CN112725367B - 甘薯蔗糖转化酶基因IbINV及其应用 - Google Patents

甘薯蔗糖转化酶基因IbINV及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甘薯蔗糖转化酶基因IbINV及其应用，该甘薯蔗糖转化酶基因为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；该基因编码的蛋白为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；将含有所述编码基因的重组载体为将SEQ ID NO.1所示的DNA分子中去掉终止密码子并融合了GFP基因序列的片段***到pGWB5的两个attR位点之间得到的重组载体。本发明的IbINV基因和重组载体可调控植物的甘薯黑斑病菌抗性，将编码IbINV蛋白的DNA分子导入目的植物，可得到黑斑病菌抗性显著增强的转基因植物。本发明提供的IbINV基因及其编码蛋白可提高植物对甘薯黑斑病菌抗性，为定向改良植物对甘薯黑斑病菌抗性奠定了基础。

Description

甘薯蔗糖转化酶基因IbINV及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种甘薯蔗糖转化酶基因IbINV及其应用。
背景技术
甘薯黑斑病又名黑疤病，在世界各甘薯产区均有发生，1937年该病害从日本鹿儿岛传入我国辽宁省盖县，并由北向南逐渐蔓延，现有26个省、市、自治区相继报道过该病害的发生和危害。甘薯黑斑病在我国各薯区发生普遍，在华北区域、黄淮海流域、长江流域、南方薯区发生危害较为严重。每年由甘薯黑斑病造成的产量损失约为5％～10％，危害严重时造成的损失可达20％～50％，甚至更高。并且，被黑斑病菌侵染的薯块中可产生甘薯黑疱霉酮等有毒物质，人畜食用后会引发中毒甚至死亡。因此，提高对甘薯黑斑病菌的抗性逐渐成为了科研领域的重点工作。
通过传统的育种方法可以在一定程度上提高植物对甘薯黑斑病菌的抗性，但是传统育种存在时间长工作量大的问题。随着分子生物学技术的快速发展，采用转基因等基因工程技术定向改良植物抗逆性已成为现实。因此，挖掘具有抗甘薯黑斑病菌的新基因并通过生物工程的手段予以利用是提高植物对甘薯黑斑病菌抗性的有效途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何提高植物对甘薯黑斑病菌的抗性。
为解决上述技术问题，甘薯蔗糖转化酶基因IbINV，其核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的甘薯蔗糖转化酶基因IbINV的优选方案：在严格条件下与SEQID NO:1限定的DNA分子杂交，且氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质。
作为本发明所述的甘薯蔗糖转化酶基因IbINV的优选方案：所述蛋白质为：B1)或B2)所示：
所述B1)为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
所述B2)为将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有90％以上的序列一致性且功能相同的蛋白质。
作为本发明所述的甘薯蔗糖转化酶基因IbINV的优选方案：所述蛋白质的相关生物材料为下述C1)至C12)中的任一种：
C1)为所述蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO.2的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C9)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
C10)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C11)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C12)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
甘薯蔗糖转化酶基因IbINV在植物抗甘薯黑斑病菌中的应用。
