CN112675148A - 一种多功能高效药物递送***及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多功能高效药物递送***及其制备方法和应用 Download PDF

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CN112675148A CN202011606510.5A CN202011606510A CN112675148A CN 112675148 A CN112675148 A CN 112675148A CN 202011606510 A CN202011606510 A CN 202011606510A CN 112675148 A CN112675148 A CN 112675148A
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Abstract

本发明提供了一种多功能高效药物递送***及其制备方法和应用，其特征是(1)采用开环聚合和氨解反应合成咪唑基团修饰的甲氧基聚乙二醇‑聚天冬氨酸mPEG‑PAsp‑IM，通过自组装技术包载疏水性药物，形成载药纳米粒；(2)通过分离和挤压等方法制备纳米血小板膜囊泡；(3)纳米血小板膜囊泡与载药纳米粒混合，通过超声方法使得载药纳米粒进入纳米血小板膜囊泡中，形成药物递送***。本发明的多功能高效药物递送***，具有pH响应性药物释放能力、良好的抗炎效果、显著的促血管内皮细胞迁移和增殖能力及抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖能力。血小板膜的包裹使得药物递送***具有显著提升的细胞摄取能力，有利于提高药物递送效果，更加高效地进行疾病的治疗。

Description

一种多功能高效药物递送***及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物领域，具体涉及一种多功能高效药物递送***及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，心血管疾病日益严重，经常需要进行血管介入术。术后再狭窄难以避免，成为心血管疾病治疗中的最大难题。作为一种血管损伤性疾病，术后再狭窄的病理生理基础是血管内膜损伤，使得局部发生炎症反应，血小板迅速聚集，导致血栓形成及内膜过度增生，最终发生血管再狭窄，手术失败。针对其病理生理特性，国内外研发出多种抗凝、抗炎及抗细胞增殖等药物。但是，药物在血管内皮损伤局部浓度较低，其效果欠佳。并且，由于术后血管再狭窄最根本原因是血管内皮层损伤，药物在发挥抗炎及抗增殖效果的同时，也会抑制血管内皮细胞的迁移和增殖，因此很难使得内皮损伤局部快速内皮化，从而加速血管再狭窄进程。因此，亟需开发具有多重功效的药物来有效地抑制术后血管再狭窄发生。
随着纳米药物递送***在各种各样疾病治疗中的快速发展和应用，纳米药物递送***受到了越来越多研究者的关注，尤其是在肿瘤和心血管疾病治疗方面具有很大的发展潜力。然而，药物高效递送至病灶乃至目的细胞仍然面临诸多问题。首先，药物递送载体需要具备良好的生物相容性和体内稳定性；其次，需要具备对病灶的靶向性及对目的细胞的高摄取率；最后，需要在靶点或目的细胞内选择性进行药物释放。目前的研究表明聚乙二醇(PEG)和两性离子表面修饰及天然细胞膜仿生修饰方法在提高药物递送载体生物相容性和体内稳定性方面具有很好的效果。尤其是，提取天然细胞膜包裹在纳米药物载体表面，能够赋予其自我识别能力，提高其免疫规避能力及体内稳定性。此外，天然细胞膜仿生修饰还能赋予药物载体某些特殊功能，比如红细胞的体内长循环能力、血小板对血管内皮损伤局部的靶向能力等。但是，对目的细胞高摄取率、高效药物递送效率及在目的细胞中选择性药物释放能力仍面临着很大的挑战。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有pH响应性药物释放能力、良好抗炎效果、促血管内皮细胞迁移和增殖同时抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖的多功能高效药物递送***。
本发明的方案如下：
一种多功能高效药物递送***，包括纳米血小板膜囊泡与载药纳米粒，所述载药纳米粒进入纳米血小板膜囊泡中，并形成药物递送***；
所述载药纳米粒为咪唑基团修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)。
本发明还公开了一种多功能高效药物递送***的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备载药纳米粒
S1-1.将BLA-NCA溶于无水DMF中，然后密封，抽真空，通保护气体；mPEG-NH2溶于无水三氯甲烷；然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中，使其反应，得到的反应混合物滴加到20-100毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
所述BLA-NCA为L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐；
所述DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
所述mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
S1-2.将S1-1所得的mPEG-PBLA溶于DMSO中，在氮气保护条件下，加入IM后，密封，在搅拌的条件下反应，将反应液滴加到盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用盐酸溶液透析，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
所述DMSO为二甲基亚砜；
所述IM为1-(3-氨基丙基)咪唑；
S1-3.将S1-2所得的mPEG-PAsp-IM与药物混合溶于DMSO中，透析，所得透析液即为载药纳米粒；
S2.血小板膜囊泡液的制备：
