CN110747242A - 一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，步骤如下：⑴制备质量浓度0.5％的瓜尔豆胶底物；⑵向底物中加入甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的复合酶，甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的酶活力比为65:1，并调节混合物的pH为6.0；⑶搅拌均匀后，放入40℃水浴锅中保温24±1h，将反应液沸水浴加热，离心，收集上清液，即得半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物。本方法首次利用半乳甘露聚糖底物瓜尔豆胶制备甘露糖，半乳糖及甘露寡糖，丰富了甘露糖，半乳糖及甘露寡糖的来源，条件温和，酶解过程无污染物产生，且无毒、耗能低、产物安全性高，24h单糖及寡糖的生成率达到88％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法。
背景技术
瓜尔豆胶也称古耳胶、瓜尔胶或胍胶，是由瓜尔豆的种子去皮去胚芽后的胚乳部分经清理、干燥粉碎后加水、再进行加压水解后用20％乙醇沉淀，离心分离后干燥、粉碎而得。甘露聚糖是除了木聚糖外，自然界分布最为广泛的一类半纤维素。天然来源于植物的甘露聚糖可分为：聚甘露糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖四类。如果半乳糖存在于聚甘露糖分子中，并通过α-1,6-糖苷键与主链中的甘露糖残基相连，则构成了半乳甘露聚糖，瓜尔豆胶即为一种以半乳糖和甘露糖残基为结构单元的多糖化合物，甘露糖与半乳糖的比例大约为二比一。甘露聚糖主链的降解需要依靠内切和外切甘露聚糖酶、甘露糖苷酶等酶的作用，但半乳甘露聚糖的完全水解还需要α-半乳糖苷酶的协同作用。
甘露糖是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，其广泛分布于体液和组织中，可直接被利用合成糖蛋白，参与免疫调节。半乳糖常以D-半乳糖苷的形式存在于大脑和神经组织中，也是某些糖蛋白的重要成分，因其具有能量，可作为营养增甜剂使用。寡糖是一类直链或含有侧链的且含有2至10个相同或不同的单糖残基的糖。甘露寡糖具有稳定性能好、安全无毒害且热值低等特点，有很高的经济价值。目前植物来源的甘露寡糖较少，通过瓜尔豆胶生产甘露寡糖有利于丰富寡糖的来源，对于后续研究具有重要意义。
甘露寡糖具有多种优良特性，目前已被广泛应用。甘露寡糖的获取主要有三种途径：(1) 化学法降解聚糖获得寡糖；(2)从天然原料中提取；(3)生物降解法。然而自然界中存在的天然甘露寡糖含量低，提取工艺复杂困难；化学降解法过程中一般需要高温、酸碱等苛刻条件，反应的稳定性和重复性较差，对设备有严重的腐蚀性，且后处理烦琐、产物获得率底、成本高、污染性强等缺陷。相比前两种方法，生物降解法即酶解法是最好的选择。因为生物将解法比较简单，降解过程所需条件温和、酶解过程无污染物产生、无毒、耗能低、产物安全性高，是生产甘露寡糖最理想的方法。在节约资源，保护环境的基础上，酶解法做到甘露寡糖的制备提供了一种极佳的选择。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
一种糖苷水解酶及其复合酶在半乳甘露聚糖降解中的应用(CN109055333A)，首次克隆了来自嗜碱芽孢杆菌N16-5的糖苷水解酶基因man113A，导入pET28a载体并在大肠杆菌中诱导表达。纯化获得的113家族糖苷水解酶Man113A具有水解甘露寡糖产生甘露糖的活性。同时，该酶可用于与α-半乳糖苷酶协同作用，对槐豆胶、瓜尔豆胶等廉价半乳甘露聚糖底物进行降解，同时生成甘露糖和半乳糖。以槐豆胶为底物甘露糖和半乳糖转化率分别达到11.6％和8.8％，以瓜尔豆胶为底物甘露糖和半乳糖转化率分别达到8.4％和15.3％。
通过对比，上述专利公开文献主要是获得了Man113A蛋白，及该蛋白的应用，本发明主要是借助于响应面法优化了两种酶的复配工艺，主要保护的是响应面法优化瓜尔豆胶的水解方法及最终的工艺参数，因此存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，该方法首次利用半乳甘露聚糖底物瓜尔豆胶制备甘露糖，半乳糖及甘露寡糖，丰富了甘露糖，半乳糖及甘露寡糖的来源，条件温和，酶解过程无污染物产生，且无毒、耗能低、产物安全性高，24h单糖及寡糖的生成率达到88％。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，步骤如下：
