CN112672757A - 抗-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素的抗体、包括该抗体的药学组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是关于对Siglec‑3受体具有结合亲和力的新颖的单克隆抗体。依据实施方式，该单克隆抗体可逆转由HBV所媒介的免疫抑制反应。因此，本发明也提供该单克隆抗体在治疗及/或预防B型肝炎病毒(HBV)感染的用途。

Description

抗-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素的抗体、包括该抗体的 药学组合物及其用途

发明背景

1.技术领域

本发明是关于治疗感染的领域。更具体来说，本发明是关于一种新颖的抗-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin,Siglec)抗体，以及其在治疗及/或预防B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的用途。

2.背景技术

与反转录病毒相似，HBV也为一种有包膜的部分双链DNA病毒。一般来说，HBV会通过RNA中间产物来进行复制，并嵌入宿主的基因体中。HBV独特的复制周期使其可持续存在于感染细胞中。HBV感染会造成不同的肝脏疾病，包括急性肝炎(acute hepatitis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)及肝癌(HCC)。世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)估计全世界约有2.57亿的人口患有HBV感染，在2015年造成约887,000人死亡。

目前尚无治疗急性B型肝炎病毒(acute hepatitis B,AHB)感染的方法。因此，护理主要着重于维持患者的舒适度及营养均衡，包括补充因呕吐及腹泻造成的水分流失。至于慢性B型肝炎病毒(chronic hepatitis B,CHB)感染，美国食品及药物管理局(Food andDrug Administration,FDA)已核准数项药品，包括恩替卡韦(entecavir,Baraclude)、拉米夫定(lamivudine,Epivir HBV)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,Hepsera)、干扰素α-2b(interferon alpha-2b,Intron A)、聚乙二醇化干扰素(pegylated interferon,Pegasys)、喜必福(telbivudine,Tyzeka)及泰诺福韦(tenofovir,Viread)。然而，对多数患者来说，这些治疗仅能抑制病毒复制，而无法有效治愈HBV感染。因此，多数患者需终身接受B型肝炎的治疗。

有鉴于此，相关领域亟需一种可有效预防及/或治疗HBV感染的新颖方法，以减少患者患有肝硬化及肝癌的机率，进而改善患者的长期存活率。

发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明的第一方面是关于一种用以治疗或预防HBV感染的抗体或其片段。该抗体包括一轻链可变(light chain variable,VL)区及一重链可变(heavy chain variable,VH)区，其中该VL区包括一第一轻链互补性决定区(complementarity determiningregion)(CDR-L1)、一第二轻链CDR(CDR-L2)及一第三轻链CDR(CDR-L3)；且该VH区包括一第一重链CDR(CDR-H1)、一第二重链CDR(CDR-H2)，及一第三重链CDR(CDR-H3)。

依据本发明某些实施方式，CDR-L1具有VYY的氨基酸序列，CDR-L2具有ISSAG(序列编号：3)的氨基酸序列，而CDR-L3则具有QYFNFP(序列编号：4)的氨基酸序列。在这些实施方式中，CDR-H1具有NNGW(序列编号：5)的氨基酸序列，CDR-H2具有GIGPYGGSTF(序列编号：6)的氨基酸序列，且CDR-H3具有SRFIGSYSHM(序列编号：7)的氨基酸序列。

较佳地，该VL区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且该VH区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。在一具体实施例中，该VL区具有序列编号：8的氨基酸序列，且该VH区具有序列编号：9的氨基酸序列。

本发明的第二方面是关于依据上述任一实施方式所述的抗体在制备一药物或一药学组合物的用途，其中该药物或该药学组合物可用以预防或治疗HBV感染。该药物或该药学组合物包括一有效量的上述抗体，以及一药学上可接受的载体。

本发明抗体的重量约占药学组合物或药物总重的0.1％到99％。在某些实施方式中，本发明抗体的重量至少占药学组合物或药物总重的1％。在某些实施方式中，本发明抗体的重量至少占药学组合物或药物总重的5％。在某些实施方式中，本发明抗体的重量至少占药学组合物或药物总重的10％。在其他实施方式中，本发明抗体的重量至少占药学组合物或药物总重的25％。

本发明的另一方面是关于一种用以预防或治疗一个体的HBV感染的方法。该方法包括对该个体施予一有效量的本发明抗体、药学组合物或药物。

可接受本发明方法治疗的个体为一哺乳动物，举例来说，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、猴子、猪、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛及兔子。较佳地，该个体是一人类。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图说明如下：

图1为依据本揭示内容实施例1所阐述的结果，其是关于B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的特定聚糖的百分比。图A：源自CHB患者的HBV(hHBV)且具有序列编号：1的氨基酸序列的肽。图B：源自hHBV且具有序列编号：2的氨基酸序列的肽。图C：源自转基因小鼠的HBV(mHBV)且具有序列编号：1的氨基酸序列的肽。bi：无末端Neu5Ac；biS1：一个Neu5Ac；biS2：二个Neu5Ac。

图2为依据本揭示内容实施例2所阐述的结果，其是关于HBV及Siglec-3的相互作用。图A及图B：利用Siglec ECD.Fc融合蛋白进行hHBV(图A)及mHBV(图B)的免疫沉淀分析。S/M/L：小型/中型/大型HBsAg，gS：糖化小型HBsAg。图C：利用ELISA以Siglec ECD.Fc来决定hHBV及mHBV的相互作用。图D：在经hHBV感染的源自单核细胞衍生的树突细胞(monocyte-derived dendritic cell,moDC)中，hHBV与Siglec-3、-7、-9之间的FRET效率。图E：在CHB患者(血清HBV DNA含量>2.0x 107IU/mL)的周边血液单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)中，hHBV与Siglec-3、-7、-9之间的FRET效率。用FLIM-FRET分析软件，并依据“材料及方法”所述的公式来测定FRET效率。每组实验n值为10-15，并将所得数据表示为平均值±标准偏差(standarddeviation,s.d.)。**p<0.01(Student’s t-试验)。图F及图G：以唾液酸聚糖(sialoglycan，图F)及经唾液酸酶-C/唾液酸酶-S处理唾液酸聚糖(图G)，进行hHBV与Siglec-3相互作用的竞争试验。图H：唾液酸酶-C及唾液酸酶-S对hHBV与Siglec-3的相互作用的影响。*p<0.05，**p<0.01，***P<0.001(Student’s t-试验)。所有的数据皆为三组独立实验的分析结果。

图3为依据本揭示内容实施例4所阐述的结果，其是关于hHBV对TLR配位体(ligand)诱导的细胞激素分泌的抑制功效。图A到图D：在经Pam3csk4刺激的moDC(图A及图B)或经聚(I:C)(poly(I:C))刺激的moDC(图C及图D)中，hHBV可抑制细胞激素的分泌。以hHBV或mHBV预处理moDC 24小时后，施予pam3csk4(图A及图B)或聚(I:C)+干扰素-γ(图C及图D)反应24小时。以ELISA决定上清液中细胞激素的含量。将三次独立实验结果表示为平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***：P<0.001(Student’s t-试验)。图E及图F：hHBV以时间相关(图E)及剂量相关(图F)的方式聚集SHP-1及SHP-2。对moDC施予不同剂量的hHBV(图E)或经过不同反应时间(图F)，以免疫印迹法观察SHP-1及SHP-2在moDC的聚集状况。利用软件进行密度测量法以定量分析信号值。以起始量标准化所得数值，并将其表示为倍数改变量。

