CN112683888B - 一种海藻酸钠低聚糖聚合度检测方法 - Google Patents
一种海藻酸钠低聚糖聚合度检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种海藻酸钠低聚糖聚合度检测方法，利用了吸光度法对海藻酸钠低聚糖的平均聚合度进行了测定，通过NMR对该误差进行矫正后，可以直接通过吸光度值直接得到低聚糖的聚合度，大大简化了海藻低聚糖平均聚合度的检测流程，适用于海藻低聚糖工业化生产、分离纯化过程中平均聚合度的判定。
Description
技术领域
本发明属于糖类分析技术领域，具体涉及一种海藻酸钠低聚糖聚合度的测定方法。
背景技术
低聚糖是由2-30个单糖单元通过糖苷键连接起来所形成的具有直链或分支链的一类糖的总称，又可以称为寡聚糖，例如海藻酸寡糖、壳寡糖、果胶寡糖等。人类日常食用的寡糖，如蔗糖、麦芽糖、乳糖等只是食品加工过程中所用的添加剂，通常认为并没有特定的调节功能。但是农业中所使用的寡糖却是具有某种或某类特定功效作用的低聚糖类，例如海藻低聚糖。海藻酸钠一种阴离子线性糖类，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)组成。天然海藻酸多糖中M和G的分布大概有三种，M-嵌段、G嵌段和MG-嵌段，而海藻低聚糖主要是通过海藻酸裂解酶通过β-消除反应得到，可以作为天然肥料、生长调节剂、食品添加剂等。低聚糖的许多性能与分子质量密切相关，尤其是其生理活性，只有其分子质量在一定范围内才表现出来，因此对低聚糖的相对平均分子质量的准确测定显得十分重要。聚合度是分子质量的另一种体现形式，测定聚合度的方法有比旋光度法、超离心法、高压电泳法、凝胶色谱法、质谱法、核磁法等，前四种方法误差较大或者操作繁琐，质谱法和核磁法测定的聚合度较为精确，但是需要提前了解糖的相关结构信息且检测费用较为昂贵。因此寻找一种快速简单且准确的方法检测低聚糖聚合度变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于：提供了一种方便快捷且准确的测定海藻低聚糖平均聚合度的方法，该测定方法操作简单且对仪器的要求不高。
本发明利用了吸光度法对海藻酸钠低聚糖的平均聚合度进行了测定，常规条件下，平均聚合度的公式为：平均聚合度＝1/还原糖的百分含量；但是海藻酸钠的单糖较难得到且价格昂贵，故而标准曲线与样品缺少准确的对应关系；此方法通过NMR对该误差进行矫正后，可以直接通过吸光度值直接得到低聚糖的聚合度，大大简化了海藻低聚糖平均聚合度的检测流程，适用于海藻低聚糖工业化生产、分离纯化过程中平均聚合度的判定。
本发明提供一种检测海藻酸钠低聚糖聚合度的方法，利用吸光度值法直接评估海藻酸钠的平均聚合度；
所述方法包括如下步骤：
(1)制备DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂：将45.5g酒石酸钾钠加到125ml热水中溶解，加入1.575g DNS和65.5ml的2mol/L NaOH；再加入1.25g重蒸酚和1.25g亚硫酸钠，搅拌
溶解，冷却后，用蒸馏水定容至250ml贮于棕色瓶中，放置7天后备用；
(2)制备一系列特定浓度的低聚糖溶液以及标准曲线所需要的溶液：采用DNS法，测定方法及步骤如下：(1)标准曲线的绘制：配置不同浓度的葡萄糖溶液，在540nm测其吸光度值，得到不同葡萄糖和吸光度曲线图，作为标准曲线图；
(3)一系列低聚糖溶液的配置：配置不同浓度待测海藻酸钠低聚糖溶液，所述海藻酸钠低聚糖溶液的浓度在所述标准曲线线性范围内；
(4)取步骤(3)的海藻酸钠低聚糖溶液，加入所述DNS试剂，100℃加热5-10min，在540nm测其吸光度值；根据标准曲线计算出还原糖的浓度，然后根据加入的待测海藻酸钠低聚糖的量计算还原糖的百分含量；
(5)通过还原糖百分含量与聚合度的关系曲线，得到待测海藻酸钠低聚糖的聚合度。
基于以上技术方案，优选的，步骤(5)所述的原糖百分含量与聚合度的关系曲线方程y＝1.085x-0.136；所述方程为通过核磁测定的聚合度与还原糖含量进行拟合所得到的；x表示100/DP(DP表示聚合度)，y表示还原糖浓度；
基于以上技术方案，优选的，所述海藻酸钠低聚糖为海藻酸寡糖和海藻低聚糖，聚合度为2-30。
所述的海藻酸钠低聚糖为经过海藻酸裂解酶处理不同时间所得到的，经过β-消除反应，在端基位置会产生还原糖。
