CN112745399A - 柚籽多糖提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柚籽多糖提取工艺，包括：将柚子籽粒烘干后粉碎得到柚籽粉，柚籽粉经脱脂处理后采用水提结合酶法，同时辅以超声提取籽多糖，然后得到的粗多糖依次经除蛋白和脱盐处理，最后通过离子交换层析和分子筛层析得到纯化的柚籽多糖。本发明采用脱脂预处理+热水浸提+酶法提取+超声提取，极大地降低了柚籽多糖的提取时间和成本，提高了提取率。本发明将柚子籽粒作为新的多糖资源，具有广阔的利用前景，对于柚子籽粒的深加工以及柚子产业发展具有积极的推动作用。

Description

柚籽多糖提取工艺

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体地说，涉及一种柚籽多糖提取工艺。

背景技术

柚子籽重量约占单果的0.1％～4.0％，其中富含多种天然生物活性成分，如柚子油、黄酮、类柠檬苦素、诺米林等，另含脂肪油、无机盐、蛋白质、粗纤维、多糖以及一些微量元素等。柚籽中的活性成分如柠檬苦素类和黄酮类化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、昆虫拒食等作用，对医药临床、农业生产和农药领域都具有十分重要的意义。在日常生活中，柚子籽大都被丢弃，造成自然资源的浪费。迄今为止，柚子皮多糖已得到了较有效的开发和利用，而对于柚籽多糖的开发利用甚少。柚子籽多糖的提取工艺及其结构、理化性质和生物活性等方面的研究还存在着较多的空白。因此，加大对柚子籽多糖的研究力度，有利于提高柚子副产物的综合利用水平并为提升其加工附加值提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种柚籽多糖提取工艺。

为了实现本发明目的，本发明提供柚籽多糖提取工艺，包括：将柚子籽粒烘干后粉碎得到柚籽粉，柚籽粉经脱脂处理后采用水提结合酶法，同时辅以超声提取籽多糖，然后得到的粗多糖依次经除蛋白和脱盐处理，最后通过离子交换层析和分子筛层析得到纯化的柚籽多糖。

前述的工艺，采用有机溶剂浸提法对柚籽粉进行脱脂处理，所用有机溶剂可选自正己烷、石油醚、丙酮，优选正己烷。

优选地，浸提的温度为160℃。

前述的工艺，将经过脱脂处理后的柚籽粉干燥至恒重，粉碎过60目筛。

前述的工艺，酶法提取使用纤维素酶(柚籽种皮主要成分为纤维素，用纤维素酶可以有针对性地除去纤维素)，脱脂处理后的柚籽粉与纤维素酶的质量比为1∶10。

本发明使用的纤维素酶可来自微生物，如绿色木霉。

优选地，采用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质。Sevag法是利用试剂中的氯仿使蛋白质变性沉淀下来，最后通过离心去除沉淀来将蛋白质去除，对多糖的结构不造成影响，且氯仿溶剂与多糖不相溶，容易去除。若采用其他脱蛋白方法，如蛋白酶法等，蛋白质的脱除效果不理想。例如蛋白酶法是利用酶的特异性将多糖中的蛋白质酶解成氨基酸或多肽，但容易造成酶解不彻底，且酶会残留在多糖中，造成纯化困难。

前述的工艺，除蛋白后的籽多糖溶液进行透析脱盐，所用透析液为去离子水，并采用真空冷冻干燥的方式对透析脱盐后的籽多糖溶液进行干燥。

优选地，真空冷冻干燥的条件为：-80℃干燥36h左右。

前述的工艺，采用阴离子交换柱进行离子交换层析，优选DEAE-Sepharose FastFlow柱，并使用不同浓度的氯化钠溶液进行梯度洗脱，并收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液。阴离子交换柱的工作原理为：将带有负电荷的多糖吸附到柱子上，带有正电荷的多糖被洗脱下来，实现带正负电荷多糖的分离。

前述的工艺，采用葡聚糖凝胶柱进行分子筛层析，优选Sephadex G100柱。分子筛层析主要是对分子量为1000～100000Da的大分子物质进行大小分级，本发明柚籽多糖的分子量在1000～100000Da之间，故可以使用此填料进行分级。

在本发明的一个具体实施方式中，柚籽多糖提取工艺包括以下步骤：

1)样品制备：将柚子籽粒筛选除杂，于50℃烘干至恒重，然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉；

2)脱脂处理：取规格为33mm×80m的滤纸筒，将10.00g柚籽粉加入到上述滤纸筒中，将金属制的滤筒接头安装到滤纸筒上，安装完毕后将滤纸筒扣在样品杆的磁铁环上；量取100mL正己烷于铝制浸提杯中，将浸提杯放置到持杯器上，将浸提杯移入2055索斯特克-阿万提浸提装置(购自丹麦福斯集团公司)中，于160℃恒温浸提22min，正己烷经冷凝后淋洗41.66min，回收溶剂10min；浸提结束后，将固体残渣和滤纸筒置于热风干燥箱中干燥至恒重；然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉末；