图4为依据本揭示内容实施例5所阐述的特定单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。图A：对moDC施予hHBV或抗-Siglec-3单克隆抗体(克隆2B9或10C8)后，观察SHP-1及SHP-2与Siglec-3的结合。将抗-Siglec-3单克隆抗体加入细胞分解物中，并以免疫印迹法来检测SHP-1及SHP-2。图B：抗-Siglec-3单克隆抗体(克隆2B9)可抑制经pam3csk4刺激的moDC分泌TNF-α。以抗-Siglec-3单克隆抗体预处理moDC 1小时后，施予pam3csk4。以ELISA决定上清液中TNF-α的含量。将由三次独立实验结果表示为平均值±标准偏差。**P<0.01，***P<0.001(Student’s t-试验)。

图5为依据本揭示内容实施例5.1所阐述的结果，其是关于单克隆抗体10C8的生物活性，其中抗-Siglec-3单克隆抗体(克隆10C8)可降低Siglec-3与hHBV之间的FRET效率。图A：Siglec-3与hHBV在CHB患者的PBMC中的相互作用。图B：Siglec-3与hHBV在经外源性hHBV处理后的moDC中的相互作用。以FLIM-FRET分析软件，并依据“材料及方法”所述的公式来测定FRET效率。每组实验n值为10-15，并将所得数据表示为平均值±标准偏差。**p<0.01(Student’s t-试验)。

图6为依据本揭示内容实施例5.2所阐述的结果，其是关于单克隆抗体10C8对hHBV媒介的免疫抑制反应的功效。图A到图D：抗-Siglec-3单克隆抗体可逆转经pam3csk4刺激的moDC(图A及图B)或经聚(I:C)刺激的moDC(图C及图D)分泌细胞激素。以抗-Siglec-3单克隆抗体预处理moDC 1小时后，在pam3csk4(图A及图B)或聚(I:C)+IFN-γ(图C及图D)存在的环境中，施予不同剂量的hHBV反应24小时。以ELISA决定细胞激素的含量。图E：抗-Siglec-3单克隆抗体可抑制hHBV媒介的SHP-1及SHP-2的聚集反应。以抗-Siglec-3单克隆抗体预处理moDC1小时后，施予HBV培养30分钟，接着加入抗-Siglec-3单克隆抗体进行反应。以SDS-PAGE分离免疫沉淀产物，并加入抗-SHP-1及抗-SHP-2单克隆抗体。利用软件进行密度测量法进行定量分析，并以未处理的对照组标准化数值后，表示为倍数值。图F到图I：逆转经pam3csk4刺激(图F及图G)或经聚(I:C)刺激(图H及图I)的CHB患者的PBMC分泌细胞激素。以抗-Siglec-3单克隆抗体预处理由CHB患者新鲜分离的PBMC，再施予pam3csk4(图F及图G)或聚(I:C)(图H及图I)培养。以ELISA来分析上清液中细胞激素的含量。将三次独立实验结果表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**p<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

I.定义

为了方便起见，在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语在这里收集。除非在本发明中另有定义，本发明中使用的科学和技术术语应具有本发明中普通技术人员所理解和使用的含义。此外，除非上下文另有定义，单数术语应包括其复数形式，复数术语应包括其单数形式。具体地说，在本说明书和权利要求中使用的单数形式“一”包括复数所指，除非上下文明确指出。此外，在本说明书和权利要求中使用的术语“至少一个”和“一个或多个”具有相同的含义，包括一个、两个、三个或多个。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所公开的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

“抗体”(antibody)一词在本发明包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多效抗体(例如双效抗体)及具有特定生物活性的抗体片段。“抗体片段”(antibodyfragment)一词包括一全长抗体的一部分，一般为其抗原结合或可变区。例示性的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂及Fv片段；双价抗体(diantibody)；直线性抗体(linearantibody)；单链抗体分子；以及由抗体片段所形成的双特异性抗体。

“抗体片段”(antibody fragment)仅包括一完整抗体的部分，其中该部分保留一完整抗体的部分、多数或全部功能。在一实施方式中，一抗体片段包括完整抗体的抗原结合位点，以保留结合抗原的能力。在另一实施方式中，抗体片段(例如包括Fc区域的抗体片段)保留该Fc区域存在于完整抗体时，至少一与该Fc区域相关的生物功能，例如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一实施方式中，抗体片段为一单价抗体，其具有大致与完整抗体相似的活体内半衰期。举例来说，该抗体片段可包括一个抗原结合臂，其是与可赋予该片段活体内稳定性的Fc序列连结。本发明的抗体片段可以不同形式存在，举例来说，可变片段(variable fragment,Fv)、单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)、抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)、F(ab)₂及单链抗体。

一抗体的“可变区”(variable region)或“可变域”(variable domain)是指该抗体重链或轻链的氨基末端域。这些位置为抗体最易变动的部分，且包括抗原结合位点。

“可变”(variable)一词是指可变域中某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合及特异性的实情。然而，可变性并非均匀分布在抗体的整个可变域。其主要集中在轻链及重链可变域中3个CDR或高度可变区。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(framework region,FR)。天然重链和轻链的可变域各自包括四个FR，它们大多采取β-折叠片构形，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条抗体链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域(constant domain)不直接参与抗体与抗原的结合，但具有不同的作用功效，例如抗体在抗体相关细胞毒杀(antibody-dependent cellular toxicity)的作用。

“互补性决定区“(complementarity determining region,CDR)在本说明书是指一抗体分子的高可变区，其可与结合抗原的三维立体表面形成互补表面。由N端到C端，各抗体重链及轻链皆包括三个CDR(CDR 1、CDR2及CDR3)。因此，一抗原结合位置包括共6个CDR，其分别为位于可变重链区的3个CDR，以及位于可变轻链区的3个CDR。

依据重链恒定域的氨基酸序列的不同，抗体(免疫球蛋白)可分为不同类型。五种主要的免疫球蛋白类型包括：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中可再细分为次类型(同型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。本领域技术人员皆知不同类型的免疫球蛋白的次单元结构及三维构型，或举例来说，可参见Abbas et al.Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(2000)。一抗体可为一较大融合分子(由抗体与一或多其他蛋白或肽共价或非共价结合所形成)的一部分。