S2-1.取患者相同血型血液加入柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血；进行离心处理，得到富含血小板的血浆上层；然后再次离心，弃去上清液，得到血小板粗品；将血小板粗品重悬于PBS缓冲溶液中，再加入柠檬酸钠缓冲溶液，离心，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀；将纯净的血小板沉淀悬浮于PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
S2-2.向样品1中滴加TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后离心，弃去上清液；再加入PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次离心，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2；
S2-3.用PBS缓冲溶液将样品2稀释，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复挤压后，收集血小板膜囊泡液为样品3；
S3.超声混合
将载药纳米粒和样品3混合，然后超声处理，得到多功能高效药物递送***。
作为改进，所述制备方法，包括如下步骤：
S1.制备载药纳米粒
S1-1.将0.3克BLA-NCA溶于0.3-1.0毫升无水DMF中，然后密封，抽真空，通氮气；0.2克mPEG-NH2溶于2-5毫升无水三氯甲烷；然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液通过注射器加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中；在35℃下，反应24-48小时，得到的反应混合物滴加到20-100毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，重复上述溶解-沉淀操作1-3次，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析2-4天，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
S1-2.将0.5克mPEG-PBLA溶于3-8毫升DMSO中，在氮气保护条件下，加入3.58毫升IM后，密封，在40℃下搅拌反应48小时；然后，将反应液滴加到20毫升0.1M的盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.01M的盐酸溶液透析2-4天，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
S1-3.将S1-2所得的mPEG-PAsp-IM与药物混合溶于DMSO中，透析2-4天，所得透析液即为载药纳米粒；
S2.血小板膜囊泡液的制备：
S2-1.取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品；将血小板粗品重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
S2-2向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2；
S2-3用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
S3.超声混合
将载药纳米粒和样品3混合，超声2-5分钟，得到多功能高效药物递送***。
作为改进，S1-3中所述mPEG-PAsp-IM和药物的质量比为5-10:1。
作为改进，S1-3中所述mPEG-PAsp-IM和DMSO的比为1克:10-200毫升。
作为改进，S2-1中所述柠檬酸钠缓冲溶液和血液体积比为1:8-10。
作为改进，S3中所述载药纳米粒和样品3的比为4微克:1-5微升。
作为改进，所述药物选用JQ1或荧光染料。
作为改进，所述药物递送***用于制备抑制术后血管再狭窄药物。
本发明的优点是：
(1)本发明的多功能高效药物递送***，采用具有pH响应性的mPEG-PAsp-IM聚合物，通过其咪唑基团的质子缓冲能力赋予递送***在目的细胞中选择性药物释放能力，大大提高药物递送效果。
(2)本发明的多功能高效药物递送***，在载药纳米粒表面包裹血小板膜，用作药物递送***，赋予其对内皮损伤局部靶向性，提高其细胞摄取率及药效，达到更好地治疗疾病的目的。
附图说明
图1为JQ1药物累计释放曲线；
图2为内皮细胞相对细胞活性图；
图3为平滑肌细胞相对细胞活性图；
图4为刺激后巨噬细胞相对活性图；
图5为细胞摄取图；
图6为IL-6炎症因子水平图；
图7为TNF-α炎症因子水平图；
图8为内皮细胞划痕愈合图；
图9为平滑肌细胞划痕愈合图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解，本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改,该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
EA.hy926细胞、A7r5细胞和RAW264.7细胞购于中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
JQ1(商品)；
荧光染料(商品)；
脂质体挤出器型号为AvantiPolarLipids,USA。
JQ1购于北京华威锐科化工有限公司
荧光染料尼罗红购于北京华威锐科化工有限公司
实施例1
对照组1：
(1)0.3克BLA-NCA溶于0.3毫升无水DMF中，然后密封，抽真空，通氮气；0.2克mPEG-NH2溶于2毫升无水三氯甲烷。然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液通过注射器加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中。在35℃下，反应24小时。得到的反应混合物滴加到20毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，重复上述溶解-沉淀操作1次，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析2天，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
