CN112679474A - 一种比率型荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
一种比率型荧光探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物化学技术领域，公开了一种比率型荧光探针及其制备方法与应用，所述比率型荧光探针的通式如式(1)所示：
式中，R1为甲基，R2选自4‑甲基吡啶、甲基，R3选自N,N‑二乙基、4‑甲基哌嗪，X为卤素。该探针具有对核酸的选择性比率荧光反应，理想的生物相容性，使用该探针首次在活细胞中实现了核酸的原位实时比率型荧光成像，成功地监测了活细胞有丝***间期核酸的变化，以及凋亡细胞中染色质的聚集和分离；通过该探针对组织切片中的核酸进行比率荧光成像，可以获得核酸含量和分布的详细信息。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种比率型荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
核酸(DNA/RNA)是存储和传输遗传信息的主要物质基础。核酸的分布和行为是一个重要的动态过程，与细胞的正常功能密切相关。核酸行为的失调会导致细胞功能障碍，并诱发各种疾病的产生，例如癌症和帕金森氏病。追踪活细胞中核酸的动态变化对于了解核酸在不同生物过程中的动态行为和功能之间的关系具有重要意义。例如，追踪核酸复制过程是可以判断细胞有丝***的不同时期和监视细胞***行为变化；跟踪细胞凋亡过程中核酸含量的分布变化可有助于理解和判断凋亡中染色质的异常。但是，目前报道的核酸成像染料并实现对活细胞中核酸含量的原位和实时量化检测。
在临床病理诊断中，除了组织结构和细胞构型特征外，细胞核的状态(例如核浆比，核形态和核酸含量)是恶性肿瘤最重要的评估依据。核酸含量的分布可以为诊断与核酸有关的疾病提供重要依据，例如区分癌症分期。目前常用的组织切片成像技术为苏木精和曙红(H&E)染色。但是，这一技术染色过程复杂，并不能准确量化组织切片的细胞内核酸含量。因此，有必要开发对组织切片和活细胞中核酸含量动态变化的可原位实时跟踪的探针。
比率型荧光成像技术具有自校准和抗干扰能力，可以用于活细胞微环境因素的可视化和定量分析。与基于荧光“开启”型的成像技术相比，比率型荧光成像技术具有更多的优势，例如减少背景和细胞内环境干扰，不受探针浓度影响以及能够进行定量分析。能够对核酸比率荧光响应的荧光探针对于原位，实时跟踪活细胞中核酸的含量和行为具有吸引力。但是，用于核酸响应的比率型荧光探针的设计面临着巨大的挑战，这不仅要求探针具有良好的膜渗透性和低细胞毒性，更重要的是这要求探针对核酸具有选择性的比率荧光应答，以及探针具有适当激发/发射波长。目前没有合适的比率荧光探针用于检测活细胞和组织切片中核酸的含量。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种化合物。
本发明的第二个方面的目的，在于上述化合物的制备方法。
本发明的第三个方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明的第四个方面的目的，在于提供上述化合物和/或试剂盒在检测样品中核酸分布和/或核酸含量中的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种检测细胞中核酸分布和/或核酸含量的方法。
本发明的第六方面的目的，在于提供一种检测组织切片中核酸分布和/或核酸含量的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种化合物，所述化合物的通式如式(1)所示：
式(1)中，R1为甲基，R2选自4-甲基吡啶
甲基，R3选自N,N-二乙基
4-甲基哌嗪
X为卤素。
在一些实施例中，R1为甲基，R2为4-甲基吡啶
R3为N,N-二乙基
X选自氯、溴、碘。
在一些实施例中，R1、R2为甲基，R3为N,N-二乙基
X选自氯、溴、碘。
在一些实施例中，R1为甲基，R2为4-甲基吡啶
R3为4-甲基哌嗪
X选自氯、溴、碘。
在一些实施例中，所述化合物为2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QPP-AS)、2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-甲基-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QMP-AS)和1-甲基-2-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯乙烯基)-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QPP-PS)中的至少一种。
所述2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物的化学结构式如式(2)所示：