本发明及请求保护的发明概念也包括抗体的氨基酸序列的微小变异，其中氨基酸序列的变异维持至少85％序列相似度，例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似度。可通过特定修饰来改变抗体的特性，而不影响其生理活性。举例来说，可改变及/或删除某些氨基酸而不影响本发明抗体的生理活性(即治疗HBV感染的能力)。特别是，保留性氨基酸取代也包括在其中。保留性取代为具有相似/相关侧链的氨基酸间的相互取代。一般来说，由基因编码的氨基酸可分为四大类：(1)酸性氨基酸，即天冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸(tryptophan)；以及(4)非带电极性氨基酸，即甘氨酸(glycine)、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。较佳的分类是：丝氨酸及苏氨酸是属脂肪羟基(aliphatic-hydroxy)类；天冬酰胺酸及谷氨酰胺是属含酰胺(amide-containing)类；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸是属脂肪类；而苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸则属芳香(aromatic)类。举例来说，当可想见若以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、以谷氨酸取代天冬氨酸、以丝氨酸取代苏氨酸，或是以一结构相似的氨基酸取代另一氨基酸时，并不会造成分子结合或蛋白特性的显著改变，特别是当该取代位置不是位于骨架区时，氨基酸之间的取代更不会影响上述特性。可通过检测抗体衍生物的特定活性来了解一氨基酸的改变是否可形成一具功能性的抗体。可利用本发明所属技术领域具有通常知识者所知的方法来制备抗体片段或类似物。片段或类似物的较佳的氨基及羧基末端是邻近功能域的边界。在一实施例中，是对本发明抗体的一氨基酸残基(例如缬氨酸)进行保留性替换(例如以亮氨酸进行替换)。在其他实施例中，是以其他适合的氨基酸残基来对本发明抗体的二个氨基酸残基进行保留性替换；举例来说，可以例示性的甲硫氨酸(M)及赖氨酸(K)、赖氨酸(K)及脯氨酸(P)、色氨酸(W)及异亮氨酸(I)、异亮氨酸(I)及脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)及缬氨酸(V)，以及谷氨酰胺(G)及赖氨酸(K)等氨基酸对来替换缬氨酸(V)及精氨酸(R)。

“序列相似度百分比(Percent(％)sequence identity)”被定义为，在比对(aligning)序列和必要时引入间隙(以实现最大百分比的序列一致性,而不将任何保留性的替换考虑为序列一致性的部分)后，候选序列中氨基酸残基与特定的肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比。为了测定序列一致性的百分比，可以通过本领域技术范围内的多种方式实现比对(alignment)，例如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行比对时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最精确的比对结果。在本说明书中，两个氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物技术信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，简称NCBI)所提供的计算机程序Blastp(protein-protein BLAST)来进行序列比对。一候选序列A相较于一参考序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中也称为序列A与序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下:

其中X是利用BLAST分析数据库对序列A、B进行比对后所得到的完全相同的氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短的氨基酸残基总数。“有效量”(effective amount)在此处是指一药物的用量足以产生期望的疗效反应。有效量也指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。具体的有效量取决于多种因素，如治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(例如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/千克(mg/kg))。或者是，可将有效量表示成活性成分(例如，本发明的单克隆抗体)的浓度，例如摩尔浓度、质量浓度、体积浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数、质量分数及混合比值。本领域技术人员可依据动物模型的剂量来计算药物(如本发明的抗体)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公开的“估算成人健康志愿者在初步临床治疗试验的最大安全起始剂量”(Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。

在本发明中，“治疗”(treat)、“治疗中”(treating)、“疗法”(treatment)是可互换的，包括部分或完全预防、改善、减轻及/或处理HBV感染相关的病征(symptom)、继发性疾病(secondary disorder)或症状(condition)。“治疗中”(treating)一词在本说明书中也指对一个体应用或施予一或多本发明抗体，该个体是患有HBV感染相关的病征、继发性疾病或症状，以达到部分或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一或多种与HBV感染相关的病征、症状、或继发性疾病的发生。与HBV感染相关的病征、继发性疾病及/或症状包括，但不限于，疲劳、恶心、呕吐、深色尿液、关节及肌肉疼痛、食欲不振、发烧、腹部不适、虚弱、黄疸及肝衰竭。在此“疗法”(treatment)也可指施予至患有早期这些病征或症状的个体，以降低该个体发展与HBV感染相关的病征、继发性疾病及/或症状的风险。当一治疗可减少一或多种病症或临床标记时，则该治疗为“有效的”(effective)。或者是，当一治疗可降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展时，则该治疗为“有效的”(effective)。

在本发明中，“预防”(prevent，preventing或prophylaxis)一词是指对一个体施予预防性治疗，其中该个体具有患有与HBV感染相关的病征、继发性疾病或症状的风险，以降低该个体发展与HBV感染相关的病征、继发性疾病及/或症状的机率。具体来说，“预防”(prevent，preventing或prophylaxis)一词是指抑制与HBV感染相关的病征、继发性疾病或症状的发生；也就是，减少病征、继发性疾病或症状发生的机率或频率。在使用一抗体、一包括该抗体的药学组合物及/或方法来进行“预防”(prevent，preventing或prophylaxis)时，是指该抗体、包括该抗体的药学组合物及/或方法可抑制该病征、继发性疾病或症状的发生，及减少该病征、继发性疾病或症状发生的机率及/或频率，而非指示或暗示使用该抗体、包括该抗体的药学组合物及/或方法后，保证该病征、继发性疾病或症状不会再次发生。

“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)一词是指当施予至人体后，通常被视为安全的分子或组合物，例如这些具有生理兼容性及不会产生过敏或类似不当反应(例如胃部不适及晕眩等)的分子或组合物。较佳地，“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)一词在本说明书中是指经由美国联邦或州政府的管理机构认可且可应用于动物或人类的分子或组合物。

“个体”(subject)一词是指哺乳动物包括人类，其可接受本发明方法的治疗。除非特定指出，否则“个体”(subject)一词同时意指男性及女性。

II.发明详细说明

本发明至少部分是基于发明人首次发现HBV对Siglec-3具有结合亲和力，且对Siglec-3具有特异性的抗体可用以逆转HBV诱导的免疫抑制反应。

因此，本发明提供一种对Siglec-3受体具有结合特异性的单克隆抗体或其片段。

依据本发明的实施方式，是利用噬菌体的scFv抗体库来制备本发明单克隆抗体。当可想见，也可通过传统免疫法(即，以特定肽免疫化动物)来制备本发明单克隆抗体。

一般来说，可用如t-BOC或FMOCα-氨基团保护法等熟知方法来合成多肽(即，Siglec-3多肽)。二种方法皆为逐步合成，即由肽的C端开始，每步骤加入一个氨基酸。也可以熟知的固相肽合成法来合成本发明多肽。

之后，可以合成多肽免疫化宿主动物(例如小鼠、大鼠或兔子)，以制备抗体。可依据惯常流程来进行免疫化反应。免疫化的时间间隔并无特定限定。免疫化的间隔时间可为数天至数周，较佳为一周；共进行2-10次，直接到达特定的抗体效价。举例来说，可每周对宿主动物皮下注射合成多肽，连续注射8周。

在最后一剂注射后，取出该动物的脾脏细胞及区***。采取血液样本并将其离心处理以分离血清。可利用任意适合的方法来检测所得血清中的抗体效价，例如酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、酶免疫分析(enzymeimmunoassay,EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)。在一较佳的实施例中，是利用ELISA来测定抗体的效价。由分离的脾脏细胞及区***制备可产生抗体的细胞。在制备可产生抗体的细胞时，宜先尽可能移除组织残渣及红血球。在此步骤可使用商业购买的红血球去除剂。或者是，可以使用包括氯化铵及三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris))的缓冲液。立即将可产生抗体的细胞与永生细胞(例如骨髓瘤细胞)进行融合，以制得杂交瘤细胞；杂交瘤细胞为一种可持续生长繁殖，并产生抗体的半永生细胞。可以使用由动物(例如小鼠)取得常用的细胞株。较适用于本发明的细胞株为可有效融合、持续产生高量抗体、对次黄嘌呤-氨蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培养液具有敏感性，且唯有在与可产生抗体的细胞融合后方可存活的细胞株。适合的骨髓瘤细胞包括，但不限在，小鼠骨髓瘤细胞株(例如骨髓瘤FO细胞)及人类骨髓瘤细胞株(例如Karpas 707H)。细胞融合通常是将脾脏细胞或***细胞与商业取得的骨髓瘤细胞在一促进细胞融合因子的作用下，进行融合反应，例如平均分子量约为200至20,000kDa的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)或其他类似物。或者是，细胞融合可以利用商业细胞融合仪，通过电刺激(例如电融合)来进行融合反应。融合后，将所得细胞稀释并培养于HAT培养液中。

