CN112725183B - 一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法 - Google Patents

一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，步骤为：（1）培养益生菌发酵液，并对发酵液进行离心，收集菌泥；（2）在菌泥中加入冷冻干燥保护剂得到混合物料；（3）将混合物料搅拌均匀，同时在搅拌时向混合物料中加入pH调节剂，将混合物料的pH调节至5.4~7.4；（4）将调节pH后的混合物料冷冻干燥。本发明在冷冻干燥前对混合物料的pH进行调整，并选择适当的冷冻干燥保护剂，可以有效提高冷冻干燥后的菌体存活率及制得的产品的货架期稳定性。

Description

一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法
技术领域
本发明涉及益生菌加工技术领域，尤其是涉及一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法。
背景技术
随着科学研究的不断深入，益生菌产业迎来了基础研究与技术应用高速发展的好时代，益生菌市场也成为目前食品领域增速最快的细分领域之一。最新科学研究表明，益生菌除了在维持肠道微生态平衡，改善肠道功能，调节机体免疫等方面具有益生作用外，在诸如肥胖、慢性代谢疾病、以及与肠脑轴相关的神经***问题中都表现出一定的积极作用。但上述益生功能一般都依赖于服用益生菌制剂时达到一定数量的活菌。2019年，由中国食品科学技术学会益生菌分会发布的《益生菌的科学共识》中，再次强调了足够数量和活菌状态与益生健康功能一起构成了益生菌的三大核心特征。
冷冻干燥是益生菌生产工艺中的重要环节，也是获得高活菌数量益生菌产品的核心技术环节。虽然冷冻干燥相比其他干燥技术对菌体的损伤较小，但仍会造成一些负面影响。冷冻干燥是冷冻技术和干燥技术的有机结合，菌体细胞在这两种激烈因素的作用下，可导致多方面的损伤，例如由于细胞内外水分冻结、冰晶生长而导致的机械损伤；细胞由于过冷失水导致溶质浓缩而引起的溶质损伤；细胞膜脂类物质由液晶相向凝胶相转变，引起细胞膜渗透性损伤等。
因此，现有技术中对益生菌进行冷冻干燥前一般会用保护剂对菌体进行包埋，减小低温对益生菌造成的损伤，从而提高益生菌冷冻干燥存活率。例如，在中国专利文献上公开的“一种口腔益生菌冻干粉制备工艺”，其公开号CN111334448A，步骤为：种子液制备；发酵；离心；包埋；冷冻干燥。该发明中的制备工艺简单，适合生产化操作。
但目前提高益生菌冷冻干燥存活率的研究中，主要着眼于保护剂种类的筛选与复配，并未关注物料pH对菌体存活率的影响。有机酸是益生菌的主要代谢产物之一，在发酵工艺结束后的离心环节、以及离心后的乳化混合等一系列后续环节中，有机酸仍会持续积累，尤其在离心后的富集状态下物料pH值会快速降低，而经本发明研究发现，较低的pH会导致冷冻干燥后的益生菌存活率降低。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中由于益生菌代谢会产生有机酸，在对益生菌发酵液进行处理的各个环节中，有机酸仍会持续积累，物料pH值会不断降低，而较低的pH会导致冷冻干燥后的益生菌存活率降低的问题，提供一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，在冷冻干燥前对混合物料的pH进行调整，并选择适当的冷冻干燥保护剂，可以有效提高冷冻干燥后的菌体存活率及制得的产品的货架期稳定性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，包括如下步骤：
(1)培养益生菌发酵液，并对发酵液进行离心，收集菌泥；
(2)在菌泥中加入冷冻干燥保护剂得到混合物料；
(3)将混合物料搅拌均匀，同时在搅拌时向混合物料中加入pH调节剂，将混合物料的pH调节至5.4～7.4；
(4)将调节pH后的混合物料冷冻干燥。
传统的益生菌冷冻干燥过程中，从培养出益生菌发酵液后至冷冻干燥前并不会关注物料的pH并对其进行调整，但由于益生菌活菌代谢会产生有机酸，在发酵液的后续处理过程中有机酸会持续积累，导致冷冻干燥前混合物料的pH会不断降低。而经本发明研究发现，较低的pH会导致冷冻干燥后的益生菌存活率降低。因此本发明在冷冻干燥前，在菌泥与冷冻干燥保护剂的混合阶段对混合物料的pH进行调整，避免了由于有机酸积累造成的混合物料pH过低，从而对冷冻干燥阶段菌体的存活与活力造成影响。
同时，本发明在冷冻干燥前将菌泥与冷冻干燥保护剂混合，冷冻干燥保护剂可以降低冷冻干燥工艺对菌体造成的损伤，所述损伤既包括对细胞内关键蛋白的活性的损伤(如β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶)，也包括对菌体细胞膜通透性所造成的损伤。因此在冷冻干燥保护剂及冷冻干燥前对pH进行调整的共同作用下，可以有效提高益生菌菌株在冷冻干燥阶段的存活率，提高益生菌菌粉产品的菌数活力，并延长菌粉产品在货架期内的稳定性，维持较高的货架期活菌数。并且，本发明工艺合理，具有较强的工业化实施性。
