CN112707806B - 一种EphB2小分子抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域；本发明公开了一种EphB2小分子抑制剂艾地苯醌及其在治疗肝纤维化中的应用；本发明发现艾地苯醌选择性抑制EphB2激酶的表达与活性，减少胶原沉积、抑制纤维增生，调节肝损伤的生化指标以及炎症相关因子的水平，下调肝纤维化相关蛋白及基因的表达，发挥抗肝纤维化作用。因此，艾地苯醌可用于治疗肝纤维化。

Description

一种EphB2小分子抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及一种EphB2小分子抑制剂艾地苯醌(Idebenone，6-(10-羟基癸基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌，6-(10-hydroxydecyl)-2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone)，以及该化合物在治疗肝纤维化中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

肝脏是人体代谢和清除外来异物的最主要器官，其功能直接影响人体健康及生命。肝纤维化是由各种因素引起的慢性肝病，包括病毒、酒精、肥胖、药物和自身免疫等。这些病因持续作用于肝脏后，肝脏发生慢性炎症，打破细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成和降解之间的平衡，ECM在肝脏内过度沉积，导致肝实质细胞结构损坏以及肝功能失调，形成肝纤维化。肝脏炎症导致肝纤维化的过程和机制已被科学界广泛认可。如果肝纤维化得不到及时的治疗，会进一步发展为肝硬化，最终导致者肝癌(hepatic cellcarcinoma，HCC)或肝衰竭。在慢性肝炎进展到肝硬化之前，肝纤维化都是一个可逆的过程，但是一旦发展为肝硬化后，临床上只有肝移植这一种治疗方法。因此，肝纤维化的防治在慢性肝病治疗中至关重要。目前对于慢性肝病的治疗方法主要为病症治疗，对于肝纤维化的治疗尚无明确有效的药物，现有的临床治疗药物多由于不良反应严重、缺乏肝脏特异靶向性等造成疗效不佳。

肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化被普遍认为是肝纤维化发生的关键因素。在正常机体中，HSC处于静息状态，当肝脏受损后，Kuppfer细胞和凋亡的肝细胞释放细胞因子例如TGF-β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)等，刺激HSC从静息状态活化为肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF)。HSC是活化的MF的主要前体，MF是在肝纤维化过程中产生ECM蛋白的主要细胞。静态HSC会存储含维生素A的脂质滴，而HSC在被激活后会失去脂质滴。因此，控制HSC的活化过程是治疗肝纤维化的重要策略。

酪氨酸激酶EphB家族最初被鉴定为轴突导向因子，与其配体Ephrins在中枢神经***的发育、老年痴呆症和损伤修复等神经疾病中扮演重要角色。随着研究的深入，发现EphB家族通过激酶活性的异常激活和蛋白的过度表达参与多种非神经细胞的生理病理过程。EphB2与其配体EphrinB首先是在肝癌细胞系中被发现的，二者之间的信号传递介导了许多重要的生理过程，在调节肝脏单核细胞浸润、肝炎、组织重塑和成纤维化方面的作用近期才得到报道。研究表明，炎症损伤导致肝脏激活的Kupffer细胞和巨噬细胞(Mφ)中EphB2表达上调，从而促进单核细胞浸润，释放细胞因子和趋化因子刺激HSC细胞增殖、迁移和活化。抑制EphB2的表达或活性则能阻止炎性细胞浸润导致的肝脏细胞损伤，有效预防和逆转肝纤维化的进程，提示EphB2有望成为肝纤维化治疗的一种全新靶点(Mimche PN,etal.Hepatology.2015,62(3):900-14.)，EphB2抑制剂也有望给肝纤维化治疗带来新的方向。然而，由于EphB受体家族具有多个成员以及同一家族成员的氨基酸序列同源性高，故目前尚未有选择性抑制EphB2活性化合物的报道，而且文献只报道了非选择性的泛家族抑制化合物。因此，开发EphB2的高选择性抑制剂将为肝纤维化患者提供新的治疗选择，在肝纤维化治疗领域将具有良好的应用前景和临床价值。