本发明有益技术效果，本发明提供的IbINV基因及其编码蛋白可提高植物对甘薯黑斑病菌抗性，为定向改良植物对甘薯黑斑病菌抗性奠定了基础。通过将SEQ ID NO.1所示的DNA分子中去掉终止密码子并融合了GFP基因序列的片段***到pGWB5的两个attR位点之间得到的重组载体。本发明的IbINV基因和重组载体可调控植物的甘薯黑斑病菌抗性，将该基因导入甘薯植株中，得到了过表达IbINV的转基因甘薯植株，将转基因植株进行甘薯黑斑病菌接种处理，与非转基因对照植株(命名为NT株系)相比，转基因株系(命名为OEV株系)对甘薯黑斑病菌的抗性显著增强，具体表现在病情指数比对照显著降低，表明IbINV蛋白及其编码基因在对黑斑病菌的抗性调控过程中起着重要的作用。本发明提供的IbINV蛋白及其编码基因在提高植物对甘薯黑斑病菌的抗性方面具有重要的理论意义与应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为IbINV基因片段电泳检测(A)和INV蛋白质***进化树构建(B)
图2为pGWB5:IbINV植物过表达载体图
图3为IbINV转基因甘薯植株的PCR检测电泳图
图4为荧光定量PCR筛选IbINV转基因甘薯株系
图5为IbINV转基因甘薯植株抗黑斑病表型
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1甘薯蔗糖转化酶IbINV基因的获得
一、甘薯总RNA提取
采用植物总RNA提取试剂盒(北京天根公司)提取移栽周期为5w左右的徐薯29植株第四片完全展开叶的总RNA，用Nanodrop检测RNA浓度及质量，电泳检测RNA完整性。具体操作参照天根植物总RNA提取试剂盒使用说明书进行。
二、第一链cDNA合成
采用Takara公司的DNaseI和AMV反转录酶，以提取的徐薯29总RNA为模板，进行基因组DNA的去除和反转录。基因组DNA的去除参照表1中的体系配比进行，混匀后37℃水浴30min后加入1μL EDTA，65℃10min以终止反应，然后迅速置冰上冷却。
表1.基因组DNA的去除体系配比表
Figure BDA0002956111790000031
反转录反应，按照表2中的反转录体系配制混合液，混合均匀后置于PCR仪中进行反转录，反应条件为：50℃反应1h，95℃反应5min，反转录获得cDNA置于-20℃保存。
表2.反转录体系配制表
Figure BDA0002956111790000032
Figure BDA0002956111790000041
三、IbINV蛋白的cDNA编码序列克隆
以徐薯29的cDNA为模板，设计正向和反向引物IbINV_F和IbINV_R(序列分别为SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)，采用上述正反向引物进行PCR扩增。扩增反应体系总体积为50μL，其中KOD buffer 25μL，dNTP 10μL，ddH2O 10μL，KOD酶1μL，正反引物各1.5μL，基因组DNA模板1μL。采用PCR扩增条件为94℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸60s，循环35次，再在68℃下延伸6min后终止反应。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶100V电泳检测，获得大小约为1983bp长度的扩增片段；
上述中的SEQ ID NO：3为：ATGGCCGCCACCACTTCTTCCG；
SEQ ID NO：4为：TTACAATTGATTGATGAAAGAG。
PCR扩增条件如下：
Figure BDA0002956111790000042
四、IbINV基因片段回收纯化
琼脂糖凝胶电泳片段回收参照说明书，按照以下步骤进行：
第一步，在凝胶成像***紫外灯下，采用干净刀片切取获得的大小约为1983bp长度的扩增条带，尽量切除不带DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好；
第二步，将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重；
第三步，加入2倍体积溶胶/结合液DB；
第四步，56℃水浴放置5min左右至胶完全溶解，每1-2min涡旋震荡一次帮助加速溶解；
第五步，将吸附柱放入收集管中，将上述溶液加入微量吸附柱中，12000rpm离心30-60s，弃掉废液；
第六步，加入900μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃掉废液；
第七步，12000rpm再次离心2min，尽量除去漂洗液；
第八步，取出微量吸附柱，放入新的离心管中，在吸附膜的中间部位加入35μL洗脱缓冲液，室温放置2min后12000rpm离心1min即可。
