CN112730563A - 一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法 - Google Patents
一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及了一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,包括以下步骤:采用水热法制备过双金属包裹的氨基化双锥形金属材料,利用还原剂,在金属材料表面生长双金属纳米粒子,制得氨基化双锥形金属材料@双金属纳米材料,通过水热法合成超薄带状纳米材料,通过金氨键将上述纳米材料修饰至金电极表面得到氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/金电极,体外形成DNA双链结构,通过信号分子的响应变化指示样品中磺胺喹喔啉的含量,得到了用于磺胺喹喔啉检测的基于内循环放大策略的电化学适体传感器。同其它用于磺胺喹喔啉含量检测的电化学传感器相比,所制备的基于内循环放大策略的电化学适体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,尤其涉及一种氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/金电极制备方法。
背景技术
现如今,人们对物质生活的需求已从解决温饱的基本需要,逐渐提升到饮食结构,饮食质量的科学层面上来。动物性食品因富含优质蛋白,已在人类日常食物中占有不小的比例。广阔的消费市场促进了畜牧业的发展,同时带来了食品安全隐患。磺胺喹喔啉是一种人工合成化学抗菌药,对畜禽消化道细菌性疾病和球虫病有很好的疗效,同时又是禽畜生长促进剂,具有抗菌谱较广,性质稳定,生产不以粮食作为原料,价格低廉等优点。但是,由于其在动物体内的残留作用及较长的代谢时间,很容易导致动物体内兽药残留超标。若大量食用含有磺胺喹喔啉药物残留的食物,人体患癌症的风险将大大增加,也会影响肠道细菌,导致消化***、泌尿***产生功能障碍。此外,磺胺喹喔啉的残留会使致病菌产生耐药性,耐药菌的病原体可能会通过食物链转移人类体内,将导致抗生素的治疗率下降,发病率、死亡率上升。同时动物体内的磺胺类药物残留会伴随动物粪便排至自然环境,对养殖场周围土壤环境和水源造成污染。中国、美国、欧盟国家等国家均规定动物性食品中磺胺类药物最大残留量为100 μg/kg。目前检测食品中磺胺喹喔啉的方法主要有液相色谱-串联质谱、高效液相色谱等,这些方法虽然具有很高的灵敏度和准确度,但需要大型昂贵的仪器设备,且样品前处理程序复杂,分析程序复杂,检测周期长,需要专业的技术人员,不适合基层单位的推广和使用,因此,急需发展检测速度快、仪器设备简单易操作、成本低、适合现场检测的方法用于肉制品中磺胺喹喔啉含量的快速检测。基于适配体的电化学电化学传感器灵敏度高、检测快捷、样品使用量少,抗干扰能力强,重现性低,成本低,因其操作简单更容易实现自动化,更为重要的是便携性高,适合现场检测和大批样品筛选检测,几乎具备上述方法所有优点,是极为重要的快速检测法。目前,设计并合成氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料,并将上述复合纳米材料作为信号放大材料构建内循环放大策略的电化学适体传感器用于磺胺喹喔啉的检测尚未见报道。
发明内容
本发明涉及一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法。
一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
所述氨基化双锥形金属材料@双金属材料的制备:采用水热合成法合成氨基化双锥形金属材料A,称取40~60 mg金属氯化物与30~50 mg的氨基官能化试剂加入10~30mL有机溶剂中,在室温下转移至高压釜中,再加入10~30 μL的水,密封放入烘箱,60~120 ℃恒温加热12~24 h,放置2~4 h,在8000~10000 rpm转速下离心4~7 min,用水和乙醇洗涤,50~80 ℃干燥6~12 h后得到氨基化双锥形金属材料A;用表面生长法在氨基化双锥形金属材料A表面生长双金属,将0.5~1.0 mL的贵金属a溶液(1~3%)和0.5~1.0 mL的贵金属b溶液(1~3%)添加至1~3 mL的氨基化双锥形金属材料(1~3 mg mL-1)中,然后在600~800 rpm转速下搅拌1~2h,将2~4 mL的还原剂(0.1~0.4 M)溶液逐滴加入该复合溶液中。随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水和乙醇洗涤3~5次即得到氨基化双锥形金属材料@双金属;