所述BLA-NCA为L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐；
所述DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
所述mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
(2)适量的mPEG-PBLA和药物JQ1混合溶于DMSO中，透析2天，所得透析液即为载药纳米粒；
所述mPEG-PBLA和JQ1的质量比为5:1；
所述mPEG-PBLA和DMSO的比为1克:10毫升。
实施例2
对照组2：
(1)0.3克BLA-NCA溶于0.5毫升无水(DMF)中，然后密封，抽真空，通氮气；0.2克mPEG-NH2溶于3毫升无水三氯甲烷中。然后，在室温下用注射器加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中。在35℃下，反应36小时。得到的反应混合物滴加到50毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，重复上述溶解-沉淀操作2次，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析3天，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
所述BLA-NCA为L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐；
所述DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
所述mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
(2)0.5克mPEG-PBLA溶于5毫升DMSO中，在氮气保护条件下，加入3.58毫升IM后，密封，在40℃下搅拌反应48小时。然后，将反应液滴加到20毫升0.1M的盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.01M的盐酸溶液透析3天，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
所述DMSO为二甲基亚砜；
所述IM为1-(3-氨基丙基)咪唑；
(3)适量的mPEG-PAsp-IM和药物JQ1混合溶于DMSO中，透析3天，所得透析液即为载药纳米粒；
所述mPEG-PAsp-IM和JQ1的质量比为8:1；
所述mPEG-PAsp-IM和DMSO的比为1克:50毫升。
实施例3
本实施例公开了一种高效药物递送***，包括纳米血小板膜囊泡与载药纳米粒，所述载药纳米粒进入纳米血小板膜囊泡中，并形成药物递送***；
所述载药纳米粒为咪唑基团修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)。
本实施例的制备方法包括如下步骤：
S1.载药纳米粒的制备：
S1-1.0.3克BLA-NCA溶于1.0毫升无水(DMF)中，然后密封，抽真空，通氮气；0.2克mPEG-NH2溶于5毫升无水三氯甲烷中。然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液通过注射器加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中。在35℃下，反应48小时。得到的反应混合物滴加到100毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，重复上述溶解-沉淀操作3次，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析4天，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
所述BLA-NCA为L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐；
所述DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
所述mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
S1-2.0.5克mPEG-PBLA溶于8毫升DMSO中，在氮气保护条件下，加入3.58毫升IM后，密封，在40℃下搅拌反应48小时。然后，将反应液滴加到20毫升0.1M的盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.01M的盐酸溶液透析4天，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
所述DMSO为二甲基亚砜；
所述IM为1-(3-氨基丙基)咪唑；
S1-3.适量的mPEG-PAsp-IM和药物JQ1混合溶于DMSO中，透析4天，所得透析液即为载药纳米粒；
所述mPEG-PAsp-IM和JQ1的质量比为10:1；
所述mPEG-PAsp-IM和DMSO的比为1克:200毫升。
S2.血小板膜囊泡液的制备：
S2-1按比例，取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品。将血小板重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；所述柠檬酸钠缓冲溶液和所述血液体积比为1:9；
S2-2向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2。
S2-3用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过400纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行20次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
S3.按载药纳米粒和样品3以4微克:2微升的比例，将载药纳米粒和样品3混合，超声3分钟,得到多功能高效药物递送***。