本发明对由500多个小分子组成的化合物库进行筛选，意外发现艾地苯醌(Idebenone，6-(10-羟基癸基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌，6-(10-hydroxydecyl)-2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone)能够选择性抑制EphB2(IC₅₀＝30nM)，通过特异性抑制EphB2激酶的活性和表达，有效抑制HSC的激活，减少胶原沉积并抑制纤维增生，调节肝损伤的生化指标以及炎症相关因子的水平，下调肝纤维化相关蛋白及基因的表达。同时，在公认的四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化小鼠模型上表现出显著治疗作用。因此，艾地苯醌作为一类新型防治肝纤维化的药物，可用于肝纤维化的预防和治疗。

抗氧化剂在治疗和预防许多全身和局部炎性疾病中的关键作用已广为人知。艾地苯醌是由日本武田制药(Takeda)开发并于1988年获批上市的一种智能促进药，作为临床应用常用的抗氧化剂之一，能够在线粒体电子传递链中充当电子载体的作用。临床上主要用于治疗与氧化压迫有关的中枢神经***退化疾病，如阿尔茨海默氏病、多梗死性痴呆、大脑局部贫血及脑衰等，也用于线粒体功能异常引起的疾病，如弗里德赖希共济失调症、莱伯氏遗传性视神经病变和杜氏肌营养不良等的治疗。截止目前，尚未有研究和报道表明艾地苯醌具有抗肝纤维化作用，更未有相关实验数据证实艾地苯醌可以通过抑制EphB2激酶的活性和表达发挥抗肝纤维化作用。

虽然前人研究(Cell Physiol Biochem.2015；35(6):2402-2411.)表明，艾地苯醌的抗氧化活性对于锐钛矿TiO2金属纳米粒子诱导的肝损伤大鼠模型具有保护作用，但是该模型并不是被学术界广泛认可的能代表肝纤维化特征的疾病模型，并且肝损伤与肝纤维化属于两种不同的疾病类型，其是否对肝纤维化有效以及如何发挥作用均有待于进一步验证。此外，有人报道(Cell Death Discov.2019；5:146)，艾地苯醌可改善博来霉素所致的肺损伤，减轻肺纤维化的症状。但是，该文所述内容与本发明具有本质差别：(1)因组织病理的差异，肺纤维化的发生发展进程与肝纤维化存在差异或不完全一致；(2)肺部炎症与肺纤维化之间的直接关系尚未阐明，而肝纤维化是慢性肝炎的直接结果；(3)博来霉素可以诱导肺损伤，是研究肺纤维化的常用模型，但是否影响肝纤维化的形成尚无定论，甚至有文献报道博来霉素对肝脏功能没有影响(Radiol.Oncol.2019,53:415-426)；(4)在艾地苯醌防治肺纤维化的同时，是否具有抗肝纤维化作用也未知。因此，综合文献报道的内容和结果，与本发明内容无直接相关性。

发明内容

本发明的目的是提供一种EphB2小分子抑制剂艾地苯醌的新用途。

一种EphB2小分子抑制剂，其中所述EphB2小分子抑制剂为艾地苯醌((Idebenone，6-(10-羟基癸基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌，6-(10-hydroxydecyl)-2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone))，其结构式如式I所示

所述的EphB2小分子抑制剂在制备EphB2激酶有关疾病的药物中的应用。

所述的EphB2激酶有关疾病为肝纤维化。

所述肝纤维化的疾病包括：慢性病毒学肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝淤血。

所述的艾地苯醌为其药用型盐、晶型、制剂和/或与给药载体组成的药物组合物。

一种药物组合物，其特征在于：包含所述的化合物和至少一种药学上可接受的载体。

所述的药物组合物在制备预防与治疗肝纤维化功效的药物的应用。

具体而言：

为了达到以上目的本发明采用了以下技术手段：

发明提出了艾地苯醌在治疗肝纤维化中的应用，所述的艾地苯醌(Idebenone)的化学结构式如式I所式：

其中，优选的、所述的艾地苯醌通过抑制EphB2激酶活性减少胶原沉积以及抑制纤维增生，调节肝损伤的生化指标以及炎症相关因子的水平，下调肝纤维化相关蛋白及基因的表达，来达到治疗肝纤维化的目的。

