CN112674203A - 一种可降解赭曲霉毒素的微生态制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分解赭曲霉毒素的微生态制剂及制备方法。该微生态制剂包括丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌、凝结纳豆芽孢杆菌、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物、丁酸钠、液体培养基等。本发明提供的可分解赭曲霉毒素的微生态制剂性质稳定,能够分解饲料中的赭曲霉毒素造成的污染,防污染能力强,并可以显著增加胃肠动力,增强胃动力,能够缓解胃肠不适或腹胀,调节胃肠胀气。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种降解赭曲霉毒素的微生态制剂及其制备方法。
背景技术
丁酸梭菌,主要分布在人的粪便和土壤中,其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸,具有极强的整肠作用,它可抑制肠道中的致病菌,促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌在动物肠道内除了促进动物肠道有益菌群的增殖和发育,抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖,纠正肠道菌群紊乱,减少肠毒素的发生,还能在动物肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶等物质,具有保健作用。
凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌,在有氧及无氧的环境下都可生长,能适应低氧的肠道环境,对酸和胆汁有较高的耐受性,能够进行乳酸发酵,产生的L-乳酸能降低肠道pH值,抑制有害菌,并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。
赭曲霉毒素(ochratoxins)分为A、B、C、D四种,是由多种曲霉和青霉菌产生的一类危害严重的二级代谢产物,其中毒性最强且分布最广的是赭曲霉毒素A(OTA),被国际癌症研究机构分类为2b级潜在的人类致癌物质,赭曲霉毒素能污染玉米、小麦、花生、水稻和干果等多种农产品,经生物链传入动物和人体后,造成机体肾脏和肝脏等多个器官受损,降低动物生产性能,削弱机体免疫能力。饲料原料因含水量较大或存放于潮湿环境中,在收获、运输或储存过程中,易发生霉变。由于饲料中营养物质裸露,非常易于感染。一般在湿热的环境中容易滋生赭曲霉而产生毒素。专利文献CN105767507A公开了一种饲料用微生态制剂、无抗饲料及其制备方法,该微生态制剂虽然能分解饲料中的抗营养物质,提高饲料利用率,抑制致病菌生长,提高动物免疫力的作用,但是无法阻止赭曲霉毒素的污染。专利文献CN106616233A公开了一种可降解霉菌毒素的预混合饲料、其制备方法及猪日粮,该预混饲料虽然能降饲料中的霉菌毒素,但依旧无法从阻止赭曲霉毒素的污染。
目前丁酸梭菌已经做为饲料添加剂被允许在饲料中添加,而且做为抗腹泻类抗生素的替代产品已经在无抗养殖中起到了替抗效果,但是由于无法从源头阻止饲料的污染,限制了丁酸梭菌等多种微生物的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂,该微生态制剂性质稳定,能够分解饲料中的赭曲霉毒素造成的污染,防污染能力强,并可以显著增加胃肠动力,增强胃动力,能够缓解胃肠不适或腹胀,调节胃肠胀气。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂,所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:丁酸梭菌40-60份、纳豆芽孢杆菌1-60份、凝结纳豆芽孢杆菌1-60份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物5-10份、丁酸钠0.1-5份、液体培养基100-200份。
优选的,所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:丁酸梭菌50份、纳豆芽孢杆菌10份、凝结纳豆芽孢杆菌15份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物8份、丁酸钠2.7份、液体培养基150份。
优选的,所述丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌与凝结纳豆芽孢杆菌的重量份数比为1:(0.1-0.5):(0.1-0.5)。
优选的,所述丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌与凝结纳豆芽孢杆菌的重量份数比为1:0.2:0.3。
优选的,所述药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物与丁酸钠的重量份数为1:0.2-0.5。
