CN112753716A - 一种农药组合物及其在防治黄曲条跳甲方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有金龟子绿僵菌与溴虫腈的农药组合物，还涉及所述农药组合物在防治黄曲条跳甲方面的应用，属于生物农药技术领域。本发明提供一种农药组合物，所述农药组合物的活性成分包括绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与和溴虫腈，所述绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与所述溴虫腈的质量比为1‑80:1，优选质量比为15‑25:1。该农药组合物能够显著减轻和控制黄曲条跳甲的发生和危害，延缓害虫抗性的产生，还能减少化学农药对土壤和环境的污染，改善土壤中微生物群。

Description

一种农药组合物及其在防治黄曲条跳甲方面的应用

技术领域

本发明涉及一种含有金龟子绿僵菌与溴虫腈的农药组合物，还涉及所述农药组合物在防治黄曲条跳甲方面的应用，属于农药技术领域。

背景技术

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)是鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomelidae)害虫，主要为害菜心、白菜、萝卜等十字花科蔬菜。黄曲条跳甲繁殖力强，生活习性复杂，卵、幼虫和蛹生活在土壤中，成虫生活在地面，具有较强的迁移能力；幼虫和成虫都可为害作物，成虫发生重时可食光整株植物，轻则造成叶片孔洞而影响蔬菜卖相；幼虫取食植株根部，危害严重的时候可造成整棵植株死亡；同时成虫和幼虫在取食的过程中还会留下伤口促进软腐病的发生。

黄曲条跳甲的抗逆性强、耐药力高，难以防治，缺乏高效药剂和单一有效防治手段。为了控制其暴发危害，常常过量使用化学农药，造成抗药性增加、天敌减少、环境污染及农产品农药残留量超标等问题。因此，发展和提高生物防治技术水平是控制黄曲条跳甲危害的迫切需要。

近年来，黄曲条跳甲的生物防治取得了一些研究成果，发现了一些真菌和细菌对跳甲有效，如玫烟色棒束孢Isariafumosorosea、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis和粘质沙雷氏菌Serratia marcescens等微生物可侵染黄曲条跳甲。专利申请号CN201510084020.6公开了一种金龟子绿僵菌CQMa421制剂在防治黄曲条跳甲中的应用；何越超等筛选了对黄曲条跳甲有效的绿僵菌Ma6菌株(福建农业学报，2017,(2):189-194)。专利申请号CN201310494943.X公开了一种粘质沙雷氏菌(保藏编号为CGMCCNO.7948)及其应用，专利申请号CN201611253650.2公开了一种苏云金芽胞杆菌(IPPBiotCo1085)及其应用，专利申请号CN201611000946.3公开了一株苏云金芽孢杆菌(保藏编号为CCTCC NO：M 2015608)及制剂与应用；申请(专利)号CN201610276234.8公开了一种含枯草芽孢杆菌的微生物农药及其制备方法。但总体上微生物杀虫剂在跳甲防治应用中仍然存在许多问题，一是成本太高，如用绿僵菌颗粒剂进行土壤处理，每亩每次施用5kg，药剂成本达150元/亩左右；二是效果不理想，对成虫防效偏低且见效较慢；三是可供选择的微生物杀虫剂产品少，适用范围有限。

基于此，发明人认为，兼顾化学药剂的速效性与低成本，利用真菌杀虫剂的环境友好性与持久性，研发真菌与化学农药复配的黄条跳甲防治剂，将可取得更佳的经济、生态与社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以生防真菌与化学药剂复配的农药组合物，所述农药组合物在防治黄曲条跳甲方面有显著的效果，其不仅兼顾化学药剂的速效性与低成本，还利用了真菌杀虫剂的环境友好性与持久性，具备很好的经济、生态与社会效益。

本发明的另一目的是提供一种可湿性粉剂，所述可湿性粉剂的活性成分包括本发明所述的绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与和溴虫腈。

