CN112680365B

CN112680365B - 一种白僵菌用液体培养基及白僵菌菌剂制备方法

Info

Publication number: CN112680365B
Application number: CN202110143160.1A
Authority: CN
Inventors: 程志强; 于晓斌; 赵春莉; 刘文丛; 高峰
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112680365A

Abstract

本发明提供了一种白僵菌用液体培养基及白僵菌菌剂制备方法，实现快速生产白僵菌，其是将菌糠、水、硫酸锰和硝酸铵混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水4～5ml，每克菌糠中加入硫酸锰0.03～0.05g，每克菌糠中加入硝酸铵0.05～0.1g。将浓度为10⁷孢子/ml的白僵菌接种液接入白僵菌用液体培养基，按每克干菌糠加入接种液0.05～0.10ml，密封后在25～27℃摇床中以150rpm速度培养4～6d后收获白僵菌菌剂，本发明产孢量高，生产成本较低。

Description

一种白僵菌用液体培养基及白僵菌菌剂制备方法

技术领域

本发明属于发酵培养技术领域，尤其涉及一种白僵菌用液体培养基及白僵菌菌剂制备方法。

背景技术

白僵菌是一种子囊菌类的真菌，能够在自然条件通过体壁接触感染杀死害虫。其可寄生15个目149个科的700余种昆虫，对人畜和环境比较安全、害虫一般不易产生抗药性、可与某些化学农药(杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂)同时使用。至今为止，白僵菌在国际上已有17种产品注册登记，用于防治蛴螬、家蝇、介壳虫、白粉虱、蚜虫、蓟马、马铃薯叶甲、蜚蠊、蝗虫、蚱蜢、蟋蟀、棉铃象、棉跳盲蝽、玉米螟、天牛、甘蔗金龟子等害虫。白僵菌高孢粉是国家***推广的高效生物杀虫剂之一，可广泛应用于森林害虫，蔬菜害虫，旱地农作物害虫等。多年来，国内应用白僵菌对近40种农林害虫防治成功，如今在生产中使用的主要有:松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫等。白僵菌防治最成功的是苗圃、草坪、农田等的蛴螬，蛴螬危害花生、大豆、草坪、蔬菜、苗圃等多种作物。在有机农产品、茶叶生产中广泛应用。

白僵菌经济、快速大量增殖生产是白僵菌大量用于生物防治实践的前提条件。目前国内外学者尝试使用当地农业废料进行白僵菌的培养，并且得到了孢子数量可观的白僵菌。菌糠是指食用菌栽培采收后的培养基剩余物，作为一种农业生产中的废弃物，其主要组成为食用菌菌丝体，纤维素含量约10％-30％，粗蛋白含量约6％-13％，粗脂肪含量约1％-3％。如若不及时处理利用，还会造成资源浪费和环境污染。研究发现，废弃的菌糠中的营养物质可以作为作物的养料，也可以用来培养其他食用菌。若将其进行利用，可以达到变废为宝的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种白僵菌用液体培养基，实现快速生产白僵菌，其是将菌糠、水、硫酸锰和硝酸铵混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水4～5ml，每克菌糠中加入硫酸锰0.03～0.05g，每克菌糠中加入硝酸铵0.05～0.1g。

作为本发明更优的技术方案，所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、平菇菌糠、滑子蘑菌糠中的一种或是几种。

作为本发明更优的技术方案，所述的每克菌糠中加入水4ml，每克菌糠中加入硫酸锰0.03g，每克菌糠中加入硝酸铵0.05g。

作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸汽压力为0.11MPa。

作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽灭菌时间30min。

本发明还有一个目的是提供一种白僵菌菌剂制备方法，生产成本较低并且周期较短，实现白僵菌大量培养，具体步骤如下：将白僵菌接种液接入白僵菌用液体培养基，按每克干菌糠加入接种液0.05～0.10ml，密封后在25～27℃摇床中以150rpm速度培养4～6d后收获白僵菌菌剂。

作为本发明更优的技术方案，按每克干菌糠加入接种液0.10ml。

作为本发明更优的技术方案，所述的白僵菌接种液通过冲洗长有白僵菌的平板得到，所述的白僵菌平板的制备过程包括:将白僵菌菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养7-10天后收获。

有益效果如下：

本发明相对于现有的固体发酵减少了发酵时间，增加了产孢量，本发明中的液体发酵所需时间为6天，得到最优孢子量浓度为1.99×10¹⁰，而常见的固体发酵时间大体都在8-10天得到的菌剂孢子数为0.2×10¹⁰左右。