⑴制备质量浓度0.5％的瓜尔豆胶底物；
⑵向底物中加入甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的复合酶，底物与复合酶的体积比为4：1，甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的酶活力比为65:1，并调节混合物的pH为6.0；
⑶搅拌均匀后，放入40℃水浴锅中保温24±1h，将反应液沸水浴加热10min， 10,000-12,000rpm离心5-10min，收集上清液，即得半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物。
而且，所述步骤⑴的具体步骤如下：
用20mM柠檬酸缓冲液配置质量浓度0.5％瓜尔豆胶底物，并于115℃下进行高压蒸汽灭菌处理，待冷却后于4℃冷藏备用。
而且，所述步骤⑵中半乳糖苷酶为α-半乳糖苷酶Gal27A，甘露聚糖酶为甘露聚糖酶 ManA。
而且，所述半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物还经过如下处理：
应用离子色谱技术对瓜尔豆胶水解产物进行定性和定量分析，具体条件为：
流动相组分：200mmol NaOH；色谱柱：Dionex Cabropac PA 1 150mm×3mm、6μm，Diono×PA 1Guard预柱、30mm×3mm、6μm；检测器：GoldAg-AgCl，脉冲安培检测器；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL。
本发明取得的优点和积极效果为：
本发明为一种利用响应面法优化甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，本发明方法首次利用半乳甘露聚糖底物瓜尔豆胶制备甘露糖，半乳糖及甘露寡糖，丰富了甘露糖，半乳糖及甘露寡糖的来源，条件温和，酶解过程无污染物产生，且无毒、耗能低、产物安全性高，24h单糖及寡糖的生成率达到88％。
附图说明
图1为本发明中还原糖的标准曲线图；
图2为本发明中甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶的单因素分析中温度的影响图；
图3为本发明中甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶的单因素分析中pH的影响图；
图4为本发明中甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶的单因素分析中最优酶活添加比的影响图；
图5为本发明中甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶的响应面预测值与实际值之间的比较图；
图6为本发明中响应面法优化甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶的各因素之间的交互作用图；其中，(a)表示反应温度和pH值之间的交互作用，(b)表示酶活添加比与反应温度之间的交互作用，(c)表示酶活添加比与pH值之间的交互作用；
图7为本发明中离子色谱法对甘露糖进行定量的标曲图；
图8为本发明中离子色谱法对半乳糖进行定量的标曲图；
图9为本发明中离子色谱法对甘露二糖进行定量的标曲图；
图10为本发明中离子色谱法对甘露三糖进行定量的标曲图；
图11为本发明中甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶底物最终产物的离子色谱图；图中M1：甘露糖；M2：甘露二糖；M3：甘露三糖；M4：甘露四糖；G：甘露糖。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，步骤如下：
⑴制备质量浓度0.5％的瓜尔豆胶底物；
⑵向底物中加入甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的复合酶，底物与复合酶的体积比为4：1，甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的酶活力比为65:1，并调节混合物的pH为6.0；