本发明的再一目的是所述的农药组合物或所述的可湿性粉剂在防治十字花科作物黄曲条跳甲发面的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种农药组合物，所述农药组合物的活性成分包括绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与和溴虫腈，所述绿僵菌MaGX19S02菌株的纯孢粉与所述溴虫腈的质量比为1-80:1或其他优选比例。

优选地，所述绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与所述溴虫腈的质量比为15-25:1。

本发明所述的农药组合物，其活性成分溴虫腈和绿僵菌MaGX19S02对黄曲条跳甲均有较高活性，且溴虫腈对绿僵菌MaGX19S02的菌丝生长和孢子萌芽的没有影响。当所述绿僵菌MaGX19S02菌株纯孢子粉与所述溴虫腈按质量比1-80:1混配时，对黄曲条跳甲的防效显著高于单剂使用，特别是当二者质量比为19.8:1时，防效达到89.33％。

优选地，本发明所述农药组合物的剂型为可湿性粉剂、颗粒剂、可分散粒剂、油悬浮剂，可分散油悬浮剂、饵剂和超低容量剂中的至少一种。

更优选地，所述农药组合物的剂型为可湿性粉剂。

另一方面，本发明提供一种可湿性粉剂，所述可湿性粉剂包括本发明所述的活性成分绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉和溴虫腈，还包括助剂。

优选地，所述助剂包括填料、润湿剂、分散剂、稳定剂和紫外保护剂。

优选地，以质量百分比计，本发明所述的可湿性粉剂包括如下组分：15-40％绿僵菌MaGX19S02纯孢粉、1-2％溴虫腈、1-2％润湿剂、12-13％分散剂、1-2％稳定剂、0.5-1.5％紫外保护剂、填料余量。

优选地，以质量百分比计，本发明所述的可湿性粉剂包括如下组分：19％绿僵菌MaGX19S02纯孢粉、1％溴虫腈、1.4％润湿剂、12.6％分散剂、2％稳定剂、1％紫外保护剂、63％填料。

优选地，所述填料为凹凸棒土；所述润湿剂为丁基萘磺酸钠；所述分散剂为MorwetD-425；所述稳定剂为黄原胶；所述紫外保护剂为荧光增白剂33。

再一方面，本发明提供所述的农药组合物或者所述的可湿性粉剂在防治十字花科作物黄曲条跳甲发面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的农药组合物通过生防真菌(绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与)和化学药剂(溴虫腈)以合适的比例复配，能够显著减轻和控制黄曲条跳甲的发生和危害，可延缓害虫抗性的产生，还能减少化学农药对土壤和环境的污染，改善土壤中微生物群；

(2)本发明提供的农药组合物不仅兼顾化学药剂的速效性与低成本，而且利用了真菌杀虫剂的环境友好性与持久性，用于防治黄曲条跳甲，可取得更佳的经济、生态与社会效益。

附图说明

图1为喷施20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液和溴虫腈50mg/L后第1d、7d和14d菜心的生长情况；其中，图1A1、图1A2、图1A3分别为20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液处理菜心后第1d、7d和14d菜心的生长情况，图1B1、图1B2、图1B3分别为溴虫腈50mg/L处理菜心后第1d、7d和14d菜心的生长情况；图1B1、图1B2、图1B3分别为清水处理菜心后第1d、7d和14d菜心的生长情况。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：本发明所述农药组合物活性成分的筛选

(1)真菌菌株对黄曲条跳甲的活性测定(菌株的筛选)

实验方法：选取淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum(菌株PlSC36C8、PlSC36C1、PlSC41A2、PlSC63C7、PlSC59A3、PlSC57B4、PlSC42B5、PlSC37C2、PlSC55C1)、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae(MaGX19S02菌株)和爪哇棒束孢Isaria javanica(IjH6102菌株)进行实验。将斜面菌种接种到PDA培养基上，25℃培养10天，刮取菌落表层分生孢子，使用0.1％吐温-80溶液配置成1.0×10⁸spores/mL孢子悬浮液备用。用CO₂将黄曲条跳甲麻醉，然后转移到1.5mL离心管中，加入1mL备用液，迅速盖好上下颠倒50次，转移到铺有滤纸的一次性塑料碗中，置于26℃，光周期14L:10D，相对湿度95±5％的人工气候箱中饲养。浸泡后的黄曲条跳甲用萝卜饲养，每两天更换一次，同时记录试虫的死亡数。用0.1％吐温-80溶液处理为对照，每处理10头虫，重复三次。使用SPSS 25软件计算分析菌株对黄曲条跳甲的致病力，结果见表1。

