CN110726837A - 用于片形吸虫病诊断的elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CL7重组蛋白，本发明还公开了CL7重组蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了表达盒、重组载体或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。本发明还公开了所述的CL7重组蛋白、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。本发明公开了用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒。本发明的试剂盒酶标检测抗体通过HRP标记的抗体来进一步发挥信号放大效果增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本；不受其他血清的干扰，交叉反应小，敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原，完全适合于片形吸虫病的现场筛查。

Description

用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及人畜共患病的检测领域，涉及用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

片形吸虫病是由吸虫纲片形科、片形属的肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫(Fasciola gigantica)引起的一类***共患病，呈世界性分布，中国各地广泛存在。除侵害牛、羊外，尚可感染马、驴、驼、狗、猫、猪、兔、鹿以及多种野生动物和人。WTO表示片形吸虫病在51个国家新兴，超过170万-240万人感染了这种人畜共患病，并且有1.8亿人可能面临受感染的危险。同时该病对畜牧业也有很大影响，严重影响农牧家庭收入，甚至危及粮食卫生安全和公共卫生安全。

片形吸虫的分泌代谢物中有多种有效抗原成分，这些抗原成分在虫体感染人体后会诱发多种免疫病理反应。而组织蛋白酶家族在片形吸虫的分泌抗原中含量较高，具有众多成员，在片形吸虫的发育及感染等方面具有重要意义。

传统上，使用患者粪便中片形吸虫虫卵的病原学方法检测片形吸虫病。但是，该方法费时费力，且漏检率高，而且这种方法不能对该病进行早期诊断。近年来，免疫检测的方法逐渐被用于片形吸虫病的临床诊断研究中来，并取得了良好的效果。目前实验室和临床应用的免疫学诊断方法主要有皮内试验(ID)、间接血凝试验(IHA)、免疫酶染色试验(IEST)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫印渍技术(ELIB)等等。但是这些方法都费时、费力，样本不易保存及运输，每次收集的样本检测结果差异较大，不利于疾控部门及医疗机构进行批量操作以及临床单位的推广应用。而酶联免疫吸附试验(ELISA)在一定程度上解决了病原学方法和其他免疫诊断方法检测费时、费力、漏检率高等诸多缺点。

在ELISA包被抗原选择上，若使用天然抗原提取物，可能存在天然抗原存批间差异大、纯化后杂质较多、有效抗原成份低等缺陷，容易造成试剂盒特异性较差、灵敏度较低、批间差异大等质量问题。

发明内容

发明目的：本发明通过蛋白质组学研究，筛选到一个潜在的诊断分子，并对其进行原核表达，基于该重组蛋白建立了一种新型的ELISA检测方法，用于动物及人的片形吸虫病的诊断。本发明是对片形吸虫组织蛋白酶抗原蛋白免疫原性的实际应用，涉及一种检测片形吸虫血清抗体的ELISA试剂盒及其制备方法和应用。本发明可以区分片形吸虫感染动物与非片形吸虫感染动物，该试剂盒以片形吸虫抗原特异性血清抗体为检测靶标，提高片形吸虫病检测方法的特异性。

技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种CL7重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括编码所述的CL7重组蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。

本发明内容还包括所述的CL7重组蛋白、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。

本发明内容还包括一种用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括所述的CL7重组蛋白。

其中，作为优选，所述试剂盒包括包被所述的CL7重组蛋白的酶标板和HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂。

其中，作为优选，所述HRP标记酶标二抗为抗绵羊IgG二抗或绵羊抗牛IgG二抗或山羊抗人IgG。

其中，作为优选，所述其他相配套试剂为样品稀释液、洗涤液和终止液。

其中，作为优选，所述样品稀释液为的pH为7.4的PBS缓冲液

其中，作为优选，所述洗涤液为浓缩洗涤液，优选为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。

其中，作为优选，所述终止液为2M硫酸溶液。

其中，作为优选，所述试剂盒还包括酶底物溶液显色液TMB(碧云天PO209)。

其中，作为优选，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

其中，作为优选，所述阳性对照为人工感染片形吸虫绵羊或牛血清抗体阳性对照。

其中，作为优选，所述阴性对照为人工未感染片形吸虫绵羊或牛血清抗体阴性对照。

其中，作为优选，所述CL7重组蛋白的包被浓度为1～50μg/ml。

本发明内容还包括提供一种所述的检测感染片形吸虫动物血清的ELISA试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