3)多糖提取：将1.00g柚籽粉末置于100mL烧杯中，按料液比1∶25加入20％的纤维素酶溶液，调pH至5.0，然后于55℃水浴锅中提取30min，接着在超声功率200w，55℃条件下超声提取25min；然后于90℃水浴锅中浸提30min，冷却至室温后，3000rpm离心10min，取上清液；向上清液中加入上清液体积3倍的95％乙醇，沉淀过夜；然后4000rpm离心10min，收集沉淀，经真空冷冻干燥得到粗多糖；

4)除蛋白：用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质，具体为：用水配制成1.00％的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入粗多糖溶液1/3体积的Sevag试剂，剧烈震荡30min后静置2h，然后4000rpm离心10min，取上清液，重复Sevag法除蛋白，直至无中间蛋白层出现为止；所用Sevag试剂中氯仿和正丁醇的体积比为4∶1；

5)透析脱盐：除蛋白后的籽多糖溶液经减压浓缩，装入透析袋内，在磁力搅拌器作用下，用去离子水在4℃条件下透析8h，每8h换一次水，直至透析后的水电导率与去离子水的电导率一致；透析结束后进行冷冻干燥，得到籽多糖中间品I；所用透析袋的规格为1000Da；

6)阴离子交换柱层析：将籽多糖中间品I用水配制成5mg/mL的多糖溶液，经0.22μm滤膜过滤后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，柱规格为Φ1.5×40cm，上样量10mL，流速为2.0mL/min，用自动收集器收集洗脱液，每10mL收集一管，先用一级水进行洗脱，直到洗脱液没有多糖检出为止；然后依次用0.1M、0.3M和0.5M的氯化钠溶液对层析柱进行梯度洗脱，每个浓度洗脱至洗脱液没有多糖检出为止；收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液，合并多糖单一峰部分(根据洗脱曲线得到一个多糖含量最高的峰值，重复多次洗脱，对峰值的多糖进行多次收集并将收集的多糖合并)，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到籽多糖中间品II；

7)葡聚糖凝胶柱层析：将20mg籽多糖中间品II溶解在4mL蒸馏水中，6000rpm离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤后加至Sephadex G100柱，用蒸馏水洗脱凝胶柱，控制流速为0.2mL/min，每管收集2mL，用苯酚-硫酸法对其多糖含量进行检测；合并属于同一洗脱峰的洗脱液，浓缩后冻干，即得纯化的柚籽多糖。

超声辅助提取法的原理为：利用超声波的空穴作用对细胞造成小空穴从而进行破坏细胞，加速细胞内容物的释放，从而提高有效成分的提取率。此方法具有操作简单、易于控制、时间短、耗能低、效率高和破坏小的优点，常用于多糖的提取。超声波辅助提取的影响因素有：超声时间、超声频率、料液比和温度等。本发明优化了超声波辅助提取的条件，在优化条件下，可得到稳定的多糖提取率。

热水浸提法(水提法)是多糖的传统提取方法，该法利用了多糖的亲水性，用热水浸煮提取或用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，在热力学分子作用力下，植物细胞质壁分离，多糖可透过细胞壁散布于水中。该法得到的多糖提取液可直接离心除去小溶物，或者利用多糖不溶于有机物的性质，用高度乙醇沉淀提纯多糖。热水提取法的影响因素一般有浸取温度、提取次数、提取时间、液料比等。水提取法具有不易破坏多糖的结构，在生产上使用安全、经济等优点，但耗时长，提取效率不高。本发明优化了热水浸提法的工艺，在脱脂处理的前提下，热水浸提加上酶法辅助和超声辅助，大大缩短提取时间并提高提取效率。

酶法辅助提取的原理为：通过细胞自身的酶系或外加酶制剂的催化作用，破坏细胞外层结构，从而促进细胞破碎，加速内容物的流出。在多糖提取中，该法具有条件温和、得率高、用时短且易控制的优点，但酶制剂价格一般偏贵，难回收，温度控制严格，操作成本高，常与其他方法结合用于提取多糖。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等。酶提取法的影响因素有：酶量、酶解温度和时间等。本发明利用超声结合酶法辅助来优化提取工艺，并且优化了酶法提取的工艺条件，使工艺易操作，多糖提取率稳定。

本工艺适合于不同柚子品种的籽多糖提取，特别适合于沙田柚籽多糖的提取。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)由于沙田柚籽粒中的油脂含量超过40％，本发明采用脱脂预处理工艺，可有效去除柚籽中的油脂成分，有利于提高后期多糖的提取效率，且脱除的油脂可进一步加工成精油或其他附加值产品。

(二)本发明采用脱脂预处理+热水浸提+酶法提取+超声提取，极大地降低了提取时间和成本，提高了提取率。特别是辅助超声提取，条件温和，对环境友好，不会破坏酸性多糖或碱性多糖的结构与生物活性，有利于后期除杂及鉴定结构。同时，热水浸提可有效避免超声导致醇提提取率下降的问题。