造成所述肝纤维化的疾病主要包括：慢性病毒学肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝淤血、遗传代谢性疾病。

所述的艾地苯醌为其药用型盐、晶型、制剂和/或与给药载体组成的复合物并通过不同途径给药。

本发明所述的艾地苯醌的药用盐型包括与无机酸、有机酸或无机碱、有机碱所形成的各种盐及各种晶型。酸性盐的例子有醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑碘酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、亚磺酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、萘磺酸盐、尼古丁酸盐、硝酸盐、乙二酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、异丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐；碱性盐的例子则有碱金属(如钠、钾)盐、碱性二价金属(如镁、锌)盐、铵盐和含1-4个碳原子的烷基铵盐。

本发明所述的艾地苯醌的具体的剂型有水溶液注射剂、油状混悬液注射剂、口服胶囊剂、口服片剂、口服水溶液、口服混悬液、直肠栓剂、滴眼液、眼膏、皮肤用软膏、皮肤用霜剂、皮肤用喷雾剂、口腔喷雾剂、口腔气雾剂、鼻腔喷雾剂和鼻腔气雾剂等，同时还包括这些不同剂型的缓释剂和控制释放速度和剂量的制剂。

本发明所述艾地苯醌或其药物上可成的盐或晶型可用于使其发挥作用的各种给药途径。例如可用于口服、非胃肠道给药、口腔吸入、透过皮肤给药、直肠给药、鼻腔给药、舌下给药、面颊给药、***给药及通过植入性容器给药等方式施用。非胃肠道给药又包括在皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤部位内和颅内注射和浸渗。制药领域的普通技术人员可以根据疾病状况和其他相关情况，选择施用的适当形式和方式。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05-90％重量活性成分，更常见约15-60％之间的活性成分。本发明化合物剂量可以使0.005-5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。所用的剂量受多种因素的影响，这些因素包括年龄、体重、健康状况、性别、种族、饮食习惯、给药时间、排尿频率及是否使用其它药物等。

本发明同时要求保护一种药物组合物，所述组合物的主要活性成分为上述艾地苯醌或其药物可成的盐或晶型，还包括临床治疗上能接受的载体或辅料及其缓控释制剂。这些药用载体或辅料包括离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人体血清白蛋白)、缓冲物(如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾等)、部分饱和植物油的甘油脂、水和盐的混合物或电解质(如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氧化钠等)、锌盐、胶态硅胶、三聚硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类、聚乙烯甘油醇、羧酸甲基纤维素钠、聚酰化物、蜡类及羊毛脂等。起缓控释作用的载体或辅料可选自纤维素衍生物(如甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟乙基甲基纤维素等)、非纤维素多糖(如葡糖糖、壳多糖、半乳糖和甘露聚糖等)、天然胶(果胶、海藻酸钠、琼脂和海藻酸钾等)、乙烯基聚合物或丙烯酸聚合物(如聚乙烯醇和聚羟乙烯934等)、惰性脂肪或蜡类(如蜂蜡、氢化植物油、硬脂酸和十八烷醇等)、聚乙烯、聚丙烯、聚硅氧烷和聚氧乙烯等。

有益效果

1、本发明采用Kinase-Glo激酶活性检测方法筛选了由500多个小分子组成的化合物库对EphB2激酶活性的影响，意外发现艾地苯醌可选择性抑制EphB2，其IC₅₀为30nM。采用计算机模拟及分子对接，分析了艾地苯醌与EphB2的相互作用，发现艾地苯醌可嵌入EphB2的激酶区口袋中，并与口袋附近的Asp739形成氢键，说明艾地苯醌可通过该氨基酸与EphB2直接结合。随后，以TGF-β1刺激活化的人LX-2细胞为肝纤维化细胞模型，考察了艾地苯醌对LX-2细胞中肝纤维化相关蛋白和基因表达的影响，以及其可能的作用机制。结果表明，艾地苯醌能够剂量及时间依赖性地抑制LX-2细胞中纤维化相关蛋白及其基因的表达水平，发挥抗纤维化作用。采用腹腔注射CCl4的方法构建了小鼠肝纤维化模型，通过灌胃给予艾地苯醌后，取小鼠血清及肝组织进行分析，发现艾地苯醌可抑制EphB2激酶的表达与活性，能够减轻小鼠肝纤维化，减少胶原沉积以及抑制纤维增生，调节肝损伤的生化指标以及炎症相关因子的水平，下调肝纤维化相关蛋白及基因的表达，在体内发挥抗肝纤维化作用。本发明通过分子、细胞和动物实验的***研究发现了EphB2的特异性抑制剂艾地苯醌(Idebenone)，证明了其在治疗肝纤维化中的作用。

