CN112662803B - 一种与甜瓜网纹性状共分离的caps分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示序列的第54位为SNP位点，且SNP位点为T/A。所述SNP位点上有甜瓜网纹的碱基为A、无甜瓜网纹的碱基为T。本发明还提供了一种利用上述CAPS分子标记鉴定甜瓜网纹有无的方法。所以，利用上述CAPS分子标记能够鉴定网纹甜瓜，将网纹甜瓜和非网纹甜瓜区分开，可以实现在苗期判断网纹甜瓜品种，辅助快速筛选所需要的个体，加快网纹甜瓜的选育过程。本发明还提供一种上述CAPS分子标记的检测引物。本发明还提供一种上述CAPS分子标记及对应的检测引物或其检测试剂的应用。

Description

一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记及应用

技术领域

本发明属于生物分子标记领域，具体涉及一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是主要的葫芦科蔬菜作物之一，栽培面积广泛，具有重要的经济价值。中国是甜瓜生产大国，甜瓜在果蔬生产中占有重要地位。

近年来，分子辅助选择育种技术得到了广泛的开发及应用，能够在分子水平上快速筛选所需要的个体，极大的缩短了育种时间，对育种工作有着极大的推动。能否找到与性状紧密连锁的标记，能否在不同材料中使用，是分子标记辅助选择育种成功与否的标志。

网纹甜瓜(Cucumis melo L.var.reticulatus Naud.)主要是指葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属甜瓜种厚皮甜瓜亚种中粗皮甜瓜变种与卡沙巴变种的杂交种，经选育而成的品种。网纹甜瓜作为厚皮甜瓜中的精品，不仅因为其具有较高的糖度和品质、独特的口感和风味，网纹甜瓜还拥有优美的网状裂纹。网状裂纹不仅增强了网纹甜瓜的观赏性，也大大提高了网纹甜瓜的商品价值。目前关于甜瓜网纹的研究仍主要集中在网纹形成发育分析，有关甜瓜网纹调控基因的精细定位、克隆及其遗传结构研究还未见报道，也未能找到与甜瓜网纹性状共分离的分子标记。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记及其应用，用于在苗期判断甜瓜网纹是否存在，加快网纹甜瓜的选育过程。

具体地，本发明提供一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记，命名为分子标记NDCAPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

基于上述，SNP位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第54位，且所述SNP位点为T/A。

基于上述，所述SNP位点上，有甜瓜网纹的碱基为A，无甜瓜网纹的碱基为T。

本发明还提供一种上述CAPS分子标记或其检测试剂在鉴定甜瓜网纹有无中的应用。

本发明还提供一种上述CAPS分子标记或其检测试剂在筛选甜瓜网纹品种中的应用。

本发明还提供一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记的检测引物，包括一对检测引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明还提供一种包含上述检测引物的试剂盒。

本发明还提供一种上述检测引物或试剂盒在鉴定甜瓜网纹有无中的应用。

本发明还提供一种上述检测引物或试剂盒在筛选甜瓜网纹品种中的应用。

本发明还提供一种鉴定甜瓜网纹有无的方法，包括：利用上述的CAPS分子标记对待测苗期甜瓜网纹品种进行分型，根据分型结果判断待测苗期甜瓜网纹品种是否有网纹。

因此，本发明提供的上述CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的第54位，该SNP位点为T/A，有甜瓜网纹的碱基为A，无甜瓜网纹的碱基为T，所以，利用本发明提供的上述CAPS分子标记能够鉴定网纹甜瓜，将网纹甜瓜和非网纹甜瓜区分开，可以实现在苗期判断网纹甜瓜品种，辅助快速筛选所需要的个体，加快网纹甜瓜的选育过程。

附图说明

图1为本发明实施例中甜瓜网纹的实物照片图，其中，左图表示网纹甜瓜类型；有图表示无网纹甜瓜类型。

图2为实施例中扩增产物和酶切产物检测的电泳图，其中A区域和C区域表示无网纹甜瓜，B区域和D区域表示网纹甜瓜；每个区域的泳道1、18为DL2000marker，第一行泳道2～17均为无网纹甜瓜PCR产物电泳图；第二行泳道2～17均为网纹甜瓜PCR产物电泳图；第三行泳道2～17均为无网纹甜瓜酶切产物电泳图；第四行泳道2～17均为网纹甜瓜酶切产物电泳图。

序列表中：

SEQ ID NO.1为分子标记NDCAPS的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2为检测引物中正向引物的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3为检测引物中正向引物的核苷酸序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中的试剂耗材等，如无特殊标注，均可从商业途径购买得到。