(三)本发明优化了酶法提取的工艺条件，节约能耗，获得提取率更高的柚籽多糖。

(四)本发明将沙田柚籽作为新的多糖资源，具有广阔的利用前景，对于沙田柚籽的深加工以及沙田柚产业发展具有积极的推动作用。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中脱脂温度对沙田柚籽油脱除率效果的影响。

图2为本发明较佳实施例中浸提时间对沙田柚籽油脱除率效果的影响。

图3为本发明较佳实施例中淋洗时间对柚籽油提取率效果的影响。

图4为本发明较佳实施例中残差概率分布图。

图5为本发明较佳实施例中沙田柚籽油脱除的响应面优化工艺试验结果。

图6为本发明较佳实施例中超声波时间对柚籽多糖提取得率的影响。

图7为本发明较佳实施例中提取时间对柚籽多糖提取得率的影响。

图8为本发明较佳实施例中提取温度对柚籽多糖提取得率的影响。

图9为本发明较佳实施例中料液比对柚籽多糖提取得率的影响。

图10为本发明较佳实施例中酶用量对柚籽多糖提取得率的影响。

图11为本发明较佳实施例中进行正交实验和响应面实验，实验结果通过Design-Expert8.0.6分析，得到酶用量、提取时间、提取温度3个因素之间交互作用的响应面图。

图12为本发明较佳实施例中进行正交实验和响应面实验，实验结果通过Design-Expert8.0.6分析，得到酶用量、提取时间、提取温度3个因素之间交互作用的等高线图。

图13为本发明较佳实施例中热风干燥多糖200×(A)、500×(B)和3000×(C)表面结构图。

图14为本发明较佳实施例中低温真空干燥多糖200×(A)、500×(B)和3000×(C)表面结构图。

图15为本发明较佳实施例中真空冷冻干燥多糖200×(A)、500×(B)和3000×(C)表面结构图。

图16为本发明较佳实施例中粗多糖蛋白质去除效果。

图17为本发明较佳实施例中除蛋白后的籽多糖透析脱盐的结果；在4℃环境下，动态透析10次，每次8h，每次用一级水4.5L，透析后的水电导率与新的去离子水的电导率一样，透析结束后。

图18为本发明较佳实施例中阴离子交换柱层析洗脱曲线。

图19为本发明较佳实施例中葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线。

图20为本发明较佳实施例中沙田柚籽多糖红外光谱图。

其中，图13～图15为扫描电镜下的观察结果。扫描电镜的型号为EVO MA15，购自卡尔·蔡司股份公司(德国)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的纤维素酶购自上海源叶生物科技有限公司，来自绿色木霉，货号为S10041-100g。

2055索斯特克-阿万提浸提装置购自丹麦福斯集团公司，型号为Soxtec 2055。

DEAE-Sepharose Fast Flow柱购自北京博尔西科技有限公司，型号为DEAE-Sepharose FF。

Sephadex G100柱购自北京博尔西科技有限公司。

实施例1沙田柚籽多糖提取工艺

包括以下步骤：

1、样品制备：将沙田柚籽筛选除杂，于50℃烘干至恒重，然后粉碎过20目筛，得到沙田柚籽粉。-20℃贮藏备用。

2、脱脂处理：取规格为33mm×80m的滤纸筒(称重)，将10.00g沙田柚籽粉加入到上述滤纸筒中，将金属制的滤筒接头安装到滤纸筒上，安装完毕后将滤纸筒扣在样品杆的磁铁环上；量取100mL正己烷于铝制浸提杯中，将浸提杯放置到持杯器上，将浸提杯移入2055索斯特克-阿万提浸提装置中，于160℃恒温浸提22min，正己烷经冷凝后淋洗41.66min，回收溶剂10min，浸提结束后，将固体残渣和滤纸筒置于热风干燥箱中干燥至恒重；然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉末。

3、多糖提取：将1.00g柚籽粉末置于100mL烧杯中，按料液比1∶25加入20％的纤维素酶溶液，调pH至5.0，然后于55℃水浴锅中提取30min，接着在超声功率200w，55℃条件下超声提取25min；然后于90℃水浴锅中浸提30min，冷却至室温后，3000rpm离心10min，取上清液；向上清液中加入上清液体积3倍的95％乙醇(如上清液有10ml，则加入30ml乙醇)，沉淀过夜；次日将样品在4000rpm离心10min，收集沉淀，真空冷冻干燥24h后取出备用，即为粗多糖。

4、除蛋白：用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质，具体为：用水配制成1.00％的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入粗多糖溶液1/3体积的Sevag试剂(氯仿和正丁醇体积比4∶1)，剧烈震荡30min后静置2h，然后4000rpm离心10min；将上清液转移至新的离心管中，重复上述过程，直至无中间蛋白层出现为止。

沙田柚籽多糖制备中去除蛋白工艺的优化，如图16所示，采用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质，在第8次使用Sevag试剂时，肉眼观察没有蛋白质沉淀出现，因此不再进行后续去蛋白工作，且第8次蛋白质去除率较好，多糖损失率也不高。