由这些融合细胞中挑选出适合的杂交瘤细胞。在HAT培养液中存活的融合细胞会形成聚集群落。收集各培养液的上清液，且以抗原来检测是否具有抗体效价。如上所述，可以使用酶联免疫吸附法、酶免疫分析或放射免疫分析来进行检测，其是将抗原涂布于盘中，并由此进行筛选。一旦确认可产生抗体的孔洞，即可将其中的细胞转移至不含氨蝶呤的次黄嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine,HT)培养液中培养。经过培养，再次确认培养上清液中的抗体效价。由最终筛选出的细胞中，分离出单一颗细胞。待单一颗细胞生长繁殖成一聚集群落后，筛选对抗原具有高度特异性的聚集群落，并使其持续生长繁殖以制成杂交瘤细胞株。

依据本发明较佳的实施方式，在筛选出一株杂交瘤细胞株后，可利用任何已知方式由该杂交瘤细胞株分离或制备单克隆抗体。举例来说，可以将杂交瘤细胞株培养于低血清浓度的培养液中，再由该培养上清液制备抗体。或者是，将杂交瘤细胞株注入动物的腹腔，由腹水来制备抗体。抗体可以任何方式进行纯化，该方式包括亲和柱、凝胶滤层析、离子交换层析或相关技术。可以使用任何相关领域本领域技术人员所熟知的方法或其组合。

或者是，可通过DNA基因克隆来制备本发明单克隆抗体。可利用常规步骤来分离及测序分析(例如可专一结合至用以编码单克隆抗体的重链及轻链基因的寡核苷酸探针)用以编码本发明单克隆抗体的DNA。较佳的DNA来源是利用这些杂交瘤细胞株。一旦分离后，可将DNA建构至表达载体，再将表达载体转染至宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢CHO细胞或不会产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，以便在重组宿主细胞中制备出单克隆抗体。

制得的单克隆抗体及用以编码这些单克隆抗体的DNA可用以制备嵌合型抗体(例如双特异性抗体)、人类化抗体及/或其抗体片段。

非人类来源的单克隆抗体因具有免疫抗原性(immunogenicity)而会造成过敏反应。单克隆抗体多是源自小鼠，其注射至人体后往往会引起严重的免疫反应。为降低非人类来源的单克隆抗体的免疫抗原性，将非人类来源的单克隆抗体的重链及轻链可变区与人类抗体的恒定区接合，以便制备人类化抗体。

为制备人类化的单克隆抗体，先将这些用以编码抗体的DNA分离并测序，再以此进行人类化建构。

依据本发明较佳的实施方式，将非人类来源的单克隆抗体的VH及VL基因建构至人类IgG1载体中。由此制得的抗体因此具有源自非人类来源的单克隆抗体的VH及VL区，而其恒定区基因(即CK或CH1-H-CH2-CH3)则为人类的IgG。

一旦制得，可依据相关领域中的标准步骤来纯化人类化单克隆抗体，包括错流过滤(cross-flow filtration)、亲和柱层析(affinity column chromatography)或凝胶滤层析(gel filtration)等方法。当可想见，人类化单克隆抗体的作用应与非人类来源的单克隆抗体相同或大致相似。较佳地，相较于非人类化抗体，人类化的单克隆抗体对人类个体具有较佳的作用效益。

本发明的第一方面因此是关于一种对Siglec-3受体具有特异性的单克隆抗体或其片段(即一种抗-Siglec-3单克隆抗体或一种抗-Siglec-3抗体片段)。依据本发明的实施方式，该单克隆抗体包括一VL区及一VH区，其中该VL区包括CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且该VH区包括CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。

依据本发明的实施方式，本发明单克隆抗体指定为抗体10C8，其CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分别具有VYY、ISSAG(序列编号：3)及QYFNFP(序列编号：4)的氨基酸序列，且其CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分别具有NNGW(序列编号：5)、GIGPYGGSTF(序列编号：6)及SRFIGSYSHM(序列编号：7)氨基酸序列。

较佳地，该VL区的氨基酸序列至少85％(即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％or 100％)相似于序列编号：8，且该VH区的氨基酸序列至少85％(即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％or 100％)相似于序列编号：9。当可想见，该VL及VH区的骨架序列可有所变异(例如以保留性或非保留性氨基酸残基进行替换)，而不会影响本发明抗体的结合亲和力及/或特异性。较佳地，以一或多具有相似特性的氨基酸残基来保留性替换骨架区的序列；举例来说，以异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸(一非极性氨基酸残基)来取代亮氨酸(另一非极性氨基酸残基)；以谷氨酸(一酸性氨基酸残基)取代天冬氨酸(另一酸性氨基酸残基)；或是以精氨酸或组氨酸(一碱性氨基酸残基)来取代赖氨酸(另一碱性氨基酸残基)。依据一较佳的实施方式，该VL及VH区的氨基酸序列分别至少90％相似于序列编号：8及9。更佳地，该VL及VH区的氨基酸序列分别至少95％相似于序列编号：8及9。在本发明一操作实施例中，该VL区具有序列编号：8的氨基酸序列，且该VH区具有序列编号：9的氨基酸序列。

本发明单克隆抗体(即，抗-Siglec-3单克隆抗体)可用以治疗或预防HBV感染。据此，本发明也提供一种药学组合物或药物，以预防或治疗HBV感染，以及/或是减缓或改善与HBV感染相关/由HBV感染所造成的病征。该药学组合物或药物包括一有效量的依据本发明的任一方面或实施例所述的单克隆抗体，以及非必要性地，一药学上可接受的载体。

一般来说，本发明单克隆抗体/抗体片段的重量约占药学组合物或药物总重的0.1％到99％。在某些实施方式中，该单克隆抗体/抗体片段的重量至少占药学组合物或药物总重的1％。在某些实施方式中，该单克隆抗体/抗体片段的重量至少占药学组合物或药物总重的5％。在某些实施方式中，该单克隆抗体/抗体片段的重量至少占药学组合物或药物总重的10％。在其他实施方式中，该单克隆抗体/抗体片段的重量至少占药学组合物或药物总重的25％。

可将本发明药学组合物配制为固体、半固体或液体形式，例如锭剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂及注射液。据此，可通过如口服、颊部、直肠、非肠胃道、静脉注射及腹腔注射等不同路径来施予本发明单克隆抗体/抗体片段。在药剂形式中，可单独施予本发明单克隆抗体/抗体片段，或是与其他已知用以治疗由HBV感染造成的疾病及病症的药学活性剂合并施予。本发明所属技术领域具有通常知识者可依据施予路径的不同来选择适当的剂型。最佳的施予路径会因疾病或病症的本质或严重程度不同而有所差异。

可依据可接受的药物制作方法来制备本发明药物或药学组合物，例如在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,MackPublishing Company,Easton,Pa(1985)”所述的方法。药学上可接受的载体为这些与剂型中其他成分兼容且可为生物体接受的物质。