表1不同菌株对黄曲条跳甲成虫的致病力

*数据为3次重复的平均值±标准误，每处理黄曲条跳甲成虫10头，同列数据后凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著(Duncan’s法，P>0.05)。下同。

实验结果：由表1的结果可知，淡紫紫孢菌PlSC59A3菌株对黄曲条跳甲的致病力最好，处理后的第9d的校正死亡率为96.30％；绿僵菌MaGX19S02菌株处理9d后黄曲条跳甲后的校正死亡率为80.00％；爪哇棒束孢IjH6102菌株处理9d后的校正死亡率为68.33％。

(2)化学药剂对黄曲条跳甲的毒力测定(化学药剂的筛选)

实验方法：用0.1％吐温-80溶液将10种化学药剂(啶虫脒、唑虫酰胺、溴虫腈、噻虫嗪、丁醚脲、哒螨灵、呋虫胺、噻虫胺、甲维盐和鱼藤酮)配置成10mg/L和100mg/L浓度的溶液备用。用CO₂将黄曲条跳甲麻醉，然后转移到1.5mL离心管中，加入1mL备用液，迅速盖好上下颠倒50次，转移到铺有滤纸的一次性塑料碗中，置于26℃，光周期14L:10D，相对湿度95±5％的人工气候箱中饲养。浸泡后的黄曲条跳甲用萝卜饲养，每天更换一次，同时记录试虫的死亡数。用0.1％吐温-80溶液处理为对照，每处理10头虫，重复三次。使用SPSS25软件计算分析化学药剂对黄曲条跳甲的毒力，结果见表2。

表2化学药剂对黄曲条跳甲成虫的活性

实验结果：由表2的结果可知，10种化学药剂中，大部分化学药剂对黄曲条跳甲均有一定的毒力，其中，溴虫腈100mg/L溶液对黄曲条跳甲毒力较好，48h后致死率达100％。

(3)化学药剂对真菌生长的影响

①化学药剂对三种真菌(淡紫紫孢菌PlSC59A3、绿僵菌MaGX19S02和爪哇棒束孢IjH6102)菌丝生长的影响

实验方法：测试10种化学药剂对三种真菌菌丝生长的影响，将各化学药剂加入高压灭菌后的PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂10-15g,水1000mL)中，分别配制为10mg/L和100mg/L含药培养基平板，接入用5mm打孔器打下培养2天的菌饼，重复3次，放置培养箱中培养7天和14天，测量菌落生长直径(纵横两个方向的平均值)，以不添加化学药剂为对照，结果如表3、表4和表5所示。

表3化学药剂对淡紫紫孢菌PlSC59A3菌株菌丝生长的影响

表4化学药剂对绿僵菌MaGX19S02菌株菌丝生长的影响

表5化学药剂对爪哇棒束孢IjH6102菌株菌丝生长的影响

实验结果：由表3-5的结果可知，唑虫酰胺对3种供试菌株(淡紫紫孢菌PlSC59A3、绿僵菌MaGX19S02和爪哇棒束孢IjH6102)的菌丝生长都有不良影响，丁醚脲和哒螨灵对淡紫紫孢菌的菌丝生长有不良影响，其他药剂对3种供试菌株的菌丝生长影响不明显。

②化学药剂对三种真菌(淡紫紫孢菌PlSC59A3、绿僵菌MaGX19S02和爪哇棒束孢IjH6102)孢子萌发的影响

实验方法：测试各化学药剂对三种真菌孢子萌发的影响，向100mL灭菌的营养液(2％葡萄糖，1％蛋白胨)中加入化学药剂和真菌孢子粉，配置成化学药剂终浓度为10mg/L和100mg/L，菌液为1×10⁶spores/mL的培养液，25±1℃，170r/min摇床中培养12h，重复3次，用血球计数板，记录萌发与未萌发的孢子数，以不加化学试剂的培养液作为对照，计算孢子萌发率，结果如表6所示。

