CN112698025B

CN112698025B - 抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒

Info

Publication number: CN112698025B
Application number: CN202011466110.9A
Authority: CN
Inventors: 何勇
Original assignee: Sichuan Orienter Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Orienter Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112698025A

Abstract

本发明公开了抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒，包括以下步骤：S1、取磁微粒，用PBS重悬磁微粒；S2、磁微粒包被：将短臂生物素标记抗原与长臂生物素标记抗原按一定比例混合，或短臂生物素标记抗体与长臂生物素标记抗体按一定比例混合，加入步骤S1获得重悬磁微粒中，混匀，反应；S3、磁微粒封闭：向步骤S2获得的溶液中加入封闭液，混匀，反应。本发明同时使用短臂生物素与长臂生物素标记的抗原或抗体进行包被磁微粒，能极大的减少空间位阻，提高抗原抗体的反应效率，磁微粒A与磁微粒B混合使用时，可明显提高整体体系的信号及灵敏度。

Description

抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒。

背景技术

化学发光免疫分析法是利用生物素与亲和素将抗原或抗体与载体或酶连接。由于生物素、亲和素的高度亲和力，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。它能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，也可被荧光素、酶等材料标记。化学发光免疫分析法具有灵敏度高，线性范围宽，特异性强，稳定性好，操作简单，可自动化的特点。

生物素的分子量较小，当与抗原或抗体反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合造成干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供抗原或抗体包被磁微粒的方法，该方法能够减少空间位阻效应、降低空间位阻效应对生物素与亲和素的结合造的干扰，进而高抗原或抗体的反应效率。

此外，本还提供上述方法制备的磁微粒、应用及试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：

抗原或抗体包被磁微粒的方法，包括以下步骤：

S1、取磁微粒，用PBS重悬磁微粒；

S2、磁微粒包被：将短臂生物素标记抗原与长臂生物素标记抗原按一定比例混合，或短臂生物素标记抗体与长臂生物素标记抗体按一定比例混合，加入步骤S1获得重悬磁微粒中，混匀，反应；

S3、磁微粒封闭：向步骤S2获得的溶液中加入封闭液，混匀，反应。

大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离，如长臂生物素，可减少位阻效应。本发明利用这一特点通过结合使用短臂生物素与长臂生物素，最大限度的减少空间位阻效应，从而提高抗原抗体的反应效率。

本发明采用的短臂生物素我生物素-N-羟基琥珀酰亚胺，Sigma-Aldrich，Cat：H1759；长臂生物素为生物素酰胺已酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma-Aldrich，Cat：B2643；短臂生物素标记抗原与长臂生物素标记抗原分别为抗原采用短臂生物素或长臂生物素标记获得；短臂生物素标记抗体与长臂生物素标记抗体分别为抗体采用短臂生物素或长臂生物素标记获得。

使用长臂生物素标记相比短臂生物素标记能减少空间位，申请人通过实验发现，将长臂生物素和短臂生物素混合使用，相比单独使用长臂生物素信号更高。

根据检测信号结果可反映空间位阻的问题，因为在生物素抗体一致及生物素抗体使用的量确定的情况下，信号的增加是因为空间位阻的减小导致，由本申请表1-表3的数据可知：将长臂生物素和短臂生物素混合使用，不仅能够降低空间位阻，且相比单独使用长臂生物素信号更高。

综上，本发明使用两种不同的生物素标记的抗原或抗体进行包被磁微粒；能极大的减少空间位阻，提高抗原抗体的反应效率；提高体系的信号及灵敏度。

进一步地，短臂生物素标记抗原与长臂生物素标记抗原的比例或臂生物素标记抗体与长臂生物素标记抗体的比例为1:1。

进一步地，短臂生物素标记抗原、长臂生物素标记抗原、短臂生物素标记抗体和长臂生物素标记抗体均为基于大分子蛋白进行生物素标记的产物。

进一步地，大分子蛋白包括BNP抗体、TG抗原。

进一步地，步骤S1中重悬磁微粒的浓度为2mg/mL。

进一步地，磁微粒为磁微粒A和磁微粒B的混合物。

磁微粒A(Dynabeads^TMMyOne^TM Streptavidin T1)，磁微粒B(Dynabeads^TMM-280Streptavidin)：

磁微粒A检测信号高，同时本底信号较高。磁微粒B本底信号低，但是包被量相对磁微粒A偏低。本方法将磁微粒A与磁微粒B混合使用，达到降低本底信号，提高体系灵敏度的同时较好的满足整个体系的线性范围。