5、透析脱盐：除蛋白后的籽多糖溶液经减压浓缩，装入透析袋(规格1000Da)内，在磁力搅拌器作用下，用去离子水在4℃条件下透析8h，每8h换一次水，每次换水前测定透析后水的电导率和透析前加入的去离子水电导率，重复多次换水，直至透析后的水电导率与去离子水的电导率一致(图17)；透析结束后进行真空冷冻干燥，得到籽多糖中间品I。

6、阴离子交换柱层析：将籽多糖中间品I用水配制成5mg/mL的多糖溶液，经0.22μm滤膜过滤后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，柱规格为Φ1.5×40cm，上样量10mL，流速为2.0mL/min，用自动收集器收集洗脱液，每10mL收集一管，先用一级水进行洗脱，直到洗脱液采用苯酚-硫酸法测得吸光值接近清水对照为止；然后依次用0.1M、0.3M和0.5M的氯化钠溶液对层析柱进行梯度洗脱，每个浓度洗脱至洗脱液没有多糖检出为止；收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液，合并多糖单一峰部分(图18)，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到籽多糖中间品II。

7、葡聚糖凝胶柱层析：将20mg籽多糖中间品II溶解在4mL蒸馏水中，6000rpm离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤后加至Sephadex G100柱，用蒸馏水洗脱凝胶柱，控制流速为0.2mL/min，每管收集2mL，用苯酚-硫酸法对其多糖含量进行检测；合并属于同一洗脱峰的洗脱液(图19)，浓缩后冻干，即得纯化的沙田柚籽多糖。

所得沙田柚籽多糖红外光谱图见图20。

实施例2沙田柚籽脱除油脂工艺的优化

1、沙田柚籽油脂脱除率的测定

称量33mm×80m的滤纸筒的重量为m₁，将经过预处理后的沙田柚籽粉末加入到已经称重的滤纸筒中，记录重量为m₂，将金属制的滤筒接头安装到滤纸筒上，安装完毕后将滤纸筒扣在样品杆的磁铁环上。用量筒取100mL的有机溶剂于铝制浸提杯中，将浸提杯放置到持杯器上，将浸提杯移入2055索斯特克-阿万提浸提装置中，设置浸提温度135℃恒温下，设置浸提时间为15min，淋洗时间为30min，回收溶剂时间为10min，浸提结束后，将固体残渣与滤纸筒放置在热风干燥箱中干燥至恒重，称重为m₃。

根据公式(1)，得到公式(2)：

其中，m₁为滤纸筒重量；m₂为滤纸筒重量加沙田柚籽粉末的重量；m₃为滤纸筒重量加脱脂后的沙田柚籽粉末的重量。

1.1试验设计

样品制备：沙田柚籽经挑选出来后，人工将果肉和树枝杂草筛选去除，放置到50℃的恒温干燥箱中烘干12h至恒重。干燥后的沙田柚籽经高速粉碎机粉碎成粉末状。人工用20目的目筛将沙田柚籽粉末中直径大于1.27mm的杂质去除，最后密封放置到-20℃冰箱中贮藏备用。

1.2沙田柚籽油脂脱除的单因素试验设计

1.2.1最佳溶剂的选择

作为脱除沙田柚籽油脂的理想溶剂应具备对油脂的溶解性好、选择性好、物理化学性质稳定、无腐蚀性、无毒性、沸点低、易于回收、价格低廉、来源广泛等特性。本实验选择分析纯的石油醚、正己烷、苯、二甲苯和丙酮作为考察溶剂。分别用这5种溶剂进行脱除，通过对比这5种溶剂的脱除效果，筛选出适合沙田柚籽油脂脱除的溶剂，重复三次平行试验。

由表1可以看出提取溶剂的脱除率由高至低分别是苯、正己烷、石油醚、丙酮、二甲苯。由于苯含有一定毒性，不能应用于饲料和食品中，故选取提脱除率较多的正己烷为脱除溶剂。因此，在后续实验中，均选用正己烷作为脱除柚籽油的溶剂。

表1 溶剂对柚籽油提取得率效果的影响

1.2.2最佳脱脂温度的选择

以正己烷为脱除浸提溶剂，准确称取5.00g处理后的沙田柚籽粉末加入到滤纸筒中，按照上述2055索斯特克-阿万提脱除沙田柚籽油脂的方法，在料液比1∶10，浸提时间15min，淋洗时间30min的条件下，探讨不同脱脂温度对沙田柚籽油脂脱除率的影响。

1.2.3最佳浸提时间的选择

以正己烷为脱除浸提溶剂，准确称取5.00g处理后的沙田柚籽粉末加入到滤纸筒中，按照上述2055索斯特克-阿万提脱除沙田柚籽油脂的方法，在料液比1∶10，脱脂温度135℃，淋洗时间30min的条件下，探讨不同浸提时间对沙田柚籽油脂脱除率的影响。

1.2.4最佳淋洗时间的选择

以正己烷为脱除浸提溶剂，准确称取5.00g处理后的沙田柚籽粉末加入到滤纸筒中，按照上述2055索斯特克-阿万提脱除沙田柚籽油脂的方法，在料液比1∶10，脱脂温度135℃，浸提时间15min的条件下，探讨不同淋洗时间对沙田柚籽油脂脱除率的影响。