优选的,所述药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物与丁酸钠的重量份数为1:0.35。
优选的,所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖10~25份、蛋白粉10~25份、去氧胆酸钠钠1-5份、红糖50~100份、维生素B1 0.1-5份、维生素B2 0.05~0.1份、维生素B12 0.02~0.05份、氯化钠1~3份、磷酸二氢钾1~2份、无菌蒸馏水500-1000份。
优选的,所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖18份、蛋白粉16份、去氧胆酸钠钠3份、红糖80份、维生素B1 2.5份、维生素B2 0.75份、维生素B12 0.03份、氯化钠2份、磷酸二氢钾1.5份、无菌蒸馏水750份。
优选的,所述丁酸梭菌活菌数为1×109-10CFU/mL。
本发明的凝结芽孢杆菌在发酵过程还可以产生大量乳酸及乙酸等酸味小分子物质,这些小分子物质赋有独特的酸香味和口感等,并起到抑菌作用,丁酸梭菌产生的丁酸、乙酸等短链脂肪酸和有机小分子酸能够调节肠道pH,刺激肠道蠕动,改善肠道微环境,抑制病原菌的增殖而调节肠道微生态平衡,并能产生B族维生素和维生素K,为动物提供营养。凝结纳豆芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的生长能够分解利用碳水化合物合成微生物蛋白,有效缓解肠胀气和肠绞痛。
本发明还提供上述微生态制剂的制备方法,包括以下步骤:将纳豆芽孢杆菌菌种接入微生物液体培养基中,于32~37℃通气发酵培养至形成芽孢,然后接入凝结纳豆芽孢杆菌菌种在28~32℃通气发酵,待凝结纳豆芽孢杆菌处于稳定期时,再接入丁酸梭菌菌种在30~37℃密闭厌氧发酵,并同时加入药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠,待丁酸梭菌和凝结纳豆芽孢杆菌同时处于稳定期时,停止发酵,即得。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明微生态制剂中的菌种均为安全、优良菌种,生长特性不同,菌株间协作共生效应好:凝结纳豆芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌可为丁酸梭菌的生长提供无氧环境,且发酵过程中,不同菌株的代谢过程各异,相互调节共同达到一个稳态,为发酵液的保存提供了有利条件,并且能够显著提高微生态制剂中维生素K的稳定性,产品性质稳定。
(2)本发明中微生态能够有效降解赭曲霉毒素,其中丁酸梭菌能够产生有机酸,提高养殖动物免疫活性,凝结纳豆芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的生长能够分解利用碳水化合物合成微生物蛋白,有效缓解肠胀气和肠绞痛。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
丁酸梭菌,菌株编号ATCC13726;纳豆芽孢杆菌菌株编号ATCC23916;凝结孢杆菌,菌株编号ATCC7050;药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物,CAS号为94465-74-4。
实施例1一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂
所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:
丁酸梭菌40份、纳豆芽孢杆菌20份、凝结纳豆芽孢杆菌20份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物5份、丁酸钠0.1份、液体培养基100份;
所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖10份、蛋白粉25份、去氧胆酸钠钠5份、红糖50份、维生素B1 0.1份、维生素B2 0.1份、维生素B12 0.05份、氯化钠1份、磷酸二氢钾2份、无菌蒸馏水50份;所述丁酸梭菌活菌数为1×1010CFU/mL;
所述的分解赭曲霉毒素的微生态制剂的制备方法,包括以下步骤:将纳豆芽孢杆菌菌种接入微生物液体培养基中,于32℃通气发酵培养至形成芽孢,然后接入凝结纳豆芽孢杆菌菌种在28℃通气发酵,待凝结纳豆芽孢杆菌处于稳定期时,再接入丁酸梭菌菌种在30℃密闭厌氧发酵,并同时加入药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠,待丁酸梭菌和凝结纳豆芽孢杆菌同时处于稳定期时,停止发酵,即得。
实施例2一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂
所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:
丁酸梭菌50份、纳豆芽孢杆菌10份、凝结纳豆芽孢杆菌15份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物8份、丁酸钠2.7份、液体培养基150份;
所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖18份、蛋白粉16份、去氧胆酸钠钠3份、红糖80份、维生素B1 2.5份、维生素B2 0.75份、维生素B12 0.03份、氯化钠2份、磷酸二氢钾1.5份、无菌蒸馏水750份;所述丁酸梭菌活菌数为5×109CFU/mL;
所述的分解赭曲霉毒素的微生态制剂的制备方法,包括以下步骤:将纳豆芽孢杆菌菌种接入微生物液体培养基中,于35℃通气发酵培养至形成芽孢,然后接入凝结纳豆芽孢杆菌菌种在30℃通气发酵,待凝结纳豆芽孢杆菌处于稳定期时,再接入丁酸梭菌菌种在35℃密闭厌氧发酵,并同时加入药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠,待丁酸梭菌和凝结纳豆芽孢杆菌同时处于稳定期时,停止发酵,即得。
实施例3一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂
所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:
丁酸梭菌60份、纳豆芽孢杆菌6份、凝结纳豆芽孢杆菌30份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物10份、丁酸钠4份、液体培养基200份;
所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖25份、蛋白粉10份、去氧胆酸钠钠1份、红糖100份、维生素B1 5份、维生素B2 0.1份、维生素B12 0.02份、氯化钠3份、磷酸二氢钾1份、无菌蒸馏水1000份;所述丁酸梭菌活菌数为1×109CFU/mL;
所述的分解赭曲霉毒素的微生态制剂的制备方法,包括以下步骤:将纳豆芽孢杆菌菌种接入微生物液体培养基中,于37℃通气发酵培养至形成芽孢,然后接入凝结纳豆芽孢杆菌菌种在32℃通气发酵,待凝结纳豆芽孢杆菌处于稳定期时,再接入丁酸梭菌菌种在39℃密闭厌氧发酵,并同时加入药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠,待丁酸梭菌和凝结纳豆芽孢杆菌同时处于稳定期时,停止发酵,即得。
对比例1
与实施例2的区别在于将凝结芽孢杆菌替换为两歧双歧杆菌。
对比例2
与实施例2的区别在于缺失凝结芽孢杆菌,缺失部分替换为纳豆芽孢杆菌。
对比例3
与实施例2的区别在于缺失纳豆芽孢杆菌,缺失部分替换为凝结芽孢杆菌。
对比例4
与实施例2的区别在于缺失药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物,缺失部分替换为丁酸钠。
对比例5
与实施例2的区别在于缺失丁酸钠,缺失部分替换为药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物。
试验例1饲料中赭曲霉毒素A的测定
各取5.00g有代表性的霉变玉米饲料,粉碎后分别与实施例1-3和对比例1-5制备得到的微生态制剂混合均匀,霉变玉米饲料与微生态制剂按质量份数1:0.2混合均匀,置于50m L具塞锥形瓶中,加入12.5m L的70%的甲醇溶液,密塞。振荡器提取5min。提取液通过快速滤纸过滤,取1m L滤液,加9m L蒸馏水稀释,摇匀,为试样液,于2-8℃暗处保存24h后,同时设置空表对照组,按照《饲料中赭曲霉毒素的测定免疫亲和柱净化—高效液相色谱法》(GB/T30957—2014)标准测定饲料中赭曲霉毒素A的含量。
表1赭曲霉毒素A含量测测定结果
组别 | 赭曲霉毒素A含量μg/kg |
空白对照组 | 63.14 |
实施例1 | 19.80** |
实施例2 | 10.33** |
实施例3 | 13.69** |
对比例1 | 40.22 |
对比例2 | 38.33* |
对比例3 | 35.44* |
对比例4 | 50.27 |
对比例5 | 36.88* |
**与空白组相比,p<0.01。
从表1中可以看出,相对空白对照,实施例1-3组混合后的霉变玉米饲料中的赭曲霉毒素A含量得到显著降低,且明显低于对比例1-5的组混合后的霉变玉米饲料中赭曲霉毒素A含量,说明本发明的微生态制剂中的药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠能够协同微生态制剂中的其他成分,有效降解饲料中的赭曲霉毒素A。
试验例2对肠推进的影响
选用雄性平均体重为18-22g昆明小鼠,随机分为空白对照组、模型对照组、实施例1-3和对比例1-5组,每组10只,雌雄各半。适应性喂养一周后开始造模,经口灌胃复方地酚诺酯6mg/kg BW,并设置空白对照组,0.5h后,各小鼠别给予2ml的墨汁(含10%的活性炭、10%***树脂),25min后立即脱颈椎处死小鼠,打开腹腔分离肠系膜,剪取上端自幽门,下端至回盲部的肠管,测量肠管长度为小肠总长度,从幽门至墨汁前沿为墨汁推进长度,计算墨汁推进率,其结果如表5所示。