进一步地，磁微粒A和磁微粒B的质量比为7:3或6:4或5:5。

采用上述抗原或抗体包被磁微粒的方法制备的磁微粒。

上述抗原或抗体包被磁微粒的方法磁微粒在化学发光免疫中的应用。

一种试剂盒，所述试剂盒包括如上述磁微粒。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明使用两种不同的生物素标记的抗原或抗体进行包被磁微粒；能极大的减少空间位阻，提高抗原抗体的反应效率；提高体系的信号及灵敏度。

2、本发明将磁微粒A与磁微粒B混合使用，达到降低本底信号，提高体系灵敏度的同时较好的满足整个体系的线性范围。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

抗原或抗体包被磁微粒的方法，包括以下步骤：

S1、取一定量的磁微粒，用1％BSA清洗磁微粒3次，再用1％BSA重悬磁微粒，定容至浓度为2mg/mL；

S2、磁微粒包被：取制备好的短臂生物素标记BNP抗体与长臂生物素标记BNP抗体，按10ug/mg的包被量向重悬好的磁微粒中加入短臂生物素标记BNP抗体或长臂生物素标记BNP抗体(即向重悬好的磁微粒中加入5ug/mg短臂生物素标记BNP抗体与5ug/mg的长臂生物素标记BNP抗体，包被总量为10ug/mg)，涡旋混匀后，室温滚动反应30min；

S3、磁微粒封闭：向步骤S2获得的溶液中加入10mM维生素H(1mg的磁珠加50ul的维生素H封闭液)，涡旋混匀后，室温滚动反应30min；

S4、清洗：用1％BSA溶液清洗上述磁微粒三次后，完成BNP磁微粒包被。

在本实施例中，磁微粒为磁微粒A(Dynabeads^TMMyOne^TM Streptavidin T1)。

对比例1：

本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：

步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入10ug/mg短臂生物素标记BNP抗体进行磁微粒包被。

对比例2：

本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入10ug/mg的长臂生物素标记BNP抗体进行磁微粒包被。

将实施例1、对比例1和对比例2包被后的BNP磁微粒进行信号值与信号比检测(化学发光免疫分析)，结果如表1所示：

表1

由表1的数据可知：

采用短臂生物素标记BNP抗体包被磁微粒(对比例1)信号为实施例1的60％左右，长臂生物素标记抗体包被磁微粒(对比例2)信号为实施例1的70％左右。实施例1较原方法信号高30％-40％，且本底信号无明显变化。

实施例2：

抗原或抗体包被磁微粒的方法，包括以下步骤：

S1、取一定量的磁微粒，用5％BSA清洗磁微粒3次，再用5％BSA重悬磁微粒，定容至浓度为2mg/mL；

S2、磁微粒包被：取制备好的短臂生物素标记25-OH VD抗体与长臂生物素标记25-OH VD抗体，按1ug/mg(即向重悬好的磁微粒中加入0.5ug/mg短臂生物素标记25-OH VD抗体与0.5ug/mg的长臂生物素标记25-OH VD抗体，包被总量为1ug/mg)的包被量向重悬好的磁微粒中加入短臂生物素标记25-OH VD抗体或长臂生物素标记25-OH VD抗体，涡旋混匀后，室温滚动反应30min；

S4、清洗：用5％BSA溶液清洗上述磁微粒三次后，完成25-OH VD磁微粒包被。

对比例3：

本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：

步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入1ug/mg短臂生物素标记25-OH VD抗体进行磁微粒包被。

对比例4：

本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：

步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入1ug/mg的长臂生物素标记25-OH VD抗体进行磁微粒包被。

将实施例2、对比例3和对比例4包被后的25-OH VD磁微粒进行信号值与信号比检测(化学发光免疫分析)，结果如表2所示：

表2

由表2所示：

由于25-OH VD为小分子，空间位阻较小。采用短臂生物素标记25-OH VD抗体包被磁微粒信号及长臂生物素标记抗体包被磁微粒信号较本发明方法的信号低10％左右，差异不明显。

实施例3：

抗原或抗体包被磁微粒的方法，包括以下步骤：

S1、用0.02M PBS清洗磁微粒3次，再用0.02M PBS重悬磁微粒，定容至浓度为2mg/mL；

S2、磁微粒包被：取制备好的短臂生物素标记TG抗原与长臂生物素标记TG抗原，向重悬好的磁微粒中加入5ug/mg短臂生物素标记TG抗原与5ug/mg的长臂生物素标记TG抗原，包被总量为10ug/mg，涡旋混匀后，室温滚动反应30min；

S4、清洗：用0.02M PBS溶液清洗上述磁微粒三次后，完成ANTI-TG项目磁微粒包被。

在本实施例中，磁微粒为磁微粒为磁微粒A(Dynabeads^TMMyOne^TM StreptavidinT1)。

对比例5：

本对比例基于实施例3，与实施例3的区别在于：

步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入10ug/mg短臂生物素标记TG抗原进行磁微粒包被。