⑶搅拌均匀后，放入40℃水浴锅中保温24±1h，将反应液沸水浴加热10min， 10,000-12,000rpm离心5-10min，收集上清液，即得半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物。
较优地，所述步骤⑴的具体步骤如下：
用20mM柠檬酸缓冲液配置质量浓度0.5％瓜尔豆胶底物，并于115℃下进行高压蒸汽灭菌处理，待冷却后于4℃冷藏备用。
较优地，所述步骤⑵中半乳糖苷酶为α-半乳糖苷酶Gal27A，甘露聚糖酶为甘露聚糖酶 ManA。
较优地，所述半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物还经过如下处理：
应用离子色谱技术对瓜尔豆胶水解产物进行定性和定量分析，具体条件为：
流动相组分：200mmol NaOH；色谱柱：Dionex Cabropac PA 1 150mm×3mm、6μm，Diono×PA 1 Guard预柱、30mm×3mm、6μm；检测器：Gold Ag-AgCl，脉冲安培检测器；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL。
具体操作及验证试验如下：
一、底物的配制及还原糖标曲的绘制：
1、底物的配制：称取0.5g瓜尔豆胶少量多次加入100mL pH为7.0的柠檬酸缓冲液中，并不停搅拌，形成均匀的乳浊液，115℃灭菌15-20min，待冷却后于4℃保存备用。
2、还原糖标曲的绘制：将180mg还原糖溶于10ml的柠檬酸-磷酸氢二钠的缓冲液中，配制成终浓度为10mM的溶液。用pH为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至不同浓度，分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0、2.4mM的标准梯度溶液，终体积是1ml。分别加入1ml的DNS试剂，沸水浴10min后迅速冷却反应液，540nm处测定吸光值。以吸光值为横坐标，还原糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。
3、计算协同率，
A–实验组Gal27A和ManA协同加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mM；
AC–实验组Gal27A单独加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mM；
AA–实验组ManA单独加入底物溶液中反应后的还原糖生成量，单位mM。
二、α-半乳糖苷酶Gal27A及甘露聚糖酶ManA协同作用单因素条件优化：
1、温度对甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶底物的影响
取pH为7.0的缓冲液配置的0.5％的瓜尔豆胶底物，分别将800μL底物在30℃、35℃、 40℃、45℃、50℃和60℃预热3-4min，然后分别加入200μL甘露聚糖酶ManA(0.76U)、半乳糖苷酶Gal27A(0.9U)以及同时加入甘露聚糖酶ManA(0.76U)和半乳糖苷酶Gal27A(0.9U)，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃反应15min，加入1mL DNS后，于沸水浴中煮10min，待冷却后将反应液于540nm处测定其吸光度值，代入还原糖当量标准曲线中计算还原糖产生量，并计算协同率，结果如图2所示，确定最佳协同反应温度为40℃。
2、pH对甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于甘露聚糖底物的影响
用pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配置质量浓度0.5％的瓜尔豆胶，将800μL 底物在40℃预热3-4min，分别加入200μL甘露聚糖酶ManA(0.76U)、半乳糖苷酶Gal27A (0.9U)以及同时加入甘露聚糖酶ManA(0.76U)和半乳糖苷酶Gal27A(0.9U)，反应15min，加入1mL DNS后，于沸水浴中煮10min，待冷却后将反应液于540nm处测定其吸光度值，代入还原糖当量标准曲线中计算还原糖产生量，并计算协同率，结果如图3所示，确定最佳协同反应pH为7.0。
3、不同添加比(U:U)对甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于甘露聚糖底物的影响