五、T-IbINV载体的构建
纯化后连接T载体，连接体系为6μl体系包括：All in one buffer 6μl，T4连接酶1μl，纯化产物4μl，混匀后顺离至底部后置于25℃温育10min，然后进行大肠杆菌转化。
具体步骤如下：
第一步，将6μl连接产物加入50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞管中混匀后静置30min；
第二步，将上述混合物转移到42℃水浴锅中，热击30s后迅速冷却2min；
第三步，加入900μl LB液体培养基，37℃，200rpm摇培1h；
第四步，取出10000rpm离心30s，弃上清，留150-200μl LB培养基；
第五步，混匀后将转化细胞转移到含有100μg/ml羧苄青霉素的LB平板中，均匀涂布后置于37℃培养箱中培养12-16h；
第六步，在抗性平板中挑取单克隆，加入到500μl浓度为100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇培3h左右；
第七步，取摇培菌液进行PCR鉴定，PCR 20μl体系包括：premix 10μl，正反引物各1.0μL，菌液2μl并用6μl DDH2O补足20μl，然后进行PCR反应，反应完成后，用0.8％琼脂糖凝胶100V电泳检测条带大小。
PCR扩增条件如下：
Figure BDA0002956111790000051
六、T-IbINV质粒提取及测序
取条带大小正确的单克隆，加入到5-7ml浓度为100μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜震荡培养后，采用天根质粒小提试剂盒进行质粒提取，具体操作参照说明书进行。将提取的质粒送上海生工测序验证序列，采用Bioedit等生物信息学软件进行序列比对分析(图1)。
实施例2 IbINV蛋白在调控植物抗甘薯黑斑病菌中的应用
一、pGWB5-IbINV过表达载体的构建
以T-IbINV质粒为模板，将质粒和水体积比为1:49稀释后作为PCR扩增模板，引物为特异性的attb-IbINV正反引物，引物序列分别为SEQ ID NO：5为：AAAAAGCAGGCTGCATGGCCGCCACCACTTCT；SEQ ID NO：6为：AGAAAGCTGGGTCCAATTGATTGATGAAAGAG；按照以下反应体系进行配制：
表3.attb-IbINV PCR反应体系配制表
Figure BDA0002956111790000061
将配置的体系轻弹混匀后顺离，PCR扩增条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火60s，68℃延伸30s，循环20次，再在68℃下延伸6min后终止反应。
以PCR1产物为模板，以attb-adaptor为引物，正反引物序列SEQ ID NO：7为：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO：8为：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。
体系配置同上，PCR扩增条件如下：
Figure BDA0002956111790000062
PCR结束后电泳检测，有目的条带且很亮，切胶回收纯化后进行BP反应，BP反应10μL体系如表4所示。混匀离心后置于25℃，3h，加入1μL Proteinase K Solution，混匀后置于37℃，10min孵育，终止反应。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α后将转化细胞转移到含有庆大霉素的LB抗性平板中。将鉴定后的单克隆在含有庆大霉素的LB液体培养基中震荡培养过夜，提取质粒pDONOR207-IbINV，部分用于测序验证，剩余质粒进行下一步LR反应，LR反应10μL体系如表5所示：
表4.BP反应体系配制表
Figure BDA0002956111790000071
表5.LR反应体系配制表
Figure BDA0002956111790000072
混匀离心后置于25℃，5h，加入1μL Proteinase K Solution，混匀后置于37℃，10min孵育，终止反应。转化步骤和PCR菌液鉴定方法同上，转化细胞转移到含有卡那霉素的LB抗性平板中。将PCR鉴定后的单克隆在含有卡那霉素的LB液体培养基中摇培过夜，提取质粒pGWB5-IbINV(图2)。
二、pGWB5-IbINV过表达载体导入根癌农杆菌
IbINV重组质粒导入根癌农杆菌，包括根癌农杆菌感受态细胞的制备、液氮冻融法转化根癌农杆菌两部分，其中根癌农杆菌感受态细胞的制备步骤如下：