可使用的固体赋形剂可以包括一或多种物质，该物质可以是调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂、片剂崩解剂或包覆性材料。若以粉末形式存在，该赋形剂是为一可与细碎活性成分混合的细碎的固体。若以片剂方式存在，活性成分是与一具有压缩特性的赋形剂，以适当比例压缩为所需的形状及大小。粉末及片剂最好包括高达99％的活性成分。适用于本发明的固体赋形剂可以是磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，以及聚乙烯吡咯烷酮等。

也可将本发明的单克隆抗体/抗体片段配制为无菌溶液或悬浮液形式的液体药学组合物，其是可以静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、脊内、腹腔或颅内等方式注射至个体。

可将本发明的药学组合物或药物配制为适用于肠道外施予的剂型，例如注射施予，其包括，但不限于皮下、弹丸注射(bolus injection)、肌肉内、腹腔内及静脉内注射。药学组合物或药物可配制成油性或水性的等渗悬浮液、溶液或乳剂，且可包括处方药剂，例如悬浮、稳定或分散药剂。或者是，药学组合物或药物可以在使用前制成干燥形式，例如粉末、晶体或冷冻干燥的固体，含无菌且无热原(pyrogen-free)的水或等渗生理食盐水。组合物也可置于无菌的安瓶或小瓶中。

当本发明单克隆抗体/抗体片段配制为静脉内、经皮或皮下注射等施予剂型时，可将单克隆抗体制为无热原的肠道外可接受的液体溶液。在考虑到pH值、等渗性及稳定性等因素下，本发明所属技术领域中具有通常知识者皆知如何制备该肠道外可接受的液体溶液。除了本发明单克隆抗体/抗体片段外，一较佳的用以静脉内、经皮或皮下注射的药学组合物或药物应包括一等渗赋形剂，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或其他熟知的赋形剂。本发明药学组合物或药物也可包括稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其他本发明所属领域具有通常知识者所知的添加剂。静脉施予本发明的药学组合物或药物的间隔时间会随着疾病的严重程度及每位个体的状况与潜在特异反应的不同而有所差异。在连续静脉内施予时，每次施予本发明单克隆抗体的间隔时间可为12到24小时。医疗人员可决定适当的静脉治疗的疗程。

本发明的另一方面是关于一种用以预防一个体感染HBV及/或治疗一个体的HBV感染的方法。该方法包括对该个体施予一有效量的本发明所述的单克隆抗体/抗体片段、药学组合物或药物。

该施予至个体的有效剂量约为每千克个体体重施予0.01到1,000毫克，例如每千克个体体重施予0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000毫克；较佳地，约为每千克个体体重施予0.1到100毫克。可以一次施予该剂量，或是以多次等分进行施予。本领域技术人员或临床人员可依据患者的生理状况或疾病的严重程度来调整施予剂量或疗程。

依据本发明某些实施方式，HBV感染会抑制个体的免疫反应，而施予本发明单克隆抗体(即，抗-Siglec-3单克隆抗体)则可逆转HBV造成的免疫抑制反应。在这些实施方式中，本发明抗-Siglec-3单克隆抗体可用以阻断HBV及Siglec-3的结合，以活化/改善宿主的免疫反应，进而清除个体体内的HBV病毒颗粒。因此，本发明抗-Siglec-3单克隆抗体可用以预防或治疗HBV感染，以及/或是减缓或改善与HBV感染相关/由HBV感染造成的病征。

基本上，可接受本发明方法治疗的个体为一哺乳动物，举例来说，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、猴子、猪、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛及兔子。较佳地，该个体是一人类。

本发明单克隆抗体(即，抗-Siglec-3单克隆抗体)可以一适当的路径施予至个体体内，例如口服、肠内、鼻腔、局部、黏膜或肠道外施予，其中肠道外施予可以是肌肉内、静脉内或腹腔内注射。

当可想见，可单独对个体施予本发明方法，也可与其他对预防或治疗HBV感染有所帮助的额外疗法共同施予。依据所需/治疗目的不同，本发明方法可在施予该额外疗法之前、期间或之后进行施予。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。相信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

血液供体

本研究血液供体是源自中国医药大学附属医院中未经治疗且为HBeAg阳性(HBVDNA>2x10⁷IU/mL)的CHB患者(n＝6)。所有的患者皆未经其他病毒感染，包括C型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)及艾司坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)。健康供体(n＝6)则来自中国台湾血液中心。本研究经伦理委员会核准，且所有参与者皆有签署知情同意书。

质粒及融合蛋白

以反转录-PCR来扩增源自人类GM-Mφ的人类Siglec-3/-7胞外域(extracellulardomain,ECD)DNA片段，并将其亚克隆至pSecTag2-hIgG载体，以制备重组Siglec-3/-7ECD.Fc融合蛋白。依据用户操作说明，利用FreeStyle 293表达***来过表达重组Siglec-3/-7/-9ECD.Fc融合蛋白。在转染后第3天及第5天收集培养上清液，并以蛋白A管柱来纯化重组融合蛋白。

纯化及定量分析HBV病毒

分别由CHB患者及HBV转基因小鼠的血液样本纯化HBV。利用熟知方法来进行纯化。依据标准HBV质粒，以RT-PCR来决定HBV病毒量。利用ELISA试剂盒来定量分析HBsAg的含量。

以Nano-LC-MS/MS确认HBsAg的聚糖结构

将由CHB患者及转基因小鼠纯化的HBV上样至12％SDS-PAGE，依据HBsAg的分子量将胶体切割为不同片段，接着以胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶分解。以配有纳米电喷雾离子源、Agilent 1100连续二元高效液相色析泵及Famos自动推样器的LTQFT Ultra(线性四极离子阱傅立叶变换离子回旋共振)质谱仪进行高分辨率及高质量准度纳米流LC-MS/MS实验。以每分钟10微升的流速将6微升的分解溶液注入自填式预柱(150微米I.D.x20毫米，5微米，

)。利用自填式反相C18纳米管柱(75微米I.D.x 300毫米，5微米，

)，以0.1％的溶于水的甲酸作为移动相A，以及0.1％的溶于80％乙腈的甲酸作为移动相B，将流速设定为每分钟300纳升，进行色谱分离。检测全扫描MS条件：质量范围为m/z 320-2000，m/z 400的分辨率为50,000。以LTQ依次分离强度最强的五种离子以进行MS2。使电喷雾电压维持在1.8kV，且将毛细管温度设置为200℃。

以唾液酸酶消除HBV及唾液酸聚糖的唾液酸

分别利用唾液酸酶S及唾液酸酶C消除HBV或唾液酸聚糖上的唾液酸。唾液酸酶S仅会释放出α(2–3)连接的Neu5Ac，而唾液酸酶C则会释放α(2–3)连接及α(2-6)连接的Neu5Ac。经唾液酸酶处理的基质可用以进行HBV-Siglec-3结合试验及竞争试验。

HBV与Siglec.Fc融合蛋白之间的相互作用

在4℃，分别将HBV(10⁹拷贝数/毫升)与重组Siglec-3/-7/-9ECD.Fc融合蛋白培养16小时后，加入与琼脂糖共轭的蛋白A磁珠进行免疫沉淀反应。利用12％SDS-PAGE分离不同分子量的样本后，转印至PVDF膜，加入封闭缓冲液(0.05％的溶于含有5％BSA的TBS的Tween20)并在4℃反应至隔日。加入与HRP共轭的多克隆山羊-抗-HBs抗体在室温反应1小时，之后加入链霉亲和素-HRP(1:10000稀释)在室温再反应1小时，并以ECL观测表达量。