作为优选，步骤(2)中所述的冷冻干燥保护剂中包括质量比为4:6～8:2的脱脂乳及产酸调节剂。
作为优选，所述产酸调节剂为山梨醇。
本发明在冷冻干燥保护剂中加入产酸调节剂，将冷冻干燥保护剂与菌泥混合后，在产酸调节剂的作用下可以降低益生菌代谢产生的有机酸积累量，从而更有利于保持混合物料pH的稳定，避免加工过程中pH降低对益生菌存活率的影响。
但产酸调节剂的加入可能会影响冷冻干燥剂保护剂对菌体的冻干保护效果，因此本发明通过对产酸调节剂种类进行筛选，并调整脱脂乳及产酸调节剂的添加比例，使本发明中的冷冻干燥保护剂既可以有效抑制益生菌菌体的产酸量，维持混合物料pH稳定，又可以在冷冻干燥过程中对菌体进行有效保护，避免冷冻干燥工艺对菌体造成的损伤。
作为优选，步骤(2)中加入的冷冻干燥保护剂质量为菌泥的1～1.5倍。
作为优选，步骤(3)中的搅拌温度为4～7℃，搅拌时间20～30min。
作为优选，步骤(3)中所述的pH调节剂选自NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、KH2PO4-K2HPO4缓冲液、KH2PO4-Na2HPO4缓冲液中的一种。pH调节剂的选择对冷冻干燥存活率有明显影响，选择本发明中的pH调节剂对菌体存活率提高的效果更优。
作为优选，步骤(3)中将混合物料的pH调节至5.8～6.2或6.8～7.4。
作为优选，步骤(1)中益生菌发酵液的培养方法为：将活化后的益生菌接种于MRS培养基中，35～40℃厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于发酵罐，在35～40℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到所述益生菌发酵液。
作为优选，步骤(1)中离心时的温度为4～7℃，离心速度4000～6000r/min，离心时间10～15min。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)在冷冻干燥前，在菌泥与冷冻干燥保护剂的混合阶段对混合物料的pH进行调整，避免了由于有机酸积累造成的混合物料pH过低，从而对冷冻干燥阶段菌体的存活与活力造成影响，有效提升了益生菌菌粉产品的菌数活力，提升菌粉产品在货架期内的稳定性，维持较高的货架期活菌数；
(2)在冷冻干燥保护剂中加入产酸调节剂，将冷冻干燥保护剂与菌泥混合后，在产酸调节剂的作用下可以降低益生菌代谢产生的有机酸积累量，从而更有利于保持混合物料pH的稳定，避免加工过程中pH降低对益生菌存活率的影响；
(3)对产酸调节剂种类进行筛选，并调整脱脂乳及产酸调节剂的添加比例，使本发明中的冷冻干燥保护剂既可以有效降低益生菌菌体的产酸量，维持混合物料pH稳定，又可以在冷冻干燥过程中对菌体进行有效保护，避免冷冻干燥工艺对菌体造成的损伤。
附图说明
图1是本发明制得的益生菌粉储存21d内的存活率变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液，在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至5.4；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例2：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至5.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例3：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.2；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例4：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例5：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至7.0；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例6：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至7.4；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例7：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用氨水将