(1)直接取出试剂盒中制备的包被所述的CL7重组蛋白的酶标板；

(2)加样：取包被了片形吸虫特异性重组抗原CL7的酶标板，在稀释板加入250μL样品稀释液，再加入1.25μL待测血清(1/200稀释)，检测孔直接加入相应的检测样本、绵羊或牛血清阳性和阴性对照样本100μL，每一个样本均做一个重复孔，在37℃下避光反应60min；

(3)洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(4)除空白对照孔外，每孔加与检测样品对应的稀释好的酶标的二抗100μL，振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液，浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(5)显色：每孔加显色液TMB 100μL，置37℃下避光显色10min；

(6)测定：每孔加终止液50μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数。

优选地，所述读数后的结果判定为空白对照孔OD值＜0.1，绵羊阳性对照＞1.686(2cut-off值)，牛阳性对照孔＞1.504(2cut-off值)，绵羊阴性对照孔＜0.422(cut-off值/2)，牛阴性对照孔＜0.3761(cut-off值/2)；

优选地，临界值(cut-off)为0.752(牛血清)0.843(羊血清)；

样本OD值≥cut-off值时，判为片形吸虫抗体阳性；

样本OD值＜cut-off值时，判为片形吸虫抗体阴性。

本发明所述检测试剂盒可以用于所有的哺乳动物的片形吸虫的检测，所述的哺乳动物包括但不仅限于人、牛、羊等。

有益效果：本发明采用的是酶联免疫诊断技术，包被在酶标板上的特异性片形吸虫重组抗原CL7可以特异性结合阳性血清中的抗片形吸虫抗体，加入的辣根过氧化物酶标记的血清相应的二抗与之结合，形成片形吸虫重组抗原-血清中的抗片形吸虫抗体-辣根过氧化物酶标记的二抗三者特异性的复合物，再加入显色剂TMB后，经TMB发生氧化还原反应产生特异波长的光波，经含450nm/630nm波长的酶标仪读数后即可进行定性判断。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明试剂盒酶标检测抗体通过HRP标记的抗体来进一步发挥信号放大效果增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本；

2、本发明试剂盒不受其他血清的干扰，交叉反应小，制备的重组抗原用于片形吸虫病的ELISA检测，敏感性要高于传统的虫卵检查，敏感性和特异性均高于现有的粗抗原和其他重组抗原，完全适合于片形吸虫病的现场筛查；

3、本发明试剂盒可用于畜牧地区的流行病学调查和养殖场的疾病监测，具有广阔的市场前景和巨大的经济潜能和社会效益。

附图说明

图1为本发明CL7蛋白重组质粒酶切鉴定；其中，M标准分子量；1-重组质粒；2-重组质粒双酶切；

图2为本发明pET-28b(+)-CL7在大肠杆菌中的表达产物；其中，M-蛋白marker；1-未诱导的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7；2-诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7；3-诱导的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7超声裂解上清部分；4-诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7超声裂解沉淀部分；

图3为本发明pET-28b(+)-CL7在大肠杆菌中的表达纯化产物；其中，M-蛋白marker；1-诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7；2-ROSETTA-pET-28b(+)-CL7破碎沉淀；3-流穿液；4-WB洗脱液；5-纯化蛋白；

图4为本发明CL7蛋白(69.8KDa)Western-blot结果；其中，M-蛋白marker；A1-抗his标签WB；B1-抗羊血WB；C1-抗兔血WB；

图5为本发明根据标准绵羊阳性阴性血清CL7-ELISA检测结果的ROC分析图，用以确定CL7-ELISA对绵羊的阳性判断值(cut-off值)；

图6为本发明根据标准牛阳性阴性血清CL7-ELISA检测结果的ROC分析图，用以确定CL7-ELISA对牛的阳性判断值(cut-off值)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1制备CL7蛋白

运用质谱分析技术，结合现有片形吸虫基因组及蛋白组数据库，首次发现了一个组织蛋白酶家族的新成员，并命名为组织蛋白酶L7(Cathepsin L7/CL7)，提取片形吸虫RNA，通过RT-PCR获得其cDNA序列，运用PCR方法从片形吸虫的cDNA中获得该序列片段。具体地，使用免疫共沉淀的方法用感染吸虫的水牛阳性血清特异性识别片形吸虫***分泌物全抗原，pull-down筛选出能与阳性血清中的抗体相结合的蛋白。经过质谱分析后，通过比对片形吸虫现有数据库，获得数十种具有与阳性血清结合的蛋白分子，对这些蛋白进行***研究，分析筛选、鉴定出此CL7蛋白，发现其是潜在的诊断靶标分子。