实施例4
通过测定累计释放率评价实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***在pH7.4和pH5.5条件下的药物释放行为，包括如下步骤：
将5毫升浓度为0.4mg/mL的实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***置于截留分子量为3500的透析袋中，然后放在45毫升pH5.5和pH7.4的PBS缓冲溶液(透析介质)中，在37℃搅拌条件下孵育。分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、36和48小时时间点取出5毫升透析介质并再次加入5毫升相应pH的PBS缓冲溶液，取出的透析介质用紫外/可见分光光度计测定吸光度。通过JQ1标准曲线确定PBS中不同时间点释放的JQ1量。
分析结果：图1为JQ1药物累计释放曲线，分别测定了实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***在不同时间点的药物累计释放率。图中结果表明，随着时间的延长，实施例1制备的对照组1在pH7.4和pH5.5条件下的药物释放率变化不大，在48小时且pH5.5条件下，累计释放率仅为7.2％。实施例2制备的对照组2和实施例3制备的多功能高效药物递送***在pH7.4条件下，药物累计释放率仅分别为13.5％和14.6％，说明在生理条件下，药物递送***很稳定。实施例2制备的对照组2和实施例3制备的多功能高效药物递送***在pH5.5条件下，药物累计释放率显著提升，分别为38.0％和41.1％，有利于在细胞内涵体酸性环境中进行高效药物释放。此外，这一结果也说明血小板膜的包裹并未影响其pH响应能力，实施例3制备的多功能高效药物递送***具有良好的pH响应性药物释放能力。
实施例5
实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***对内皮细胞(EA.hy926细胞)、平滑肌细胞(A7r5细胞)和脂多糖刺激的巨噬细胞(脂多糖刺激的RAW264.7细胞)活性的影响通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，包括如下步骤：
EA.hy926细胞、A7r5细胞和脂多糖刺激的RAW264.7细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)DMEM细胞培养基中，细胞生长到90％后，将DMEM细胞培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后培养基换为新鲜的10％FBS DMEM生长培养基。将不同浓度的JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***水溶液加入到10％FBS DMEM生长培养基中，混合均匀。24小时后弃去上层清液，向每个孔中加入5mg/mL的MTT溶液(pH＝7.4的PBS缓冲溶液为溶剂)20微升，继续培养4小时，使甲瓒结晶。培养，小心弃去孔内培养基，而后向孔内加入150微升DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490纳米波长处测量各孔的光密度值(OD)。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：
Figure BDA0002873711360000081
其中，OD：实验组的吸光度值，ODblank：调零组的吸光度值，OD0：对照组的吸光度值。
分析结果：图2为内皮细胞相对细胞活性，图3为平滑肌细胞相对细胞活性，图4为刺激后巨噬细胞相对细胞活性，分别测定了JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***。图2中结果表明，所有样品均具有很高的细胞活性，且随着浓度的提升，相对细胞活性没有明显下降的趋势，说明在浓度≤5μg/mL时，JQ1药物对内皮细胞活性影响不大，且实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***对内皮细胞活性影响很小。图3和图4结果表明，在相应浓度下，JQ1药物、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***能够显著降低平滑肌细胞和刺激后巨噬细胞的活性，说明多功能高效药物递送***能够抑制平滑肌细胞增殖且具有一定的抗炎效果。因此，这种药物递送***具备多重功效。
实施例6
采用荧光染料尼罗红替代JQ1药物，通过上述相同方法制备相应的对照组1、对照组2及多功能高效药物递送***。
利用内皮细胞(EA.hy926细胞)、平滑肌细胞(A7r5细胞)和脂多糖刺激的巨噬细胞脂多糖刺激的RAW264.7细胞)摄取实验来评价实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***在这三种细胞内的摄取效果。
步骤如下：分别将EA.hy926细胞、A7r5细胞和脂多糖刺激后的RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度约为105个/孔，在37℃、5％CO2条件下培养24小时，弃去上清，加入500微升无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下饥饿处理12小时，弃去500微升无血清DMEM培养基，分别加入适量尼罗红、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***，使得尼罗红浓度为4μg/mL。在37℃、5％CO2条件下孵育4小时，弃去上清液，用PBS缓冲溶液洗三次。用200微升pH＝7.4的PBS缓冲溶液重悬细胞，获得细胞悬液，通过流式细胞仪检测分析。
分析结果：图5为内皮细胞、平滑肌细胞和刺激后RAW264.7巨噬细胞摄取结果，分别测定了JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能药物递送***。平均荧光强度代表细胞摄取率，摄取率越高越有利于提高药物递送效果。从图中可以看出，与尼罗红组相比，其他组在同种细胞中的摄取率显著提高。而且，实施例3制备的多功能高效药物递送***在三组细胞中的摄取率大大高于其他组，说明血小板膜的包裹能够显著提升其在三组细胞中的摄取率。与内皮细胞和刺激后的巨噬细胞相比，实施例3制备的多功能高效药物递送***在平滑肌细胞中的摄取率最高，更有利于其在平滑肌细胞中发挥药效，抑制其增殖。
