CN112680361A - 一种加纳木霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种加纳木霉菌，所述加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌的菌株号TR2122，保藏号为CGMCC No.21025。本发明还公开了一种有机水溶肥，含有本发明加纳木霉菌发酵产生的加纳木霉菌发酵上清液。本发明通过发酵工艺，既解决了加纳木霉菌工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。本发明制备的有机水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。

Description

一种加纳木霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种加纳木霉菌及其应用。

背景技术

木霉菌(包括“加纳”木霉)是自然界中对多种植物病原菌有抑制和灭杀功能的微生物。人类利用木霉菌的优良特性，通过特定的工艺加工技术，将其制成不同剂型的生物农药。木霉菌分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的厚垣孢子、具有易贮藏和使用方便等特点，并且具有以下功效：防治多种植物病害，促进植物生长。

水溶肥是一种经水溶解或稀释，用于滴灌施肥、喷灌施肥、叶面施肥、无土栽培和浸种蘸根等用途的液体或固体肥料。因其具有速溶、施肥均匀、吸收率高、见效快、施用方便等显著优点，得到了迅猛的发展，随着国家对水肥一体化的大力推广，水溶肥市场规模和销量在逐年增加。截止到2015年6月1日，在农业部登记的水溶肥料品种有6545个，其中大量元素水溶肥料1383个，微量元素水溶肥料1668个，含氨基酸的水溶肥料1630个，含腐植酸水溶肥料1527个，中量元素水溶肥料240个，有机水溶肥料97个。国内各种水溶肥料的产量相差较大，其中大量元素水溶肥料占68％，中量元素的占10％，腐植酸水溶肥料占12％，其他类型的占10％。然而，以加纳木霉菌发酵上清液为溶剂制造生产的水溶肥，在我国目前的肥料登记产品中还屈指可数。

近年来，随着我国生物农药行业的迅猛发展，木霉菌相关产品增长势头强劲。目前生物农药企业多采用液体发酵技术，批量生产木霉菌制剂。在木霉菌类活体微生物制剂的生产过程中会产生大量发酵上清液，每生产1kg的木霉菌产品就有1.5kg的发酵上清液产生，这些上清液中含有多种微量元素，以及发酵过程中产生的小分子活性物质如多种氨基酸、发酵过程产生多种大分子活性物质如活性蛋白酶等。这些活性物质配以腐植酸能促进作物根系生长，增强作物抗逆能力，促进土壤中有益微生物代谢和生长，缓冲土壤酸碱度，提高土壤保水、保肥和通气能力，提高作物对土壤水肥的吸收，使植株生长健壮，根深叶茂，增加植株干重；促进叶片光合作用，使得果实光亮，促进中微量元素吸收，增加果实重量。然而目前木霉菌制剂生产工厂处理发酵上清液的正常流程是其经过三废处理排放进入环境，这样“简单粗暴”的处理方式，不仅造成一定程度的资源浪费，而且存在污染环境的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种加纳木霉菌及其应用，不但能够减少废水处理、降低能耗，还能满足肥力高、吸收快、无环境污染、增强植物的抗逆和抗病害能力的要求。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种木霉菌，所述加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌的菌株号TR2122，保藏号为CGMCC No.21025。

本发明的加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌保藏于于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2020年12月21日。

本发明的第二方面是提供一种加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，采用上述加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌发酵，包括如下步骤：

步骤一，将所述木霉菌菌种接于培养基中，恒温培养；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，然后向所述中级发酵罐中倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵，得到木霉菌发酵液；

步骤四，使用离心机将步骤三所得的所述木霉菌发酵液进行离心，即得所述加纳木霉菌发酵上清液。

进一步地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

进一步优选地，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

进一步地，步骤三中，所述发酵的条件为：28-30℃温度、0.4-0.5kg压力、1500-1800L/H空气流量和120-150rpm转速。

进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体条件为：121℃温度、15磅压力下灭菌20min。

进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌前，向所述中级发酵罐内加入消泡剂；优选为：在所述100L规格中级发酵罐中加入50ml消泡剂。

