀释，37℃孵育1小时；
(5)按商品化试剂说明书(上海碧云天生物科技有限公司)加入HRP标记山羊抗兔IgG，1:8000稀释，37℃孵育45分钟。用PBST洗涤5次，3分钟/次；
(6)加入显色液(TMB)100μL/孔，室温避光显色5-15分钟，最后加入100μL 2mol/L硫酸终止反应；用酶标仪测定OD450nm值。
按照上述优化方法进行ELISA分析，评估三种重组蛋白与LMBV抗体强阳性(血清稀释40倍，OD450nm值在1.0左右的血清样品)和弱阳性(血清稀释40倍，OD450nm值在0.3～0.4的血清样品)两类血清的反应性，筛选最佳的固相包被物。试验过程中，设置不加血清样品的空白对照孔。
结果如表1所示，分析得出：(1)3种重组蛋白中，LVMCPn与LMBV抗体强阳性和弱阳性两类血清的ELISA反应性最好(OD450nm值最高)，灵敏度较高；
(2)3种重组蛋白中，LVMCPn包被浓度为升高至8μg/mL时，阴性对照变化较小，计算P/N值可见，LVMCPn孔的P/N值较高，该抗原的特异性较好。
综上，选择LVMCPn作为LMBV抗体检测固相包被物。
表1 LMBV抗体与不同抗原的ELISA反应性(OD450nm均值)
Figure BDA0002868633330000071
Figure BDA0002868633330000081
实施例4 LMBV特异抗体间接ELISA方法构建
1、抗原和抗体最佳使用浓度(棋盘滴定)
以梯度稀释的阳性血清为样品，固定兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG稀释度，ELISA固相包被不同浓度抗原，通过棋盘滴定法了解最佳抗原使用浓度和样品稀释度。具体操作按以下步骤进行：
(1)LMBV重组蛋白(LVMCPn)固相包被：将LVMCPn稀释至16、8、4、2、1、0.5μg/mL，分别包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20，1:40，1:80，1:160，1:320稀释阳性和阴性血清，按100μL/孔加样，37℃孵育30分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加第一抗体：加入1:4000稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体作为第一抗体，100μL/孔，37℃孵育1小时；
(5)加第二抗体：加入1:8000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
(8)计算阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值即P/N值，根据比值大小确定抗原血清最佳稀释度。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。结果如表2和表3所示。
表2 不同浓度抗原与不同稀释倍数血清ELISA检测结果
Figure BDA0002868633330000082
Figure BDA0002868633330000091
表3 ELISA反应的P/N值
Figure BDA0002868633330000092
按照试验结果P/N值分析，P/N值最大时，重组蛋白LVMCPn包被浓度8μg/mL、血清稀释倍数为20倍。
2、第一抗体和第二抗体最佳使用浓度
2.1兔抗IgM多克隆抗体(第一抗体)使用浓度优化
参照棋盘滴定优化结果，以8μg/mL的LVMCPn包被酶标反应板，加入20倍稀释的阳性和阴性血清，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)做梯度稀释，确定抗体的最佳使用浓度。具体操作按以下步骤进行：
(1)LMBV重组蛋白(LVMCPn)固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20稀释阳性和阴性血清，按100μL/孔加样，37℃孵育30分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加第一抗体：分别加入1000、2000、4000、8000和16000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)，100μL/孔，37℃孵育1小时；
(5)加第二抗体：加入8000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
(8)计算阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值即P/N值，根据比值大小确定抗原血清最佳稀释度。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。结果如下表4和表5所示。
表4 不同稀释度第一抗体ELISA检测结果
Figure BDA0002868633330000101
表5 ELISA反应的P/N值
Figure BDA0002868633330000102
Figure BDA0002868633330000111
按照试验结果P/N值分析，P/N值最大时，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)稀释倍数为4000倍。
2.2HRP标记的羊抗兔IgG使用浓度优化
参照优化结果，以8μg/mL的LVMCPn包被酶标反应板，加入20倍稀释的阳性和阴性血清，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)4000倍稀释，对商品化HRP标记的羊抗兔IgG(第二抗体)做梯度稀释，确定第二抗体的最佳使用浓度。具体操作按以下步骤进行：
(1)LMBV重组蛋白(LVMCPn)固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/mL，包被聚苯乙烯酶标板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)加样：将酶标板置于室温下30分钟，按1:20稀释阳性和阴性血清，按100μL/孔加样，37℃孵育30分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加第一抗体：加入4000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)，100μL/孔，37℃孵育1小时；
(5)加第二抗体：分别加入2000、4000、8000和16000倍稀释的商品化HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
(8)计算阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值即P/N值，根据比值大小确定抗原血清最佳稀释度。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。
结果如下表6和表7所示。
表6 不同稀释度第二抗体ELISA检测结果
Figure BDA0002868633330000112
Figure BDA0002868633330000121
表7 ELISA反应的P/N值
Figure BDA0002868633330000122
按照试验结果P/N值分析，P/N值最大时，商品化HRP标记的羊抗兔IgG(第二抗体)稀释倍数为8000或4000倍。
3、最佳孵育条件
参照优化结果，在LMBV抗体检测中，以8μg/mL的LVMCPn包被酶标反应板，加入20倍稀释的阳性和阴性血清，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)4000倍稀释，商品化HRP标记的羊抗兔IgG(第二抗体)做8000稀释。本试验将进一步优化待检血清及第一抗体的最佳孵育条件——温度和时间。