1.3沙田柚籽油脱除的响应面优化工艺试验设计

该试验基于单因素试验的结果，使用Design-Expert.V8.0.6软件中的Box-Behnken进行响应面优化试验设计。选取脱脂温度(A)、浸提时间(B)、淋洗时间(C)3个对沙田柚籽油脂脱除效果有影响的试验因素为自变量，分别以1、0、-1对每个自变量的高、中、低实验水平进行编码。以沙田柚籽油脂脱除率(Y)为响应值，建立三因素三水平BBD响应面试验研究，利用Design-Expert.V8.0.6软件对实验结果进行数据处理分析，得到最优的索氏阿万提法脱除沙田柚籽油脂的工艺参数。

1.4结果与分析

1.4.1单因素试验结果分析

(1)脱脂温度对沙田柚籽油脂脱除率效果的影响

固定沙田柚籽粉的样品质量为5.00g，料液比1∶10，浸提时间15min，淋洗时间30min的条件下，改变脱脂温度，分别设置125℃、135℃、145℃、155℃、165℃，探讨不同脱脂温度对沙田柚籽油的脱除的影响。由图1可知，随着温度升高，沙田柚籽油脂的脱除率缓慢增加。这是因为随着温度的升高，油脂分子的动能增加，加速了油脂分子的运动，大大推动了扩散作用，所以温度的升高会增大提取速率，使脱除率也有一定的提高。但当脱脂温度到达155℃后，沙田柚籽油脂脱除率不再随温度的升高而增加。这是由于绝大部分油脂分子热运动加剧到一定程度时会冲破细胞壁的束缚扩散到溶剂中，此时即使继续升高温度也很难使提脱除率进一步提高。因此选择155℃作为脱除温度。

(2)浸提时间对沙田柚籽油脂脱除率效果的影响

固定沙田柚籽粉的样品质量为5.00g，料液比1∶10，脱脂温度135℃，淋洗时间30min的条件下，改变浸提时间，分别设置5min、10min、15min、20min、25min，探讨不同浸提时间对沙田柚籽油脂的脱除率的影响。由图2可知，随着浸提时间的延长，沙田柚籽油的脱除率增加明显，这是由于随着浸提时间的延长，扩散到提取溶剂中的油脂逐渐增多，当浸提时间达到20min时，沙田柚籽油的提取得率增加缓慢，考虑到提取效率，故选择20min作为浸提时间。

(3)淋洗时间对沙田柚籽油脂脱除率效果的影响

固定沙田柚籽粉的样品质量为5.00g，料液比1∶10，脱脂温度135℃，浸提时间15min的条件下，改变淋洗时间，分别设置10min、20min、30min、40min、50min，探讨不同淋洗时间对沙田柚籽油的提取率的影响。由图3可知，随着淋洗时间的增长，扩散到提取溶剂的油脂逐渐增多，当淋洗时间达到40min后，沙田柚籽油提取得率增加缓慢，考虑到提取效率，选择40min作为淋洗时间。

1.4.2 CCD优化结果分析

(1)各因素组合结果分析

为了进一步优化阿万提脱除沙田柚籽油的工艺参数，通过单因素试验结果确定提取温度(A)、浸提时间(B)和淋洗时间(C)的单因素最佳条件分别为155℃、20min和40min。以1、0、-1对每个自变量的高、中、低实验水平进行编码，设计了3因素3水平的试验设计表，以沙田柚籽油的提取率(R)为响应值进行Box-Behnken试验。各因素水平编码值如表2所示。

表2 Box-Behnken试验因素与水平

本实施例包括两种类型的17个试验点，第一类为析因点，是自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点，析因点共有12个。第二类为位于区域中心的各自变量均为零水平的重复试验点，用来检验回归方程与中心试验点的拟合情况，同时可以提供剩余自由度，以提高试验的精度，本实施例设计的零点实验重复5次，响应面试验设计与试验结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验设计及其结果

(2)模型的构建与分析

利用Design experV8.0.6对CCD试验组合中的响应结果进行多元二次回归分析，分析结果见表4。由表4可知，模型F＝278.75＞F0.05(14，14)＝2.48，p＜0.0001，证明试验的二次多项模型具有极显著性。A、B和C因子的p值均小于0.05，说明A、B和C是影响沙田柚籽油脂脱除工艺的显著因素，在总的作用因素下，C项的F值最大，其影响最显著。回归方程的AB交互项、AC交互项和BC交互项的p值均小于0.05，说明各个因子对响应值的影响不是简单的线性关系，各因子交互作用对沙田柚籽油脂脱除工艺有显著影响。其中，失拟项F＝13.23，p＝0.0512＞0.05，在α＝0.05水平上不显著。模型R²＝0.9972，校正系数R² _Adj＝0.9936，说明99.36％的试验响应值可以用该模型进行解释。由图4残差概率分布图可见，残差概率分布在同一条直线上，说明模型的拟合性较好，能很好地描述试验结果，可用该模型来分析和预测沙田柚籽油脂脱除的工艺结果。