附图说明

图1艾地苯醌和EphB2相互作用图。A，分子对接结果；B，相互作用示意图。

图2为正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组(IDE组)的LX-2细胞中肝纤维化相关蛋白和基因的表达。A，Western blot；B，RT-qPCR。

图3为正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组(IDE组)的小鼠血清生化指标ALT、AST、T-Bil和羟脯氨酸(Hyp)含量。

图4为正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组(IDE组)的小鼠肝组织HE染色结果，说明艾地苯醌能够有效抑制小鼠的肝纤维化程度。

图5为正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组(IDE组)的小鼠肝组织MASSON染色结果，结果说明艾地苯醌能够有效抑制小鼠的肝纤维化程度。

图6为正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组(IDE组)的小鼠肝组织中纤维化相关蛋白和基因的表达。

其中：*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1EphB2小分子抑制剂的筛选与验证

1.体外激酶检测：采用Promega公司的Kinase-Glo激酶活性检测试剂盒(Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assays)筛选了由500多个小分子组成的化合物库对EphB2激酶的半数抑制浓度(IC₅₀)。该方法为化学发光法，一种通过激酶和底物反应，均质荧光素酶检测的方法。荧光素酶反应中需要ATP的参加，激酶催化底物磷酸化需要消耗ATP，激酶反应结束，加入等体积Kinase-Glo试剂，测量发光信号。发光信号与体系中剩余的ATP成正比，与激酶活性成反比。加入激酶抑制剂后，激酶受到抑制，活性降低，消耗的ATP减少，当激酶活性降低至初始活性一半时抑制剂的浓度即为抑制剂对该激酶的半数抑制浓度。

2.分子对接：以艾地苯醌为配体，EphB2为受体，采用MOE(Molecular OperatingEnvironment)软件进行分子对接，对接过程大致如下：从PBD数据库下载EphB2的结晶结构文件，载入MOE，选择适当的力场(MMFF94)，执行能量最小化模块，得到优化的蛋白对接区域，进行对接的运算，得到配体在不同构象时的对接能量及可能的结合位点，得分最高的对接模型即为最佳对接模型。

3.实验结果：

利用Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒筛选了由500多个小分子组成的化合物库对EphB2的抑制作用，发现艾地苯醌表现出最优活性(IC₅₀为30nM)，测定艾地苯醌对其它肝纤维相关激酶活性的影响，结果显示它仅对EphB2有很强的抑制作用，而对其它激酶无显著抑制作用，说明艾地苯醌是一种EphB2的高选择性抑制剂。

为了研究艾地苯醌与EphB2蛋白发生相互作用的结构基础，利用分子模拟软件MOE将艾地苯醌与EphB2的晶体结构进行了分子对接。发现艾地苯醌可嵌入EphB2的激酶区口袋中，并与口袋附近的Asp739形成氢键，说明艾地苯醌通过该氨基酸与EphB2直接结合抑制其活性(见图1)。

实施例2艾地苯醌在治疗肝纤维化中的应用

1.细胞、动物及实验试剂

人源肝星状细胞LX-2(购买于湘雅医学院)，小鼠(品系：C57，南京模式动物研究所购买)，四氯化碳(CCl₄，Sigma购买)。

2.LX-2细胞诱导活化

LX-2细胞在37℃，5％CO2条件下，实验组分别加入化合物溶液，模型组加入含有TGF-β1(终浓度5ng/mL)的DMEM培养液处理，对照组加入不含有化合物及TGF-β1的DMEM培养液。提取细胞蛋白及基因进行检测。