表6化学药剂对3种真菌菌株孢子萌发的影响

实验结果：由表6的结果可知，爪哇棒束孢和淡紫紫孢菌株的孢子萌发率受10种化学药剂影响较大，而绿僵菌受到的影响较小。

综合上述实施例1的实验结果可知，筛选出绿僵菌MaGX19S02菌株和溴虫腈作为本发明农药组合物的有效成份。

实施例2：绿僵菌MaGX19S02菌株分生孢子生产与质量检测

分生孢子生产：取保存的斜面菌种，刮取少量分生孢子接种至PDA平板上，27±1℃培养箱中培养7天，将上述至分生孢子接种到PD种子培养基培养，将种子液接种于袋装大米中进行固体发酵，用孢子分离器收集分生孢子粉，冷冻干燥，质量检测后封装备用。

含水量测定：将洗净的称量瓶在120℃干燥箱中干燥10min,冷却后称重,得称量瓶重m1；取1g左右孢子粉于称量瓶中，称总重m2(精确至0.0001g),然后于120℃干燥箱内烘干2h，盖上瓶盖称重，记为m3。重复3次，计算孢子含水量，取其平均值，结果见表7。可知，纯孢粉含水量为2.15％。

含水量(％)＝(m2-m3)/(m2-m1)×100

含孢量测定：用万分之一天平准确称取干燥后的孢子粉10mg于离心管中，用1mL0.1％Tween-80溶液溶解均匀，于漩涡混合器上充分混合均匀，再将孢子悬浮液稀释100倍，采用血球计数板测定孢子浓度，重复3次，取其平均值，计算孢子粉的含孢量，结果见表7。可知，纯孢粉含孢量为2.36×10¹⁰个分生孢子/g。

孢子萌发率测定：取适量收集的孢子粉10mg置于1mL灭菌的离心管中，取1mL高压灭过菌的0.05％Tween-80溶液溶解混合均匀。将上述孢子悬浮液置于含有100mL灭过菌的萌发液(2％葡萄糖，1％蛋白胨)的250mL三角瓶中，置于25±1℃摇床，170r/min,培养72h；显微镜下记录萌发和未萌发的孢子数(孢子膨胀比原孢子大1倍或芽长度大于孢子半径的即视为萌发)，重复3次，计算孢子萌发率，结果见表7，绿僵菌MaGX19S02菌株纯孢粉萌发率为93.69％。

孢子萌发率(％)＝发芽孢子数/孢子总数×100

表7绿僵菌MaGX19S02菌株纯孢粉质量检测结果

实施例3：绿僵菌MaGX19S02与溴虫腈有效成份配比筛选

实验材料：用0.1％吐温-80溶液将溴虫腈配置成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L浓度的溶液，将实施例2所制备的绿僵菌纯孢粉配置成1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵spores/mL的孢子悬浮液备用。

(1)绿僵菌MaGX19S02与溴虫腈对黄曲条跳甲的毒力测定

实验方法：使用浸虫法测试溴虫腈和绿僵菌纯孢粉对黄曲条跳甲的LC₅₀，用CO₂将黄曲条跳甲麻醉，然后转移到1.5mL离心管中，加入1mL备用液，迅速盖好上下颠倒50次，转移到铺有滤纸的一次性塑料碗中，置于26℃，光周期14L:10D，相对湿度95±5％的人工气候箱中饲养。浸泡后的黄曲条跳甲用萝卜饲养，每两天更换一次，同时记录试虫的死亡数。用0.1％吐温-80溶液处理为对照，每处理10头虫，重复三次。使用SPSS 25软件计算死亡率，结果见表8、表9。