表4 回归方程各项的方差分析表

(3)单因素及交互作用分析

①每个响应面分析图分别代表着独立变量之间的相互作用，此时第三个变量保持在最佳水平。

②每个等高线图中，椭圆形区域中心柚籽油的提取率达到最高，等高线图越趋于椭圆形表明交互作用越显著，越趋于圆形表明交互作用越不显著。

③从响应面分析图(图5)可以看出，A、B和C因素都对沙田柚籽油提取率影响显著，表现为曲线陡峭，随着不同因素的增加或减小，响应值变化较大，

④等高线图可看出等高线图形趋于椭圆形，说明各因素的交互作用对沙田柚籽油的提取率影响显著。

1.4.3模型的验证

为了验证模型的适应性，根据上述实验模型所确定的最优参数为：温度160℃、浸提时间22分钟、淋洗时间41.66分钟，重复3次实验，结果为44.63％、44.52％和44.67％，得到提取率平均值为44.61％与预测值44.85％相差0.24％，表明该模型较好地预测了了实际沙田柚籽提取率的情况，由此可见试验结果表明回归模型真实可靠。得到的方程如下：

R1＝44.64+1.41A+1.65B+1.82C+0.65AB+0.8AC+0.53BC-2.51A2-2.11B2-2.38C2实施例3沙田柚籽多糖提取工艺的优化

1.1标准曲线绘制

准确称取120℃干燥恒重的葡萄糖10mg，置100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，得到浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。精密量取标准溶液各0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml置于10ml容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至2ml，再分别加入1.0ml体积分数5％的苯酚溶液及7ml的浓硫酸溶液，摇匀，水浴加热25℃，冷却至室温，在490nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。

1.2多糖的提取

准确称取1.00g沙田柚籽粉末，置于100mL烧杯中，按料液比1∶25加入2％的纤维素酶溶液，调pH至5.0后，置于50℃的水浴锅中提取30min，水浴后利用超声波在功率200w、50℃条件下提取5min，超声波处理后置于90℃水浴锅中灭酶10min，冷却至室温。在3000rpm转速下离心10min后提取上清液，加入原体积3倍(上清液10ml，则加入30ml乙醇)的95％的乙醇，沉淀过夜。次日将样品在4000rpm转速下离心10min后取沉淀得到粗多糖。

1.3多糖提取率的测定

采用苯酚-硫酸法。加超纯水将粗多糖定容到250ml后，取多糖液1.0ml到10ml试管中，加入蒸馏水定容至2ml，再分别加入1.0ml体积分数5％的苯酚溶液及7ml的浓硫酸溶液，摇匀，置于加水的烧杯中，100℃沸水浴加热15min后，迅速冷却至室温，在490nm处测定吸光度值。试验重复3次，取平均值。根据标准曲线回归方程计算多糖浓度，多糖提取率公式如下：

1.4试验设计

1.4.1沙田柚籽多糖提取的单因素试验设计

采用超声波和酶制剂对多糖辅助提取时，影响多糖的绿的关键因素包括：超声波时间、提取时间、提取温度、料液比和酶用量。

1.4.2超声波时间对沙田柚籽多糖得率的影响

将提取时间、提取温度、料液比、酶用量分别设为30min、50℃、1∶25、5％，超声波时间依次为5min、10min、15min、20min、25min，比较在不同超声波时间下柚籽多糖得率的差异。

1.4.3水提时间对沙田柚籽多糖得率的影响

将超声波时间、提取温度、料液比、酶用量分别设为5min、50℃、1∶25、5％，提取时间依次为30min、40min、50min、60min、70min，比较在不同提取时间下柚籽多糖得率的差异。

1.4.4水提温度对沙田柚籽多糖得率的影响

将超声波时间、提取时间、料液比、酶用量分别设为5min、30min、1∶25、5％，提取温度依次为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，比较在不同提取温度下柚籽多糖得率的差异。

1.4.5料液比对沙田柚籽多糖得率的影响

将超声波时间、提取时间、提取温度、酶用量分别设为5min、30min、50℃、5％，料液比依次为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45，比较在不同料液比下柚籽多糖得率的差异。

1.4.6酶用量对沙田柚籽多糖得率的影响

将超声波时间、提取时间、提取温度、料液比分别设为5min、30min、50℃、1∶25，酶用量依次为0％、5％、10％、15％、25％，比较不用酶用量下柚籽多糖得率的差异。

1.5沙田柚籽多糖提取的PBD试验优化设计

在单因素试验的基础上，以柚籽多糖得率为响应值，应用软件Design-Expert8.0对影响柚籽得率的超声波时间、提取时间、提取温度、料液比和酶用量5个因素各设两个水平，进行二水平的PBD试验设计，因素水平表见表5。