实施例一分子标记NDCAPS

本实施例提供一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记，命名为分子标记NDCAPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本实施例提供的分子标记NDCAPS与甜瓜网纹性状紧密连锁，双亲序列分别位于甜瓜基因组DHL92 v3.6.1第2号染色体的MELO3C010288基因上的第16408616位核苷酸至第16409141位核苷酸，大小为526bp，如SEQ ID NO.1所示。通过对双亲序列比对，明确双亲上存在非同义突变，MELO3C010288基因的16408669位点上，即分子标记NDCAPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第54位为SNP位点，该位点的碱基发生T/A突变，即将缬氨酸突变为谷氨酸。具体地，在所述SNP位点，无甜瓜网纹的碱基为缬氨酸T、有甜瓜网纹的碱基为谷氨酸A，对应的实物外观如图1所示。

本实施例提供的分子标记NDCAPS的获取：

利用全密网纹甜瓜品种PI-169329和无网光皮甜瓜品种20KH.111为亲本获得F₂分离群体，通过双亲全基因组重测序结合F₂代群体ddRAD-seq技术构建高密度遗传图谱，通过2018年F₂群体、2019年春秋F_2:3群体3个季节的网纹性状调查，在甜瓜基因组第2号染色体上定位到唯一一个在3个环境下重复出现且遗传效应极高的主效QTL位点(LOD值>20，表型变异解释率>45％)，其他染色体区域未发现显著性位点。利用扩大的F₂群体精细定位至2号染色体16382539～16414439区段内。在区段内存在2个候选基因，通过对双亲序列比对发现在MELO3C010288基因上发现一个SNP位点，该位点位于甜瓜基因组2号染色体16408669位点上，且碱基有T/A突变。根据该突变点开发分子标记，命名为NDCAPS，上游引物NDCAPSL，下游引物NDCAPSR。限制性核酸内切酶为MnlI。

实施例二检测引物

本实施例提供一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记的检测引物，包括一对检测引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本实施例还提供一种包含上述检测引物的试剂盒。

实施例三鉴定甜瓜网纹有无的方法

本实施利用实施例一提供的分子标记NDCAPS或实施例二提供的特异性检测引物鉴定甜瓜网纹的有无，具体方法如下：

1、利用改良过的CTAB法提取苗期待测甜瓜DNA

(1)在表1所示的来源于国家西瓜甜瓜种质中期库的甜瓜材料的待测植株三叶一心时，取幼叶于2mL离心管中，用冰袋带回，使用真空冷冻抽干机进行抽干，抽干后用研磨仪磨碎至甜瓜叶粉末状；

(2)向离心管中加入1000μL已经在65℃水浴锅中预热1h的2％CTAB，震荡，使甜瓜叶粉末于液体充分接触，放入65℃水浴锅内1h，期间每10min混匀一次；

(3)水浴后晾至室温，于4℃采用13000r/min的转速离心15min；

(4)离心后，将上清液吸出，移入新的2mL离心管中，加入900μL的氯仿/异戊醇(体积比24:1)溶液，充分摇匀后，于4℃采用13000r/min的转速离心15min；再重复2次此步骤；

(5)吸出600～700μL上清液并置于1.5mL离心管中，加入700μL 4℃预冷的无水乙醇，充分摇匀，4℃沉淀1h；

(6)取出离心管，于4℃采用13000r/min的转速离心15min，离心后吸出上清液，保留沉淀；

(7)用75％的乙醇清洗2～3次，室温晾干，加入蒸馏水补足50μL，获得待测甜瓜DNA样品，该样品可在-80℃冰箱永久保存。

2、以上述步骤1得到的待测甜瓜DNA样品为模板，用实施例二提供的检测引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物

PCR扩增的反应体系为10μL反应体系，由下列成分组成：DNA模板1μL、2×Es TaqMasterMix 4μL、正向引物2pM 1μL、反向引物2pM 1μL、蒸馏水3μL，其中的Es TaqMasterMix包括Es Taq DNA Polymerase、Mg²⁺和dNTPs；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环，再72℃延伸7min，4℃保温保存。

3、利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对步骤2所得的PCR扩增产物进行检测，检测结果如图2所示的电泳图的第一行及第二行所示，扩增的条带在526bp处，由此说明，该处存在SNP位点。

4、对PCR扩增产物进行酶切检测

酶切的体系如下：PCR扩增产物5μL、10×FlashOne^TMBuffer 1μL、FlashCut^TMMnlI0.5μL、蒸馏水补足8μL；

酶切条件为：先37℃温育30min，再80℃温育20min使酶失活，停止反应。

利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，检测结果如图2所示的电泳图的第三行及第四行所示，无网纹甜瓜有三条带分别位于336bp、138bp和52bp处，网纹甜瓜有两条带分别位于336bp和190bp处。