所述2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-甲基-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物的化学结构式如式(3)所示：
所述1-甲基-2-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯乙烯基)-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物的化学结构式如式(4)所示：
优选的，所述化合物为比率型荧光探针。
本发明的第二个方面，提供第一方面的化合物的制备方法，其合成线路为：
式中，R1为甲基，R2选自4-甲基吡啶
甲基，R3选自N,N-二乙基
4-甲基哌嗪
X为卤素；
包括如下步骤：
(1)将化合物1与化合物6反应，得到化合物2；
(2)将化合物2与化合物3反应，得到化合物4；
(3)将化合物4与化合物5反应，得到比率型荧光探针。
步骤(1)中所述化合物1和化合物6的摩尔比优选为1：(2～40)；更优选为1：(5～20)。
步骤(1)中所述反应在有机溶剂中进行。
所述有机溶剂优选为乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种。
步骤(1)中所述反应的条件优选为40-50℃搅拌状态下回流反应12～48h。
步骤(2)中所述化合物2与化合物3的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)；更优选为化合物1：(1.05～1.1)。
步骤(2)中所述反应在有机溶剂中进行。
所述有机溶剂优选为1-丁醇。
步骤(2)中所述反应的条件优选为110-150℃搅拌状态下回流反应6～18h。
步骤(3)中所述化合物4与化合物5的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)；更优选为化合物1：(1.05～1.1)。
步骤(3)中所述反应在有机溶剂中进行。
所述有机溶剂优选为1-丁醇。
步骤(3)中所述反应的条件优选为110-150℃搅拌状态下回流反应6～18h。
步骤(3)中反应结束后还包括如下步骤：分离得到沉淀、洗涤、干燥。
本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，包含第一方面的化合物。
本发明的第四个方面的目的，在于提供第一方面的化合物和/或第三方面的试剂盒在检测样品中核酸分布和/或核酸含量中的应用。
所述样品优选为细胞和组织切片中的至少一种。
所述细胞优选为动物细胞。
所述组织切片优选为动物组织切片。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种检测细胞中核酸分布和/或核酸含量的方法，将第一方面的化合物与细胞混合，孵育，进行共聚焦成像。
所述孵育的条件优选为30～40℃孵育2～6小时。
本发明的第六方面的目的，在于提供一种检测组织切片中核酸分布和/或核酸含量的方法，用第一方面的化合物对组织切片进行染色，进行共聚焦成像。
所述染色的时间优选为1～3小时。
本发明的有益效果是：
本发明首次提供了一种用于细胞和组织切片中核酸分布和含量定量检测的化合物，该化合物具有对核酸的选择性比率荧光反应，理想的生物相容性，使用该化合物首次在活细胞中实现了核酸的原位实时比率型荧光成像，成功地监测了活细胞有丝***间期核酸的变化，以及凋亡细胞中染色质的聚集和分离；通过该化合物对组织切片中的核酸进行比率荧光成像，可以获得核酸含量和分布的详细信息。
附图说明
图1是QPP-AS的ESI-MS谱图。
图2是QPP-AS的NMR氢谱图。
图3是QPP-AS的NMR碳谱图。
图4是QMP-AS的ESI-MS谱图。
图5是QMP-AS的NMR氢谱图。
图6是QMP-AS的NMR碳谱图。
图7是QPP-PS的ESI-MS谱图。
图8是QPP-PS的NMR氢谱图。
图9是QPP-PS的NMR碳谱图。
图10是的QPP-AS的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图：其中，A)是QPP-AS的紫外-可见吸收光谱图，B)是QPP-AS的荧光发射光谱图。
图11是QMP-AS与QPP-PS的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图：其中，A)是QMP-AS的紫外-可见吸收光谱图，B)是QPP-PS的紫外-可见吸收光谱图，C)是QMP-AS的荧光发射光谱图，D)是QMP-AS的荧光发射光谱图。
图12是QMP-AS、QPP-PS及QPP-AS对细胞的毒性图：其中，(A)为A549在不同浓度的QMP-AS、QPP-PS及QPP-AS中的细胞存活率图；(B)是HeLa在不同浓度的QMP-AS、QPP-PS及QPP-AS中的细胞存活率图；(C)是LO2在不同浓度的QMP-AS、QPP-PS及QPP-AS中的细胞存活率图。