第一步，挑取根癌农杆菌EHA105的单菌落于5mL含40μg/mL利福霉素(Rif)的YEP液体培养基中，28℃，230rpm培养至OD600≈0.6；
第二步，收集1.5mL菌液，4℃，8000rpm离心1min，弃尽上清；
第三步，菌体用200μL ddH2O充分重悬，4℃，8000rpm离心1min，弃尽上清；
第四步，重复步骤第三步三次，弃尽上清；
第五步，菌体再用200μL ddH2O充分重悬，即为根癌农杆菌感受态细胞。
液氮冻融法转化根癌农杆菌，具体操作步骤如下：
第一步，冰浴融化农杆菌EHA105感受态细胞100μL；
第二步，取20μL重组质粒加入到根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上10min；
第三步，将冰浴后的混合物立即置于液氮中速冻1min；
第四步，37℃水浴5min后，加入900mL YEP液体培养基，28℃，200rpm震荡培养2h；
第五步，8000rpm离心2min，留底部100μL菌液，悬浮沉淀后均匀涂布于含100μg/mL卡那霉素(Km)或者壮观霉素(Spec)和40μg/mL利福平的YEP固体培养基上，在28℃培养箱中倒置培养2d；
第六步，菌液PCR检测阳性克隆。
三、IbINV转基因甘薯植株的获得
第一步，侵染和共培养
采用农杆菌介导的胚性愈伤遗传转化方法将IbINV的cDNA编码序列导入到徐薯29胚性愈伤中，具体方法如下：将继代3d的胚性悬浮细胞系悬浮于制备好的OD600＝1.0的根癌农杆菌菌液中，侵染10min，期间多次轻轻摇动三角瓶，以使菌液和愈伤充分接触。然后将菌液倒出，并用无菌滤纸将多余菌液吸出。将侵染过的胚性悬浮细胞转移至含有2.0mg/l 2,4-D，20mg/l AS的MS固体培养基上进行共培养，固体培养基上铺一层无菌滤纸，以抑制农杆菌生长，28℃，暗培养3d。同时以未转化的愈伤作为对照。
第二步，转化体的抑菌和选择培养
将共培养3d的胚性愈伤细胞用无菌水清洗5～6次，再用含600mg/l头孢菌素的MS液体培养基，抑菌处理1h，期间置于水平摇床上，100rpm震荡处理，以更有效的除去残留的根癌农杆菌。然后用含200mg/l头孢菌素和含100mg/l潮霉素的培养基进行暗培养。
第三步，体细胞胚的诱导
将筛选出的抗性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基上，光照培养诱导体细胞胚发生，培养条件为28℃。
第四步，拟转基因植株再生
用含200mg/l头孢菌素和含100mg/l潮霉素的MS培养基进行光照培养，使其再生成完整植株。
第五步，PCR鉴定
提取上述再生甘薯株系的基因组DNA，通过PCR技术检测IbINV基因是否整合到野生型甘薯植株中，具体步骤如下：
①提取甘薯植株基因组DNA，具体步骤如下：
(1)CTAB抽提液置于65℃水浴中预热；
(2)称取除去主脉的新鲜叶片1.0g，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎；
(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB提取液8mL，再加入160μLβ-巯基乙醇(终浓度为2％)，CTAB抽提液稍溶化后，用研棒将CTAB抽提液与磨碎的样品混合均匀后转入50mL离心管中；
(4)样品于65℃水浴保温60min，每10-20min摇动一次离心管，注意不要将离心管盖子盖紧以防样品喷出；
(5)加等体积的24:1氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀；
(6)待平衡后，室温下10000rpm离心5min；
(7)取上层水相小心转入新管，加入2倍体积预冷的无水乙醇颠倒混匀后，室温下10000rpm离心5min弃上清；
(8)加入2mL 75％乙醇洗涤2次后置于室温下干燥；
(9)加入ddH2O并于37℃助溶；
(10)加入2μL(10μg/μL)Rnase，37℃消化30min，除去DNA样品中的RNA；
(11)分装后置于-20℃保存备用。
②设计用于PCR鉴定的引物8和引物9(引物8为SEQ ID NO：3，引物9为SEQ ID NO：9)、引物10和引物11(引物10为SEQ ID NO：10，引物11为SEQ ID NO：9)；
上述中SEQ ID NO：9为：TTGCTTTGAAGACGTGGTTG；SEQ ID NO：10为：GATTCAAGGCTTGCTTCACA。