3.1待检血清孵育条件优化
具体操作按以下步骤进行：
(1)LMBV重组蛋白(LVMCPn)固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)待检血清加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20稀释阳性和阴性血清，按100μL/孔加样，设置孵育条件①37℃，1小时、②37℃，30分钟和③室温，1小时；250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加第一抗体：加入4000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)，100μL/孔，37℃孵育1小时；
(5)加第二抗体：加入8000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
(8)计算阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值即P/N值，根据比值大小确定抗原血清最佳稀释度。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。结果如下表8和表9所示。
表8 待检样品不同孵育条件ELISA检测结果
Figure BDA0002868633330000131
表9 ELISA反应的P/N值
Figure BDA0002868633330000132
按照试验结果P/N值分析，P/N值最大时，待检血清的最佳孵育条件为37℃、30分钟或室温、1小时，为节省检测时间，优选待检血清的最佳孵育条件为37℃、30分钟。
3.2兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体孵育条件优化
具体操作按以下步骤进行：
(1)LMBV重组蛋白(LVMCPn)固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)待检血清加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20稀释阳性和阴性血清，按100μL/孔加样，37℃，30分钟；250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加第一抗体：加入4000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)，100μL/孔，设置孵育条件①37℃，1小时、②37℃，30分钟和③室温，1小时；
(5)加第二抗体：加入8000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
(8)计算阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值即P/N值，根据比值大小确定抗原血清最佳稀释度。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。结果如下表10和表11所示。
表10 第一抗体不同孵育条件ELISA检测结果
Figure BDA0002868633330000141
Figure BDA0002868633330000151
表11 ELISA反应的P/N值
Figure BDA0002868633330000152
按照试验结果P/N值分析，P/N值最大时，兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体最佳孵育条件为37℃、1小时。
4、特异性试验
应用优化的试验条件配制LMBV抗体ELISA检测试剂，分别检测(1)鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)、(2)舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)、(3)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、(4)鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和(5)弹状病毒(SHRV)的抗体阳性血清(利用全菌/毒灭活物制备)，评估检测方法的特异性。试验过程中，设置不加样品的试验对照作为空白对照。结果如下表12。
表12 ELISA检测特异性分析
Figure BDA0002868633330000153
Figure BDA0002868633330000161
除LMBV抗体阳性血清外，与其他多种常见病原抗体均不反应，说明该方法的特异性好。
5、重复性试验
应用优化的试验条件组装3个批次试剂盒(实验室制品)。对45份大口黑鲈血清样品检测，每份血清在同一板块内做5个重复，对检测结果统计分析，分别评估试剂盒批内重复和批间重复的变异系数。试剂盒批内和批间的最大变异系数(CV)分别为5％和6％，试剂盒具有很好的重复性和稳定性。
实施例5实际应用案例
从池塘中随机转运500尾大口黑鲈(约40g/尾)到两个水泥池，两池标记为组1和组2，250尾/池(组)。以灭活LMBV全病毒作为抗原制备油乳剂灭活疫苗，组1大口黑鲈腹腔疫苗，100微升/尾；组2大口黑鲈正常饲喂、不免疫。21天后，分别对两组鱼行尾静脉采血，分离血清；应用本发明建立方法检测大口黑鲈血清样品。
ELISA检测方法：
(1)固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/ml，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
(3)待检血清加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20稀释组1(随机选47份)和组2的待检血清(随机选47份)，按100μL/孔加样，37℃，30分钟；250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(4)加入4000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体，100μL/孔，37℃，1小时；
(5)加入8000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
(6)加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
(7)每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
酶标仪读数结果如下表13所示。
对结果进行分析，得出：
(1)组1为LMBV灭活疫苗免疫组，其中，A行1列为LMBV抗体阳性血清样品；其余47个为组1池中随机选择的大口黑鲈血清样品；ELISA抗体检测结果显示，随机选择的47份血清样品OD450nm平均值为0.229±0.151；组2为正常饲喂、未免疫组，其中，E行1列为LMBV抗体阴性血清样品；其余47个为组2池中随机选择的大口黑鲈血清样品；47份血清样品OD450nm平均值为0.097±0.033。统计分析(T检验)表明，二者差异极显著，说明所建立的ELISA检测法可评价不同免疫处理后的LMBV抗体变化；
(2)针对组2中OD450nm值偏高的两份血清样品(0.264和0.222)，利用qPCR法检测血清中LMBV核酸，均为阳性，说明未经免疫的大口黑鲈LMBV抗体升高系LMBV野毒影响所致。
(3)通过检测大量血清样本，结合qPCR法LMBV核酸检测，本ELISA方法的Cut-off值按照C.O＝2.1×N(N为阴性对照OD450nm，当N不足0.05时按0.05计)。按照这一判定方法，组1中14/47份血清样品为LMBV抗体阳性，组2中2/47为LMBV抗体阳性。
表13 血清样品LMBV抗体检测结果
Figure BDA0002868633330000171