使用蛋白A/G+-琼脂糖免疫沉淀试剂盒(Santa Cruz Biotechnology，USA)用于共免疫共沉淀(Co-IP)。

1、ESP(***代谢物)抗原的制备：

1)将大片成虫从感染水牛的胆管中分离出来；

2)用温PBS清洗3次，37℃下RPMI 1640培养基孵育1h；

3)将孵育好的寄生虫转移到新的培养基中，37℃下孵育12h，2500×g，20min获得上清液；过滤灭菌(0.2μm)，浓缩后冷冻成粉末，存放在-80℃中备用，使用时用去离子水中溶解。

2、取900μg ESP抗原，1000μL水牛正常血清(阴性水牛血清)和20μL蛋白A/G+琼脂糖珠，在4℃下孵育2h；

3、离心1000×g，4℃培养5min，上清液(1000μL左右)转入新鲜管；

4、上清加入500μL水牛阳性血清(取自前期感染500只感染大片吸虫囊尾蚴的水牛)，每管分别加入20μL蛋白A/G+琼脂糖珠，4℃孵育一夜；

5、离心1000×g，4℃离心5min；

6、弃上清液，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次后，用50μL 1×SDS上样缓冲液再悬浮；取其中10μL样品100℃下煮沸10min，其余40μL样品留作质谱鉴定。

质谱分析：CO-IP得到的液体经过溶液中胰蛋白酶消化，将样本溶于40μL的0.1％v/v甲酸(FA)中，用高效液相色谱/质谱法(HPLC/MS)进行分析。

将其与现有的片吸虫的基于数据库比较，分析得到数段具有免疫原性的多肽，其中即有本发明的CL7蛋白的氨基酸序列。

通过质谱分析，比对蛋白组数据库，然后通过对应的基因组数据库获得蛋白的基因序列，所述的特异性抗原CL7的基因序列包含如SEQ ID No.1所示的片段，所述片段的序列如下：

在5’3’端分别加入酶切位点BamH1和Xho1酶切序列，并将该序列进行最优基因密码子优化分析得到优化序列如下：

其CL7蛋白所示的片段的氨基酸序列如下：

b)将该基因序列送至金斯瑞公司构建质粒pET-28b(+)-CL7过程；将获得的质粒双酶切得到如图1的电泳图。图1为本发明CL7蛋白重组质粒酶切鉴定；其中，M标准分子量；泳道1-重组质粒；泳道2-重组质粒双酶切。酶切结果显示目的条带大小正确，构建成功。

2、将质粒pET-28b(+)-CL7转化到表达大肠杆菌BL21(ROSETTA)

A)取1支含有50μL的ROSETTA感受态细胞(储存于-80℃)在冰上解冻20-30分钟；

B)取2μl(将冻干的4μg构建好的pET-28b(+)-CL7质粒用无菌水溶解成100ng/μl溶解后，转入解冻后的感受态细胞里(用手指轻轻弹拨)；

C)冰上放置30分钟；

D)将其2/3放置在42℃的水浴锅中，水浴120秒，进行热击；

E)立即从水浴锅取出，放回冰上2分钟；

F)加入800μlLB培养基，并在37℃振荡培养箱(200rpm)中生长60分钟；

G)将其全部转化到含有100μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂平板上；

H)平板倒置，37℃过夜培养。

3、挑取单克隆菌落液体扩大培养，送测序，确定阳性菌株ROSETTA-pET-28b(+)-CL7；

4、按照1/100接菌到LB培养基，2小时37℃，OD值0.6-0.8左右加入1M IPTG诱导在37℃下诱导蛋白表达4小时，再分组破碎取上清沉淀，12％SDS-PAGE分析得到图2。

图2为本发明pET-28b(+)-CL7在大肠杆菌中的表达产物；其中，泳道M为蛋白marker；泳道1为未加IPTG诱导的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7菌株，泳道2为IPTG诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7菌株，两者对比发现70Kda处出现诱导后才翻译的蛋白，这与我们的目的蛋白CL7大小相符合；泳道3诱导的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7超声裂解上清部分；泳道4-诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7超声裂解沉淀部分。泳道3对比泳道4发现蛋白只表达于沉淀。