表2墨汁推进率的测定结果
组别 | 墨汁推进率% |
空白组 | 48.33±0.91 |
模型组 | 17.26±0.64** |
实施例1 | 45.21±0.56■■ |
实施例2 | 49.55±0.73■■ |
实施例3 | 48.12±0.64■■ |
对比例1 | 22.45±0.56■ |
对比例2 | 26.47±0.43■ |
对比例3 | 30.31±0.35■ |
对比例4 | 28.40±0.66■ |
对比例5 | 20.47±0.51 |
注:**与空白组相比,p<0.01,■■与模型组相比,p<0.01,■与模型组相比,p<0.05。
从表2中可以看出,模型对照组相对空白对照组减少了墨汁推进率,说明构建模型成功。相比对比例1-5的微生态制剂,实施例1-3的墨汁推进率均显著高于模型对照组,说明本发明的微生态制剂中的丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌和凝结纳豆芽孢杆菌能协同微生态制剂其他组分,显著增加胃肠动力,增强胃动力,能够缓解胃肠不适或腹胀,调节胃肠胀气。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种可分解赭曲霉毒素的微生态制剂,其特征在于,所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:丁酸梭菌40-60份、纳豆芽孢杆菌1-60份、凝结纳豆芽孢杆菌1-60份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物5-10份、丁酸钠0.1-5份、液体培养基100-200份。
2.根据权利要求2所述微生态制剂,其特征在于,所述微生态制剂包括以下重量份数的原料:丁酸梭菌50份、纳豆芽孢杆菌10份、凝结纳豆芽孢杆菌15份、药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物8份、丁酸钠2.7份、液体培养基150份。
3.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于,所述丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌与凝结纳豆芽孢杆菌的重量份数比为1:(0.1-0.5):(0.1-0.5)。
4.根据权利要求3所述微生态制剂,其特征在于,所述丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌与凝结纳豆芽孢杆菌的重量份数比为1:0.2:0.3。
5.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于,所述药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物与丁酸钠的重量份数为1:0.2-0.5。
6.根据权利要求4所述微生态制剂,其特征在于,所述药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物与丁酸钠的重量份数为1:0.35。
7.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于,所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖10~25份、蛋白粉10~25份、去氧胆酸钠钠1-5份、红糖50~100份、维生素B1 0.1-5份、维生素B2 0.05~0.1份、维生素B12 0.02~0.05份、氯化钠1~3份、磷酸二氢钾1~2份、无菌蒸馏水500-1000份。
8.根据权利要求7所述微生态制剂,其特征在于,所述液体培养基为,1L培养基由以下组分组成:葡萄糖18份、蛋白粉16份、去氧胆酸钠钠3份、红糖80份、维生素B1 2.5份、维生素B2 0.75份、维生素B12 0.03份、氯化钠2份、磷酸二氢钾1.5份、无菌蒸馏水750份。
9.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于,所述丁酸梭菌活菌数为1×109-10CFU/mL。
10.根据权利要求1-8任一项所述的分解赭曲霉毒素的微生态制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将纳豆芽孢杆菌菌种接入微生物液体培养基中,于32~37℃通气发酵培养至形成芽孢,然后接入凝结纳豆芽孢杆菌菌种在28~32℃通气发酵,待凝结纳豆芽孢杆菌处于稳定期时,再接入丁酸梭菌菌种在30~37℃密闭厌氧发酵,并同时加入药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和丁酸钠,待丁酸梭菌和凝结纳豆芽孢杆菌同时处于稳定期时,停止发酵,即得。
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