对比例6：

本对比例基于实施例3，与实施例3的区别在于：

步骤S2中向重悬好的磁微粒中加入10ug/mg的长臂生物素标记TG抗原进行磁微粒包被。

将实施例3、对比例5和对比例6包被后的TG磁微粒进行信号值与信号比检测(化学发光免疫分析)，结果如表3所示：

表3

由表3的数据可知：

采用短臂生物素标记TG抗原包被磁微粒信号为本发明方法的70％左右，长臂生物素标记抗体包被磁微粒信号为本发明方法的80％左右。本发明方法较原方法信号高20％-30，且本底信号无明显变化。

由表1-表3的数据可知：

本发明主要对大分子项目有较大作用，小分子有轻微作用。同时使用短臂生物素标记抗原或抗体与长臂生物素标记抗原或抗体包被磁珠，能极大的减少大分子抗原或抗体空间位阻，提高抗原或抗体的包被量，提高体系的信号及灵敏度。

由本申请表1-表3的数据可知：将长臂生物素和短臂生物素混合使用，不仅能够降低空间位阻，且相比单独使用长臂生物素信号更高。

实施例4：

本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为7:3(A组)。

实施例5：

本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为6:4(B组)。

实施例6：

本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为5:5(C组)。

实施例4-实施例6制备的磁微粒信号值与信号比如表4所示：

表4

由表4的数据可知：当磁微粒A与磁微粒B混合使用时，能明显改善BNP项目的本底信号，且BNP高值信号下降较小。当磁微粒A与磁微粒B比例为6：4时该体系的S/NSB最好。

实施例7：

本实施例基于实施例2，与实施例2的区别在于：

实施例8：

本实施例基于实施例2，与实施例2的区别在于：

实施例9：

本实施例基于实施例2，与实施例2的区别在于：

实施例7-实施例9制备的磁微粒信号值与信号比如表5所示：

表5

由表5的数据可知：当磁微粒A与磁微粒B混合使用时，明显提高体系的灵敏度，当磁微粒A与磁微粒B比例为6：4与5：5时该体系的S/NSB最好。

实施例10：

本实施例基于实施例3，与实施例3的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为7:3(D组)。

实施例11：

本实施例基于实施例3，与实施例3的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为6:4(E组)。

实施例12：

本实施例基于实施例3，与实施例3的区别在于：

磁微粒为磁微粒A与磁微粒B的混合物，磁微粒A与磁微粒B的质量比为5:5(F组)。

实施例10-实施例12制备的磁微粒信号值与信号比如表6所示：

表6

由表6的数据可知：

当磁微粒A与磁微粒B混合使用时，能明显改善ANTI-TG项目的本底信号，且ANTI-TG高值信号下降较小。当磁微粒A与磁微粒B比例为5：5时该体系的S/NSB最好。

由实施例4-12的数据可知：

结合两种磁珠使用，具有可结合较多的生物素化抗原或抗体及干扰小、本底信号低的优点，当磁微粒A与磁微粒B的质量比在6:4到5:5时整个体系的灵敏度最好。

综上，同时使用短臂生物素与长臂生物素标记的抗原或抗体进行包被磁微粒，能极大的减少空间位阻，提高抗原抗体的反应效率，磁微粒A与磁微粒B混合使用时，可明显提高整体体系的信号及灵敏度。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取磁微粒，用PBS重悬磁微粒；

2.根据权利要求1所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述短臂生物素标记抗原与长臂生物素标记抗原的比例或短臂生物素标记抗体与长臂生物素标记抗体的比例为1:1。

3.根据权利要求1所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述短臂生物素标记抗原、长臂生物素标记抗原、短臂生物素标记抗体和长臂生物素标记抗体均为基于大分子蛋白进行生物素标记的产物。

4.根据权利要求3所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述大分子蛋白包括BNP抗体或TG抗原。

5.根据权利要求1所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，步骤S1中重悬磁微粒的浓度为2mg/mL。

6.根据权利要求1所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述磁微粒为磁微粒A和磁微粒B的混合物；磁微粒A为Dynabeads^TMMyOne^TM Streptavidin T1，磁微粒B为Dynabeads^TMM-280 Streptavidin。

7.根据权利要求6所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法，其特征在于，所述磁微粒A和磁微粒B的质量比为7:3或6:4或5:5。

8.如权利要求1-7任一项所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法制备的磁微粒。

9.如权利要求1-7任一项所述的抗原或抗体包被磁微粒的方法或权利要求8所述磁微粒在化学发光免疫中的应用。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求8所述的磁微粒。