图13是QPP-AS对核酸的荧光反应图：其中，A)为QPP-AS对不同浓度的dsDNA的荧光反应图；B)为dsDNA的浓度与I670nm/I510nm的关系图；C)为QPP-AS对不同浓度的小牛胸腺DNA(ctDNA)的荧光响应图；D)为QPP-AS对不同浓度的RNA的荧光响应图。
图14是QMP-AS及QPP-PS对核酸的荧光响应图：其中，A)为QMP-AS对不同浓度的dsDNA的荧光响应图；B)为QMP-AS对不同浓度的dsDNA的荧光响应图。
图15是QPP-AS的细胞成像图：其中，A)为QPP-AS的双发射细胞成像图；B)为QPP-AS与Hoechst 33342在细胞核中的共定位成像图。
图16是QPP-AS在活细胞和固定细胞中对核酸的比率型荧光成像图：其中，A)为QPP-AS在正常活细胞、经DNase处理的固定细胞、经RNase处理的固定细胞中对核酸的比率荧光成像图；B)为QPP-AS的活细胞内3D比率型荧光成像图。
图17是QPP-AS在细胞中对核酸的比率型荧光成像图：其中，A)为QPP-AS在处于有丝***中期的细胞中对核酸的比率型荧光成像图；B)为QPP-AS在处于有丝***末期的细胞中对核酸的比率型荧光成像图；C)为QPP-AS在处于有丝***间期的G2阶段的细胞中对核酸的比率型荧光成像图；D)为QPP-AS在凋亡细胞中对核酸的比率型荧光成像图；E)为细胞有丝***的不同时期的归一化的比率荧光强度图。
图18是QPP-AS在组织中对核酸的比率型荧光成像图：其中，A)为QPP-AS在人结肠直肠癌的癌旁组织中对核酸的比率型荧光成像图；B)为QPP-AS在人结肠直肠癌的癌灶组织中对核酸的比率型荧光成像图；C)为QPP-AS在胆管癌的癌旁组织中对核酸的比率型荧光成像图；D)为QPP-AS在胆管癌的癌灶组织中对核酸的比率型荧光成像图。
图19是实施例1中QPP-AS的合成路线图。
图20是实施例2中QMP-AS的合成路线图。
图21是实施例3中QPP-PS的合成路线图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中的A549(人肺腺癌)，HeLa(人***)和LO2(人肝细胞)是从中山大学实验动物中心(中国广州)获得的。将细胞维持在含有10％FBS，100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的RPMI 1640培养基或DMEM中。将细胞在湿润的培养箱中培养，该培养箱在37℃的恒温下提供5％CO2和95％空气的气氛。
本实施例中的人癌症样品(人类大肠癌组织、人类胆管癌组织)分别于2020年1月至2020年6月从中山大学癌症中心获得。所有样品均在知情同意下获得。这项研究得到中山大学伦理委员会的批准。
实施例1,2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QPP-AS)的制备
QPP-AS的合成路线图如图19所示：
(1)将7-氯-2-甲基喹啉(化合物1-1)(10mmol，1.77g)溶解于30mL乙腈中，加入碘甲烷(100mmol，14.2g)得到反应液，将反应液置于冷凝回流装置中，控制温度在42.5℃，搅拌反应24小时，冷却，反应体系中析出固体，过滤，用乙腈洗涤沉淀5次，将得到的沉淀真空干燥，可得化合物2-1(白色固体，2.64g，产率73％)。
(2)将7-氯-1,2-二甲基喹啉-1-鎓碘化物(化合物2-1)(2mmol，0.636g)和1-(4-吡啶基)哌嗪(化合物3-1)(2.1mmol,0.342g)的混合物置于20mL 1-丁醇中得到反应液，将该反应液置于冷凝回流反应装置中，对反应体系快速搅拌并于118℃回流反应12小时，制得1,2-二甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-鎓碘化物(化合物4-1)；在该反应体系中继续加入4-(二乙氨基)苯甲醛(化合物5-1)(2.1mmol,0.372g)并在原反应条件下继续反应12小时；反应结束后，冷却，溶液中析出固体，过滤，用冷的乙腈对沉淀洗涤5次，将得到的沉淀真空干燥，得到深紫色固体的化合物QPP-AS(0.858g，产率71％)。其ESI-MS谱、NMR谱如图1、图2、图3所示，具体如下：ESI-MS(CH3OH):m/z calcd for[QPP-AS-I]+,478.30；found:478.75.1H NMR(400MHz,CH3OH-d4)δ9.25(d,J＝8.6Hz,1H),9.03(s,2H),8.80(d,J＝9.1Hz,1H),8.74(d,J＝8.7Hz,1H),8.67(d,J＝15.5Hz,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,2H),8.35(d,J＝9.2Hz,1H),8.19(d,J＝15.5Hz,1H),8.04–7.95(m,4H),7.61(s,1H),5.16(s,3H),4.82(dd,J＝14.7,6.1Hz,8H),4.31(q,J＝7.0Hz,4H),2.03(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ156.81,155.69,153.76,150.40,146.25,142.30,141.55,140.77,132.03,131.57,129.56,128.49,122.43,120.67,117.31,115.47,112.77,111.77,107.88,97.20,45.39,45.20,44.42,12.98。