表8不同浓度溴虫腈对黄曲条跳甲成虫的毒力

表9不同浓度绿僵菌MaGX19S02对黄曲条跳甲成虫的致病力

实验结果：由表8、表9的结果可得，溴虫腈浓度高于60mg/L时，对黄曲条跳甲成虫毒力较好，在处理36h后，死亡率达100％；绿僵菌MaGX19S02孢子悬浮液在1×10⁸和1×10⁹spores/mL浓度处理黄曲条跳甲成虫，对黄曲条跳甲致病力较好，第九天时，致死率达60％以上。由SPSS软件分析得出溴虫腈在处理黄曲条跳甲成虫2天时对黄曲条跳甲成虫LC₅₀为52.08mg/L，绿僵菌MaGX19S02在处理黄曲条跳甲成虫9天时对黄曲条跳甲成虫LC₅₀为3.37×10⁷spores/mL。

(2)绿僵菌MaGX19S02与溴虫腈混配对黄曲条跳甲的活性测定

实验方法：配制绿僵菌1×10⁷孢子/ml的孢子悬浮液与溴虫腈50mg/L溶液，将其按一定体积比混合得10mL混配药液，参照前述方法处理黄曲条跳甲成虫。测定结果见表10。

表10绿僵菌与溴虫腈混配对黄曲条跳甲的活性

实验结果：由表10的结果可知，在处理后第7d，当绿僵菌分生孢子与溴虫腈以不同比例混配时，对黄曲条跳甲都显著高于空白对照(CK)与单独处理，特别是当纯孢粉与溴虫腈两者以19.8:1(m/m)混配时，对黄曲条跳甲的致死率最高，达89.33％。

实施例4：绿僵菌纯孢粉和溴虫腈混配可湿性粉剂配方筛选与加工

(1)填料的筛选

填料对绿僵菌孢子萌发的影响：将填料与活性成分(绿僵菌纯孢粉和溴虫腈)以1/1比例混合均匀，在25+1℃培养箱里放置14d之后取10mg，加入无菌的1mL 0.05％Tween-80溶液震荡混合均匀，放入100mL灭菌的营养液(2％葡萄糖，1％蛋白胨)中，放置摇床25+1℃，170r/min，72h后镜检，观察孢子萌发率，重复3次，计算平均数，结果见表11。

填料对绿僵菌菌丝生长的影响：将各填料加入PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10-15g，水1000mL)中，最终浓度为0.03g/mL，高压灭菌，倒入培养皿，凝固后接入用5mm打孔器打下培养2天的菌饼，重复3次，放置培养箱中培养7天和14天，测量菌落生长直径(纵横两个方向的平均值)，以不添加填料对照，结果见表11。

填料比例筛选：将填料/活性成分/十二烷基苯磺酸钠以下列质量分数:54/40/6、64/30/6和74/20/6均匀混合，准确称量样品1g，从烧杯口齐平位置一次均匀倒进盛有100mL水的250mL烧杯液面上，同时计时至样品全部润湿为止，记录润湿时间，重复3次，计算平均值。对照以不加润湿剂十二烷基苯磺酸钠，结果见表12。

表11填料对绿僵菌MaGX19S02菌株生长与孢子萌发的的影响

表12不同填料含量的润湿时间

实验结果：由表11和12的结果可知，凹凸棒土和高岭土对绿僵菌孢子萌发和菌丝生长均无明显抑制作用，但填料为凹凸棒土时，润湿时间更短；因此，本发明可湿性粉剂中的填料优选为凹凸棒土。

(2)润湿剂筛选

实验方法：将各种供试润湿剂以6％的比例加入含20％活性成分的样品中，余下部分填料补充。取上述混合均匀的样品1g，加入100mL灭菌的营养液(2％葡萄糖，1％蛋白胨)中，25+1℃，170r/min摇床中培养72h，重复3次，用血球计数板，记录萌发与未萌发的孢子数，以不加润湿剂的样品作为对照，计算孢子萌发率，结果见表12。