表5 PBD试验设计

1.6沙田柚籽多糖提取的BBD试验优化设计

根据PBD试验设计原理，以柚籽多糖得率为响应值，应用软件Design-Expert8.0进行三因素三水平的响应面试验设计，因素水平编码见表6。

表6 BBD试验设计

1.7结果与分析

1.7.1单因素试验结果分析

(1)超声波时间对柚籽多糖提取得率的影响，结果见图6。

(2)提取时间对柚籽多糖提取得率的影响，结果见图7。

(3)提取温度对柚籽多糖提取得率的影响，结果见图8。

(4)料液比对柚籽多糖提取得率的影响，结果见图9。

(5)酶用量对柚籽多糖提取得率的影响，结果见图10。

1.7.2 PBD试验优化结果分析

(1)各因素组合结果分析

根据PBD试验原理，筛选对多糖提取率有显著影响的5个因素，试验设计及结果见表7。

表7 试验设计及结果

(2)模型的构建与分析

利用Desig-Expert 8.0.6对表8进行数据处理及回归分析，得到表8的方差分析结果。经修正不显著项后，各因素对多谈提取率影响的一次回归方程为Y＝87.13+1.95A-2.23B+1.52C，回归方程P＝0.0030，差异高度显著(P＜0.01)，模型R²＝0.9209，校正系数R² _Adj＝0.8551，说明85.51％的试验响应值可以用该模型进行解释，且该模型具有良好的拟合度。

表8 数据处理及回归分析

注：-差异不显著；*，P＜0.05，差异显著；**，P＜0.01，差异高度显著；***，P＜0.001，差异极显著。

(3)BBD试验因素的选择

酶用量和提取时间对柚籽多糖提取率的影响高度显著，提取温度对柚籽多糖提取率的影响显著；超声波时间和料液比对柚籽多糖提取率的影响不显著。因此，选择对柚籽多糖提取率影响显著的3个因素，固定超声波时间和料液比为20min和1∶25，进行BBD试验。经Desig-Expert 8.0.6数据分析，预测A为25％，B为40min，C为90℃。

1.7.3 BBD试验优化结果分析

(1)各因素组合结果分析

根据PBD试验结果及BBD试验原理，以酶用量、提取时间、提取温度为自变量，杀菌率为响应值，进行BBD试验设计。设计结果见表9。

表9 BBD试验设计

(2)模型的构建与分析

利用Design-Expert8.0.6对表9进行数据分析及回归分析，得到表10的方差分析结果。该模型P＜0.001，差异极显著，失拟项P＝0.072＞0.05，差异不显著，模型R²＝0.9925，校正系数R2_Adj＝0.9829，预测值R² _pred＝0.902，即98.29％的试验响应值可以用该模型进行解释，且该模型具有良好的拟合度，因此可以用该模型进行分析及预测沙田柚籽多糖提取率的变化。

表10 方差分析结果

注：-差异不显著；*，P＜0.05，差异显著；**，P＜0.01，差异高度显著；***，P＜0.001，差异极显著。

由表10可知，一次项对提取率的影响程度由大到小依次为提取时间(极显著)、提取温度(显著)、酶用量(不显著)，且酶用量与提取时间、提取时间与提取温度存在显著的交互作用。经修正不显著项后，得到二次多项回归方程如下：

Y＝22.42+0.45A+2.33B+1.38C-1.01AB-0.12AC+1.1BC-4.46A²+1.41B²-9.32C²。

(3)响应面交互作用分析

通过Design-Expert8.0.6分析，得到酶用量、提取时间、提取温度3个因素之间交互作用的响应面图和等高线图。

由图11可见，提取温度90℃时，提取时间和酶用量对沙田柚籽多糖提取率影响的等高线图为椭圆形，较密集，说明提取时间和酶用量交互作用显著。固定酶用量，随着我去时间的升高，响应值逐渐增大，但曲面弧度增加较缓。固定提取时间，随着酶用量的改变，响应值先急剧增大而后缓慢减小，酶用量21.25％时，提取率最高。

由图12可见，酶用量为25％时，提取温度和提取时间对提取率的影响等高线为椭圆形，较密集，说明提取时间和提取温度交互作用显著。固定提取时间，随着提取温度的升高，响应面先增大后减小，87.5℃时，提取率最高。固定提取温度，随着提取时间的延长，响应面逐渐增大，40min时，提取率最高。

1.7.4模型验证

对数据进行多元二次回归分析，得到柚籽多糖的最佳提取条件，在优化出的最佳条件下，对柚籽多糖进行提取，计算多糖得率。分析实测值和模型预测值有无统计学差异。

通过Design-Expert8.0.6对模型优化分析，得到优化工艺条件为酶用量20％、提取温度50min、提取温度95℃。提取率预测值为22.418％。在优化条件下，固定超声波时间为20min，料液比为1∶25，进行3次重复验证实验，得到提取率为22.72％，与BBD预测结果基本一致，说明BBD优化条件具有可靠性，该模型具有实用价值。