竞争试验

将Siglec ECD.Fc融合蛋白(5微克)涂布于微量滴定盘，在包括不同浓度的以下聚糖的环境中，加入HBsAg(100纳克)：Neu5Ac(α2-6)-Gal-GlcNAc、Neu5Ac(α2-3)-Gal-GlcNAc及Gal-GlcNAc，在不含蛋白的封闭缓冲液中，在4℃反应12小时。经唾液酸酶处理及未经唾液酸酶处理的唾液酸聚糖可用以进行竞争试验。

利用生物层干涉法(Bio-layer interferometry,BLI)决定受体-病毒的相互作用

利用生物层干涉法来决定人类Siglec.Fc融合蛋白与HBV之间的相互作用。简单来说，使生物传感器与Siglec.Fc融合蛋白固定后，在室温以电泳缓冲液(10mM Tris·HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂及2mM MgCl₂，pH7.4)分析Siglec.Fc与HBV之间的结合。决定HBV与人类Siglec-3之间的价数，如以下公式所述，其与多价结合强度及单价结合强度相关：

KA,surf＝F(Sx 10^-2)^n-1x(KA,单个)ⁿ，其中KA,surf为KD(HBV与Siglec-3)的倒数，KA,单个为KD(双触角(Biantennary)α2-6连结的唾液酸糖肽及Siglec-3)的倒数；n为价数值；F为***中的统计因子，S等于

其是依据RCSB蛋白数据库(编号：5J0B)的Siglec-3的晶体结构推知而得。计算三项独立的BLI分析结果，以得到n值(价数值)。

制备及确认抗-Siglec单克隆抗体，并筛选拮抗性抗体

由噬菌体表现的合成抗体库来制备抗-Siglec单克隆抗体。结合功能性scFv可变体及人类IgG来建构通用型人类抗体，并以FreeStyle 293表达***进行制备。

利用与APC共轭的抗-Siglec-3及人类IgG(由与APC共轭的试剂盒所制备)进行流式细胞仪分析，以决定其与moDC的结合能力。基于抗体对经TLR2刺激的moDC分泌细胞激素的抑制功效来确认为促效型及拮抗型-Siglec-3单克隆抗体。简单来说，将moDC种植在培养盘24小时，加入抗-Siglec单克隆抗体反应1小时，之后再加入pam3 csk4(每毫升0.05微克)反应24小时。以ELISA试剂盒来分析上清液中细胞激素的含量。

细胞培养

利用标准密度梯度离心，由健康人类供体及CHB患者的全血分离PBMC。为制备初始巨噬细胞，利用抗-CD14微磁珠进行高梯度磁选，由PBMC纯化CD14+细胞。将细胞培养于含有10％FCS及人类GM-CSF/IL-4的全RPMI 1640细胞培养液中培养6-7天，以制备moDC。

为了解HBV的抑制功效，将moDC(每孔6x10⁴细胞)与HBV培养24小时，之后加入Pam3csk4(每毫升0.05微克)或聚(I:C)(每毫升100微克)+IFN-γ(每毫升100纳克)反应24小时。为确认为促效型或拮抗型Siglec-3单克隆抗体，将CHB患者的moDC(每孔洞6x10⁴细胞)及PBMC(每孔6x10⁴细胞)与抗-Siglec单克隆抗体培养1小时，再加入HBV反应24小时，之后加入Pam3csk4(每毫升0.05微克)或聚(I:C)(每毫升100微克)反应24小时。以ELISA试剂盒分析上清液中细胞激素的含量。

共焦显微镜

将CHB患者的moDC(2x10⁵细胞)及PBMC与分离自CHB患者的HBV(每毫升10⁹拷贝数)在含有或不含有抗-Siglec-3单克隆抗体(每毫升3微克，克隆10C8)的环境中，冰上培养1小时。在4℃洗涤并固定细胞1小时，接着在室温加入细胞渗透缓冲液(0.5％的溶于PBS的Triton X-100)作用15小时后，置于封闭缓冲液(3％BSA)反应1小时，之后加入一级抗体。在4℃培养24小时后，在室温加入二级抗体反应1小时，接着加入鬼笔环肽(phalloidin，每微升1单位)及Hoechst 33342作用10分钟，再以Leica SP5共焦显微镜观察表达量。

荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)及荧光生命周期影像(fluorescence lifetime imaging,FLIM)

将Siglec-3(作为供体)与一级抗体在4℃共同培养24小时后，加入驴抗-小鼠(H+L)Alexa-Fluor 647共轭的二级抗体，在室温反应1小时。将HBsAg(作为受体)与100微升的每毫升10微克的一级抗体在4℃共同培养24小时后，加入驴抗-山羊(H+L)Alexa-Fluor 546共轭的二级抗体，在室温反应1小时。染色后，以PBS洗涤细胞，并将细胞重新悬浮于固定溶液，并以盖玻片封盖。

为进行FLIM-FRET分析，以Leica SP5共焦显微镜记录FLIM。测量仅表达FRET供体的细胞及同时表达FRET供体及受体的细胞的荧光生命周期。以镭射(488纳米)脉冲样本，并收集样本的发散波长(500到550纳米)。各样本皆记录10,000个光子。依据以下公式计算FRET效率(E)：E＝1-(τDA/τD)，其中τDA为共表达FRET供体及受体的细胞的平均荧光生命周期，而τD则为仅表达FRET供体的细胞的平均荧光生命周期。

检测经HBV处理的moDC中，与Siglec-3结合的SHP-1及SHP-2

将moDC与HBV培养后，重新悬浮在细胞分解缓冲液中，加入抗-Siglec-3多克隆抗体后，以与蛋白A共轭的琼脂糖进行免疫沉淀反应。利用SDS-PAGE分离不同分子量的免疫沉淀物，并其转印至PVDF膜，分别加入抗-SHP-1及SHP-2抗体。之后依序加入与HRP共轭的抗-兔子IgG抗血清，以及增强化学冷光检测试剂。为检测Siglec-3的总量，以Re-Blot增强溶液消除结合抗体后，加入小鼠抗-Siglec-3抗体。

统计分析

将数值表示为平均值±标准偏差。所有的实验都至少重复3次。以Student t-试验评估分析结果。当P值为0.05时，即视为具有显著差异。

实施例1HBsAg的聚糖结构

为了解hHBV与mHBV的唾液酸聚糖的不同，以CsCl₂超速离心法分别纯化CHB患者(hHBV)及转基因小鼠(mHBV)血清中的病毒颗粒，接着以纳流LC-MS/MS及GlycoSeq软件测定聚糖结构。