③以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR检测，PCR扩增体系如表6所示，
表6.转基因植株鉴定PCR反应体系配制表
Figure BDA0002956111790000101
PCR扩增程序为：
Figure BDA0002956111790000102
扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，从图3可以看出，两个目标片段均能扩增到的为IbINV转基因阳性甘薯植株，表明IbINV基因已经整合到甘薯基因组中，将这些转基因株系命名为OEV株系。
四、荧光定量PCR筛选IbINV转基因甘薯株系
使用植物总RNA提取试剂盒(北京天根公司)提取IbINV转基因株系总RNA，并完成第一链cDNA合成，取反转录后的cDNA 10μL加40μL DW稀释成模板，荧光定量PCR反应20μL体系如表7所示，RT-INV-Primer-F和RT-INV-Primer-R的引物序列分别为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12；其中，SEQ ID NO：11为：GGGGCCGTTCGGACTTCT；SEQ ID NO：12为：ACCGTGCTTCCATAAACCTCTT。将配置好的20μL体系震荡混匀离心后进行反应，反应条件为：95℃预变性15min，95℃变性20s，58℃退火40s，72℃延伸20s，循环45次，再在95℃下反应5s，65℃溶解5s。反应结束后观察溶解曲线，记录Ct值，定量计算方法采用2-ΔΔt进行。
表7.定量PCR反应体系配制表
Figure BDA0002956111790000103
结果如图4所示，OEV株系普遍表现出IbINV基因上调表达，其中OEV7的IbINV平均上调表达量为NT的7.5倍左右，OEV8中IbINV基因上调表达表达量约为NT的14.4倍，因此后续试验中选取OEV7和OEV8作进一步研究；
五、IbINV转基因植株对甘薯黑斑病菌的抗性鉴定
甘薯黑斑病抗性鉴定表型分析参照以下步骤：
第一步，采集甘薯黑斑病样，分离纯化得到甘薯黑斑病菌，并经科赫式法则验证后，PDA平板中培养7天，备用；
第二步，称取马铃薯20g加入1L超纯水煮沸至马铃薯完全烂软后过滤，加15g蔗糖并定容至1L，然后于121℃高压灭菌15min备用；
第三步，取出活化好的甘薯黑斑病菌，用直径为6mm的打孔器打取菌碟，每个三角瓶中接种20个菌碟，将接种好的三角瓶置于28℃恒温摇床中，于120rpm/min摇培48h；
第四步，过滤收集滤液，将孢子悬浮液浓度调节至约为1×105CFU/ml；
第五步，剪取生长一致的OEV7和OEV8各3株，分别种植在装灭菌土的花盆中，将制备好的孢子悬浮液进行灌根处理，每个盆钵灌根量为50ml，之后定期喷雾保湿；
第六步，接种15d后，观察和记录发病情况。并根据发病程度将病情指数分为6个等级。
薯苗黑斑病病情指数分级标准如下：0级：整株健康无病症；1级：植株正常生根，地下部茎有零星黑斑，茎基部叶片发黄或有萎蔫，地上部正常分枝生长；3级：植株生根但根系较少，地下部茎有连片黑斑，茎基部叶片发黄，薯苗生长缓慢；5级：植株几乎不生根，茎基部叶片发黄，薯苗完全不分枝；7级：地下部坏死腐烂，整株叶片发黄，植株萎蔫；9级：地下部坏死腐烂，薯苗心叶腐烂，整株死亡。按照以下公式计算平均病情指数，平均病情指数＝(重复1病情指数+重复2病情指数+重复3病情指数)/3。
结果如图5所示，可以看出IbINV转基因植株OEV株系比野生型甘薯植株NT对黑斑病的抗性显著提高，进一步测定了各株系被甘薯黑斑病菌侵染后病情指数，结果如表8所示，黑斑病菌侵染15d后OEV7和OEV8的平均病情指数分别为0.67和1.00，NT平均病情指数为3.67，显著性分析结果表明OEV7和OEV8的平均病情指数显著低于NT。
表8.OEV株系接种甘薯黑斑病菌15d后的病情指数
Figure BDA0002956111790000121
上述实验结果表明，IbINV蛋白及其编码基因可以调节植株对甘薯黑斑病菌的抗性。

Claims (1)

1.甘薯蔗糖转化酶基因IbINV在甘薯抗甘薯黑斑病菌中的应用，其中甘薯蔗糖转化酶基因IbINV的核苷酸是以徐薯29的cDNA为模板，通过引物IbINV_F和引物IbINV R进行PCR扩增获得的核苷酸；
上述引物IbINV F为：ATGGCCGCCACCACTTCTTCCG；
引物IbINV R为：TTACAATTGATTGATGAAAGAG。
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