进一步地，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28-30℃。

进一步地，所述中级发酵罐指的是大于1L而小于1吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。

本发明的第三方面是提供一种有机水溶肥，采用上述方法制得的加纳木霉菌发酵上清液，包括如下重量百分比的组分：

本发明的第四方面是提供上述有机水溶肥的制备方法，包括如下步骤：

按照配比，将所述加纳木霉菌发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述矿物腐植酸钾加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入所述硝酸钾、尿素、聚磷酸铵、磷酸氢二钾、糖蜜粉和胡萝卜素，搅拌完全溶解后，过滤即得所述有机水溶肥。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1、本发明通过发酵工艺，既解决了木霉菌工业废水的环境污染问题，又使废物得到再利用，产生了环境与经济的双重效益。

2、本发明制备的有机水溶肥不仅可以明显提高农作物的产量，改善农作物的品质，长期使用可以改良土壤环境以及增强植物的抗逆性和抗病性。

附图说明

图1为本发明TR2122的分生孢子梗形态；

图2为本发明TR2122的分生孢子梗形态；

图3为本发明TR2122的分生孢子形态；

图4为本发明TR2122的菌落形态PDA平板照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了一种加纳木霉菌，从上海市浦东新区孙桥番茄根围土壤中采集分离得到，上述加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌的菌株号TR2122，保藏号为CGMCCNo.21025。

本发明的加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2020年12月21日。

加纳木霉菌株培养特性：

本发明加纳木霉菌株在PDA培养基中，黑暗条件下20-30℃培养64小时，菌落半径可以达到70mm，40℃培养64小时，菌落半径可以达到50-60mm。参照图4，分生孢子均一、连续地布满在菌落上，黑绿色；多数分生孢子在35℃形成，温度逐渐到30℃和5℃时分生孢子产量逐渐减少。25℃时气生菌丝呈棉絮状(DMC上)。20℃ 1小时黑暗和12小时冷荧光照射培养1周，菌落上的气生菌丝稀疏，分生孢子均一地呈连续的宽带状分布，没有形成离散分布的分生孢子簇的倾向。

加纳木霉菌株微观形态特性：

参照图1-3，本发明加纳木霉菌株的分生孢子梗不形成可育延伸物。缺乏不育的毛状结构。典型的分生孢子梗包括发育强壮的中轴，上面向顶方向着生单个瓶梗，然后从顶端向下产生成对的逐渐变长的二次分枝。瓶梗直接产生二次分枝上，一般不是旋涡状排列。分生孢子梗主轴宽度为(1.8～)2.5～3.5(～4.0μm)。瓶梗圆柱状或者在中间稍微膨大，直或者弯曲，长度为(4.5～)6.0～10.5(～15.0)μm，最宽处为(2.0～)2.5～3.5(4.5～)μm，基部宽度为(1.0～)1.5～2.5(～3.5)μm，长宽比例为(1.3～)2.0～3.0(～6.8)，母细胞宽度为(1.8～)2.5～3.5(～4.0)μm。少见间生瓶梗。分生孢子绿色，窄或细椭圆形，大小为(3.5～)4.5～6.2(～7.5)×(2.0～)2.2～3.2(～4.5)μm，长宽比例为(1.3～)1.5～2.5(～3.2)；光滑或者有疣状突起。典型菌株不产生厚垣孢子，但有些菌株产生大量厚垣孢子，球形或者亚球形，端生或者间生(间生时其性状为其母细胞的性状)，大小为(4.5～)7.0～10.2(11.7)μm。不产生共无性型。

加纳木霉的分子生物学鉴定：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应)对本发明加纳木霉菌株TR2122进行分子生物学鉴定。

用引物ITS4和ITS5扩增的ITS1-5.8S-ITS2区序列得到的序列段，通过NCBI GenBank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，该序列段与加纳木霉菌的相似度达到99％。

ITS序列如下：

TTGAAGGAAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAaCCaGCGGAGGGAtCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTTCCGTCGCGGCTCTGTTTTAACTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCACGCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATCCAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTtGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA

采用引物Ef728和Tef1αR扩增Tef1α序列得到的序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，Tef1α序列与加纳木霉的相似度达到99％。

