CN112675353A - 重组胶原蛋白敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组胶原蛋白敷料及其制备方法。所述方法通过在重组胶原蛋白、透明质酸钠、壳聚糖中加水，搅拌至完全溶解后，调节pH至碱性，得到敷料原液，然后将敷料原液注入成型模具中速冻成型，最后冷冻干燥、脱模制得重组胶原蛋白敷料。本发明制备方法简单，制备的重组胶原蛋白敷料生物活性高、保湿性强、拉伸强度高，柔软可塑性强，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医疗用品技术领域，涉及一种重组胶原蛋白敷料及其制备方法。
背景技术
医用敷料是一类用于各种创伤、创口表面进行临时覆盖的医用材料，可用于创面渗出液的吸收，具有止血、促进创面愈合的作用，使创口免遭细菌感染及其他外来因素的影响。理想的医用敷料应具备良好的机械性能、理化性能和生物学性能，同时还应具备易于制备、消毒灭菌、贮存及廉价等特点。
敷料的基本材料主要包括天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料主要有胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、硫酸软骨素海藻酸等，合成高分子材料主要有聚乙二醇、聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮等。相对于合成高分子材料具有良好的机械性能、加工性能及化学稳定性等特点，天然高分子材料则具有良好的生物相容性和可降解性，在组织工程与再生医学领域得到广泛的应用。
胶原蛋白(也称胶原)是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖，使***具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性和生物降解性能。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、保健、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛的应用。另外，胶原蛋白也可作为食品添加剂、饲料添加剂、絮凝剂、照相乳胶材料、表面活性剂和固定化酶载体材料等应用于各个工业和实验室领域。
目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)，从中提取胶原蛋白，但所得到的产品成分复杂，主要应用于饲料添加及微生物发酵培养基，应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用，而利用DNA重组技术生产的重组人胶原蛋白，具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白敷料及其制备方法。
实现本发明目的的技术方案如下：
重组胶原蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在重组胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸钠中加入水，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至6.8～7.5，得到敷料原液；所述的敷料原液中，按质量百分比计包括：重组胶原蛋白1％～10％，透明质酸钠0.5％～5％，壳聚糖0.5％～2％，余量为水；
步骤2，将敷料原液进行除菌过滤后，注入成型模具中，置于-40～-30℃下速冻成型；
步骤3，将速冻成型品冷冻干燥，脱模，得到重组胶原蛋白敷料。
优选地，步骤1中，物料的具体添加方式为：先加水将壳聚糖和透明质酸钠在40～60℃下搅拌溶解，搅拌速度为500～1000r/min；溶解均匀后降温至20～30℃，再加入重组胶原蛋白，搅拌速度为100～300r/min；溶解均匀后用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.8～7.5。
优选地，步骤2中，采用0.22μm的除菌滤芯进行除菌过滤。
优选地，步骤3中，冷冻干燥温度为-40～-30℃，真空度小于10Pa，冷冻干燥时间为10～30h。
本发明还提供上述制备方法制得的重组胶原蛋白敷料。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用重组胶原蛋白与透明质酸钠和壳聚糖进行复合，避免了胶原蛋白单独使用时存在的物理机械性能差，易被胶原酶降解等问题，通过重组胶原蛋白与透明质酸钠和壳聚糖的协同作用，并通过调节敷料原液的pH，进一步提高了敷料的力学性能。本发明的重组胶原蛋白敷料生物活性高、保湿性强、柔软可塑性强，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，采用的重组胶原蛋白采用201110327865.5公开的重组胶原蛋白。
实施例1～6，对比例1～6
各实验例中使用的重组胶原蛋白敷料原液，由重组胶原蛋白、水溶性壳聚糖、透明质酸钠和水组成，具体成分如表1所示：
表1实施例1-6和对比例1-6的重组胶原蛋白敷料原液的配方组成
重组胶原蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，按表1中配方，先加水将壳聚糖和透明质酸钠在50℃下搅拌溶解，搅拌速度为1000r/min；溶解均匀后降温至25℃，再加入重组胶原蛋白，搅拌溶解，搅拌速度为300r/min，得到敷料原液；
步骤2，将敷料原液用0.22μm的除菌滤芯进行除菌过滤后，注入成型模具中，置于-40℃冰箱速冻成型，成型模具尺寸为10cm*10cm。
步骤3，将速冻成型品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冷冻干燥温度为-40～-30℃，真空度小于10Pa，冷冻干燥时间为20h，脱模，包装，得到重组胶原蛋白敷料。
实施例7～12
实施例7～12与实施例1～6的重组胶原蛋白敷料原液的配方组成相同，具体成分如表2所示。
表2实施例7～12的重组胶原蛋白敷料原液的配方组成
| 成分(全成分按100g计) | |
| 实施例7 | 重组胶原蛋白10g；透明质酸钠0.5g；水溶性壳聚糖0.5g；余量水 |
| 实施例8 | 重组胶原蛋白10g；透明质酸钠0.5g；水溶性壳聚糖2g；余量水 |
| 实施例9 | 重组胶原蛋白10g；透明质酸钠5g；水溶性壳聚糖0.5g；余量水 |