将各润湿剂以6％的比例加入20％孢子粉的样品中，余下部分填料补充，充分混匀。采用万分之一天平称取1g样品，量取自来水100mL,倒入250mL烧杯中，将烧杯置于25+1℃恒温水浴锅中，待温度恒定后，称取适量可湿性粉剂样品，将样品从与烧杯口齐平处位置，一次性均匀的倒在该烧杯液面上，不扰动液面，同时立即用秒表计时，直到样品全部润湿为止，记录润湿时间，如此重复5次，取其平均值，作为该样品的润湿时间，以不加润湿剂的样品为对照，测定润湿时间，比较润湿性，结果见表13。

表13润湿剂的润湿时间及其对分生孢子萌发率的影响

实验结果：由表13的实验结果可知，各润湿剂对绿僵菌孢子萌发无显著差异下，其中，丁基萘磺酸钠润湿性最好；因此，本发明可湿性粉剂中的润湿剂优选为丁基萘磺酸钠。

(3)分散剂的筛选

实验方法：将各分散剂以6％的比例加入含6％丁基萘磺酸钠和20％活性成分的样品中，余下部分填料补充。取上述混合均匀的样品1g，加入100mL灭菌的营养液(2％葡萄糖，1％蛋白胨)中，25+1℃，170r/min摇床中培养72h，重复3次，用血球计数板，记录萌发与未萌发的孢子数，以不加分散剂的样品作为对照，计算孢子萌发率，结果见表14。

将分散剂以6％的比例加入含6％丁基萘磺酸钠和20％活性成分的样品中，余下部分以填料补充，充分混匀，制成待测样品备用。称取500mg样品直按置于盛有250mL自来水30+1℃的量简中，轻轻振摇使试样分散，然后盖上塞子，在1min内上下颠倒30次左右，打开塞子，在常温下静止水浴30min，在10-15s用吸管内将溶液从225mL(9/10)处吸出，操作过程中，不要晃动或搅起量筒内的沉降物，并确保吸管顶端总是在液面几毫米以下，量筒中剩余物即为下悬液，将下悬液倒入已干燥称重的100mL的烧杯中，用少量蒸馏水冲洗量筒，洗液也置倒入烧杯中，将放有下悬液的烧杯放入100C的烘箱中，烘干至恒重，之后取出冷却至室温称重，重复3次，计算悬浮率，结果见表13。

悬浮率(％)＝((m1-m2)/m1)×(10/9)×100

m1：配置悬浮液所取式样中有效成分质量/g；

m2：留在留在量简底部25mL悬浮液中有效成分质量/g。

表14分散剂的悬浮率及其对分生孢子萌发率的影响

实验结果：由表14的结果可知，各分散剂对绿僵菌孢子萌发无显著差异下，MorwetD-425分散性最好；因此，本发明可湿性粉剂中的分散剂优选为Morwet D-425。

(4)润湿剂、分散剂配比的确定

实验方法：将从助剂中筛选出的悬浮性较好的助剂与润湿性较高的助剂两个按照1/9、3/7、5/5、7/3、9/1的比例混合均匀，取上述试样lg，分别测定悬浮率和润湿时间，筛选出复配助剂最佳配比，结果见表15。

表15润湿剂与分散剂配比对悬浮率与润湿时间的影响

实验结果：由表15的结果可知，润湿剂和分散剂比例在1/9时，其悬浮率和润湿性较好。因此，本发明可湿性粉剂中的润湿剂/分散剂(丁基萘磺酸钠/Morewet D-425)比例优选为1/9。

(5)润湿剂、分散剂含量的确定

实验方法：将分散剂与润湿剂按最佳配比，以4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％润湿剂/分散剂比例，20％的活性成分，余下部分填料填充制成1g混合制剂，分别进行悬浮率与润湿时间测定实验。选出悬浮率与润湿时间较好的混合制剂，作为最终助剂的含量，结果见表16。

表16润湿剂+分散剂用量对悬浮率与润湿时间的影响

试验结果：由表16的结果可知，在润湿剂+分散剂使用比例为14％时，润湿性和分散性较好；因此，本发明可湿性粉剂中润湿剂与分散剂总含量优选为14％。

(6)稳定剂的确定

实验方法：将2.0％供试稳定剂分别加入筛选出的润湿剂和分散剂(润湿剂/分散剂为1/9，总用量为14％)中，填料补足至100％，常温储存7天后，以不加稳定剂的制剂作为对照，每处理重复3次，测定孢子的萌发率及悬浮率，结果见表17。