实施例2,2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-甲基-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QMP-AS)的制备
QMP-AS的合成路线图如图20所示：
(1)将7-氯-2-甲基喹啉(化合物1-1)(10mmol，1.77g)溶解于30mL乙腈中，加入碘甲烷(100mmol，14.2g)得到反应液，将反应液置于冷凝回流装置中，控制温度在42.5℃，搅拌反应24小时，冷却，反应体系中析出固体，过滤，用乙腈洗涤沉淀5次，将得到的沉淀真空干燥，可得化合物2-1(白色固体，2.64g，产率73％)。
(2)将7-氯-1,2-二甲基喹啉-1-鎓碘化物，(化合物2-1)(2mmol，0.636g)和1-甲基哌嗪(化合物3-2)(2.1mmol,0.210g)的混合物置于20mL 1-丁醇中得到反应液，将该反应液置于冷凝回流反应装置中，对反应体系快速搅拌并118℃回流反应12小时，制得1,2-二甲基-7-(4-甲基-1-哌嗪-基)喹啉-1-鎓碘化物(化合物4-2)；在该反应体系中继续加入4-(二乙氨基)苯甲醛(化合物5-1)(2.1mmol,0.372g)并在原反应条件下继续反应12小时；反应结束后，冷却，反应体系中析出固体，过滤，用乙腈对沉淀洗涤5次，将得到的沉淀真空干燥，得到紫色固体的化合物QMP-AS(0.683g,产率63％)。其ESI-MS谱、NMR谱如图4、图5、图6所示，具体如下：ESI-MS(CH3OH):m/z calcd for[QMP-AS-I]+,415.29；found:415.66.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝8.8Hz,1H),8.17–8.00(m,3H),7.79(d,J＝8.9Hz,2H),7.66(dd,J＝9.2,1.9Hz,1H),7.48(d,J＝15.5Hz,1H),7.36(s,1H),6.79(d,J＝9.0Hz,2H),4.34(s,3H),3.48(q,J＝6.9Hz,4H),2.86(s,3H),1.16(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.03,153.78,150.58,146.88,142.13,141.53,132.20,131.56,122.43,121.18,118.22,116.41,112.59,111.82,99.50,52.65,44.94,44.44,12.98。
实施例3，1-甲基-2-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯乙烯基)-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物(QPP-PS)的制备
QPP-PS的合成路线图如图21所示：
(1)将7-氯-2-甲基喹啉(化合物1-1)(10mmol，1.77g)溶解于30mL乙腈中，加入碘甲烷(100mmol，14.2g)得到反应液，将反应液置于冷凝回流装置中，控制温度在42.5℃，搅拌反应24小时，冷却，反应体系中析出固体，过滤，用乙腈洗涤沉淀5次，将得到的沉淀真空干燥，可得化合物2-1(白色固体，2.64g，产率73％)。
(2)将7-氯-1,2-二甲基喹啉-1-鎓碘化物，(化合物2-1)(2mmol，0.636g)和1-(4-吡啶基)哌嗪，(化合物3-1)(2.1mmol,0.342g)的混合物置于20mL 1-丁醇中制备反应液，将该反应液置于冷凝回流反应装置中，对反应体系快速搅拌并118℃致溶液回流，反应12小时，制得1,2-二甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-鎓碘化物(化合物4-1)；在该反应体系中继续加入4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯甲醛(化合物5-2)(2.1mmol,0.428g)并在原反应条件下继续反应12小时；反应结束后，冷却，反应体系中析出固体，过滤，用乙腈对沉淀洗涤5次，将得到的沉淀真空干燥，得到深紫色固体的化合物QPP-PS(0.859g,产率68％)。其ESI-MS谱、NMR谱如图7、图8、图9所示，具体如下：ESI-MS(CH3OH):m/z calcd for[QPP-PS-I]+,505.31；found:505.62.