结合大量样本检测结果，本ELISA检测法操作及判定方法为：
1、固相包被：将LVMCPn稀释至8μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃孵育1小时、4℃孵育过夜，次日，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
2、封闭：加入封闭液150μL/孔，37℃封闭1小时，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干，4℃保存待用；
3、待检血清加样：将ELISA板置于室温下30分钟，按1:20稀释阳性(随机选47份)和阴性血清(随机选47份)，按100μL/孔加样，37℃，30分钟；250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
4、加第一抗体：加入4000倍稀释的兔抗大口黑鲈IgM多克隆抗体(第一抗体)，100μL/孔，37℃，1小时；
5、加第二抗体：加入8000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育45分钟，按250μL/孔加洗涤液，连续洗涤3次，拍干；
6、加TMB显色液，50μL/孔，室温避光显色5-15分钟；
7、每孔加终止液50μL终止反应，终止后10分钟内读数，酶标仪OD450nm读数。
8、结果判定方法：(1)P/N＞3时试验结果成立(P为阳性对照OD450nm，N为阴性对照OD450nm)；(2)S≥2.1×N时判定为阳性(S为待检样品OD450nm，N为阴性对照OD450nm，当N不足0.05时按0.05计)。
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。
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<120> 用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的ELISA试剂盒及其检测方法
<130> 111
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> Micropterus salmoides
<400> 1
Thr Tyr Phe Val Lys Glu His Tyr Pro Val Gly Trp Phe Thr Lys Leu
1 5 10 15
Pro Thr Ala Ala Thr Lys Thr Ser Gly Thr Pro Ala Phe Gly Gln His
20 25 30
Phe Ser Val Gly Val Pro Arg Ser Gly Asp Tyr Val Leu Asn Ser Trp
35 40 45
Leu Val Leu Lys Thr Pro Gln Ile Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gln Phe
50 55 60
Asn Ala Asn Gly Thr Ile Arg Trp Thr Lys Asn Leu Met His Asn Val
65 70 75 80
Val Glu His Ala Ala Leu Ser Phe Asn Glu Ile Gln Ala Gln Gln Phe
85 90 95
Asn Thr Ala Phe Leu Asp Ala Trp Asn Glu Tyr Thr Met Pro Glu Ala
100 105 110
Lys Arg Ile Gly Tyr Tyr Asn Met Ile Gly Asn Thr Ser Asp Leu Val
115 120 125
Asn Pro Ala Pro Ala Thr Asp Gln Ala Gly Ala Arg Val Leu Pro Ala
130 135 140
Lys Asn Leu Val Leu Pro Leu Pro Phe Phe Phe Gly Arg Asp Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Pro Tyr Asn Glu Ile Arg Ile Thr
165 170 175
Ile Ser Leu Arg Ser Ile Gln Asp Leu Leu Ile Leu Gln His Lys Thr
180 185 190
Thr Gly Glu Val Lys Pro Ile Val Ala Thr Asp Leu Glu Gly Gly Leu
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Pro Asp Thr Val Glu Ala His Val Tyr Met Thr Val Gly Leu
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<213> Micropterus salmoides
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Val Asn Pro Ala Pro Ala Thr Asp Gln Ala Gly Ala Arg Val Leu Pro
165 170 175
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195 200

Claims (10)

1.一种抗体捕获剂，其特征在于，所述抗体捕获剂为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽。
2.用于检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的抗体捕获剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相支持物、第一抗体、酶标记的第二抗体、封闭液、显色液和终止液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为抗大口黑鲈IgM多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的第二抗体选自HRP标记的山羊抗兔IgG。
6.权利要求2至5任一项所述的试剂盒检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)固相包被：将固相支持物先用所述抗体捕获剂包被，再用封闭液封闭；
2)加样：加入稀释后待测样品；
3)加第一抗体：加入稀释后的第一抗体；
4)加酶标记的第二抗体：加入稀释后的酶标记的第二抗体；
5)显色：加入显色液；
6)终止：加入终止液；
7)检测并判定：将步骤6)得到的最终样品液用酶标仪测OD450nm值，判断结果；
上述方法不用于疾病的诊断和治疗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括阳性对照试验和阴性对照试验；当进行阳性对照试验时，将步骤2)中的待测样品替换为阳性对照品；当进行阴性对照试验时，将步骤2)中的待测样品替换为阴性对照品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，P/N>3时，试验结果成立；S≥2.1×N时，判定为阳性；其中，P为阳性对照OD450nm值，N为阴性对照OD450nm值，S为待测样品OD450nm值；当N不足0.05时，按0.05计。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述阳性对照品为LBMV 灭活病毒免疫大口黑鲈后制备的抗体；所述阴性对照品为不含LBMV抗体的大口黑鲈血清。
10.权利要求1所述的抗体捕获剂在制备检测大口黑鲈虹彩病毒抗体的试剂中的用途。
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