所述超薄带状纳米材料的制备:采用水热合成法合成超薄带状纳米材料,将0.1~0.5 g金属醋酸物和0.1~0.5 g金属化合物溶解于40 mL一定比例的碱溶剂与水的混合溶液中,搅拌15~30 min后转移至50 mL的高压釜中,密封后放入烘箱中90~180 ℃加热8~16 h。加热结束静置2~4 h,随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水洗涤3~5次即得到超薄带状纳米材料;
所述氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极的制备:将金电极置于强氧化性溶液中浸泡20~60 min,再将金电极依次用乙醇、二次蒸馏水超声洗涤5~10 min。取5~10mg超薄带状纳米材料溶于含1%~3% PEI的2 ml蒸馏水中,超声5~10 min,搅拌4~6 h,得到的黑色分散液用蒸馏水清洗1~3次,10000~12000 rpm离心收集,随后将收集物与2~4 mL双金属包裹的氨基化双锥形金属材料 (1~3 mg mL-1)在600~800 rpm磁搅拌下混合20~22 h,最后在60℃离心干燥后分散在2~4 mL蒸馏水中。取2~5 μL上述溶液滴加至金电极表面,干燥后用二次蒸馏水冲洗,冲洗后得到氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/金电极。随后,在体外先将10~20 μL 2~5 μM磺胺喹喔啉适体链S1与10~20 μL 2~5 μM 3’端延长了十个碱基且修饰巯基的互补链S2在50~100℃互补,形成DNA双链结构。移取2~4 μL DNA双链滴加至电极表面,30~60 ℃下孵育60~90 min,冲洗后移取2~4 μL电极封闭剂滴加至电极表面于30~60 ℃下孵育30~60 min,然后将电极浸泡在10 mL含20~40 μM信号分子的缓冲溶液中10~30 min,干燥后移取5~10 μL含有不同浓度磺胺喹喔啉和1~5 U核酸外切酶的混合物滴加至金电极表面于30~60 ℃下孵育60~120 min,得到氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极;
所述电化学传感器是以氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极为工作电极,以铂丝电极为对电极,饱和氯化银为参比电极。DNA双链通过互补链S2延长后的3’端修饰的巯基固定在电极表面,当样本中含有目标物磺胺喹喔啉时,适体链S1与目标物结合,与互补链S2分离,S1、S2均暴露5’端,核酸外切酶从单链的5’端开始剪切,释放目标物及S2延长的碱基上吸附的信号分子,造成响应信号的变化,得到了用于磺胺喹喔啉含量检测的内循环信号放大策略型电化学适体传感器。
所述的氨基化双锥形金属材料为铁金属纳米材料、钴金属纳米材料、锆金属纳米材料中的一种或多种。
所述的金属氯化物为氯化铁、氯化钴、氯化锆中的一种或多种。
所述的氨基官能化试剂为阳离子聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、二氨基对苯二酸中的一种或多种。
所述的有机溶剂为乙醇、***、二甲基甲酰胺中的一种或多种。
所述的还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、硫酸亚铁中的一种或多种。
所述的贵金属a溶液为硝酸银,氯金酸,氯铱酸中的一种或多种。
所述的贵金属b溶液为氯铂酸,氯钯酸,氯酸中的一种或多种。
所述的带状纳米材料为五氮掺杂二氧化钛,二硒化钴,镍基二氧化钒中的一种或多种。
所述的金属醋酸物为醋酸钛,醋酸钴,醋酸镍中的一种或多种;
所述金属化合物为硝酸钠,硒酸钠,钒酸钠中的一种或多种。
所述碱性溶剂为二乙烯三胺、氢氧化钾、乙二胺、氢氧化钠中的一种或多种。
所述的碱性溶剂和水的混合溶液体积比例为1:1~3:1。
所述的强氧化溶液为浓HCl、H2O2、浓HNO3、浓H2SO4中的两种混合物,体积比为1:1~3:1。
所述的电极封闭剂为己硫醇、6-巯基乙醇、牛血清白蛋白中的一种或多种。
所述的信号分子为亚甲基蓝、硫瑾、二茂铁中的一种或多种。
所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。
所述的核酸外切酶为RECJF外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种。
本发明涉及的传感器中,以氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极为工作电极,同其它用于磺胺喹喔啉含量检测的电化学传感器相比,所制备的基于内循环信号放大策略的适体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述:
实施例1
具体步骤如下:
(1)氨基化双锥形钴金属材料@铂钯双金属材料的制备:首先采用水热合成法合成氨基化双锥形钴金属材料,称取60 mg六水合二氯化钴与31mg的二氨基对苯二酸加入10 mL二甲基甲酰胺中,在室温下转移至高压釜中,再加入28 μL的水,密封放入烘箱,120 ℃恒温加热20 h,放置3 h,在8000 rpm转速下离心6 min,用水和乙醇洗涤,75℃干燥10h后得到氨基化双锥形钴金属材料;然后用表面生长法在氨基化双锥形钴金属材料表面生长双金属,将0.5 mL的H2PtCl6溶液(1%)和0.5 mL的Na2PdCl4溶液(1%)添加至2 mL氨基化双锥形钴金属材料(1 mg mL-1)中,然后在650 rpm转速下搅拌1h,将2.4mL的NaBH4(0.1 M)溶液逐滴加入该复合溶液中。随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水和乙醇洗涤3次即得到氨基化双锥形钴金属材料@铂钯。
(2)碲化锌的制备:将0.31 g醋酸锌和0.18g碲酸钠于40mL氢氧化钠溶液与水的混合溶液中,其中,氢氧化钠与水的比例为1:2,搅拌30min后转移至50mL的高压釜中,密封放入烘箱中180℃加热15h。加热结束静置4h,随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水洗涤3次即得到碲化锌。
(3)氨基化双锥形钴金属材料@铂钯 /碲化锌/核酸适配体金电极的制备:将金电极置于强氧化性溶液中浸泡30min,再将金电极依次用乙醇、二次蒸馏水超声洗涤10 min。取5mg碲化锌溶于含3%PEI的2ml蒸馏水中,超声10min,搅拌4h,得到的黑色分散液用蒸馏水清洗3次, 12000rpm离心收集,随后将收集物与2ml生长铂钯的氨基化双锥形钴金属材料(3 mg mL-1)在600rpm磁搅拌下混合21h,最后在60℃离心干燥后分散在4mL蒸馏水中。后取5μL上述溶液滴加至金电极表面,干燥后用二次蒸馏水冲洗,冲洗后得到氨基化双锥形钴金属材料@铂钯 /碲化锌/金电极。随后,在体外先将10 μL 5 μM磺胺喹喔啉适体链S1与10μL5 μM 3’端延长了十个碱基且修饰巯基的互补链S2在95℃互补,形成DNA双链结构。移取2μLDNA双链滴加至电极表面,37℃下孵育60 min,冲洗后移取2 μL电极封闭剂滴加至电极表面于37 ℃下孵育60 min,然后将电极浸泡在10mL含20μM亚甲基蓝的PBS溶液中10~30min,干燥后移取5 μL含有不同浓度磺胺喹喔啉和5 U的RECJF核酸外切酶的混合物滴加至金电极表面于37℃下孵育120 min,得到氨基化双锥形钴金属材料@铂钯/碲化锌/核酸适配体金电极。
(4)电化学传感器是以氨基化双锥形钴金属材料@铂钯/碲化锌/核酸适配体金电极为工作电极,以铂丝电极为对电极,饱和氯化银为参比电极。DNA双链通过互补链S2延长后的3’端修饰的巯基固定在电极表面,当样本中含有目标物磺胺喹喔啉时,适体链S1与目标物结合,与互补链S2分离,S1、S2均暴露5’端,核酸外切酶从单链的5’端开始剪切,释放目标物及S2延长的碱基上吸附的信号分子,造成响应信号的变化,得到了用于磺胺喹喔啉含量检测的内循环信号放大型电化学适体传感器。
所制备的电化学传感器对磺胺喹喔啉的检测具有准确度高,线性范围宽(0.01 ~50 ng/mL),检测下限低(5.0 pg/mL)的特点。同时,对实际样品(如猪肉、牛肉)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
以上实施例只是为了说明本发明,而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上,可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内,本发明可以有不同于上述的其它实现方式,选用其它试剂材料、调整孵育时间等方法均在本发明专利要求范围之内。
Claims (4)
1.一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)氨基化双锥形金属材料@双金属材料的制备:采用水热合成法合成氨基化双锥形金属材料A,称取40~60mg金属氯化物与30~50mg的氨基官能化试剂加入10~30 mL有机溶剂中,在室温下转移至高压釜中,再加入10~30μL的水,密封放入烘箱,60~120℃恒温加热12~24h,放置2~4 h,在8000~10000 rpm转速下离心4~7 min,用水和乙醇洗涤,50~80℃干燥6~12h后得到氨基化双锥形金属材料A;用表面生长法在氨基化双锥形金属材料A表面生长双金属,将0.5~1.0 mL的贵金属a溶液(1~3%)和0.5~1.0 mL的贵金属b溶液(1~3%)添加至1~3 mL的氨基化双锥形金属材料(1~3 mg mL-1)中,然后在600~800 rpm转速下搅拌1~2h,将2~4 mL的还原剂(0.1~0.4 M)溶液逐滴加入该复合溶液中;随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水和乙醇洗涤3~5次即得到氨基化双锥形金属材料@双金属;