| 实施例10 | 重组胶原蛋白1g；透明质酸钠0.5g；水溶性壳聚糖0.5g；余量水 |
| 实施例11 | 重组胶原蛋白1g；透明质酸钠0.5g；水溶性壳聚糖2g；余量水 |
| 实施例12 | 重组胶原蛋白1g；透明质酸钠5g；水溶性壳聚糖0.5g；余量水 |
上述重组胶原蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，按表2中配方，先加水将壳聚糖和透明质酸钠在50℃下搅拌溶解，搅拌速度为1000r/min；溶解均匀后降温至25℃，再加入重组胶原蛋白，搅拌溶解，搅拌速度为300r/min，溶解均匀后用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.8～7.5，得到敷料原液；
步骤2，将敷料原液用0.22μm的除菌滤芯进行除菌过滤后，注入成型模具中，置于-40℃冰箱速冻成型，成型模具尺寸为10cm*10cm；
步骤3，将速冻成型品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冷冻干燥温度为-40～-30℃，真空度小于10Pa，冷冻干燥时间为20h，脱模，包装，得到重组胶原蛋白敷料。
表征实验
1、拉伸强度
取实施例1～12和对比例1～6制得的重组胶原蛋白敷料样品，将样品放置在夹板间，保持样品垂直状态，以100mm/min速率，使样品伸长到断裂。拉伸强度(N/cm)＝最大载荷(N)/样品宽度(cm)，结果如表3所示：
表3各实施例和对比例制得的重组胶原蛋白敷料的拉伸强度
| 实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 拉伸强度(N/cm) | 1.51 | 1.47 | 1.66 | 1.11 | 1.31 | 1.25 |
| 对比例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 拉伸强度(N/cm) | 0.87 | 0.65 | 0.92 | 0.88 | 0.97 | 0.77 |
| 实施例 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 拉伸强度(N/cm) | 2.41 | 2.12 | 2.26 | 2.01 | 1.87 | 1.95 |
从表3可以看出，实施例1～6与对比例1～6相比，其制得的重组胶原蛋白敷料的拉伸强度更优，均＞1.0N/cm，说明通过调控敷料原液中重组胶原蛋白、透明质酸钠和壳聚糖的比例，使三者更好地发挥协同作用，提高敷料的力学性能。对比实施例1～6和实施例7～12的拉伸强度数据可知，通过调节辅料原液的pH为6.8～7.5，能够进一步地提高重组胶原蛋白敷料的力学性能。
2、吸水率
按照《YY/T0471.1-2004接触性创面敷料试验方法第1部分：液体吸收性》规定的方法对实施例7～12制得的重组胶原蛋白敷料进行吸水率检测，结果如表4所示。
表4实施例7～12制得的重组胶原蛋白敷料的吸水率
从表4可以看出，实施例7～12制得的重组胶原蛋白敷料的吸水率均超过自身重量的11倍以上，说明本发明的重组胶原蛋白敷料具有较强的吸水能力。
3、细胞增殖实验
(1)取生长状况良好的人表皮细胞，消化制成单细胞悬浮液并计数，调整细胞密度为104个/mL，均匀接种细胞至96孔细胞培养板，每孔加入200μL细胞悬浮液，待细胞贴壁后，加入等量稀释10倍的样品(空白组、实施例7-12)，每个样品设置5个复孔，放置在37℃、5％CO2培养箱中连续孵育24、48、72、96、120、144、168h
(2)至每个时间节点，向相应的孔中加入20μL MTT溶液(用pH＝7.4的PBS配置)，继续孵育4h，终止培养。
(3)快速翻转培养板，弃去上清液，向每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解。
(4)用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基的孔的吸光值作为空白对照调零，取6孔平均值。
(5)以培养时间最为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线，计算各样品的细胞增殖率，结果如表5所示。
表5生长在实施例7～12制得的重组胶原蛋白敷料的细胞增殖率
| 实施例 | 空白 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 细胞增殖率(％) | 100 | 151 | 143 | 138 | 134 | 117 | 121 |
从表5可以看出，生长在实施例7～12制得的重组胶原蛋白敷料的细胞的细胞增殖率均超过空白对照组，说明本发明的重组胶原蛋白敷料具有较高的生物活性。
Claims (5)
1.重组胶原蛋白敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在重组胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸钠中加入水，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至6.8～7.5，得到敷料原液；所述的敷料原液中，按质量百分比计包括：重组胶原蛋白1％～10％，透明质酸钠0.5％～5％，壳聚糖0.5％～2％，余量为水；
步骤2，将敷料原液进行除菌过滤后，注入成型模具中，置于-40～-30℃下速冻成型；
步骤3，将速冻成型品冷冻干燥，脱模，得到重组胶原蛋白敷料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，物料的具体添加方式为：先加水将壳聚糖和透明质酸钠在40～60℃下搅拌溶解，搅拌速度为500～1000r/min；溶解均匀后降温至20～30℃，再加入重组胶原蛋白，搅拌速度为100～300r/min；溶解均匀后用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.8～7.5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，采用0.22μm的除菌滤芯进行除菌过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，冷冻干燥温度为-40～-30℃，真空度小于10Pa，冷冻干燥时间为10～30h。
5.根据权利要求1至4任一所述的制备方法制得的重组胶原蛋白敷料。
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