实施例7
利用ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-6炎症因子水平来衡量实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***的抗炎效果，包括如下步骤：
将脂多糖刺激的RAW264.7细胞接种于6孔板，细胞密度约为5×105个/孔。在37℃、5％CO2条件下培养24小时，弃去上清，加入500微升无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下饥饿处理12小时，弃去500微升无血清DMEM培养基，分别加入适量JQ1实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***，使得JQ1最终浓度为0.05、0.5和5μg/mL。孵育24小时后，收集上清液，根据说明书，采用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α和IL-6炎症因子水平。收集正常RAW264.7细胞和未经任何处理的脂多糖刺激的RAW264.7细胞的上清，测定其TNF-α和IL-6炎症因子水平。
分析结果：图6为IL-6炎症因子水平，图7为TNF-α炎症因子水平，分别测定了正常RAW264.7细胞、刺激后RAW264.7巨噬细胞和JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能药物递送***处理的刺激后RAW264.7巨噬细胞。图6和图7结果表明，与刺激后RAW264.7巨噬细胞两组相比，其他组的IL-6和TNF-α炎症因子的水平显著降低，且随着JQ1浓度升高，两种炎症因子的水平逐渐降低。当JQ1浓度为5μg/mL时，JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能药物递送***组的炎症因子水平与正常RAW264.7细胞相近，说明这些样品具有良好的抗炎效果。此外，与其他组相比，实施例3制备的多功能高效药物递送***具备更低的炎症因子水平，说明其具有更高的药效。
实施例8
将EA.hy926细胞和A7r5细胞接种于24孔培养板中，细胞密度约为105个/孔，，在37℃、5％CO2条件下培养24小时，弃去上清，加入500微升无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下饥饿处理12小时，弃去500微升无血清DMEM培养基，分别加入适量JQ1、实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***，使得JQ1浓度为0.5μg/mL。孵育48小时后，利用200微升移液器枪头在每个孔内轻轻地划出一条连续的细胞层断面。用D-hanks缓冲液(pH＝7.4)洗掉孔内的细胞碎屑。利用倒置显微镜观察划痕处细胞的迁移过程，在确定的时间间隔0、12、24小时对其拍照。未经任何处理的EA.hy926细胞和A7r5细胞用作对照。利用ImageJ2.1软件计算照片中细胞的迁移面积。划痕处相对愈合面积百分比按照如下公式计算：
Figure BDA0002873711360000101
分析结果：图8为不同时间点EA.hy926细胞的迁移图和由Image-ProPlus(6.0)计算的12和24小时后的相对愈合面积；图9为不同时间点A7r5细胞的迁移图和由Image-ProPlus(6.0)计算的12和24小时后的相对愈合面积。从图8和图9中结果可以看出，与对照相比，所有样品对内皮细胞(EA.hy926细胞)的迁移和增殖能力没有任何影响，在24小时时，伤口基本都完全愈合，愈合面积均为90％以上。同时，在24小时，与对照基本完全愈合相比，所有样品处理的平滑肌细胞(A7r5细胞)伤口没有愈合，相对愈合面积接近于或等于0％。实施例1和实施例2制备的对照组1和对照组2及实施例3制备的多功能高效药物递送***组的相对愈合面积要比JQ1组低，说明这些组具有更好的药物递送效果。这些结果说明这些样品具有显著的抑制平滑肌细胞迁移和增殖能力，同时不影响内皮细胞的迁移和增殖。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不等同于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，不脱离本发明的精神和范围下所做的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种多功能高效药物递送***，其特征在于，包括纳米血小板膜囊泡与载药纳米粒，所述载药纳米粒进入纳米血小板膜囊泡中，并形成药物递送***；
所述载药纳米粒为咪唑基团修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)。
2.一种基于权利要求1所述的多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备载药纳米粒
S1-1.将BLA-NCA溶于无水DMF中，然后密封，抽真空，通保护气体；mPEG-NH2溶于无水三氯甲烷；然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中，使其反应，得到的反应混合物滴加到20-100毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
所述BLA-NCA为L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐；
所述DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
所述mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
S1-2.将S1-1所得的mPEG-PBLA溶于DMSO中，在氮气保护条件下，加入IM后，密封，在搅拌的条件下反应，将反应液滴加到盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用盐酸溶液透析，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