Tef1α序列如下：

TCATCGAGAAAGTCGAGAAGGTAAGCTTTAGTCCGTTCAGTATCGAGTTTCGAGCCCGATTTTTCCTGCCTCTGTGCCCAACATTTGTCGACCGAATTTCGCTGTCGACGGGATTTTTCCCATTCACCCCGCTTTCTTCTACCCCTCCTTTGAGCGACGCAAAATTTTTTTTGCTACGCCGTTGGTTTTAGCGGGGGTGCATCTCGAGCAACCCCACCATTACTCTCTGGCCGCTCTCTGGTCCTCCAGACAACAGTCAACGCACCCGCATCGTCATTCCTCCAGCAGTTTCTCCAGGATGCTAATCAAATTCCACTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTACGTTTGATCCATTGCCTTTTCCGTGCGTCGTTGTCGGCACAAACTAACATGTCCCTCATAGACGCTCCCGGCCACCGTGACTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGACTGCGCTATCCTCATtATCGCTGCCGgtACTGGTGAGTTCGAGGATGGTATCTCTAAGGGGA

通过分子生物学菌种鉴定并结合形态特征，可确定本发明分离的菌株为加纳木霉菌株。

上述加纳木霉菌株的分生孢子阶段为半知菌门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢(Moniliaceae)、木霉属(Trichoderma)，其有性态是属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、肉座目(Hypocreales)、肉座科(Hypocreaceae)、肉座菌(Hypocrea)。

实施例2

本实施例提供一种加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将实施例1分离得到的加纳木霉菌种接于PDA培养基中，恒温培养一周；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养24H，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液121℃温度、15磅压力下灭菌20min后，保持正压，冷却至30℃，然后向中级发酵罐中倒入步骤二所得的一级种子液，加压通入无菌空气，在28-30℃温度、0.4-0.5kg压力、1500-1800L/H空气流量和120-150rpm转速条下进行发酵6天，得到木霉菌发酵液；

步骤四，使用离心机将木霉菌发酵液进行离心，即得加纳木霉菌发酵上清液。

步骤二和步骤三中，上述培养液包括如下重量比的组分：

优选地，上述培养液包括如下(表1)重量比的组分：

表1

实施例3

本实施例提供一种有机水溶肥，分别对应采用上述实施例2中采用组别1-3培养液所得的加纳木霉菌发酵上清液，分别包括如下(表2)重量百分比的组分：

表2

组分	实施例3-1	实施例3-2	实施例3-3
				加纳木霉菌发酵上清液	70％	67.11％	62.50％
矿物腐植酸钾	3.43％	2.75％	3.25％
				硝酸钾	3.72％	8.0％	2.68％
尿素	3.08％	3.25％	8.20％
				聚磷酸铵	2.32％	3.35％	4.82％
磷酸氢二钾	6.25％	6.94％	6.00％
				糖蜜粉	10.70％	8.50％	12.05％
胡萝卜素	0.5％	0.1％	0.5％

上述有机水溶肥采用如下方法制备：按照配比，将所述加纳加纳木霉菌发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述矿物腐植酸钾加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入所述硝酸钾、尿素、聚磷酸铵、磷酸氢二钾、糖蜜粉和胡萝卜素，搅拌完全溶解后，过滤即得所述有机水溶肥，避光存贮在阴凉干燥处。

应用例

田间肥效试验：使用上述实施例3-1制备的含腐殖酸水溶肥开展对葡萄的肥效试验。试验地点在云南省巍山庙街镇进行，葡萄品种为夏黑，示范面积：200亩，示范时间：2020年1月至6月，试验方法：12-18升/亩/季。共设3种处理，分别是：无施肥对照、含腐殖酸水溶肥(上海万力华生物科技有限公司)、复合肥(北京中科利农生物技术研究院)，施肥6个月后对葡萄的根系、树势、产量、品质等方面进行检测。

试验结果表明：

(1)本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄上处理后，葡萄的生长、叶片的色泽、根系和产量均比市售复合肥和无施肥对照有明显的促进作用。从树势和挂果情况对比来看，使用含腐殖酸水溶肥后延长葡萄的瓜果采摘时间，树势更加茂盛，衰败时间明显延长，果实的色泽更加的黑亮。从根系对比情况看，使用含腐殖酸水溶肥后葡萄的须根明显增多。试验结果如表3所示：