结果发现源自hHBV表面抗原(hHBsAg)且具有重叠序列的二条肽皆包括N-聚糖。第一条肽具有序列编号：1的氨基酸序列(T₁₄₀KPTDGN₁₄₆CTCIPIPSSW₁₅₆，N-聚糖是位于Asn-146位置)；而第二条肽则具有序列编号：2的氨基酸序列(P₁₄₂ SDGN₁₄₆CTCIPIPSSWAFGK₁₆₀，N-聚糖是位于Asn-146位置)。T/S₁₄₃突变指出CHB患者的血清存在HBV突变株。对第一条肽来说，荷质比(mass to charge ratio,m/z)1068.94的信号值表示GlcNAc存在，m/z656.92的信号值表示Neu5Ac-Gal-GlcNAc存在，而m/z1515.02-1923.80的信号值则表示具有唾液酸化聚糖的延伸分支的片段化(结果未显示)。该结果显示，hHBsAg具有双触角N聚糖：Neu5Ac-Gal-GlcNAc-Man连接于GlcNAc。进一步以伪-MS质谱仪来分析末端唾液酸与半乳糖的连结。低m/z 274.12及m/z 292.15信号值显示Neu5Ac(α2-6)-Gal-GlcNAc的存在(结果未显示)。此外，约有45％肽包括与二个唾液酸(biS2,27.6％)或一个唾液酸(biS1,17.9％)共轭的双触角N-聚糖(图1的图A)。在第二条肽也可观察到相似的结果(图1的图B)。相较之下，即使具有相同的与聚糖共轭的肽序列，源自mHBV表面抗原(mHBAg)的第一条肽并不包括N-聚糖(图1的图C)。

这些结果指出，源自CHB患者的HBsAg(称为hHBsAg)包括双触角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAcMan，其是与hHBV的小型S抗原的Asn-146共轭，而源自HBV转基因小鼠的mHBsAg在相同位置则不具有双触角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAcMan。

实施例2HBV Asn-146唾液酸聚糖与人类Siglec成员的相互作用

基于hHBV双触角聚糖相似于人类Siglec-3、-7、-9的配位体，本实施例将分析hHBV与这些骨髓性Siglec(高表达于树突细胞及其他骨髓细胞)的相互作用。

将重组Siglec ECD.Fc融合蛋白与hHBV共同培养，以检测其与hHBV的相互作用。抗-HBsAg多克隆抗体可结合所有糖化及非糖化的HBsAg(小型、中型及大型)，而人类Siglec-3.Fc则主要结合糖化小型HBsAg(h)(gs,27KDa)(图2的图A)；这些结果指出，Siglec-3偏好与hHBV的小型HBsAg的唾液酸聚糖结合。然而，在相同条件下，Siglec-7.Fc及Siglec-9则不会产生相似的相互作用(图2的图A)，该结果显示hHBV优选地通过小型HBsAg上的唾液酸聚糖来与Siglec-3结合(图2的图A)。

即使mHBV的Asn-146位置不具有唾液酸聚糖，但在mHBV可发现糖化及非糖化HBsAg(图2的图B)。该结果与先前研究结果一致，即在氨基酸残基Asn-129、Asn-130及Asn-131可检测到其他的糖化位置。进一步以免疫沉淀法及ELISA来分析骨髓性Siglec与mHBV的结合特异性。然而，这些Siglec均无法与mHBV结合(图2的图B)，ELISA结果也显示其不会与三种Siglec结合(图2的图C)。

为确认hHBV与人类Siglec-3离体的结合特异性，由CHB患者分离周边血液细胞后，以抗-HBsAg抗体及与Alexa-Fluor 546共轭的二级抗体，以及抗-Siglec-3单克隆抗体及与Alexa-Fluor 488共轭的二级抗体进行双染。以鬼笔环肽染色细胞轮廓。数据指出仅能在Siglec-3⁺细胞检测HBsAg，其是与HBsAg同位表达(结果未显示)。这些结果显示，hHBV会结合至Siglec-3⁺人类骨髓细胞。接着以FRET来分析hHBV与Siglec-3的直接结合。数据指出仅能在hHBV与Siglec-3之间检测到高能量转移，而在Siglec-7及Siglec-9则无法检测到(图2的图D及图E)。此外，加入Siglec-3配位体(Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc)可以剂量相关的方式抑制Siglec-3-HBV的相互作用(或结合反应)，而在相同条件下加入Neu5Ac(α2–3)GalGlcNAc及GalGlcNAc则不会抑制Siglec-3-HBV的相互作用(图2的图F)。为进一步确认hHBV-Siglec-3的相互作用是通过α2-3连结的唾液酸，分别加入唾液酸酶S(释放α2-3唾液酸)及唾液酸酶C(释放α2-3andα2-6唾液酸)以消除Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚糖及hHBV上的唾液酸。结果证实经唾液酸酶C(而非唾液酸酶S)处理的Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚糖会丧失其对Siglec-3-HBV相互作用的抑制功效(图2的图G)，且唾液酸酶C会降低hHBV结合至Siglec-3(图2的图H)。

整体来说，这些结果证实hHBV与Siglec-3的相互作用主要是通过与HBsAg相关的唾液酸聚糖上的末端α2-6唾液酸。

实施例3测定HBV与人类Siglec的结合亲和力

本实施例将分析人类Siglec-3与hHBV病毒体之间的结合亲和力。重组Siglec-3.Fc(Siglec-3为二聚体)及单体Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc之间的平衡解离常数(KD)为1.59(±0.97)x10^-3，而Siglec-3.Fc及双触角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc之间的KD则为9.59(±1.45)x10^-5(表1)。

表1Siglec-3.Fc与Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚糖的反应动力学

Ka：结合速率常数。

Kd：解离速率常数。

KD：平衡解离常数。由三项独立实验得到结果，并将结果表示为平均值±标准偏差。

重组Siglec-3与人类HBV(hHBV)病毒体之间的KD会增加至1.15(±0.11)x10^-10(表2)。相较之下，在相同条件下，小鼠HBV(mHBV)病毒体则不会与人类Siglec-3结合(表3)。

表2重组Siglec-3与hHBV的反应动力学

Ka：结合速率常数。

Kd：解离速率常数。

KD：平衡解离常数。由三项独立实验得到结果，并将结果表示为平均值±标准偏差。

表3重组Siglec-3与mHBV的反应动力学

Ka：结合速率常数。

Kd：解离速率常数。

KD：平衡解离常数。由三项独立实验得到结果，并将结果表示为平均值±标准偏差。

HBV与重组Sigelc-3.Fc之间的价数(N)为2，意指各单体Siglec-3会结合至一双触角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc。相较之下，在相同条件下，hHBV则不会与其他Siglec-7及Siglec-9结合。以唾液酸酶C消除hHBV上α2-6连结的Neu5Ac可阻断Siglec-3与hHBV的结合(表4)。

表4Siglec-3与特定hHBV的反应动力学

Ka：结合速率常数。

Kd：解离速率常数。

KD：平衡解离常数。由三项独立实验得到结果，并将结果表示为平均值±标准偏差。

这些数据指出，hHBV病毒体会通过双触角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc的末端α2-6唾液酸结合至Siglec-3。

实施例4hHBV会抑制TLR配位体刺激moDC分泌细胞激素

本实施例将分析Asn-146唾液酸聚糖对TLR配位体(其为免疫细胞的潜力活化剂)刺激单核细胞衍生的树突细胞(moDC)分泌细胞激素的作用。

分别将源自CHB患者及转基因小鼠的moDC与Pam3csk4(TLR-2配位体)及聚(I:C)(TLR-3配位体)与干扰素-α(IFN-α)共同培养。hHBV会以剂量相关的方式抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)及干扰素γ诱导蛋白10(interferon gamma-inducedprotein 10,IP-10)的产生；在相同条件下，mHBV则不具该抑制功效(图3的图A到图D)。这些结果显示hHBV所媒介的抑制反应可能是通过活化Siglec-3所造成。为确认该推论是否属实，将moDC与hHBV共同培养不同时间后，以抗-Siglec-3单克隆抗体进行免疫沉淀反应，以检测SHP-1及SHP-2，其在Siglec-3活化后会通过ITIM域聚集(图3的图E)。这些结果显示，在15分钟时，可检测到SHP-1及SHP-2的信号，在30分钟时达最大量，而在培养60分钟后减少(图3的图E)。此外，hHBV会以剂量相关的方式聚集SHP-1及SHP-2(图3的图F)。