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(d,J＝8.6Hz,1H),8.32(d,J＝7.0Hz,2H),8.08(dd,J＝21.9,9.0Hz,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.84(d,J＝8.8Hz,2H),7.69–7.60(m,2H),7.22–7.15(m,3H),7.11(d,J＝8.8Hz,2H),4.36(s,3H),3.99–3.88(m,8H),3.52(s,4H),3.04–2.87(m,4H),2.60(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ172.49,156.65,155.42,153.96,152.16,144.98,142.41,142.31,141.40,131.74,131.13,126.09,121.31,117.94,115.97,115.78,115.16,107.91,96.92,53.27,45.57,45.39,45.14,21.55。
实施例4,QPP-AS、QMP-AS、QPP-PS的光物理性质
取实施例1～3制备的QPP-AS、QMP-AS、QPP-PS分别溶于缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液,100mM KCl,pH 7.4)、有机溶剂二氯甲烷(DCM)，进行紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱分析，结果如图10和图11所示：图10中A)，在缓冲溶液，QPP-AS在288nm(ε＝1.97×104mol-1cm-1L)和512nm(ε＝3.57×104mol-1cm-1L)有两个最大吸收峰。而在有机溶剂二氯甲烷(DCM)中的吸收峰分别为309nm(ε＝2.29×104mol-1cm-1L)和562nm(ε＝5.43×104mol-1cm-1L)。随着溶剂极性的增加，QPP-AS的吸收带呈现出蓝移，表明了跃迁的电荷转移；图10中B)，在缓冲溶液中，QPP-AS在405nm的激发下发出绿色荧光(λem＝510nm)，在488nm的激发下几乎不发光；而在有机溶剂DCM中，QPP-AS在405nm的激发下发出弱绿色荧光(λem＝500nm)和强红色荧光(λem＝650nm)，并且在488nm的激发下还发出强红色荧光(λem＝650nm)；QMP-AS和QPP-PS在缓冲溶液和DCM中的紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱显示出相似的结果：图11中A)，在缓冲溶液，QMP-AS在285nm(ε＝3.61×104mol-1cm-1L)和518nm(ε＝3.77×104mol-1cm-1L)有两个最大吸收峰；而在有机溶剂二氯甲烷(DCM)中的吸收峰分别为307nm(ε＝3.14×104mol-1cm-1L)和581nm(ε＝7.43×104mol-1cm-1L)；图11中C)，在缓冲溶液中，QPP-AS在405nm的激发下发出绿色荧光(λem＝515nm)，在488nm的激发下同样几乎不发光；而在有机溶剂DCM中，QPP-AS在405nm的激发下发出弱绿色荧光(λem＝480nm)和强红色荧光(λem＝640nm)，并且在488nm的激发下还发出强红色荧光(λem＝645nm)；类似地，在图11中B)，在缓冲溶液，QPP-PS在283nm(ε＝3.83×104mol-1cm-1L)和478nm(ε＝2.18×104mol-1cm-1L)有两个最大吸收峰；而在有机溶剂二氯甲烷(DCM)中的吸收峰分别为284nm(ε＝3.79×104mol-1cm-1 L)和542 nm(ε＝ 3.38×104 mol-1 cm-1 L)；图11中D)，在缓冲溶液中，QPP-AS在405nm的激发下发出绿色荧光(λem＝515nm)，在488nm的激发下同样几乎不发光；而在有机溶剂DCM中，QPP-PS在405nm的激发下发出绿色荧光(λem＝510nm)和红色荧光(λem＝640nm)，并且在488nm的激发下也发出强红色荧光(λem＝641nm)；表明QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS具有适用于微环境比率型荧光响应的潜力。
实施例5 QPP-AS、QMP-AS、QPP-PS的生物相容性
采用MTT测定法测定QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS对A549，HeLa和LO2细胞系的细胞毒性，具体如下：分别将QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并用培养基稀释至梯度浓度(3.125μM、6.250μM、12.500μM、25.000μM、50.000μM、100.000μM)，最终DMSO比例为1％(v/v)，含DMSO(最终DMSO比例为1％(v/v))的培养基为对照组(0μM)；先将在96孔板上培养的细胞生长至铺满，然后分别加入等量不同浓度的QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS孵育8小时，换上新的培养基，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4小时，然后小心除去培养基，并加入DMSO(每孔150μL)，将96孔板摇动3分钟，使用酶标仪测量595nm处的吸光度，结果如图12所示：QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS均显示出较弱的细胞毒性，孵育12小时后，即使探针的浓度高达100μM，所有被测细胞的存活率仍超过75％。