将筛选的湿润剂、分散剂最佳配比及用量，将2.0％的供试稳定剂分别加入到制剂中，以填料补足100％，54℃热贮14d后，以不加稳定剂的制剂作为对照，每处理重复3次。测定其孢子萌发率及悬浮率的变化，从而选择最佳的稳定剂结果见表17。

按筛选的湿润剂、分散剂最佳配比及用量，将筛选出的稳定剂以1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的比例加入到初始制剂中，以白炭黑填料补足100％制成1g样品，综合考虑不同制剂润湿时间、悬浮率和流动性的变化，选择稳定剂的使用量，结果见表18。

表17稳定剂对分生孢子萌发率和悬浮率的影响

表18黄原胶用量对悬浮率和润湿时间的影响

实验结果：由表17的结果可知，常温储存14天和热储14天后，黄原胶对体系的稳定性较好。因此，本发明可湿性粉剂中稳定剂优选为黄原胶。

由表18的结果可知，润湿时间和悬浮率差异均不明显，黄原胶用量为2％时体系悬浮率较好，综合实际情况；因此，本发明可湿性粉剂中稳定剂黄原胶用量优选为2％。

(7)紫外保护剂的确定

取孢子粉10mg于高压灭菌的离心管中，用0.05％吐温水震荡摇匀稀释为浓度为10×10⁶孢子/mL的分生孢子悬浮液，将上述分生孢子悬浮液以30ml分装在5个烧杯中，前四个分别加入荧光素钠、1-羟基苯并***、荧光增白剂33和2-(3,5-二叔戊基-2-羟苯基)苯并***各0.01g，第5个烧杯作为空白对照，然后震荡摇匀，移取0.1ml稀释液，涂布于PDA平板上，每个处理设置3个重复。将所有处理的平板置于25+1C培养箱中培养2d，计算各平板孢子萌发率，结果见表19。

紫外保护剂对孢子粉的保护作用测试：将依照0.5-1.5％的紫外保护剂与上述筛选出的填料、湿润剂、分散剂、稳定剂混合制备可湿性粉剂，分别置于以下四种紫外光照条件下(处理1：254nm，10cm,30min)、(处理2：254nm,10cm,1h)、(处理3：365nm,10cm,30min)、(处理4：365nm，10cm,1h)处理后，25±1℃培养48h后观察孢子萌发率，计算保护剂对孢子的保护性能。以不加任何保护剂为对照，重复3次，结果见表20。

表19紫外保护剂对孢子萌发率的影响

表20紫外保护剂对分生孢子的保护作用

实验结果：由表19的结果可知，四种紫外保护剂对绿僵菌孢子萌发均没有显著抑制。

由表20的结果可知，荧光增白剂33对孢子的保护性能较好，因此，本发明可湿性粉剂的紫外保护剂优选为荧光增白剂33。

(8)20％绿僵菌MaGX19S02分生孢子·溴虫腈可湿性粉剂的配制

20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂配制：按质量分数，取63％凹凸棒土、19％绿僵菌MaGX19S02菌株的纯孢粉、1％溴虫腈、1.4％丁基萘磺酸钠、12.6％Morwet D-425、2％黄原胶和1％荧光增白剂33，准确称取上述配方中各组分，放入搅拌器中充分搅拌均匀。按有关农药制剂标准检测该制剂质量合格，备用。

实施例5：20％绿僵菌MaGX19S02分生孢子·溴虫腈可湿性粉剂在防治黄曲条跳甲中的应用

(1)室内生物活性测定

实验方法：应用上述实施例3中所配制的20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂，将其配置成不同浓度的悬浮液，在实验室条件下浸渍处理黄曲条跳甲，每处理重复三次，每处理试虫数10，处理后连续7天调查黄曲条跳甲的死亡率。不同浓度的可湿性粉剂悬浮液对黄曲条跳甲的校正死亡率如表21。