用pH为7.0的缓冲液配置质量浓度0.5％瓜尔豆胶，将800μL底物在45℃预热3-4min，将200μL甘露聚糖酶ManA和半乳糖苷酶Gal27A混合酶液按照不同添加比加入反应体系中，添加比为160:1(14.4U:0.09U)、80:1(7.2U:0.09U)、40:1(3.6U:0.09U)、20:1(1.8U:0.09 U)、10:1(0.9U:0.09U)、5:1(0.45U:0.09U)。在最适反应条件下反应15min，加入1mLDNS后，于沸水浴中煮10min，待冷却后将反应液于540nm处测定其吸光度值，代入还原糖当量标准曲线中计算还原糖产生量，并计算协同率，结果如图4所示，确定最佳协同反应配比为80∶1。
三、响应面法优化甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶底物的条件：
在协同作用的温度、pH和配比的单因素实验结果基础上，对协同作用的条件以温度 (35℃、40℃、45℃)，pH(5.0、6.0、7.0)和酶活添加比(20∶1、40∶1、80∶1)三个因素进行三因素三水平实验设计。对响应面实验的设计与因素水平如表1所示，按不同实验组合条件进行协同作用研究，以协同率为响应值(Y值)，协同作用于瓜尔豆胶的实验响应值如表 2所示，利用响应面分析软件对协同作用于瓜尔豆胶所获得的试验数据表2进行方差分析，分析结果如表3所示，根据单因素实验结果，结合Box-Behnken设计原则，选取温度、pH和酶活比例为自变量，按照-1、0、1的低、中、高三水平编码，以协同率为响应值，建立多元二次方程，通过对温度(A)，pH(B)和添加比(C)与响应值协同率(Y)之间的关系进行拟合，得到的响应曲面多元二次回归模型方程为：
表1作用于瓜尔豆胶底物的响应面实验因素与水平
表2 ManA和Gal27A协同作用于瓜尔豆胶的响应面实验设计与结果
表3 ManA和Gal27A协同作用于瓜尔豆胶的响应面实验结果方差分析表
*表示显著；**表示极显著
对实验获得的回归方程的各项进行方差分析可知，该模型的F＝46.47，显著性水平达P ＜0.0001，表明该实验模型得到的回归方程效果达到了显著水平，能够正确地反映各因素与响应值之间的变化关系，具有统计学意义。模型中的失拟项F＝6.57，P＝0.0503(＞0.05)，表示失拟项不显著，说明该模型在整个被研究的回归区域内具有良好的拟合效果，模型残差均由随机误差引起，模型预测准确度高。另外，预测值与真实值之间的比较如图5所示，这些点分布在相对接近回归线的位置，表明模型预测值与实验值吻合性较好(R2＝0.98)，可以利用该模型代替真实的试验点进行结果的分析。该模型的CV＝1.30％，AdeqPrecision＝ 17.95，则都符合响应面的检验原则。则表明该实验模型可靠，有着较高的可信度和精确度。根据F值和P值看出，影响ManA和Gal27A协同水解瓜尔豆胶的因素主次顺序为：反应温度＞添加比＞pH。
由表3中的F值和P值可知，交互项BC的偏回归系数(P＜0.05)显著，说明pH和添加比的交互项对协同率有显著的影响。交互项AB和AC的偏回归系数(P＞0.05)不显著，说明温度与pH的交互项以及温度与酶活力比的交互项对协同率的影响不显著。如图6所示，为每两种因素之间的交互作用对ManA和Gal27A协同水解瓜尔豆胶的影响响应面图。
分析图6(a)可知，在保持添加比为零水平(40:1)不变的条件下，协同率会随着温度的增加而增加；在一定温度下，pH的增加导致了协同率先增加后降低(在pH处于5至6之间时，随着pH的升高，协同率增加，pH处于6至7之间时随着pH的升高，协同率逐渐降低)。从图6(b)中可知，在保持pH值为零水平(pH＝6)不变的情况下，协同率也是随着温度的增加而增加，在添加比处于20:1至68:1之间随着添加比的增加协同率逐渐增加，在添加比处于68:1至80:1之间略有下降趋势。从图6(c)可知，在保持温度为零水平(40℃) 不变的情况下，添加比及pH值过高或过低都会影响ManA和Gal27A的协同率，使协同率有所降低。
利用Design-Expert 8.06软件对实验数据进行优化及预测，以便进一步确定ManA和 Gal27A协同作用于瓜儿豆胶的最佳条件。优化得到的最佳工艺条件为反应温度40.0℃、反应 pH 6.2、ManA和Gal27A的酶活力比为65.5:1，此条件下协同率为2.49。考虑实际以及为了实验操作方便，将该水解条件修改为：反应温度40℃、反应pH 6.0、ManA和Gal27A的配比为65:1。按照该条件进行多次平行实验，以验证响应面优化法的可靠性。在实际中所测得的协同率为2.48(n＝9)，该值与模型理论预测值2.49相差较小，由此表明构建的实验模型的预测值与实际值的拟合性能较好，采用响应面法优化ManA和Gal27A协同作用于瓜儿豆胶的工艺条件参数准确可靠，建立的模型具有可靠性。