5、大量培养阳性菌株，沉淀蛋白使用尿素试剂变性；用镍柱亲和层析纯化蛋白，并用8M、6M、4M、2M、1M梯度尿素透析法每个浓度8小时透析复性沉淀蛋白，12％SDS-PAGE分析得到图3。

6、用BCA法检测蛋白浓度。

图3为本发明pET-28b(+)-CL7在大肠杆菌中的表达纯化产物；其中，泳道M为蛋白marker；泳道1为诱导后的ROSETTA-pET-28b(+)-CL7；泳道2为ROSETTA-pET-28b(+)-CL7破碎沉淀；泳道3为流穿液；泳道4为WB洗脱液；泳道5为纯化蛋白。泳道1&270K Da处出现明显蛋白条带，显示蛋白诱导表达成功，并且表达于沉淀；泳道3为过柱流穿液出现少量蛋白说明蛋白挂柱能力较差或者Ni柱饱和，泳道4washing buffer最终洗涤液中基本无条带，杂蛋白洗脱结果理想，无其他杂蛋白柱内残余；泳道5为纯化蛋白CL7条带单一，纯化效果理想。BCA法测得的蛋白浓度为0.65mg/ml(总共8ml)。

7、运用抗his标签一抗，片形吸虫阳性绵羊血清一抗和抗绵羊血清二抗，片形吸虫阳性兔血清一抗和羊抗兔血清二抗，分三组平行组对纯化后的重组蛋白CL7进行Western-blot，验证免疫原性。得到图4，具体地；

A)收集好纯化好的蛋白样品，上缓冲液处理完毕；

B)进行SDS-PAGE；

C)转膜：取下PAGE胶，放置处理好的PVDF膜上300mA 90min；

D)5％BSA4℃过夜封闭；

E)一抗室温孵育1h；0.05％PBST洗涤3次10min/次；

F)二抗室温孵育1h；0.05％PBST洗涤5次5min/次；

G)DAB液显色；

h)拍照。

图4为本发明CL7蛋白(69.8KDa)Western-blot结果；其中，泳道M为蛋白marker；泳道A1为抗his标签WB；泳道B1为抗羊血WB；泳道C1为抗兔血WB；

三组实验WB图显示在70KDa处，有单一条带，说明我们的蛋白是携带HIS的重组蛋白，且与阳性羊血清和兔血清有免疫反应，可作为免疫识别抗原。

实施例2 ELISA最佳反应方法的建立

2.1最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释度确定

(1)用抗原稀释液BC液(0.05M NaHCO₃缓冲液PH 9.6)稀释抗原(纯化好的CL7)，选用Costar酶标板(Costar 42582USA)包被检测稀释后的抗原，选取每孔浓度为1、2、5、10、20、50μg/ml稀释好的抗原4℃过夜，第二日1％BSA37℃封闭2小时，弃液拍干。

(2)加样：取步骤(1)包被了片形吸虫特异性重组抗原CL7的酶标板，在检测孔和其复孔中分别加入稀释1/100、1/200的标准阳性血清(人工感染片形吸虫绵羊血清为阳性对照)和未感染阴性血清(对照组未感染片形吸虫绵羊血清为阴性对照)，在37℃下避光反应60min；稀释液为pH为7.4的PBS缓冲液；

(3)洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；洗涤液含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；

(4)除空白对照孔外，每孔加与检测样品对应的稀释好的酶标的二抗100μL(稀释液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液；酶标检测抗体为用HRP标记酶标二抗为抗绵羊IgG(Sigma A9452-1VL)二抗或绵羊抗牛IgG二抗(Bio-radAA123P)。

(5)洗板：浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(6)显色：每孔加显色液TMB(碧云天PO209)100μL，置37℃下避光显色10min；

(7)测定：每孔加终止液(2M硫酸溶液)50μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数；终止液为2M硫酸溶液；

(8)根据数值阳性平均值P和阴性平均值N，最大值P/N、临界值2N选出最优反应条件：根据表1结果显示稀释1/200待检血清浓度，0.1μg/孔100μL抗原包被量时(浓度为1μg/m1)，P/N、2N的结果最佳所以选为最优反应条件。