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例8：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例9：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用KH2PO4-K2HPO4缓冲液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例10：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用KH2PO4-Na2HPO4缓冲液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例11：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和木糖醇；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例12：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和山梨醇；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例13：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和木糖醇；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，测得混合物料pH＝5.63；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例14：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和山梨醇；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，测得混合物料pH＝5.67；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例15：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中35℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在35℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为8：2的脱脂乳和山梨醇；
(3)将混合物料在4℃下充分搅拌混合20min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例16：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中40℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在40℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.5倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为4:6的脱脂乳和山梨醇；
(3)将混合物料在7℃下充分搅拌混合30min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例17：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为脱脂乳；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
实施例18：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为1:9的脱脂乳和山梨醇；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，同时，搅拌时在此温度条件下，采用NaOH溶液将混合物料pH调整至6.8；
(4)取一个专用容器，加入上述调节pH后的混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
对比例1：
(1)将存放于-80℃环境下冷冻保存的嗜热链球菌进行活化，接种在MRS培养基中37℃条件下进行厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于10L发酵罐，在37℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到嗜热链球菌发酵液；在4000r/min、4℃条件下离心10min，收集菌泥；
(2)在离心所得的菌泥中加入菌泥质量1.2倍的冷冻干燥保护剂得到混合物料，冷冻干燥保护剂组成为质量比为6：4的脱脂乳和蔗糖；
(3)将混合物料在5℃下充分搅拌混合25min，测得混合物料pH＝5.0；
(4)取一个专用容器，加入上述混合物料50g，转移至冷冻干燥机内，进行冷冻干燥，得到益生菌粉。
对上述实施例1～6和对比例1中制得的益生菌粉的冷冻干燥存活率、胞外酶和胞内酶活性进行测定，结果如表1所示。
测试方法为：
一、菌株冷冻干燥存活率的测定：
取1mL实施例和对比例中冷冻干燥前的混合物料测定活菌数；冷冻干燥后得到的益生菌粉样品采用无菌蒸馏水溶解；采用平板菌落计数法分别测定冻干前物料活菌数(N1)与冻干后菌粉的活菌数(N2)，分别记录冻干前物料重量(m1)与冻干后菌粉重量(m2)，菌株在冷冻干燥阶段的存活率通过以下公式计算得到：
Figure BDA0002875228570000111
二、胞外酶活性测定：
冻干后的益生菌粉复温后水化，用无菌蒸馏水复溶至原浓度。在37℃恒温培养箱中放置20min后，4℃条件下，8000g离心10min，取上清液用于细胞外酶活测定。β-半乳糖苷酶活性：取上清液200ul，加入200μL 20mmol/L的ONPG溶液(溶于磷酸盐缓冲液)，在37℃条件下水浴10min，然后加入600μL 0.5mol/L的碳酸钠溶液终止反应，在420nm波长下测定。反应生成的ONP浓度通过标准曲线计算得到。每分钟分解ONPG生成1μmol ONP的量定义为一个β-半乳糖苷酶活力单位。乳酸脱氢酶(LDH)活性：参考乳酸脱氢酶试剂盒方法，采用比色法进行测定。
三、胞内酶活性测定：
冻干后的益生菌粉复温后水化，用无菌蒸馏水复溶至原浓度。在37℃恒温培养箱中放置20min后，4℃条件下，8000g离心10min，弃去上清液，菌泥用1mL无菌水重悬后，用溶菌酶处理。取菌液1mL加入1.5mL离心管，10000rpm离心10min，弃去上清，加入0.5mL 10mg/mL的溶菌酶,重悬后转移至15ml离心管。加入MES缓冲液2.25mL,震荡混匀并置于37度水浴处理20min，加入0.25mL 4mol/L的NaCl溶液，继续处理30min后，再加入MES缓冲溶液2.5mL。以不加酶液的样品为对照样，其他处理一致。上述溶液取1mL，10000g 15min,4℃离心，去除细胞碎片后，用于测定胞内酶活。β-半乳糖苷酶活性与乳酸脱氢酶活性的测定方法与胞外酶活性测定方法一致。
表1：益生菌粉性能测试结果。
Figure BDA0002875228570000112
Figure BDA0002875228570000121
从表1中可以看出，与对比例1中在冷冻干燥前不对混合物料的pH进行调节相比，实施例1～6中采用本发明中的方法对益生菌粉进行冷冻干燥后，菌株的冻干存活率均有提升，表明升高冻干前菌泥与保护剂混合物料的pH对提高菌株在冷冻干燥环节中的存活有促进作用，在pH＝5.4～7.4范围内较pH＝5.0条件下均有促进作用；其中，最优pH为5.8，其次为7.0～7.4。而由于菌株代谢产生的有机酸积累，冷冻干燥前混合物料的pH较低，对比例1中冷冻干燥前不对混合物料pH进行调节，冷冻干燥后菌体的存活率明显降低。说明较低的pH会对菌体存活率造成影响，可能是由于增加了菌体的细胞膜通透性，以及影响了菌体细胞中参与生理生化反应的关键蛋白酶酶活。
胞外酶结果反应了冷冻干燥工艺对细胞膜通透性的影响。对比例1中，β-半乳糖苷酶的胞外酶活性为0.106±0.002umol/min/mg，LDH酶的胞外酶活性为0.057±0.016U/mg，均高于实施例1-6中的相应结果，表明调节冻干前得物料pH至5.4-7.4与pH＝5.0条件相比可以显著降低冷冻干燥对菌细胞细胞膜造成的损伤。此外，实施例1-6中菌体细胞内β-半乳糖苷酶和LDH酶的活力均高于对比例1，说明调整PH后冷冻干燥工艺对细胞内的关键代谢酶的不良影响也显著减小。与存活率指标相类似的，胞内酶活力以实施例2(PH＝5.8)与实施例6(PH＝7.4)条件下较优。
对上述实施例7～10中制得的益生菌粉的冷冻干燥存活率进行测定，结果如表2中所示。
表2：实施例7～10中益生菌粉冻干存活率测试结果。
编号 冻干后pH 冻干存活率(％)
实施例4 5.67 70.6
实施例7 5.71 76.7
实施例8 6.40 93.8
实施例9 6.40 80.3
实施例10 6.39 87.4
从表2中可以看出，实施例7～10中改变pH调节剂的种类，结果显示，pH调节剂的选择对冷冻干燥存活率有明显影响。选择磷酸盐缓冲溶液对存活率提高的效果更优于NaOH溶液(实施例4)和氨水(实施例7)。在三种磷酸盐缓冲溶液中，又以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(实施例8)为最优。
对上述实施例11～19中制得的益生菌粉的冷冻干燥存活率进行测定，结果如表3中所示。
表3：实施例11～19中益生菌粉冻干存活率测试结果。