实施例6核酸滴定
取实施例1～3得到的QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS溶解于DMSO中制备浓度为10mM储备液，将储备液分别稀释于缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，100mM KCl，pH 7.4)中，得到浓度为3μM的QPP-AS、QMP-AS和QPP-PS工作液；用溶剂为缓冲液的浓度为10mM的双链DNA储备液，制备不同浓度(0、0.6μM、1.2μM、1.6μM、2.4μM、3μM、3.6μM、4.2μM、4.8μM、5.4μM、6.0μM)的双链DNA(分别以此对应为0、0.2eq.、0.4eq.、0.6eq.、0.8eq.、1.0eq.、1.2eq.、1.4eq.、1.6eq.、1.8eq.、2.0eq.)(dsDNA:5′–CGCGAATTCGCG–3′(SEQ ID NO：1)，购于Invitrogen)、小牛胸腺DNA(分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL)(ctDNA：5’-CGTGAATTCACG-3’(SEQ ID NO：2)，购于Sigma-Aldrich)、RNA(分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL)(5′-GGCCGAAAUCCCGAAGUAGGCC-3′(SEQ ID NO：3)，购于Sigma-Aldrich)滴加至浓度为3μM的QPP-AS溶液，每次测量前平衡5分钟，测量荧光值，结果如图13所示：图13中A)、C)、D)，QPP-AS的新荧光峰(λem＝670nm)逐渐出现，原始绿色荧光峰(λem＝510nm))保持不变；表明QPP-AS适合于缓冲溶液中对核酸的比率荧光响应。图13中A)的双链DNA的量与I670nm/I510nm(I670nm表示在670nm处的荧光强度；I510nm表示在510nm处的荧光强度)的关系图如图13中B)所示：用溶剂为缓冲液的，浓度为10mM的双链DNA储备液，制备不同浓度(0、0.6μM、1.2μM、1.6μM、2.4μM、3μM、3.6μM、4.2μM、4.8μM、5.4μM、6.0μM)的双链DNA(分别以此对应为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0eq.)(dsDNA:5′–CGCGAATTCGCG–3′(SEQ ID NO：1)，购于Invitrogen)滴加至浓度为3μM的QMP-AS、QPP-PS溶液，每次测量前平衡5分钟，测量荧光值，结果如图14所示：图14中A)，QMP-AS的新荧光峰(λem＝680nm)逐渐出现，原始绿色荧光峰(λem＝515nm)略有增加；图14中B)，QPP-PS的新荧光峰(λem＝640nm)逐渐出现，原始绿色荧光峰(λem＝505nm)稳定不变；表明QMP-AS和QPP-PS也可以用于缓冲溶液中对核酸的比率型荧光响应。
实施例7，QPP-AS的基本成像性质
双发射成像性质实验：将A549细胞接种在35mm培养皿中培养24小时，于QPP-AS(10μM)在37℃孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次并通过共聚焦显微镜观察，共聚焦成像是通过双发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm；红光通道λ2＝670±20nm)在激发波长为405nm；通过λ2/λ1的比值获得比率型荧光成像；结果如图15中A)所示：在405nm激发下，QPP-AS在两个发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm，红光通道λ2＝670±20nm)中成像与体外荧光实验一致。
细胞核共定位实验：将A549细胞接种在35mm培养皿中24小时，与QPP-AS(10μM)在37℃条件下孵育4小时后，加入Hoechst 33342(2μM)。孵育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次并通过共聚焦显微镜观察，QPP-AS：λex＝405nm；λem＝670±20nm；Hoechst33342：λex＝405nm；λem＝445±20nm，结果如图15中B)所示：QPP-AS在细胞核中的红色荧光与Hoechst33342(DNA结合剂)具有良好地共定位；表明QPP-AS主要染色在细胞核中。
