CN108893479A - 一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法 - Google Patents

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李洪民
张爱君
陈晓光
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Abstract

本发明属于基因工程领域,具体为一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法；主要涉及IbMPK6的功能验证和应用。在甘薯中过表达该基因，获得的转基因植株明显提高甘薯耐逆性，方法是将IbMPK6的cDNA同源重组到过表达载体pMDC84中的CaMV35S强启动子后，获得重组载体。再利用农杆菌介导转化法，获得过表达该基因的转基因植株。经过逆境胁迫处理实验，发现于对照植株相比，转基因植株明显提高甘薯的耐低温性和耐盐性。

Description

一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及在甘薯主栽品种Xushu29中过表达蛋白激酶IbMPK6基因。
背景技术
非生物胁迫是影响植物生长发育，导致农作物减产的主要因素。甘薯在我国种植广泛，种植面积、总产量方面均占世界首位。甘薯因其耐贫瘠、易管理、产量高和丰富的营养价值，广泛的应用在人民日常消费、动物饲料以及工业燃料中，是继水稻、小麦和玉米等之后最重要的农作物之一。但低温、盐碱等非生物环境因素限制了甘薯的产量和甘薯产业的发展。
有丝***原激活的蛋白激酶(MAPK，Mitogen-activated Protein Kinase)是广泛存在于真核生物中的信号分子，由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成，通过级联依次磷酸化反应方式参与胞外信号放大和胞内信号传递，参与生物或非生物的胁迫反应、激素反应、细胞***、生长发育与程序性凋亡等。MAPK级联组成复杂，且相互交织，冗余，同时具有多效性，仅有少数的级联被详细阐明。如MKK1/MKK2-MPK4/MPK6级联响应高盐、低温胁迫；MKK6-MPK4/MPK11级联在调控细胞***上起着重要的功能；MEKKK1-MKK2-MPK4/MPK6级联信号参与植物抵御低温胁迫等。拟南芥中共有20个MAPK，根据被上游MAPKK的磷酸化位点，MPK6属于TEY基序中的A组。干旱、低温和高盐胁迫都可诱导AtMPK6的表达。近年来通过基因工程手段异源或同源过表达MPK6激酶，提高植物耐非生物胁迫性。如在拟南芥中，AtMPK6可以诱导SOS1表达，维持细胞内外的离子平衡，增加耐盐性。在水稻中，OsMPK6参与海藻糖的代谢途径，提高OsTPP1的表达量，提高水稻的耐寒性。
甘薯蛋白激酶IbMPK6响应多种非生物胁迫,但其生物学功能尚不明确。本发明通过转基因手段验证其基因功能，并提高甘薯对环境的耐逆性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种通过在35S强启动子控制下，在甘薯主栽品种徐薯29中过表达IbMPK6基因来提高了甘薯的耐寒性和耐盐性性的方法。
本发明的技术方案为：一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，所述方法通过过表达IbMPK6基因以提高甘薯植株对逆境的抵御性。
所述IbMPK6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将上下游引物扩增IbMPK6基因序列。
所述上下游引物为IbMPK6F和IbMPK6R，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2和SEQID No.3所示。
本发明中一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其包含如下步骤
步骤1：构建重组载体CaMV35S-IbMPK6。
步骤2：把重组载体质粒转入农杆菌GV3101菌株中，在YEP培养基中加入卡那霉素，经平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，获得过表达IbMPK6基因的农杆菌重组菌株。
步骤3：利用农杆菌介导法侵染甘薯愈伤，在MS培养基中加入潮霉素进行选择性培养，直至愈伤长成小苗。
步骤4：提取小苗叶片DNA，根据载体GFP基因设计引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5鉴定转基因植株；并设计qRT-PCR引物SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，筛选转基因株系。
步骤5：验证该基因IbMPK6在提高甘薯的耐非生物胁迫性。
本发明中的过表达IbMPK6基因的农杆菌单菌落接种在液体YEP培养基，30℃过夜培养。取100μl过夜培养液转接到含有100μM乙酰丁香酮的新鲜的YEP培养基中，30℃培养4-6小时，培养液OD600达到0.8-1.0，离心收集菌体。
本发明中的所述筛选出的过表植株放置在温室中进行扩繁，光照强度为150μmolm-2s-1，湿度85％，光照时间16h/8h(光/暗)，温度25℃。
本发明还提供一种bMPK6基因在甘薯植株中的应用。
本发明的有益效果：
本发明鉴定了IbMPK6基因的功能，且通过过表达IbMPK6基因明显提高甘薯植株对低温和盐胁迫的抵御性。
附图说明
图1：重组载体CaMV35S-IbMPK6示意图
图2：PCR鉴定甘薯转基因植株
图3：qRT-PCR筛选甘薯转基因植株
图4：IbMPK6过表达转基因植株提高甘薯耐非生物胁迫性
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
实施例1
重组载体CaMV35S-IbMPK6的构建
以徐薯29的cDNA为模板，利用已公开的上下游引物PCR扩增IbMPK6基因，连接到T-blunt载体上，并将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在LB培养基中加入卡那霉素，经平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，通过验证的单菌落摇菌提取质粒进行测序。再利用Invitrogen公司提供的gateway载体构建技术，将IbMPK6的cDNA同源重组到过表达载体pMDC84的CaMV35S强启动子后，获得重组载体CaMV35S-IbMPK6。
实施例2
农杆菌介导法侵染甘薯愈伤
挑取过表达IbMPK6基因的农杆菌单菌落接种在液体YEP培养基，30℃过夜培养。取100μl过夜培养液转接到含有100μM乙酰丁香酮的新鲜的YEP培养基中，30℃培养4-6小时，培养液OD600达到0.8-1.0，离心收集菌体。菌体重新悬浮在含有100μM乙酰丁香酮的新鲜的YEP培养基中，调至OD600至0.8。菌液中加入甘薯愈伤组织，室温轻轻震荡30min后。把愈伤移至含有100μM乙酰丁香酮的MS固体培养基上暗培养2-3d后，用清水洗去愈伤表面的菌液，将愈伤移至含有潮霉素的MS固体培养基上，光下培养，期间不断更换培养基，直至愈伤长成小苗。
实施例3
验证该基因IbMPK6在提高甘薯的耐非生物胁迫性
筛选出的过表达IbMPK6转基因株系和对照植株(徐薯29)放置在温室中进行扩繁，光照强度为150μmol m-2s-1，湿度85％，光照时间16h/8h(光/暗)，温度20-25℃。培养3周后选取长势一致的甘薯幼苗进行非生物胁迫处理，且实验重复3次。低温胁迫：把实验材料移入4℃的人工培养箱中处理48h,恢复室温放置24h；高盐胁迫：使用含有250mM NaCl的培养液浇灌植株20d，恢复正常浇灌10d。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)
<120> 一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法
<130> 2018.4.4
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacgctg gttcggctca gccggcggac acggtgatgt cggaggctgc gccacctcag 60
cctccagtgc ccgggatcga caacattccg gcgacactca gtcacggcgg cagattcatc 120
caatacaaca tcttcggcaa cgtctttgag gtcacagcca agtacaagcc tcccatcatg 180
cctatcggca aaggcgccta tggaatcgtc tgttctgctt tgaattcgga aacgaatgag 240
cacgtagcga taaaaaaaat agcgaatgct tttgataaca aaatcgatgc caagaggact 300
ctgcgtgaga tcaagttgct tcgccacatg gatcacgaaa atattgttgc aattagagat 360
ataataccac ctcctcagag agcgtcattc aatgacgttt atattgcata tgagcttatg 420
gacactgatc ttcatcaaat tattcgctct aatcagtcat tatcagagga gcactgtcag 480
tatttcttgt atcagattct ccgtgggttg aaatacatac attctgcaaa tgttttgcac 540
agggacttga aacccagcaa tctactattg aatgccaatt gtgatctgaa aatatgtgat 600
tttggattag ctcgtgtgac atctgaaaca gattttatga ctgaatatgt tgtgactaga 660
tggtaccggc cacctgagct attattgaac tcttctgact acactgcagc cattgatgta 720
tggtcagtgg gttgtatttt catggaattg atggatcgga aacccctatt ccctggtaga 780
gatcatgtcc accagctacg tctgcttatg gagctaatag gtacaccttc ggaggctgaa 840
atggagtttt tgaatgagaa tgcgaaaaaa tatatccggc agcttccatt atatcgtcgc 900
cagtcattta ctgaaaggtt tccacatgcg caccctggtg ctattgatct tgttgagaaa 960
atgttgacat ttgatcctag gcgaagaatt accgttgaag gtgcacttgc gcatccttac 1020
ctaacatcac tccatgatat cagtgacgag ccaagttgca cgactccctt taactttgat 1080
tttgagcagc atgcattgag tgaggagcag atgaaggagc tgatttaccg agaggctgtt 1140
gctttcaacc ccgagtttga gctgcaaatg tga 1173
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggacgctg gttcggctca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catttgcagc tcaaactcgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagaggacca tcttgttcaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catccatgcc atgtgtaatc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcggcagatt catccaatac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatcgctacg tgctcattcg 20