实施例4沙田柚籽多糖制备中干燥方式的优化

分别采用热风干燥、低温真空干燥和真空冷冻干燥对步骤5(透析脱盐)所得籽多糖中间品I的干燥方式进行优化。具体如下：

1.热风干燥(60℃下干燥18h)：多糖颜色呈米白色薄片状、颗粒可轻易被手指捏碎、表面粗糙度较大、表面结构较松散、呈断裂片状、内部通透性较差(图13，A～C)。

2.低温真空干燥(30℃下干燥18h)：多糖颜色呈淡黄色薄片状、轻轻摇动可见细屑飞起、表面粗糙度较小、表面呈堆叠片状结构、内部通透性一般(图14，A～C)。

3.真空冷冻干燥(-80℃下干燥36h)：多糖颜色呈雪白色薄片状、颗粒有轻微韧性易揉成团、表面较光滑、表面呈丝状相连、内部通透性最佳(图15，A～C)。

最终将真空冷冻干燥作为最佳干燥方式。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.柚籽多糖提取工艺，其特征在于，包括：将柚子籽粒烘干后粉碎得到柚籽粉，柚籽粉经脱脂处理后采用水提结合酶法，同时辅以超声提取籽多糖，然后得到的粗多糖依次经除蛋白和脱盐处理，最后通过离子交换层析和分子筛层析得到纯化的柚籽多糖。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，采用有机溶剂浸提法对柚籽粉进行脱脂处理，所用有机溶剂选自正己烷、石油醚、丙酮；优选正己烷。

3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，浸提的温度为160℃。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，将经过脱脂处理后的柚籽粉干燥至恒重，粉碎过60目筛。

5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，酶法提取使用纤维素酶，脱脂处理后的柚籽粉与纤维素酶的质量比为1∶10。

6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，采用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质。

7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，除蛋白后的籽多糖溶液进行透析脱盐，所用透析液为去离子水，并采用真空冷冻干燥的方式对透析脱盐后的籽多糖溶液进行干燥。

8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，采用阴离子交换柱进行离子交换层析，优选DEAE-Sepharose Fast Flow柱，并使用不同浓度的氯化钠溶液进行梯度洗脱，并收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液。

9.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，采用葡聚糖凝胶柱进行分子筛层析，优选Sephadex G100柱。

10.根据权利要求1-9任一项所述的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品制备：将柚子籽粒筛选除杂，于50℃烘干至恒重，然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉；

2)脱脂处理：取规格为33mm×80m的滤纸筒，将10.00g柚籽粉加入到上述滤纸筒中，将金属制的滤筒接头安装到滤纸筒上，安装完毕后将滤纸筒扣在样品杆的磁铁环上；量取100mL正己烷于铝制浸提杯中，将浸提杯放置到持杯器上，将浸提杯移入2055索斯特克-阿万提浸提装置中，于160℃恒温浸提22min，正己烷经冷凝后淋洗41.66min，回收溶剂10min；浸提结束后，将固体残渣和滤纸筒置于热风干燥箱中干燥至恒重；然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉末；

3)多糖提取：将1.00g柚籽粉末置于100mL烧杯中，按料液比1∶25加入20％的纤维素酶溶液，调pH至5.0，然后于55℃水浴锅中提取30min，接着在超声功率200w，55℃条件下超声提取25min；然后于90℃水浴锅中浸提30min，冷却至室温后，3000rpm离心10min，取上清液；向上清液中加入上清液体积3倍的95％乙醇，沉淀过夜；然后4000rpm离心10min，收集沉淀，经真空冷冻干燥得到粗多糖；

4)除蛋白：用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质，具体为：用水配制成1.00％的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入粗多糖溶液1/3体积的Sevag试剂，剧烈震荡30min后静置2h，然后4000rpm离心10min，取上清液，重复Sevag法除蛋白，直至无中间蛋白层出现为止；所用Sevag试剂中氯仿和正丁醇的体积比为4∶1；

5)透析脱盐：除蛋白后的籽多糖溶液经减压浓缩，装入透析袋内，在磁力搅拌器作用下，用去离子水在4℃条件下透析8h，每8h换一次水，直至透析后的水电导率与去离子水的电导率一致；透析结束后进行冷冻干燥，得到籽多糖中间品I；所用透析袋的规格为1000Da；

6)阴离子交换柱层析：将籽多糖中间品I用水配制成5mg/mL的多糖溶液，经0.22μm滤膜过滤后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，柱规格为Φ1.5×40cm，上样量10mL，流速为2.0mL/min，用自动收集器收集洗脱液，每10mL收集一管，先用一级水进行洗脱，直到洗脱液没有多糖检出为止；然后依次用0.1M、0.3M和0.5M的氯化钠溶液对层析柱进行梯度洗脱，每个浓度洗脱至洗脱液没有多糖检出为止；收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液，合并多糖单一峰部分，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到籽多糖中间品II；

7)葡聚糖凝胶柱层析：将20mg籽多糖中间品II溶解在4mL蒸馏水中，6000rpm离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤后加至Sephadex G100柱，用蒸馏水洗脱凝胶柱，控制流速为0.2mL/min，每管收集2mL，用苯酚-硫酸法对其多糖含量进行检测；合并属于同一洗脱峰的洗脱液，浓缩后冻干，即得纯化的柚籽多糖。

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