所述DMSO为二甲基亚砜；
所述IM为1-(3-氨基丙基)咪唑；
S1-3.将S1-2所得的mPEG-PAsp-IM与药物混合溶于DMSO中，透析，所得透析液即为载药纳米粒；
S2.血小板膜囊泡液的制备：
S2-1.取患者相同血型血液加入柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血；进行离心处理，得到富含血小板的血浆上层；然后再次离心，弃去上清液，得到血小板粗品；将血小板粗品重悬于PBS缓冲溶液中，再加入柠檬酸钠缓冲溶液，离心，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀；将纯净的血小板沉淀悬浮于PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
S2-2.向样品1中滴加TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后离心，弃去上清液；再加入PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次离心，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2；
S2-3.用PBS缓冲溶液将样品2稀释，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复挤压后，收集血小板膜囊泡液为样品3；
S3超声混合
将载药纳米粒和样品3混合，然后超声处理，得到多功能高效药物递送***。
3.根据权利要求2所述的一种多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备载药纳米粒
S1-1.将0.3克BLA-NCA溶于0.3-1.0毫升无水DMF中，然后密封，抽真空，通氮气；0.2克mPEG-NH2溶于2-5毫升无水三氯甲烷；然后，将mPEG-NH2的三氯甲烷溶液通过注射器加入到上述BLA-NCA的DMF溶液中；在35℃下，反应24-48小时，得到的反应混合物滴加到20-100毫升冰***，有沉淀生成；固液分离，固体溶解于三氯甲烷中，重复上述溶解-沉淀操作1-3次，得到的沉淀溶解在DMF中，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用超纯水透析2-4天，透析液冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸苄基酯(mPEG-PBLA)；
S1-2.将0.5克mPEG-PBLA溶于3-8毫升DMSO中，在氮气保护条件下，加入3.58毫升IM后，密封，在40℃下搅拌反应48小时；然后，将反应液滴加到20毫升0.1M的盐酸溶液中，置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.01M的盐酸溶液透析2-4天，透析液冷冻干燥得咪唑修饰的甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸(mPEG-PAsp-IM)；
S1-3.将S1-2所得的mPEG-PAsp-IM与药物混合溶于DMSO中，透析2-4天，所得透析液即为载药纳米粒；
S2.血小板膜囊泡液的制备：
S2-1.取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的柠檬酸钠缓冲溶液，阻止其凝血，在200g转速、37℃条件下离心10分钟，得到富含血小板的血浆上层；然后在2000g再次离心10分钟，弃去上清液，得到血小板粗品；将血小板粗品重悬于0.9毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，再加入0.1毫升的柠檬酸钠缓冲溶液，然后以2000g离心10分钟，弃去上清液，得到纯净的血小板沉淀，悬浮于0.5毫升PBS缓冲溶液中，得到血小板悬浮液，为样品1；
S2-2向样品1中滴加5微升TritonX-100裂解液，裂解血小板；然后以20000g离心10分钟，弃去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液并反复吹打，得到血小板膜悬液粗品；再次以20000g离心10分钟，弃去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液，反复吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜悬液，为样品2；
S2-3用pH＝7.4的PBS缓冲溶液将样品2稀释至8毫升，通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集血小板膜囊泡液为样品3；
S3.超声混合
将载药纳米粒和样品3混合，超声2-5分钟，得到多功能高效药物递送***。
4.根据权利要求3所述的一种多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，S1-3中所述mPEG-PAsp-IM和药物的质量比为5-10:1。
5.根据权利要求3所述的一种多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，S1-3中所述mPEG-PAsp-IM和DMSO的比为1克:10-200毫升。
6.根据权利要求3所述的一种多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，S2-1中所述柠檬酸钠缓冲溶液和血液体积比为1:8-10。
7.根据权利要求3所述的一种多功能高效药物递送***的制备方法，其特征在于，S3中所述载药纳米粒和样品3的比为4微克:1-5微升。
8.根据权利要求1所述一种多功能高效药物递送***，其特征在于，所述药物选用JQ1或荧光染料。
9.一种根据权利要求1所述的多功能高效药物递送***的应用，其特征在于，所述药物递送***用于制备抑制术后血管再狭窄药物。
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