实施例8，QPP-AS在活细胞中对核酸进行比率荧光成像
活细胞中核酸比率荧光成像实验方法：
将A549细胞接种在35mm培养皿中培养24小时，与QPP-AS(10μM)在37℃条件下孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次并通过共聚焦显微镜观察，共聚焦成像是通过双发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm；红光通道λ2＝670±20nm)，成像所用激发波长为405nm，通过λ2/λ1的比值获得比率型荧光成像，使用相同的参数通过共聚焦显微镜检查法测量所有比率荧光成像；使用相同参数进行共聚焦显微镜断层扫描。在彩条中，H表示高信号，L表示低信号。
凋亡细胞中核酸比率荧光成像实验方法：
将A549细胞用顺铂(25μM)孵育12小时以诱导细胞发生凋亡，用探针QPP-AS(10μM)在37℃条件下孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次并通过共聚焦显微镜观察，共聚焦成像是通过双发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm；红光通道λ2＝670±20nm)，成像所用激发波长为405nm，通过λ2/λ1的比值获得比率型荧光成像，使用相同的参数通过共聚焦显微镜检查法测量所有比率荧光成像。在彩条中，H表示高信号，L表示低信号。
剔除核酸的细胞中比率荧光成像实验方法：
将A549细胞接种在35mm培养皿中24小时，与QPP-AS(10μM)在37℃条件下继续孵育4小时，将细胞用PBS洗涤3次，并用PBS中的4％多聚甲醛固定(室温20分钟，1mL/孔)。然后在室温下用含有0.1％TritonX-100的PBS(1mL/孔)渗透细胞20分钟，然后在37℃下，用100U/mL的DNase(Takara)或100μg/mL的RNase(Takara)分别处理细胞2h，最后用PBS洗涤细胞3次并通过共聚焦显微镜观察，共聚焦成像是通过双发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm；红光通道λ2＝670±20nm)成像所用的激发波长为405nm，通过λ2/λ1的比值获得比率型荧光成像数据，使用相同的参数通过共聚焦显微镜检查法测量所有比率荧光成像。在彩条中，H表示高信号，L表示低信号。
结果如图17所示：图17中A)，比率荧光信号准确地显示了核中核酸的比分布位置和相对含量，信噪比良好；DNase处理后，细胞核内红色荧光信号和比率荧光信号均明显降低；RNase处理后红色荧光信号和比率荧光信号均仍主要集中在细胞核中，结果表明比率荧光信号强度与核酸含量直接相关；图17中B)，QPP-AS提供了出色的3D比率荧光成像，并且Z-stack断层扫描也清楚地显示了每层图片中核酸的相对含量。
借助染色体形态可用于区分细胞***周期。但是当细胞处于***间期，特别是在伴随DNA倍增的有丝***间期(G0-G2)阶段，将无法通过染色质形态区分细胞***阶段。该技术壁垒可以通过活细胞中核酸比率荧光成像法攻克。通过持续捕捉活细胞的比率荧光成像，挑选有丝***中期、末期、有丝***间期的G2阶段的比率荧光成像图，结果如图17中A)～C)所示：图17中A)，使用QPP-AS可以通过红光通道清楚地识别细胞***中期染色体的形态，通过比率荧光信号观察到更高浓度的核酸，这与核酸复制和染色体的形成有关，因此导致核酸的排列更紧密；同样，在有丝***末期(图17中B))，核酸均匀地分为两组，通过QPP-AS进行比率荧光成像分析可以清楚地判断其含量的变化；更重要的是，与处于有丝***间期(G0/G1)阶段，具有正常核酸含量的细胞相比，通过QPP-AS的比率荧光成像可以检测到在有丝***间期的G2阶段(图17中C))的细胞具有更多的核酸；归一化的比率荧光强度分析结果与细胞***不同阶段核酸含量的一般规律一致(如图17中E))。
凋亡过程中核酸的比率荧光成像如图17中D)所示：可以观察到细胞核的显着收缩甚至核小体的出现；更重要的是，通过分析比率荧光成像，可以观察到一些具有核碎片和较高核酸浓度的区域，该实验结果可以清晰判断出凋亡过程中细胞核形态及核酸含量的变化。
实施例10 QPP-AS在组织切片中核酸的比率荧光成像