表1最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释度确定ELISA OD值

注：羊阳1-4：实验室人工感染片形吸虫绵羊血清；羊阴1-2：未感染的绵羊血清；PBS缓冲液为空白对照。

2.2ELISA方法判定CUT-OFF值的确定

本发明中，所述判定cut-off是使用21份真阳性牛血清样本，9份真阴性牛血清样本，11份真阳性绵羊血清样本，9份真阴性绵羊血清样本分别进行2.1建立的ELISA测试，并进行统计学计算结果，利用GraphPad Primse6.01对于组内组间差异系分析以及ROC曲线分析。所有阳性样本来源自实验室人工感染吸虫动物，阴性样本来自实验室未感染对照组动物。本实施例中cut-off取值方式取最大Youdens J值时的临界值(Youdens J＝敏感性+特异性-1)；

根据ROC数据分析(图5和图6)得出以下结论：

根据实验2.2的ROC数据分析直接得出临界值(cut-off)为0.843(绵羊血清)，临界值(cut-off)0.7523(牛血清)时，本试剂盒对绵羊的敏感性是100％，对牛的敏感性是100％。

本试剂盒对绵羊血清进行CL7-ELISA测试结果发现对绵羊的特异性达到100％；根据ROC数据分析，直接得出临界值(cut-off)为0.7523(牛血清)时，本试剂盒对牛的特异性是100％。

读数后的结果判定为

空白对照孔OD值＜0.1，绵羊阳性对照>1.686(2cut-off值)，牛阳性对照孔>1.504(2cut-off值)，绵羊阴性对照孔＜0.422(cut-off值/2)，牛阴性对照孔＜0.3761(cut-off值/2)；

临界值(cut-off)为0.7523(牛血清)或为0.843(绵羊血清)；

样本OD值≥cut-off值时，判为片形吸虫抗体阳性；

样本OD值＜cut-off值时，判为片形吸虫抗体阴性。

实施例3 ELISA试剂盒

试剂盒包括：已包被片形吸虫可溶性抗原标准液的酶标板和两种HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂；酶标检测抗体为用HRP标记酶标二抗为抗绵羊IgG(Sigma A9452-1VL)二抗或绵羊抗牛IgG二抗(Bio-rad AA123P)；

试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液；

稀释液为pH为7.4的PBS缓冲液；

洗涤液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；

终止液为2M硫酸溶液；

酶底物溶液显色液TMB(碧云天PO209)；

阳性对照为实验室人工感染片形吸虫动物血清(牛/绵羊)；

阴性对照为实验室未感染片形吸虫对照组血清(牛/绵羊)。

实施例4 ELISA试剂盒的抗干扰测试

通过实施例3组装的试剂盒，采用实施例2.1的方法对样品进行检测：样品包括：21份阳性牛血清样本9份真阴性牛血清样本，15份阳性羊血清样本1份阳性兔血清样本，9份感染其他寄生虫绵羊血清(羊包虫n＝2、羊东毕吸虫n＝3、羊捻转线虫n＝4)，5份感染华支睾吸虫兔血清(n＝5)，2份阴性羊血清样本，兔血二抗使用Abcam公司ab6721 1/10000。所有阳性样本来源自实验室人工感染寄生虫动物，阴性样本来自实验室未感染对照组动物。

根据结果显示CL7-ELISA对牛的检测干扰率0％，对绵羊的检测干扰率0％。虽然不能良好鉴别兔华支睾吸虫，但牛羊不是华支睾吸虫宿主。故说明我们建立的CL7ELISA能够良好区分牛和绵羊血清吸虫感染和其他虫感染，具有高特异性，可用于牛绵羊片形吸虫的诊断。

检测结果如表2所示：

表2

实施例5 ELISA试剂盒检测样本案例

1、按照实施例2的方法对实施例1制备的纯化后的重组CL-7抗原进行包被，直接取出已包被CL-7抗原的包被板；

2、加样：取包被了片形吸虫特异性重组抗原CL7的酶标板，在稀释板加入250μL样品稀释液(PBS PH7.4)，再加入2.5μL待测血清(1/200稀释)，检测孔和复孔分别直接加入相应的检测样本以及标准阳性阴性绵羊血清，并且设置空白对照组，在37℃下避光反应60min；

3、洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

4、除空白对照孔外，检测孔和其复孔加入检测样品(来源于河北省不同地区的330份未知绵羊血清)对应的稀释好的酶标的二抗(抗绵羊IgG Sigma A9452-1VL)100μL，振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液，浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

5、显色：每孔加显色液TMB(碧云天PO209)100μL，置37℃下避光显色10min；

6、测定：每孔加终止液(2M硫酸溶液)50μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数。

(7)结果统计

根据检测结果显示河北省9个地区阜平的绵羊吸虫感染率最高达到30％，其他地区感染率均不高主要在2.86％左右。总感染率为4.85％，与最近几年河北省片形吸虫流行病学调查结果相似。