本发明使用由菌糠和添加剂制备得到的液体培养基培养白僵菌，为白僵菌的生长提供大部分的营养物质，硝酸铵和硫酸锰作为菌糠培基的补充物质，为白僵菌的增殖提供N源和生长所需的无机盐成分，产孢量高；同时菌糠作为农业废料，其经济易得，使用菌糠培养淡紫拟青霉，在获得生防菌的同时也提高了菌糠的利用价值。

本发明的白僵菌菌剂的制备方法操作简单、流程清晰，对生产环境和生产设备要求低，生产成本较低生产周期较短，在培养过程中使用摇床培养基进行混合，在增加其供氧量的同时，也减少了生产中杂菌的污染问题，非常适合小型企业和生产单位快速生产白僵菌。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施列来进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅限于下面的实施例，不能理解为对发明保护范围的限制。

所述的白僵菌购自广东省微生物菌种保藏中心，编号为3.428。

实施例1：

第一步：白僵菌的菌糠培养基的制备；

在50ml锥形瓶中放入2g菌糠、0.06g硫酸锰、0.10g硝酸铵、8ml蒸馏水充分混合高压蒸汽121℃，灭菌30min得到。

第二步：白僵菌平板制备；

将白僵菌菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在25℃培养箱中培养10天后收获。

第三步：通过冲洗长有白僵菌的平板，得到浓度为10⁷孢子/ml的白僵菌接种液；

第四步：接入实施例1中的菌糠培养基，在灭菌的装有菌糠培养基的50ml锥形瓶中加入0.20ml的接种液，瓶口用封口膜封口，放在25℃的摇床中培养6d后收获。；

第五步：将收获产物进行测量，使用4层无菌纱布过滤，得到滤液。测量滤液中的孢子数。

使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例2：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的蒸馏水的体积为10ml。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例3：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的硝酸铵的质量为0.16g。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例4：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第一步中所加入的硫酸锰的质量为0.08g。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例5：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所设定的温度为29℃。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例6：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所加入的接菌量的体积为0.14ml。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例7：

本实施例与实施例1的区别仅在于：第四步中所培养的时间为5d。使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量见表1

实施例1至7中使用各种菌糠制备白僵菌液体培养基及产孢量如表1所示。

表1

实施例1中木耳菌糠作为培养基发酵的白僵菌孢子液浓度最大，比同等条件下其他菌糠提高3.0-5.0％，比白僵菌孢子液浓度最低的实施例2的平菇菌糠提高了45.2％。

本发明相对于现有的固体发酵减少了发酵时间，增加了产孢量。本发明中的液体发酵所需时间为6天，得到最优孢子量浓度为1.99×10¹⁰，而常见的固体发酵时间大体都在8-10天得到的菌剂孢子数为0.2×10¹⁰左右。

本发明的培养基配方和制作方法简单，材料易得，成本低廉，白僵菌孢子产量高。白僵菌的培养方法操作简单，生产工艺流程清晰，生产周期短，孢子产量大，对生产环境和生产设备要求低，可操作性强，生产成本较低。

本发明中的接种液浓度作为实施例中的常量，许多相关文献中使用的较优接种液浓度为10⁷，理论上，上述步骤中10⁷可以改为其他数据，从接种液用量研究的结果来估计，在接种液用量不变的情况下，改变接种液浓度，得到的白僵菌菌剂的最终孢子量会出现先上升到达最高点后下降的现象。

以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种白僵菌用液体培养基，其特征在于：是将菌糠、水、硫酸锰和硝酸铵混匀后经高压蒸汽灭菌制备得到，每克菌糠中加入水4~5ml，每克菌糠中加入硫酸锰0.03~0.05g，每克菌糠中加入硝酸铵0.05~0.1g；所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、平菇菌糠、滑子蘑菌糠中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的一种白僵菌用液体培养基，其特征在于：所述的每克菌糠中加入水4ml，每克菌糠中加入硫酸锰0.03g，每克菌糠中加入硝酸铵0.05g。

3.如权利要求1所述的一种白僵菌用液体培养基，其特征在于：所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸气压力为0.11MPa。

4.如权利要求1所述的一种白僵菌用液体培养基，其特征在于：所述的高压蒸汽灭菌的时间为30min。

5.一种白僵菌菌剂制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将白僵菌接种液接入如权利要求1所述的白僵菌用液体培养基，按每克干菌糠加入接种液0.05~0.10ml，密封后在25~27°C摇床中以150rpm速度培养4~6d后收获白僵菌菌剂。

6.如权利要求5所述的一种白僵菌菌剂制备方法，其特征在于，按每克干菌糠加入接种液0.10ml。

7.如权利要求5所述的一种白僵菌菌剂制备方法，其特征在于，所述的白僵菌接种液是通过将白僵菌块放置在装有灭菌PDA培养基中，在29℃培养箱中培养7-10天后培养后，冲洗平板，得到白僵菌接种液。