四、甘露聚糖酶及半乳糖苷酶协同作用于瓜尔豆胶底物最终产物的离子色谱：
1、离子色谱的样品的处理
样品用超滤管(3kDa)超滤离心，以去除样品中的蛋白质，上样前过0.22μm滤膜。离子色谱的操作条件如下：流动相组分：A：500mmol NaOH，B：去离子水；流动相条件： 40％A+60％B等度进样；色谱柱：Dionex Cabropac PA 1(150mm×3mm，6μm),Diono×PA 1 Guard(预柱，30mm×3mm，6μm)；检测器：GoldAg-AgCl，脉冲安培检测器；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL。
2、离子色谱标曲的绘制
用去离子水配置5mg/L，7.5mg/L，10mg/L，15mg/L，20mg/L，30mg/L浓度梯度的甘露糖水溶液，离子色谱进样，计算甘露糖峰积分面积，以积分面积为横坐标，甘露糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图7。同上步骤绘制半乳糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖标准曲线，如图分别为图8、9、10。
3、水解产物分析
根据对ManA与Gal27A的协同作用条件优化的结果，在反应温度40℃、反应pH 6.0、ManA和Gal27A的配比为65:1条件下制备水解产物。取800μL的已灭菌底物中加入200μL 含ManA(3250U)和Gal27A(50U)混合酶液(为了缩短反应时间，加大了酶量)，反应期间在12h和24h时间点进行取样，将水解产物用去离子水稀释50倍后用离子色谱对12h 和24h的水解产物进行分析，发现24h水解完全，24h离子色谱定性结果如图11，对24h的产物定量分析结果如表4所示。
半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的生成率是指水解释放出的半乳糖，甘露糖及甘露寡糖与瓜尔豆胶总量的比值，计算公式如下：
因此水解瓜尔豆胶生成半乳糖，甘露糖及甘露寡糖的总生成率为88％。
表4瓜尔豆胶24h水解产物组分分析
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
Claims (4)
1.一种甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴制备质量浓度0.5％的瓜尔豆胶底物；
⑵向底物中加入甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的复合酶，底物与复合酶的体积比为4：1，甘露聚糖酶和半乳糖苷酶的酶活力比为65:1，并调节混合物的pH为6.0；
⑶搅拌均匀后，放入40℃水浴锅中保温24±1h，将反应液沸水浴加热10min，10,000-12,000rpm离心5-10min，收集上清液，即得半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物。
2.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体步骤如下：
用20mM柠檬酸缓冲液配置质量浓度0.5％瓜尔豆胶底物，并于115℃下进行高压蒸汽灭菌处理，待冷却后于4℃冷藏备用。
3.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，其特征在于：所述步骤⑵中半乳糖苷酶为α-半乳糖苷酶Gal27A，甘露聚糖酶为甘露聚糖酶ManA。
4.根据权利要求1至3任一项所述的甘露聚糖酶及半乳糖苷酶复配水解瓜尔豆胶生产半乳糖、甘露糖及甘露寡糖的方法，其特征在于：所述半乳糖、甘露糖及甘露寡糖混合物还经过如下处理：
应用离子色谱技术对瓜尔豆胶水解产物进行定性和定量分析，具体条件为：
流动相组分：200mmol NaOH；色谱柱：Dionex Cabropac PA 1 150mm×3mm、6μm，Diono×PA 1 Guard预柱、30mm×3mm、6μm；检测器：GoldAg-AgCl，脉冲安培检测器；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL。
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