Claims (8)

1.一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于：所述方法通过过表达IbMPK6基因以提高甘薯植株对逆境的抵御性。
2.根据权利要求1所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于：所述IbMPK6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于：克隆权利要求2所述基因的引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
4.根据权利要求3所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于：所述过表达是将上下游引物扩增IbMPK6基因序列。
5.根据权利要求1所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：构建重组载体CaMV35S-IbMPK6；
步骤2：把重组载体质粒转入农杆菌GV3101菌株中，在YEP培养基中加入卡那霉素，经平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，获得过表达IbMPK6基因的农杆菌重组菌株；
步骤3：利用农杆菌介导法侵染甘薯愈伤，在MS培养基中加入潮霉素进行选择性培养，直至愈伤长成小苗；
步骤4：提取小苗叶片DNA，根据载体上GFP6基因设计引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；鉴定转基因植株；并设计qRT-PCR引物SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，筛选转基因株系；
步骤5：验证该基因IbMPK6在提高甘薯的耐非生物胁迫性。
6.根据权利要求5所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于，挑取过表达IbMPK6基因的农杆菌单菌落接种在液体YEP培养基，30℃过夜培养；取100μl过夜培养液转接到含有100μM乙酰丁香酮的新鲜的YEP培养基中，30℃培养4-6小时，培养液OD600达到0.8-1.0，离心收集菌体。
7.根据权利要求5所述的一种利用IbMPK6基因提高甘薯对逆境抵御性的方法，其特征在于，筛选出的过表达植株放置在温室中进行扩繁，光照强度为150μmol m-2s-1，湿度85％，光照时间16h/8h(光/暗)，温度25℃。
8.一种IbMPK6基因利用权利要求5所述的步骤在甘薯植株中的应用。
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