3.CCl₄诱导肝纤维化模型构建

健康C57雄性小鼠30只(体重190-220g)按照体重均衡原则随机分为三组，即正常对照组、模型组、艾地苯醌治疗组。皆在标准饲养环境中饲养。实验总共为期六周，模型组和艾地苯醌治疗组小鼠腹腔注射CCl₄，正常对照组小鼠腹腔注射溶剂玉米油，每周两次。第三周开始，艾地苯醌治疗组开始灌胃艾地苯醌(50mg/kg)，正常对照组和模型组小鼠灌胃玉米油对照，每天一次。试验结束后，取肝左叶用4％多聚甲醛固定，其余肝组织放入液氮冷冻，随后转移至负80冰箱中保存。固定的肝组织进行病理染色。

4.肝功能检测

采用深圳雷杜生命科技公司Chemray 240全自动生化分析仪测试血清样本，对肝功能进行检测，指标包括谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)及总胆红素(Total bilirubin，T-bil)。

5.肝组织中羟脯氨酸含量测定

根据南京建成生物工程研究所碱水解法羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒说明书测定肝组织中羟脯氨酸含量。

6.实验结果

6.1艾地苯醌可降低LX-2细胞中肝纤维化相关蛋白和基因的表达水平

Western Blot和RT-qPCR结果如图2所示，艾地苯醌处理可以抑制TGF-β1诱导活化的LX-2细胞中的EphB2激酶活性，抑制其磷酸化，显著降低肝纤维化相关蛋白α-SMA及其基因的表达。

6.2艾地苯醌可减轻小鼠肝损伤

取小鼠血清对肝功能指标进行血清生化检测，结果如图3所示，显示艾地苯醌可显著下调ALT、AST和T-Bil水平，减轻小鼠肝损伤。艾地苯醌治疗组小鼠肝组织中的Hyp含量显著下降，说明艾地苯醌可以减轻CCL₄造成的肝损伤，减少胶原的过度沉积。

6.4艾地苯醌可减轻小鼠肝纤维化程度

HE染色结果如图4所示，对照组小鼠组织内肝细胞为不规则的多边形，细胞核圆润且位于细胞中央；肝细胞呈索状排列分布，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列；组织内肝血窦间隙大小均匀未见扩张；组织形态结构正常，未见明显病理变化。模型组小鼠肝组织内部分肝细胞脂肪变性，细胞内可见形态规则的圆形空泡，细胞核被空泡挤压至边缘，如红色箭头所示；组织部分汇管区纤维组织增生，可见成纤维细胞和纤维细胞大量增生，如蓝色箭头所示；部分汇管区血管增生，部分增生的血管扩张淤血，管腔内可见大量红细胞和炎性细胞，如黄色箭头所示。艾地苯醌治疗组小鼠肝组织内可见部分肝细胞水肿，细胞肿胀、胞浆淡染，如黑色箭头所示；肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，未见紊乱；肝血窦间隙大小均匀，未见扩张。

MASSON染色如图5所示，对照组小鼠肝小叶中央静脉管壁周围仅有少量蓝色胶原纤维沉积。模型组小鼠在CCl₄腹腔注射造模6周后，可见明显肝小叶纤维间隔，中央静脉管及汇管周围有明显蓝色胶原纤维沉积，与邻近间隔相连接包围肝小叶。艾地苯醌治疗组小鼠肝脏中央静脉管周围胶原纤维沉积减少，纤维间隔不明显。

6.5艾地苯醌可降低小鼠肝组织中肝纤维化相关蛋白和基因的表达水平

Western Blot和RT-qPCR结果如图6所示，艾地苯醌处理可以下调CCl₄造成的肝纤维化模型小鼠肝组织中纤维化相关蛋白α-SMA及其基因的表达水平，同时抑制EphB2激酶的表达与磷酸化。

Claims (4)

1.EphB2小分子抑制剂在制备EphB2激酶有关疾病的药物中的应用；

所述EphB2小分子抑制剂为艾地苯醌，其结构式如式I所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的EphB2激酶有关疾病为肝纤维化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肝纤维化的疾病包括：慢性病毒学肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝淤血。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的艾地苯醌为其药用型盐、晶型、制剂和/或与给药载体组成的药物组合物。

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