表3

序列表

<110> 扬州大学

<120> 用于片形吸虫病诊断的ELISA检测试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1836

<212> DNA

<213> CL7的基因序列(CL7)

<400> 1

atgcgattgt tcatattagc cgtcctcacg gtcggagtgc ttggctcgaa tgatgatttg 60

tggcatcaat ggaagcgaat gtacaataaa gaatacaatg gggctgacga tgagcacagg 120

cgaaaaattt gggaagagaa tgtgaaacat attcaagaac acaacctacg tcacgatctc 180

ggcctcgtca cctacacatt gggattgaac caattcactg atatgacatt cgaggaattc 240

aaggccaaat atctaaccga aatgccacgc gcgtccgata tactctcaca cgccgtcctc 300

acggtcggag tgcttggctc gaatgatgat ttgtggcatc aatggaagcg aatgtacaat 360

aaagaataca atggggctga cgatgagcac agacgaaata tttgggaaga gaatgtgaaa 420

catattcaag aacacaacct acgtcacgat ctcggcctcg tcacctacac attgggattg 480

aaccaattca ctgatatgac attcgaggaa ttcaaggcca aatatctaac cgaaatgcca 540

cgcgcgtccg atatactctc acacggtatc ccgtatgagg cgaacaaccg tgccgtaccc 600

gacaaaattg actggcgtga atctggttat gtgacggggg tgaaagatca gggaaactgt 660

ggttcctgtt gggctttctc aacaaccggt actatggagg gacagtatat gaaaaacgag 720

agaactagta tttcattctc tgagcaacaa ctggtcgatt gtagcggtcc ttggggaaat 780

aatggttgcg gtggtggatt gatggaaaat gcatatgaat atttgaaaca atttggaata 840

ttagccgtcc tcacggtcgg agtgcttggc tcgaatgatg atttgtggca tcaatggaag 900

cgaatgtaca ataaagaata caatggggct gacgatgagc acagacgaaa tatttgggaa 960

gagaatgtga aacatattca agaacacaac ctacgtcacg atctcggcct cgtcacctac 1020

acattgggat tgaaccaatt cactgatatg acattcgagg aattcaaggc caaatatcta 1080

accgaaatgc cacgcgcgtc cgatatactc tcacacggta tcccgtatga ggcgagcaac 1140

cgtgccgtac ccgacaaaat tgactggcgt gaatctggtt atgtgacggg ggtgaaagat 1200

cagggaaact gtggttcctg ttgggctttc tcaacaaccg gtactatgga gggacagtat 1260

atgaaaaacg agagaactag tatttcattc tctgagcaac aactggtcga ttgtagcggt 1320

ccttggggaa ataatggttg cggtggtgga ttgatggaaa atgcatatga atatttgaaa 1380

caatttggat tggaaaccga atcctcttat ccgtacaggg ctgtggaagg tcagtgtcga 1440

tacaataggc agttgggagt tgccaaagtg actggctact atactttgca ttctggcaat 1500

gaggcaggat tgaaaagttt agtcggttcc gaaggacctg ctgcggtcgc tgtggatgtt 1560

gaatctgact tcatgatgta caggtacgtg cttttatgtc aagaaaccga atcctcttat 1620

ccgtacaggg ctgtggaagg tcagtgtcga tacaataggc agttgggagt tgccaaagtg 1680

actggctact atactttgca ttctggcaat gaggcaggat tgaaaagttt agtcggttcc 1740

gaaggacctg ctgcggtcgc tgtggatgtt gaatctgact tcatgatgta caggtacgtg 1800

cttttatgtc atcggacgag acgaatgata aactaa 1836

<210> 2

<211> 1849

<212> DNA

<213> CL7的优化基因序列(CL7)