本发明所述测定方法也可以称为比色法为DNS法，即利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后，在碱性条件下发生显色反应，从而得到还原糖浓度和吸光度的曲线
基于以上技术方案，优选的，所述海藻酸钠低聚糖为由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid,M)和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid,G)聚合而成；所述β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid,M)和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid,G)的结构式如下：
基于以上技术方案，优选的，所述海藻酸钠低聚糖的结构式如下：
有益效果
(1)常规条件下，平均聚合度的公式为：平均聚合度＝1/还原糖的百分含量；但是海藻酸钠的单糖较难得到且价格昂贵，故而标准曲线与样品缺少准确的对应关系；此方法通过NMR对该误差进行矫正后，可以直接通过吸光度值直接得到低聚糖的聚合度，大大简化了海藻低聚糖平均聚合度的检测流程，适用于海藻低聚糖工业化生产、分离纯化过程中平均聚合度的判定。
(2)常规条件下，DNS法通常用来检测生成的还原糖的量来评估水解酶的活性，通过此方法，可以进一步计算出产物的聚合度，为后续的实验安排提供了方便。
附图说明
图1为本发明DNS原理图。
图2为还原糖标准曲线图。
图3为NMR图谱解析海藻低聚糖。
图4为还原糖含量与聚合度的对应关系图。
图5为ESI-MS图解析海藻低聚糖图。
具体实施方式
结合具体实施案例进一步说明本发明的技术解决方案，实施例中所使用的高分辨核磁共振波谱仪条件：脉冲程序zg30,测试温度为70℃，扫描宽度为5000HZ，扫描延迟为2s，扫描次数为64次。使用的ESI-MS为负离子检测模式，带有Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱DAD紫外检测器。本发明所使用的得NMR检测聚合度使用的方法参考文献TheCatalytic Activities of the Bifunctional Azotobacter vinelandii Mannuronan C-5-Epimerase and Alginate Lyase AlgE7 Probably Originate from the Same ActiveSite in the Enzyme；THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.276,No.34,Issue ofAugust 24,pp.31542–31550,2001。
实施例1
试剂：将45.5g酒石酸钾钠加到125ml热水中溶解，加入1.575g DNS和65.5ml的2mol/L NaOH；再加入1.25g重蒸酚和1.25g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后，用蒸馏水定容至250ml贮于棕色瓶中，放置7天后备用；
(2)标准曲线的绘制：配置不同浓度的葡萄糖溶液，采用DNS法在540nm测其吸光度值，得到不同葡萄糖浓度和吸光度曲线图，作为标准曲线图；如图2所示：标准曲线为y＝0.16x-0.02
(3)一系列低聚糖溶液的配置：取寡聚海藻酸钠，均为甘露糖醛酸与古罗糖醛酸混合片段，配置成浓度为1mg/ml溶液；
(4)试管中移取128μl该溶液，加入96μlDNS试剂于100℃显色10min，取出至常温25℃，加入1.376ml一次水，然后吸取200μl的溶液放入比色皿中，测定540nm的还原糖吸光度值。通过标准曲线计算还原糖的百分含量为10.96％，
(5)代入方程y＝1.085x-0.136，得到对应的平均聚合度为9.67。通过NMR检测平均聚合度为9.8。
实施例2
本发明其他步骤同实施例1
(3)取寡聚海藻酸钠，均为古罗糖醛酸片段，配置成浓度为1mg/ml溶液；
(4)试管中移取128μl该溶液，加入96μl DNS试剂于100℃显色10min，取出至常温25℃，加入1.376ml一次水，然后吸取200μl的溶液放入比色皿中，测定540nm的还原糖吸光度值。通过标准曲线计算还原糖的百分含量为10.96％，