表21 20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂对黄曲条跳甲致病力

实验结果：由表21的结果可知，使用20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液对黄曲条跳甲致病力效果最好，第7d后对黄曲条跳甲成虫的致死率达93.33％，可湿性粉剂稀释500倍液、1000倍液和1500倍液的黄曲条跳甲成虫死亡率分别为93.33％、50％和40％均优于单独使用绿僵菌纯孢粉的33.33％和单独使用溴虫腈原药的26.67％。

(2)田间药效试验

试验方法：试验设在华南农业大学校内农场，供试作物为生长期的菜心，试验处理分别为实施例3中制作的20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液、溴虫腈(50mg/L)和清水对照，共设三个处理，每处理小区12㎡，每处理重复三次，采用电动喷雾器喷洒试验药剂(空白对照喷洒等量清水)。于处理后1、7、14天每个重复随机选取20株苗调查叶片受害情况。按下列分级方法记录并计算叶片受害指数：

0级：无被害状；

1级：叶片上有零星被害状；

3级：叶片上有三分之一以下面积被害；

5级：叶片上有三分之一或至二分之一面积被害；

7级：叶片上有二分之一至三分之二面积被害；

9级：叶片上有三分之二以上面积被害。

处理叶片受害指数如表22，施药1d、7d和14d的菜心生长情况如图1所示。

表22不同处理对菜心的保苗效果

试验结果：表22的结果显示，施用20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液第7d和第14d后的菜心受害指数分别为38.89和48.89，而施用溴虫腈(50mg/L)第7d和第14d后的菜心受害指数分别为91.11和171.11，由此可见，施药第7d和第14d后，施用20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂500倍液对菜心的保苗效果要远优于单独使用溴虫腈，

图1施药1d、7d和14d的菜心生长情况显示，本发明提供的农药组合物(20％绿僵菌MaGX19S02·溴虫腈可湿性粉剂)对黄曲条跳甲防治效果显著。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种农药组合物，其特征在于，所述农药组合物的活性成分包括绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与和溴虫腈，所述绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与所述溴虫腈的质量比为1-80:1或其他优选比例。

2.如权利要求1所述的农药组合物，其特征在于，所述绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉与所述溴虫腈的质量比为15-25:1。

3.如权利要求1或2所述的农药组合物，其特征在于，所述农药组合物的剂型为可湿性粉剂、颗粒剂、可分散粒剂、油悬浮剂、可分散油悬浮剂、饵剂和超低容量剂中的至少一种。

4.如权利要求3所述的农药组合物，其特征在于，所述农药组合物的剂型为可湿性粉剂。

5.一种可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂包括权利要求1所述的活性成分绿僵菌MaGX19S02的纯孢粉和溴虫腈，还包括助剂。

6.如权利要求5所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述助剂包括填料、润湿剂、分散剂、稳定剂和紫外保护剂。

7.如权利要求6所述的可湿性粉剂，其特征在于，以质量百分比计，所述可湿性粉剂包括如下组分：15-40％绿僵菌MaGX19S02纯孢粉、1-2％溴虫腈、1-2％润湿剂、12-13％分散剂、1-2％稳定剂、0.5-1.5％紫外保护剂、填料余量。

8.如权利要求7所述的可湿性粉剂，其特征在于，以质量百分比计，所述可湿性粉剂包括如下组分：19％绿僵菌MaGX19S02纯孢粉、1％溴虫腈、1.4％润湿剂、12.6％分散剂、2％稳定剂、1％紫外保护剂、63％填料。

9.如权利要求6-8任一所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述填料为凹凸棒土；所述润湿剂为丁基萘磺酸钠；所述分散剂为Morwet D-425；所述稳定剂为黄原胶；所述紫外保护剂为荧光增白剂33。

10.如权利要求1-4任一所述的农药组合物或者如权利要求5-9任一所述的可湿性粉剂在防治十字花科作物黄曲条跳甲方面的应用。

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