<400> 2

ggatccgatg cgtctgttca tcctggcggt gctgaccgtg ggtgttctgg gcagcaacga 60

cgatctgtgg caccagtgga agcgtatgta caacaaagag tataacggtg cggacgatga 120

acaccgtcgt aagatctggg aggaaaacgt gaaacacatt caggagcaca acctgcgtca 180

cgacctgggt ctggttacct acaccctggg cctgaaccaa tttaccgata tgaccttcga 240

ggaatttaag gcgaaatatc tgaccgaaat gccgcgtgcg agcgacattc tgagccacgc 300

ggttttaact gtgggtgttt taggcagcaa tgatgacctg tggcatcaat ggaaacgcat 360

gtataataag gaatacaatg gcgcggatga cgaacaccgt cgtaacattt gggaagaaaa 420

cgtgaagcat atccaagaac ataacctgcg tcatgatctg ggcctggtga cctataccct 480

gggtctgaat caattcaccg acatgacctt tgaagagttt aaggcgaaat acctgaccga 540

gatgccgcgt gcgagcgata tcctgagcca cggtattccg tatgaggcga acaaccgtgc 600

ggtgccggac aagatcgatt ggcgtgaaag cggttacgtg accggcgtta aagatcaggg 660

taactgcggc agctgctggg cgttcagcac caccggtacc atggagggcc aatatatgaa 720

gaacgaacgt accagcatca gctttagcga gcagcaactg gtggattgca gcggtccgtg 780

gggcaacaac ggttgcggtg gcggtctgat ggagaacgcg tacgaatatc tgaaacagtt 840

cggtattctg gcggttctga ccgtgggcgt tctgggtagc aatgatgatc tgtggcacca 900

atggaaacgc atgtacaata aggagtataa cggcgcggat gatgagcacc gtcgtaacat 960

ctgggaagag aatgttaagc atatccaaga acacaacctg cgtcatgacc tgggcctggt 1020

gacctacacc ctgggtctga accagttcac cgacatgacc ttcgaagaat tcaaagcgaa 1080

atacttaact gaaatgccgc gtgcgtctga cattctgagc catggtattc cgtacgaagc 1140

gagcaatcgc gcggttccgg ataaaattga ctggcgcgag agcggctatg ttaccggcgt 1200

taaggaccag ggcaactgcg gtagctgctg ggcgtttagc accaccggca ccatggaagg 1260

tcagtacatg aaaaatgaac gtaccagcat tagcttcagc gaacagcaac tggttgactg 1320

cagcggtccg tggggtaaca acggttgcgg cggtggcctg atggaaaatg cgtatgagta 1380

cctgaagcag ttcggtctgg agaccgaaag cagctacccg tatcgtgcgg tggaaggcca 1440

gtgccgttac aaccgtcaac tgggtgtggc gaaggttacc ggctactata ccctgcacag 1500

cggtaacgag gcgggcctga aaagcctggt tggtagcgaa ggtccggcgg cggtggcggt 1560

tgacgtggag agcgatttta tgatgtaccg ttatgtgctg ctgtgccaag aaaccgagag 1620

cagctatccg taccgtgcgg ttgagggcca atgccgctat aatcgccagc tgggtgtggc 1680

gaaagtgacc ggttattaca ccctgcatag cggtaacgaa gcgggtctga agagcctggt 1740

gggtagcgag ggtccggcgg cggttgcggt ggacgttgaa agcgacttca tgatgtaccg 1800

ttatgttctg ctgtgccacc gtacccgtcg tatgatcaac taactcgag 1849

<210> 3

<211> 611

<212> PRT

<213> CL7的氨基酸序列(CL7)

<400> 3

Met Arg Leu Phe Ile Leu Ala Val Leu Thr Val Gly Val Leu Gly Ser

1 5 10 15

Asn Asp Asp Leu Trp His Gln Trp Lys Arg Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

20 25 30

Asn Gly Ala Asp Asp Glu His Arg Arg Lys Ile Trp Glu Glu Asn Val

35 40 45

Lys His Ile Gln Glu His Asn Leu Arg His Asp Leu Gly Leu Val Thr

50 55 60

Tyr Thr Leu Gly Leu Asn Gln Phe Thr Asp Met Thr Phe Glu Glu Phe

65 70 75 80

Lys Ala Lys Tyr Leu Thr Glu Met Pro Arg Ala Ser Asp Ile Leu Ser

85 90 95

His Ala Val Leu Thr Val Gly Val Leu Gly Ser Asn Asp Asp Leu Trp

100 105 110

His Gln Trp Lys Arg Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Asn Gly Ala Asp Asp