(5)代入方程y＝1.085x-0.136,得到对应的平均聚合度为9.67；NMR检测平均聚合度为9.8。
实施例3
本发明其他步骤同实施例1
(3)取寡聚海藻酸钠，为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸聚合而成，配置成浓度为1mg/ml溶液；
(4)试管中移取128μl该溶液，加入96μl DNS试剂于100℃显色10min，取出至常温25℃，加入1.376ml一次水，然后吸取200μl的溶液放入比色皿中，测定540nm的还原糖吸光度值。通过标准曲线计算还原糖的百分含量为29.57％，
(5)代入方程y＝1.085x-0.136,得到对应的平均聚合度为3.61；NMR检测平均聚合度为3.6。再次通过ESI-MS进行检测，如同图5，可以看出寡聚糖混合液组分中含有二糖、三糖、四糖，并且二糖比四糖的含量略高些，可知平均聚合度在3-4之间，与该发明中所测得聚合度范围一致。
图1为为本发明DNS原理图，从图中可以看出，M和G在水溶液中可开环形成还原糖，而DNS可与还原糖在碱性加热的环境下变色。
图3为NMR图谱解析海藻低聚糖图，从图中可以看出每个不同化学环境下的H对应不同的峰位移以及不同含量的H对应不同的峰面积，因此可以根据这些信息代入公式DPn＝[IG-5+IM-1+(IGred+IMred)×2]/[IGred+IMred]。
实施例4
取5mg一系列海藻低聚糖于0.5ml D2O中，于70℃进行1H NMR检测。将得到的核磁峰图进行一一分析，计算得到对应寡糖的聚合度。将该聚合度与该寡聚糖对应的还原糖的含量进行拟合，得到一个线性方程，如图4。
Claims (4)
1.一种检测海藻酸钠低聚糖聚合度的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）制备DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂：将45.5g酒石酸钾钠溶于70℃水中，然后加入1.575gDNS和65.5ml的2mol/LNaOH溶液；再加入1.25g重蒸酚和1.25g亚硫酸钠，搅拌溶解，定容至250ml，得到所述DNS试剂；
（2）标准曲线的绘制：配置不同浓度的葡萄糖溶液，在540nm测其吸光度值，得到不同葡萄糖和吸光度曲线图，作为标准曲线图；
（3）配置不同浓度待测海藻酸钠低聚糖溶液，所述海藻酸钠低聚糖溶液的浓度在所述标准曲线线性范围内；
（4）取步骤（3）的海藻酸钠低聚糖溶液，加入所述DNS试剂，100oC水浴5-10min，在540nm测其吸光度值；根据标准曲线计算出还原糖的浓度，然后根据加入的待测海藻酸钠低聚糖的量计算还原糖的百分含量；
（5）通过还原糖百分含量与聚合度的关系曲线，得到待测海藻酸钠低聚糖的聚合度；
步骤（5）所述的还原糖百分含量与聚合度的关系曲线方程y=1.085x-0.136；所述方程为通过核磁测定的聚合度与还原糖含量进行拟合所得到的；x表示100/DP，DP表示聚合度，y表示所述的还原糖百分含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述海藻酸钠低聚糖为海藻低聚糖，所述海藻酸钠低聚糖的聚合度为2-30。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述海藻酸钠低聚糖由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid, M）和α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid, G）聚合而成；所述β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid, M）和α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid,G）的结构式如下：
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述海藻酸钠低聚糖的结构式如下：
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