(2)超薄带状纳米材料的制备:采用水热合成法合成超薄带状纳米材料,将0.1~0.5 g金属醋酸物和0.1~0.5 g金属化合物溶解于40 mL一定比例的碱溶剂与水的混合溶液中,搅拌15~30min后转移至50 mL的高压釜中,密封后放入烘箱中90~180 ℃加热8~16 h;加热结束静置2~4 h,随后,将混合物通过离心纯化并用蒸馏水洗涤3~5次即得到超薄带状纳米材料;
(3)氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极的制备:将金电极置于强氧化性溶液中浸泡20~60 min,再将金电极依次用乙醇、二次蒸馏水超声洗涤5~10 min;取5~10 mg超薄带状纳米材料溶于含1%~3% PEI的2 ml蒸馏水中,超声5~10min,搅拌4~6h,得到的黑色分散液用蒸馏水清洗1~3次,10000~12000rpm离心收集,随后将收集物与2~4 mL双金属包裹的氨基化双锥形金属材料 (1~3 mg mL-1)在600~800 rpm磁搅拌下混合20~22 h,最后在60 ℃离心干燥后分散在2~4 mL蒸馏水中;取2~5 μL上述溶液滴加至金电极表面,干燥后用二次蒸馏水冲洗,冲洗后得到氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/金电极;随后,在体外先将10~20 μL 2~5 μM磺胺喹喔啉适体链S1与10~20 μL 2~5 μM 3’端延长了十个碱基且修饰巯基的互补链S2在50~100℃互补,形成DNA双链结构;移取2~4 μL DNA双链滴加至电极表面,30~60 ℃下孵育60~90 min,冲洗后移取2~4 μL电极封闭剂滴加至电极表面于30~60 ℃下孵育30~60 min,然后将电极浸泡在10 mL含20~40 μM信号分子的缓冲溶液中10~30 min,干燥后移取5~10 μL含有不同浓度磺胺喹喔啉和1~5 U核酸外切酶的混合物滴加至金电极表面于30~60 ℃下孵育60~120 min,得到氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极;
(4)电化学传感器是以氨基化双锥形金属材料@双金属/超薄带状纳米材料/核酸适配体/金电极为工作电极,以铂丝电极为对电极,饱和氯化银为参比电极;DNA双链通过互补链S2延长后的3’端修饰的巯基固定在电极表面,当样本中含有目标物磺胺喹喔啉时,适体链S1与目标物结合,与互补链S2分离,S1、S2均暴露5’端,核酸外切酶从单链的5’端开始剪切,释放目标物及S2延长的碱基上吸附的信号分子,造成响应信号的变化,得到了用于磺胺喹喔啉含量检测的内循环放大策略型电化学适体传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的氨基化双锥形金属材料为铁纳米材料、钴纳米材料、锆纳米材料中的一种或多种;所述的金属氯化物为氯化铁、氯化钴、氯化锆中的一种或多种;所述的氨基官能化试剂为阳离子聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、二氨基对苯二酸中的一种或多种;所述的有机溶剂为乙醇、***、二甲基甲酰胺中的一种或多种;所述的还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、硫酸亚铁中的一种或多种;所述的贵金属a溶液为硝酸银,氯金酸,氯铱酸中的一种或多种;所述的贵金属b溶液为氯铂酸,氯钯酸,氯酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的带状纳米材料为五氮掺杂二氧化钛,二硒化钴,镍基二氧化钒中的一种或多种;所述的金属醋酸物为醋酸钛,醋酸钴,醋酸镍中的一种或多种;所述金属化合物为硝酸钠,硒酸钠,钒酸钠中的一种或多种;所述碱性溶剂为二乙烯三胺、氢氧化钾、乙二胺、氢氧化钠中的一种或多种;所述的碱性溶剂和水的混合溶液,体积比例为1:1~3:1。
4.根据权利要求1所述的一种基于内循环放大策略的磺胺喹喔啉电化学适体传感器制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述的强氧化溶液为浓HCl、H2O2、浓HNO3、浓H2SO4中的两种混合物,体积比为1:1~3:1;所述的电极封闭剂为己硫醇、6-巯基乙醇、牛血清白蛋白中的一种或多种;所述的信号分子为亚甲基蓝、硫瑾、二茂铁中的一种或多种;所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种;所述的核酸外切酶为RECJF外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种。
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