115 120 125

Glu His Arg Arg Asn Ile Trp Glu Glu Asn Val Lys His Ile Gln Glu

130 135 140

His Asn Leu Arg His Asp Leu Gly Leu Val Thr Tyr Thr Leu Gly Leu

145 150 155 160

Asn Gln Phe Thr Asp Met Thr Phe Glu Glu Phe Lys Ala Lys Tyr Leu

165 170 175

Thr Glu Met Pro Arg Ala Ser Asp Ile Leu Ser His Gly Ile Pro Tyr

180 185 190

Glu Ala Asn Asn Arg Ala Val Pro Asp Lys Ile Asp Trp Arg Glu Ser

195 200 205

Gly Tyr Val Thr Gly Val Lys Asp Gln Gly Asn Cys Gly Ser Cys Trp

210 215 220

Ala Phe Ser Thr Thr Gly Thr Met Glu Gly Gln Tyr Met Lys Asn Glu

225 230 235 240

Arg Thr Ser Ile Ser Phe Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Ser Gly

245 250 255

Pro Trp Gly Asn Asn Gly Cys Gly Gly Gly Leu Met Glu Asn Ala Tyr

260 265 270

Glu Tyr Leu Lys Gln Phe Gly Ile Leu Ala Val Leu Thr Val Gly Val

275 280 285

Leu Gly Ser Asn Asp Asp Leu Trp His Gln Trp Lys Arg Met Tyr Asn

290 295 300

Lys Glu Tyr Asn Gly Ala Asp Asp Glu His Arg Arg Asn Ile Trp Glu

305 310 315 320

Glu Asn Val Lys His Ile Gln Glu His Asn Leu Arg His Asp Leu Gly

325 330 335

Leu Val Thr Tyr Thr Leu Gly Leu Asn Gln Phe Thr Asp Met Thr Phe

340 345 350

Glu Glu Phe Lys Ala Lys Tyr Leu Thr Glu Met Pro Arg Ala Ser Asp

355 360 365

Ile Leu Ser His Gly Ile Pro Tyr Glu Ala Ser Asn Arg Ala Val Pro

370 375 380

Asp Lys Ile Asp Trp Arg Glu Ser Gly Tyr Val Thr Gly Val Lys Asp

385 390 395 400

Gln Gly Asn Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Thr Met

405 410 415

Glu Gly Gln Tyr Met Lys Asn Glu Arg Thr Ser Ile Ser Phe Ser Glu

420 425 430

Gln Gln Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Trp Gly Asn Asn Gly Cys Gly

435 440 445

Gly Gly Leu Met Glu Asn Ala Tyr Glu Tyr Leu Lys Gln Phe Gly Leu

450 455 460

Glu Thr Glu Ser Ser Tyr Pro Tyr Arg Ala Val Glu Gly Gln Cys Arg

465 470 475 480

Tyr Asn Arg Gln Leu Gly Val Ala Lys Val Thr Gly Tyr Tyr Thr Leu

485 490 495

His Ser Gly Asn Glu Ala Gly Leu Lys Ser Leu Val Gly Ser Glu Gly

500 505 510

Pro Ala Ala Val Ala Val Asp Val Glu Ser Asp Phe Met Met Tyr Arg

515 520 525

Tyr Val Leu Leu Cys Gln Glu Thr Glu Ser Ser Tyr Pro Tyr Arg Ala

530 535 540

Val Glu Gly Gln Cys Arg Tyr Asn Arg Gln Leu Gly Val Ala Lys Val

545 550 555 560

Thr Gly Tyr Tyr Thr Leu His Ser Gly Asn Glu Ala Gly Leu Lys Ser

565 570 575

Leu Val Gly Ser Glu Gly Pro Ala Ala Val Ala Val Asp Val Glu Ser

580 585 590

Asp Phe Met Met Tyr Arg Tyr Val Leu Leu Cys His Arg Thr Arg Arg

595 600 605

Met Ile Asn

610

Claims (10)

1.一种CL7重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所示的CL7重组蛋白的核酸或基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

3.表达盒、重组载体或重组菌株，其含有权利要求2所述的核酸或基因。

4.权利要求1所述的CL7重组蛋白、权利要求2所述的核酸或基因、权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组菌株在制备检测片形吸虫试剂盒方面的应用。

5.一种用于片形吸虫诊断的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的CL7重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被权利要求1所述的CL7重组蛋白的酶标板和HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述HRP标记酶标二抗为抗绵羊 IgG二抗或绵羊抗牛IgG二抗或山羊抗人IgG。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述其他相配套试剂为样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述CL7重组蛋白的包被浓度为1~50μg/ml。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为感染片形吸虫的绵羊或牛血清，所述阴性对照未感染片形吸虫的绵羊或牛血清。

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