编号 冻干后pH 冻干存活率(％)
实施例4 5.67 78.9
实施例11 6.32 51.2
实施例12 6.28 98.9
实施例13 5.49 45.8
实施例14 5.48 72.4
实施例15 6.08 88.5
实施例16 6.14 93.2
实施例17 6.02 82.9
实施例18 6.30 80.4
对比例1 4.93 64.3
从表3中可以看出，实施例11～18中改变冷冻干燥保护剂中选用的产酸调节剂种类或改变产酸调节剂的用量，对冷冻干燥后的冻干存活率均有明显影响。结果显示，实施例4中虽然在冻干前将pH调节至6.8，但冷冻干燥过程中pH仍有明显下降，导致最终菌体存活率仍然不理想。实施例11中采用木糖醇作为产酸调节剂，虽然可以减少有机酸的积累，冷冻干燥过程中pH下降不明显，但木糖醇对菌体的冻干保护效果不佳，冻干后的菌体存活率较低。而实施例12中采用山梨醇作为产酸调节剂时，既可以有效减少有机酸的积累，又可以有效降低冻干工艺对菌体造成的损伤，冷冻干燥后的菌体存活率高，说明产酸调节剂的种类对冻干后的菌体存活率有较大影响。
实施例13～14中虽然在冷冻干燥保护剂中分别添加了、木糖醇及山梨醇作为产酸调节剂，物料pH高于对比例1(蔗糖)，但由于在之前的制备过程中仍有有机酸积累，在冻干前不对混合物料的pH进行调整，菌体的冻干存活率与实施例4、11和12中相比均有明显降低。
实施例15～18中改变冷冻干燥保护剂中脱脂乳与产酸调节剂的添加比例，结果显示，实施例17中不在冷冻干燥保护剂中加入山梨醇、实施例18中加入的山梨醇的添加比例超出本发明中的范围外，冻干后的菌体存活率与实施例12和实施例15、16中相比均有明显降低，说明冷冻干燥保护剂的组分配比对菌体的存活率也有明显影响。
四、货架期稳定性测试：
将上述实施例和对比例中制得的益生菌粉在常温条件下(25℃)存放，进行货架期菌数稳定性跟踪。分别在存放的0d与21d测定菌粉活菌数，采用平板菌落计数法测定，并进行存活率计算，结果如表4所示。
表4：货架期稳定性测试结果。
Figure BDA0002875228570000141
从表4中可以看出，实施例1～6样品在21d贮藏期内的菌粉存活率均高于对比例1，表明调整PH对冷冻干燥后的菌粉产品在货架期内的活菌数的维持具有提升作用。
以冷冻干燥前的存活率为100％进行换算，计算冷冻干燥后菌粉(即菌粉0d)、储存21d后菌粉(即菌粉21d)的存活率，结果如图1所示。综合冷冻干燥环节的活力损失和储存阶段的活力损失，在不进行pH调整的条件下(对比例1)存活率为29.9％，实施例1～6样品存活率均优于对比例1。说明采用本发明中的方法，在冷冻干燥前对混合物料的pH进行调整，可以有效降低益生菌冷冻干燥环节的活力损失和储存阶段的活力损失，提高制得的产品的货架期稳定性。

Claims (6)

1.一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）培养益生菌发酵液，并对发酵液进行离心，收集菌泥；
（2）在菌泥中加入冷冻干燥保护剂得到混合物料，加入的冷冻干燥保护剂质量为菌泥的1~1.5倍；所述的冷冻干燥保护剂中包括质量比为4:6~8:2的脱脂乳及产酸调节剂；所述产酸调节剂为山梨醇；
（3）将混合物料搅拌均匀，同时在搅拌时向混合物料中加入pH调节剂，将混合物料的pH调节至5.4~7.4；
（4）将调节pH后的混合物料冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，步骤（3）中的搅拌温度为4~7℃，搅拌时间20~30min。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，步骤（3）中所述的pH调节剂选自NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、KH2PO4-K2HPO4缓冲液、KH2PO4-Na2HPO4缓冲液中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，步骤（3）中将混合物料的pH调节至5.8~6.2或6.8~7.4。
5.根据权利要求1所述的一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，步骤（1）中益生菌发酵液的培养方法为：将活化后的益生菌接种于MRS培养基中，35~40℃厌氧培养，得到种子液；经过多代种子液放大培养后，接种于发酵罐，在35~40℃条件下、MRS培养基中厌氧培养至对数末期，得到所述益生菌发酵液。
6.根据权利要求1或5所述的一种提高益生菌冷冻干燥存活率的方法，其特征是，步骤（1）中离心时的温度为4~7℃，离心速度4000~6000r/min，离心时间10~15min。
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