这些数据显示，hHBV会通过Siglec-3诱导的抑制信号来抑制TLR配位体诱导细胞激素分泌。

实施例5评估抗-Siglec-3单克隆抗体对HBV感染的功效

5.1制备及鉴定抗-人类Siglec-3单克隆抗体

本实施例将制备四株抗Siglec-3单克隆抗体，以鉴定可阻断HBV媒介的免疫抑制反应的拮抗型抗-Siglec-3单克隆抗体。

首先，由噬菌体表达的合成人类抗体库筛选出抗-人类Siglec-3单克隆抗体，并评估其对HBV媒介的免疫抑制反应的抑制功效。流式细胞仪分析结果显示，在筛选出的克隆中，克隆2B9及克隆10C8对moDC具有最高的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)(结果未显示)。依据测序结果，单克隆抗体10C8的VL及VH区分别包括序列编号：8及9的氨基酸序列，其中CDR-L1到CDR-L3分别包括VYY、ISSAG(序列编号：3)及QYFNFP(序列编号：4)的氨基酸序列；而CDR-H1到CDR-H3则分别包括NNGW(序列编号：5)、GIGPYGGSTF(序列编号：6)及SRFIGSYSHM(序列编号：7)的氨基酸序列。

克隆2B9显然为一促效型单克隆抗体，因为它会促使SHP-1及SHP-2聚集(图4的图A)及抑制经Pam3csk4刺激的moDC表达TNF-α(图4的图B)。克隆3B8、4D2及5E3也呈现与克隆2B9相似的特性，因此也为促效型单克隆抗体(结果未显示)。相较之下，在相同条件下，克隆10C8既不会使SHP-1及SHP-2聚集，也不会抑制Pam3csk4诱导TNF-α表达(图4的图A及图B)，也就是克隆10C8不会通过Siglec-3产生抑制信号。

此外，如FRET结果所示，克隆10C8可抑制CHB患者的PBMC中Siglec-3与HBV的相互作用(图5的图A)。荧光影像指出，在施予同型对照单克隆抗体(IgG1)或未施予单克隆抗体时，Siglec-3会与HBV同位表达于CHB患者的PBMC，而施予克隆10C8则会阻断Siglec-3与HBV的相互作用(结果未显示)。相似的结果也可见于与外源性hHBV培养的moDC(图5的图B)。

这些结果证实克隆10C8为拮抗型抗-Siglec-3单克隆抗体，可用以阻断细胞表面HBV-Siglec-3的相互作用。

5.2HBV会抑制TLR配位体诱导细胞激素表达，而拮抗型抗-Siglec-3单克隆抗体则可逆转该抑制反应

本实施例将分析克隆10C8是否可逆转hHBV媒介的抑制反应。

在含有hHBV的环境下，将moDC与pam3csk4及聚(I:C)+IFN-γ共同培养，接着以ELISA检测TNF-α及IP-10的表达量。图6的结果指出，HBV会以剂量相关的方式抑制经Pam3sk4或聚(I:C)+IFN-γ刺激的moDC表达TNF-α及IP-10，而克隆10C8可阻断HBV媒介的抑制反应(图6的图A到D)。此外，克隆10C8也可抑制hHBV诱导SHP-1及SHP-2聚集至Siglec-3的反应(图6的图E)。进一步，克隆10C8可增强CHB患者的经TLR配位体刺激的PBMC中TNF-α及IP-10表达量(图6的图F及图I)。

据此，这些数据证实克隆10C8为一拮抗型抗-Siglec-3单克隆抗体，可用以阻断moDC中HBV媒介的抑制信号。

综上所述，本发明的发明人意外地发现HBV对Siglec-3受体具有结合亲和力。基于该发现，本发明提供了一种新颖的抗-Siglec-3单克隆抗体(即，10C8单克隆抗体)，其可逆转HBV诱导的免疫抑制反应，因此可用以研发治疗及/或预防HBV感染的药物。

虽然上文实施方式中公开了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 中央研究院

<120> 抗-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素的抗体、包括该抗体的药学组合物及其用途

<130> P3053-CN

<160> 9

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-hHBsAg肽1

<400> 1

Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser

1 5 10 15

Trp

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-hHBsAg肽2

<400> 2

Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala

1 5 10 15

Phe Gly Lys

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-L2

<400> 3

Ile Ser Ser Ala Gly

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-L3

<400> 4

Gln Tyr Phe Asn Phe Pro

1 5

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H1

<400> 5

Asn Asn Gly Trp

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H2

<400> 6

Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H3

<400> 7

Ser Arg Phe Ile Gly Ser Tyr Ser His Met

1 5 10

<210> 8

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-VL区

<400> 8

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Gly Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

20 25 30

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Asp Val Tyr Tyr Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Leu Tyr Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Tyr Phe Asn Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 9

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-VH区

<400> 9

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Ala Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile

35 40 45

Asn Asn Gly Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Arg Phe Ile Gly Ser Tyr Ser His Met Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

Claims (16)

1.一种用以预防或治疗B型肝炎病毒(HBV)感染的抗体或其片段，包括：

一轻链可变区，其包括VYY、ISSAG(序列编号：3)及QYFNFP(序列编号：4)氨基酸序列；以及

一重链可变区，其包括NNGW(序列编号：5)、GIGPYGGSTF(序列编号：6)及SRFIGSYSHM(序列编号：7)氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述轻链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且所述重链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述轻链可变区具有序列编号：8的氨基酸序列，且所述重链可变区具有序列编号：9的氨基酸序列。

4.一种用以预防或治疗一个体的HBV感染的方法，包括对所述个体施予一有效量的如权利要求1所述的抗体。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且所述抗体的所述重链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述轻链可变区具有序列编号：8的氨基酸序列，且所述重链可变区具有序列编号：9的氨基酸序列。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述个体为人类。

8.一种如权利要求1所述的抗体于制备一药物的用途，其中所述药物是用以预防或治疗一个体的HBV感染。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且所述抗体的所述重链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述轻链可变区具有序列编号：8的氨基酸序列，且所述重链可变区具有序列编号：9的氨基酸序列。

11.一种如权利要求1所述的抗体在预防或治疗HBV感染的用途。

12.如权利要求11所述的抗体的用途，其中所述抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且所述抗体的所述重链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。

13.如权利要求12所述的抗体的用途，其中所述轻链可变区具有序列编号：8的氨基酸序列，且所述重链可变区具有序列编号：9的氨基酸序列。

14.一种用以预防或治疗HBV感染的药学组合物，包括一有效量的如权利要求1所述的抗体，以及一药学上可接受的载体。

15.如权利要求14所述的药学组合物，其中所述抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：8，且所述抗体的所述重链可变区的氨基酸序列至少85％相似于序列编号：9。

16.如权利要求15所述的药学组合物，其中所述轻链可变区具有序列编号：8的氨基酸序列，且所述重链可变区具有序列编号：9的氨基酸序列。

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