将组织(人类大肠癌组织、人类胆管癌组织)在10％的中性***中固定24小时，包埋在石蜡中，制备厚度为5μm的切片，除去石蜡，然后用探针QPP-AS(浓度为10μM)对组织样本进行染色1.5小时。用PBS洗涤3次，然后通过共聚焦显微镜观察。共聚焦成像是通过双发射通道(绿光通道λ1＝510±20nm；红光通道λ2＝670±20nm)，成像所用的激发波长为405nm；通过λ2和λ1的比值获得比率型荧光成像数据；结果如图18所示：在不同的癌组织切片中，绿色荧光分布在整个细胞中，并显示了组织切片中的细胞轮廓，而由于探针对核酸的特异性响应，红色荧光显示了细胞核的轮廓；绿色和红色荧光通道的叠加图可以清楚地显示肿瘤细胞的“核-质比”信息；此外，通过比率通道还清楚地观察到了细胞中的核酸含量；例如，图18中A)、B)，通过QPP-AS可以观察到在大肠结直肠癌的癌旁组织中，细胞显示为规则的腺泡，而在肿瘤灶中，细胞则具有杂乱的嵌套结构，较大的细胞体积以及巨大而异质的核；此外，QPP-AS可以通过比率荧光成像提供有关核酸含量分布的信息，如图18中C)、D)，肝胆管癌中的细胞显示为丰富且完整的细胞质，但细胞核较小；在绿色通道中有明显的荧光，红光通道并没有检测到红色荧光，对应着在比率通道中只显示浅蓝色，这表明我们检测到了无核的红细胞；另外，比率型荧光成像表明了癌细胞中的核酸含量高于癌旁组织。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）
<120> 一种比率型荧光探针及其制备方法与应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcgaattcg cg 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtgaattca cg 12
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggccgaaauc ccgaaguagg cc 22
Claims (10)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的通式如式(1)所示：
式(1)中，R1为甲基，R2选自4-甲基吡啶、甲基，R3选自N,N-二乙基、4-甲基哌嗪，X为卤素。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R2为4-甲基吡啶，R3为N,N-二乙基，X选自氯、溴、碘。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R2为甲基，R3为N,N-二乙基，X选自氯、溴、碘。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R2为4-甲基吡啶，R3为4-甲基哌嗪，X选自氯、溴、碘。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物、2-(4-(二乙氨基)苯乙烯基)-1-甲基-7-(4-甲基-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物和1-甲基-2-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯乙烯基)-7-(4-(4-吡啶基)-1-哌嗪基)喹啉-1-碘化物中的至少一种。
6.权利要求1～5中任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物的合成线路为：
式中，R1为甲基，R2选自4-甲基吡啶、甲基，R3选自N,N-二乙基、4-甲基哌嗪，X为卤素；
包括如下步骤：
(1)将化合物1与化合物6反应，得到化合物2；
(2)将化合物2与化合物3反应，得到化合物4；
(3)将化合物4与化合物5反应，得到；
步骤(1)中所述化合物1和化合物6的摩尔比优选为1：(2～40)；
步骤(1)中所述反应的条件优选为40-50℃搅拌状态下回流反应12～48h；
步骤(2)中所述化合物2与化合物3的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)；
步骤(2)中所述反应的条件优选为110-150℃搅拌状态下回流反应6～18h；
步骤(3)中所述化合物4与化合物5的摩尔比优选为1：(1.0～1.2)；
步骤(3)中所述反应的条件优选为110-150℃搅拌状态下回流反应6～18h。
7.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5中任一项所述的化合物。
8.权利要求1～5中任一项所述的化合物和/或权利要求7所述的试剂盒在检测样品中核酸分布和/或核酸含量中的应用，其特征在于：
所述样品为细胞和组织切片中的至少一种。
9.一种检测细胞中核酸分布和/或核酸含量的方法，其特征在于：将权利要求1～5中任一项所述的化合物与细胞混合，孵育，共聚焦成像。
10.一种检测组织切片中核酸分布和/或核酸含量的方法，其特征在于：用权利要求1～5中任一项所述的化合物对组织切片进行染色，共聚焦成像。
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| MING-QI WANG ET AL.: "G-quadruplex DNA fluorescence sensing by a bis-amine-substituted styrylquinolinium dye", 《DYES AND PIGMENTS》 * |
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