5、自然群体甜瓜网纹的区分鉴定

对表1所示的16种无网纹甜瓜和16种网纹甜瓜进行基因序列测试，并进行核苷酸序列比对。经核苷酸序列比对发现：表1所示的32中甜瓜品种在对应的2号染色体16408669位点为SNP位点，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第54位为SNP位点；且表1所示的16中无网纹甜瓜在SNP位点的碱基为缬氨酸T，表1所示的16中甜瓜网纹在SNP位点的碱基为谷氨酸A。该结果与预期的试验结果相同。

表1植物材料来源及相区分的SNP位点

电泳顺序	课题组编号	品种名称	类型	来源	16408669位点
						2	HH01	真正哈密瓜	无网纹	日本	T
3	HH23	Ames8578	无网纹	美国	T
						4	HH27	Ames29539	无网纹	土库曼斯坦	T
5	HH30	Ames29564	无网纹	土库曼斯坦	T
						6	HH52	PI164610	无网纹	印度	T
7	HH104	PI614576	无网纹	印度	T
						8	HB94	伊丽莎白239	无网纹	日本	T
9	HB21	江苏三叶瓜	无网纹	江苏	T
						10	HB22	三叶花酥瓜	无网纹	江苏	T
11	HB30	青皮绿瓤	无网纹	江苏	T
						12	HB37	TH-10长甜菜瓜	无网纹	河南	T
13	HB38	脆菜瓜	无网纹	河南	T
						14	HB42	特大黑皮面瓜	无网纹	河南	T
15	HB49	黄香瓜	无网纹	湖南	T
						16	HB54	看瓜	无网纹	江苏	T
17	H906	20KH.111	无网纹	阿富汗	T
						2	HH05	Primo—4	有网纹	美国	A
3	HH06	PI-164569	有网纹	苏联	A
						4	HH10	PMR-45	有网纹	日本	A
5	HH19	Ames26810	有网纹	美国	A
						6	HH20	Ames29858	有网纹	法国	A
7	HH35	NSL30032	有网纹	美国	A
						8	HH36	NSL34600	有网纹	美国	A
9	HH37	NSL60241	有网纹	美国	A
						10	HH38	NSL74171	有网纹	美国	A
11	HH39	PI116489	有网纹	印度	A
						12	HH66	PI351132	有网纹	伊朗	A
13	HH68	PI378169	有网纹	以色列	A
						14	HH80	PI502328	有网纹	俄罗斯	A
15	HB40	早黄醉仙	有网纹	山东	A
						16	HH75	PI446928	有网纹	以色列	A
17	H581	PI-169329	有网纹	中国	A

其中，表1中的“电泳顺序”是指图2所示的电泳图中的每一行的泳道顺序。

因此，利用本实施例提供的分子标记NDCAPS或实施例二提供的特异性检测引物通过PCR产物与酶切产物，可以在甜瓜苗期将网纹甜瓜和非网纹甜瓜区分开，实现在苗期判断网纹甜瓜品种，快速筛选所需要的个体，加快网纹甜瓜的选育过程。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

序 列 表

<110> 河南农业大学

<120> 一种与甜瓜网纹连锁的CAPS分子标记引物及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 526

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>分子标记NDCAPS的核苷酸序列

<400> 1

ggaccaattg tgagagccaa cacagcaatt tgctttgtat taaattttgc ttcctctgtt 60

ttcaatattc tcatctccat attttttgct tcacattcac acccaccatt gttgttgtta 120

ttattattat tatttctcac atcttcatat tgaataatgt tcaccataca tcgaacatca 180

ttattttcca cctctgaaat tatattattg ttactatcac gttgatttgt tctttcttct 240

atagcttgca acaatggggg gagaagatct gcaacttctc tagagtttcc atttgaaaaa 300

tggcttctga ccatcttccc tatgaattcc ttgatgaagg caattgcaag ataagccacc 360

aacatcgatg tcccgacgta cgtcaccaca aatggatgct cgtagtctgt aaaaataccc 420

tatcaaacgc caaaaacatg ttatatataa acatgaatta aacttttcga cctaaacttt 480

tgagctaaca agtgtaagta taaacgaacc tgtgtgatct cggagg 526

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 检测引物中正向引物的核苷酸序列

<400> 2

ggaccaattg tgagagccaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>检测引物中反向引物的核苷酸序列

<400> 3

cctccgagat cacacaggtt 20

Claims (4)

1. 一种与甜瓜网纹性状共分离的CAPS分子标记，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第55位存在T/A多态性。

2.一种权利要求1所述的CAPS分子标记在鉴定甜瓜网纹有无中的应用。

3.一种权利要求1所述的CAPS分子标记在筛选甜瓜网纹品种中的应用。

4.一种鉴定甜瓜网纹有无的方法，包括：利用权利要求1所述的CAPS分子标记对待测苗期甜瓜网纹品种进行分型，根据分型结果判断待测苗期甜瓜网纹品种是否有网纹。