表3本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄上的促生试验结果

(2)使用过本发明含腐殖酸水溶肥的葡萄其糖分、维生素C、有机酸都要高于市售复合肥和无施肥对照，说明含腐殖酸水溶肥对葡萄品质的提升有非常好的作用。从转色情况看，使用本发明含腐殖酸水溶肥后葡萄转色明显提前，附图3，有利于葡萄提前上市抢占价格市场。试验结果如表4所示：

表4本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄上的品质试验结果

检测项目	含腐殖酸水溶肥	复合肥	无施肥对照
				维生素C(mg/100g)	3.26	3.01	2.62
有机酸(mg/kg)	9.4×10<sup>3</sup>	8.7×10<sup>3</sup>	8.5×10<sup>3</sup>
				糖度(％)	17.8	17.4	17.5

(3)本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄地土壤水解性氮、有效磷、速效钾等改良方面优于售复合肥和无施肥对照，并且土壤的疏松度、有机质含量、阳离子交换量等都有明显的提升，并在本发明含腐殖酸水溶肥处理后的土壤出现了大量可食用野生菌菇。试验结果如表5所示：

表5本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄地土壤改良试验结果

检测项目	含腐殖酸水溶肥	复合肥	无施肥对照
				PH	4.8	4.7	4.3
有机质(g/Kg)	32.9	13.2	13.0
				水解性氮(mg/kg)	258	171	182.6
有效磷(mg/kg)	162	151.8	148.8
				速效钾(mg/kg)	878	758	738
阳离子交换量(cmol/kg(+))	13.38	5.2	4.3
				容重(g/cm<sup>3</sup>)	1.32	1.5	1.43

(4)本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄生长过程中进行液面喷施，对葡萄霜霉病具有一定的防治效果。试验结果如表6所示：

表6本发明含腐殖酸水溶肥在葡萄霜霉病的防效结果

处理	用量	病情指数	防效
				含腐殖酸水溶肥	300-500倍	3.85	45.65
复合肥	300-500倍	5.06	13.89
				无施肥对照	/	5.09	/

上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种加纳木霉菌，其特征在于，所述加纳木霉(Trichoderma ghanense)菌的菌株号TR2122，保藏号为CGMCC No.21025。

2.一种加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，采用如权利要求1所述的加纳木霉菌，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将所述加纳木霉菌菌种接于培养基中，恒温培养；

步骤二，将经步骤一培养后的菌种转移至培养液中进行摇瓶培养，得到一级种子液；

步骤三，将中级发酵罐中的培养液高温高压灭菌，然后向所述中级发酵罐中倒入步骤二所得的所述一级种子液，加压通入无菌空气进行发酵，得到加纳木霉菌发酵液；

步骤四，使用离心机将步骤三所得的所述加纳木霉菌发酵液进行离心，即得所述加纳木霉菌发酵上清液。

3.根据权利要求2所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

4.根据权利要求3所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述培养液包括如下重量比的组分：

5.根据权利要求2所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述发酵的条件为：28-30℃温度、0.4-0.5kg压力、1500-1800L/H空气流量和120-150rpm转速。

6.根据权利要求2所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌的具体条件为：121℃温度、15磅压力下灭菌20min。

7.根据权利要求2所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌前，向所述中级发酵罐内加入消泡剂。

8.根据权利要求2所述的加纳木霉菌发酵上清液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述高温高压灭菌后，所述中级发酵罐保持正压，冷却至28-30℃。

9.一种有机水溶肥，采用如权利要求2-8任一项所述的方法制得的加纳木霉菌发酵上清液，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

10.根据权利要求9所述的有机水溶肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

按照配比，将所述加纳木霉菌发酵上清液投入配料罐中，然后开启搅拌装置；再将所述矿物腐植酸钾加入所述配料罐中，待搅拌彻底溶解后，再加入所述硝酸钾、尿素、聚磷酸铵、磷酸氢二钾、糖蜜粉和胡萝卜素，搅拌完全溶解后，过滤即得所述有机水溶肥。

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